CN117295518A

CN117295518A - 使用免疫治疗剂的治疗的增强

Info

Publication number: CN117295518A
Application number: CN202280030257.4A
Authority: CN
Inventors: 佩尔·克里斯蒂安·松蒂姆; 斯韦恩·克沃勒; 斯皮罗斯·科托普利斯; 安德鲁·约翰·希利
Original assignee: Act Therapeutics LLC
Current assignee: Act Therapeutics LLC
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2023-12-26
Also published as: GB202105691D0; AU2022260125A1; EP4326326A1; WO2022223626A1; GB2605996A; CA3216195A1

Abstract

本发明涉及超声介导的免疫治疗药剂和方案的增强，并且特别地用于癌症和自身免疫病的免疫治疗性治疗。更特别地，本发明提供了簇组合物和药物组合物，其用于将免疫治疗剂递送至体内的目的靶区域，并用于增强活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润，并用于治疗实体瘤和自身免疫病理状况。

Description

使用免疫治疗剂的治疗的增强

技术领域

本发明涉及超声介导的免疫治疗剂向病理部位的靶向递送，并且特别地用于使用这样的治疗剂的药物治疗。因此，本发明提供了簇组合物(cluster composition)和药物组合物，其用于递送和制备，以用于施用用于治疗病理状况(例如癌症和自身免疫病/炎性疾病)的免疫治疗剂。

背景技术

免疫治疗是通过激活或抑制免疫系统对疾病进行的治疗。免疫治疗剂(immunotherapeutic agent，ITA)的使用正在快速发展，并且新的类别、药剂和现有药剂的新用途正被不断开发。不同类别的免疫治疗剂包括：单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)、融合蛋白、可溶性细胞因子受体、重组细胞因子、小分子模拟物(small-moleculemimetic)、细胞治疗剂、癌症疫苗和溶瘤病毒。其中，mAb是迄今为止最重要的一类，具有广泛的用于治疗多种病理状况(包括癌症和自身免疫病)的经批准药剂。

单克隆抗体治疗是使用mAb与某些细胞或蛋白质进行单特异性结合的免疫治疗形式。目标是该治疗将刺激患者的免疫系统攻击这些细胞，或者替代地，mAb可用于与参与T细胞调节的分子结合以去除阻断T细胞响应的抑制性途径。这被称为免疫检查点治疗。目前，多于80种不同的mAb被FDA批准用于治疗一系列疾病，特别是肿瘤和自身免疫病。mAb的治疗用途是快速增长的领域(segment)：2019年，美国10种最畅销药物中有7种是mAb，以Humira(Abbvie，自身免疫病)、Opdivo(BMS，癌症)和Keytruda(Merck，癌症)为首。

免疫肿瘤学(immuno-oncology，IO)是人工刺激免疫系统以治疗癌症，提高免疫系统对抗疾病的自然能力[Carter and Thurson,Immune-oncology agents for cancertherapy,The Pharmaceutical Journal,May7 2020]。免疫系统的正常抗体与外部病原体结合，而经修饰的免疫治疗抗体与肿瘤抗原结合，标记并识别癌细胞以供免疫系统抑制或杀伤。IO药剂探索了不同于常规化学治疗剂的多种作用机制(mechanism of action，MoA)，例如，检查点抑制剂增强了机体自身的细胞毒性T细胞以识别和攻击肿瘤细胞。单克隆抗体代表了目前临床实践中最重要的IO药剂类别。然而，IO领域还包括溶瘤病毒(例如塔利拉维(talimogene laherparepvec))、细胞因子(例如干扰素和白介素)和一系列癌症疫苗。

免疫治疗也被广泛用于抑制自身免疫，并且还用于治疗变态反应或用于降低对移植器官的排斥。例如，肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor alpha，TNF-α)的抑制剂通常用于减轻疾病(例如类风湿性关节炎、炎性肠病和银屑病)的炎症。

成功的药物治疗的先决条件是药物到达血管隔室外部的间质组织。用于直接作用于病理状况(例如，如用化学治疗剂)或用于与免疫细胞相互作用。然而，对于大多数治疗剂，仅有非常小部分的施用药物到达体内的靶标病理疾病区域(例如肿瘤)-大部分在到达其靶标之前全部被健康组织吸收、降解或排泄。例如，对于许多化学治疗方案，在靶标癌组织中累积的施用剂量少于0.01％[Kurdziel et al.:"Human Dosimetry and PreliminaryTumour Distribution of 18F-Fluoropaclitaxel in Healthy Volunteers and NewlyDiagnosed Breast Cancer Patients Using PET/CT",JNucl Med.2011Sep；52(9):1339-1345]。在全身施用之后，药物从血管隔室向间隙空间的外渗可通过三个基本过程发生：被动扩散、对流转运和通过血管上皮细胞的转胞吞作用。对于大多数小分子药物，被动扩散是迄今为止最重要的外渗和分布途径。然而，由于大多数ITA的物理化学性质和大尺寸，被动扩散在外渗过程中没有发挥重要作用。大多数ITA的共同点是它们依赖于大分子结构或纳米尺寸的构建体，例如mAb的分子量为约150.000道尔顿(Dalton)并且直径为10至15nm，而溶瘤病毒是直径通常测量为50至150nm的大构建体。相比之下，大多数化学治疗剂的分子量小于1000道尔顿，显示出亚-nm尺寸。这些尺寸有效地阻止了药物从血管隔室的外渗，并因此显著降低了治疗的潜在效力[Ryman and Meibohm,CPT Pharmacometrics SystPharmacol.2017Sep；6(9):576-588]。因此，血管壁代表了有效使用ITA的重要障碍，并且提高药物外渗的方法可能潜在地导致这些药剂的治疗作用的市场提高。

此外，在免疫肿瘤学中，递送治疗作用的不是ITA本身，而是炎性细胞因子(例如IL-1、IL-12、IL-18、TNFα和INFγ)和活化的免疫细胞(例如活化的T细胞，例如CD3、CD4和CD8阳性细胞)，其中ITA阻断受体并使免疫细胞能够对所述病理细胞启动所需的细胞毒性过程。因此，为了使治疗起作用，活化的免疫细胞必须能够在被活化之后浸润病理状况，使肿瘤在免疫学上“热”而不是在免疫学上“冷”。在此，血管屏障再次代表了显著的障碍-在许多情况下，免疫细胞浸润是有限的，而增强这种浸润的方法可能潜在地导致这些药剂的治疗作用的显著提高。

尽管与例如化学治疗剂相比在毒性谱方面有所改善，但免疫治疗仍然受到不希望的全身效应和剂量限制性毒性的阻碍。由于其作用机制，ITA与独特但多变的毒性谱相关。最严重的问题是对免疫系统的潜在超生理刺激，导致潜在威胁生命的促炎细胞因子的不受控制和快速产生，但ITA也可表现出一系列皮肤病学、内分泌、肝和胃肠毒性。因此，提高剂量来克服有限的外渗是不可行的。然而，如果能够以一些方式提高外渗效力，则可以开发更低剂量的药物，同时仍然保持治疗效力，并且同时降低成本和全身毒性。

许多免疫治疗方案仅在一小部分治疗的患者群体中有效；一些对治疗响应良好，并且一些可能根本没有响应。对于临床响应中的这些差异存在数个可能的原因，包括不同基因突变的存在和个体患者中特定信号传导途径的不同程度的活性。然而，也可能是药物外渗和/或活化的细胞浸润因患者而异，和响应的可变性部分是由于给定对象间质组织中的药物浓度不足，或者活化的细胞对病理状况的浸润不足。

存在显著的与基于免疫治疗的治疗相关的成本影响。例如，用选定的mAb治疗非小细胞肺癌一年的全球成本估计超过800亿美元。对于多种ITA，每位患者每年的估计成本超过100,000英镑，这给医疗保健系统带来了显著的压力。实施这些较新的靶向治疗的成本急剧上升，并且治疗的持续时间也延长了，因为许多疾病越来越多地被当作慢性病症来治疗。在UK，国家健康和护理卓越研究所(National Institute for Health and CareExcellence，NICE)是负责确定新的治疗是否对NHS是成本有效的组织。新的治疗的成本是使用被称为质量调整生命年(quality-adjusted life year，QALY)的标准化测量对其临床效力进行评价的。为了被NHS认为是成本有效的，治疗的成本不应该多于20,000至30,000英镑/QALY收益，或者寿命终止治疗不应该多于50,000英镑。新的ITA越来越多地超过这些阈值，导致被NICE拒绝和患者的可及性降低。确定提高药物从血管隔室的外渗并增强药物在病理组织中的分布的方法可以使剂量降低，同时保持治疗效力，继而显著降低治疗成本。

目前正在研究在治疗局部病理状况(例如实体瘤)中专门集中于靶向药物递送的治疗选择，包括纳米粒、分子靶向以及超声和微泡(microbubble)介导的治疗，即声孔效应(sonoporation)。在过去的二十年里，对使用超声进行药物递送越来越感兴趣。对于最新的综述，参见Castle et al[Castle et al,Am J Physiol Heart Circ Physiol February1,2013304:H350-H357]。许多方法基于使用类似于用作超声造影剂用于医学成像应用的那些的微泡，用于释放并入或附着的药物和/或用于增强全身(共)施用药物的摄取。声孔效应是其中将气体微泡注射到脉管系统(vasculature)中，并通过超声(ultrasound，US)刺激以引起生物力学作用，从而提高血管屏障的渗透性和在特定位置(例如，实体瘤内)处的药物的外渗的方法。微泡是稳定的气泡(gas bubble)(直径2至3μm)，其经血管内注射并通常在体内稳定多至1至2分钟，且没有已知的副作用。在施加超声之后，这些微泡振荡并与附近的内皮/血管壁细胞相互作用，通过多种生物力学作用形成开窗术。这种相互作用可允许提高药物从血管隔室的外渗、胞内药物摄取，并且还使治疗剂比单独渗透到血管壁中更深地渗透到组织中。虽然这种技术显示出具有前景，但是由于使用了为超声成像而设计和优化的市售微泡(对比微泡)而不是治疗增强，声孔效应的真正潜力是有限的。因此，大量的研究集中于开发针对超声介导的、靶向的和增强的治疗而优化的“下一代”微泡。一个主要的限制是微泡的尺寸。由于尺寸小，它们在血管隔室内发挥的生物力学作用的水平是有限的。此外，与内皮壁的物理接触是有限的，并且由于所诱导的生物力学作用通常随着与血管壁的距离呈指数下降，因此诱导开窗术的有效性受到限制。由于这些限制，常规造影微泡下的声孔效应需要使用相对高能量的US场(高机械指数，MI)。尽管微泡介导的递送机制已经在体内被清楚地证明，但是存在相关的生物作用，这提出了该方法的安全性问题。微泡空化机制很可能参与其中，并且尤其是已经观察到微出血和不可逆的血管损伤。这些过程也可导致血管关闭，即血管塌陷(暂时地或永久地)，有效地停止血液灌注，并因此停止药物摄取。

在WO2015/047103中，提出了超声介导的靶向递送的概念，其中微泡/微滴簇组合物与治疗剂一起施用，并且其中相对于单独的治疗剂，对靶标病理状况的超声声波作用可导致治疗作用提高。这一概念被称为声束治疗(Acoustic Cluster Therapy，ACT声孔效应或ACT)，后来在一系列临床前原理证明和概念证明研究(用多种化学治疗剂治疗多种癌症病症)中进行了研究。例如，van Wamel et al.,Acoustic Cluster Therapy enhances thetherapeutic efficacy of paclitaxel andfor treatment of humanprostate adenocarcinoma in mice,J Control Release,236(2016)15-21]，证明了ACT与标准护理、小分子化学治疗方案、药剂组合的潜力。

基于上文，显然需要新的和替代的用于使用免疫治疗剂进行治疗的组合物和方法，使得能够提高间质组织的摄取和/或提高活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润。这将具有改善治疗结局的潜力，并且还可被探索以降低全身剂量，限制毒性并显著降低治疗的成本。

发明内容

本发明的目的是提供这样的组合物和方法，其用于使用免疫治疗剂(ITA)的药物治疗和免疫治疗方法，并且特别地用于治疗癌症和自身免疫病。本发明涉及超声介导的ITA向病理部位的靶向递送，并且涉及使用这样的治疗剂的药物治疗。

本发明人已经发现声束治疗可用于递送ITA和增强活化的免疫细胞浸润。在WO2015/047103中提出的ACT是用于超声介导的靶向递送的概念，其中微泡/微滴簇组合物与治疗剂一起施用，并且其中对靶标病理状况的超声声波作用与仅使用单独的治疗剂相比可导致治疗作用的提高。尽管WO2015/047103提供了在ACT过程期间所施加的US场的特征的广泛描述，但是本发明人现已出乎意料地发现，其中仔细选择该方法的超声声波作用频率和压力的特定用途提供了血管屏障的提高的浸润性、共同施用的治疗剂和/或炎性细胞因子的提高的外渗和/或活化的免疫细胞的浸润，并且避免了不良作用，充分发挥了ACT的潜力。

基于进行的和计划的研究，本申请人现已出乎意料地发现ACT技术(其中仔细选择该方法的超声声波作用频率和机械指数)的特定用途在用ITA治疗中是有用的，并且其与用单独的ITA治疗对象相比特别地提供了共同施用ITA的改善的治疗作用。

现已确定了簇组合物和在增强ITA治疗作用的方法中使用该簇组合物的方法。这使用ACT技术以在体内从施用的包含微泡/微滴簇的组合物产生大的相转变泡。与局部超声声波作用相组合，这有助于增强之前、和/或共同、和/或之后单独施用的治疗剂和/或炎性细胞因子的外渗和摄取，并增强活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润，提供了与使用单独的治疗剂相比治疗作用的显著提高。

此外，本发明人已经将ACT技术与临床相关药剂组合，并且确定了使用本发明的组合物和方法，即使大的ITA也可被递送至靶标病理部位，并且改善了ITA从血管隔室向靶组织间质的外渗。

因此，本发明提供了微泡/微滴簇组合物，其用于增强ITA向靶标病理组织递送的方法。同样，本发明提供了增强ITA向靶组织间质递送的方法，其包括向对象施用微泡/微滴簇组合物。本公开内容证明了双组分微泡/微滴簇组合物(其中作为第一组分的微泡与作为第二组分的微滴物理地连接成簇)可用于有助于增强之前、和/或共同、和/或之后单独施用的ITA的摄取的方法。与使用单独的治疗剂相比，该方法提供了显著提高了治疗作用的潜力。

在一个方面中，本发明提供了用于治疗哺乳动物对象的病理状况的方法的微泡/微滴簇组合物，其中所述方法包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种免疫治疗剂(ITA)；

(ii)向所述对象施用所述微泡/微滴簇组合物；

其中所述至少一种ITA在所述簇组合物之前、和/或与所述簇组合物共同、和/或在所述簇组合物之后单独地施用；

(iii)通过以1至10MHz的第一频率和0.1至0.4的第一机械指数对所述对象内的目的区域进行超声声波作用来激活来自步骤(i)的簇组合物中微滴的可扩散组分的相转变(phase shift)；

(iv)进一步用第二频率为0.4至0.6MHz且第二机械指数为0.1至0.3的超声进行声波作用。

同样，本发明提供了用至少一种免疫治疗剂(ITA)治疗哺乳动物对象的病理状况的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种免疫治疗剂(ITA)；

(ii)向所述对象施用微泡/微滴簇组合物；

(iii)通过以1至10MHz的第一频率和0.1至0.4的第一机械指数对所述对象内的目的区域进行超声声波作用来激活来自步骤(i)的簇组合物中微滴的可扩散组分的相转变；

步骤(iv)的进一步声波作用有助于步骤(i)中施用的ITA的外渗和活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润。

附图说明

图1提供了簇尺寸相对于体内产物效力的可视图，其中Y轴示出了从US成像计算的灰度增强的相关系数(即在活化之后沉积的泡的量)，并且X轴示出了簇直径(以μm计)。

图2提供了在簇组合物的超声活化之后大的泡群体的衰减谱。Y轴示出了衰减(以dB/cm计)。X轴示出了频率(以MHz计)。

图3提供了针对入射US场的不同频率和机械指数(Mechanical Index，MI)，活化的泡对低频增强声波作用场响应的建模结果。静止时泡的半径为20μm，并且入射场由8个周期(其中频率和MI如各图中所示)组成。对于每个图，Y轴示出了活化的泡的半径(以μm计)。X轴示出了时间(以微秒计)。

图4提供了在用500kHz且机械指数(MI)为0、0.1、0.2、0.3和0.4的增强阶跃声波作用场进行ACT治疗之后，肿瘤特异性摄取荧光染料(伊文思蓝)的结果(下图)。Y轴示出了肿瘤特异性摄取(以mg伊文思蓝/mg肿瘤组织计)。X轴示出了机械指数。上面的四个图示出了在所研究的不同MI下，活化的泡对入射US场响应的建模结果。Y轴示出了活化的泡的半径(以μm计)。X轴示出了时间(以微秒计)。

图5提供了nab-紫杉醇(nab-PTX)±ACT在小鼠中治疗前列腺癌的治疗效力的结果。Y轴示出了所有经处理动物的总存活(以％计)。X轴示出了在研究开始之后的时间(以天计)。组：盐水对照(灰色虚线)、单独的nab-PTX(灰色实线)、具有增强场500kHz(MI 0.2)的nab-PTX+ACT(黑色实线)和具有增强场900kHz(MI 0.2)的nab-PTX+ACT(黑色虚线)。

图6提供了nab-紫杉醇±ACT在小鼠中治疗乳腺癌的治疗效力的结果。Y轴示出了归一化的肿瘤直径(mm)。X轴示出了在研究开始之后的时间(天)。组：盐水对照(黑色，空心方块)、单独的nab-PTX(黑色，空心圆圈)、具有增强场MI 0.1(500kHz)的nab-PTX+ACT(灰色，实心圆圈)和具有增强场MI 0.2(500kHz)的nab-PTX+ACT(黑色，实心圆圈)。

图7提供了实施例3的研究中使用的装置的A)设置照片和B)设置示意图，所述装置用于实施包括超声激活和增强的ACT声孔效应操作。在图7B中，数字表示如下：1是双频超声换能器(2.7MHz和500kHz输出)，2是超声波导，3是水浴，4是超声凝胶，5是超声吸收垫，6是具有簇组合物的注射器，7是VeVo成像台，8是导管，以及9是肿瘤。

图8提供了来自实施例3：reo病毒与ACT组合用于治疗肝细胞癌的治疗作用的研究结果。Y轴示出了肿瘤体积作为用溶瘤呼肠孤病毒(实心三角形)、盐水对照(实心正方形)和溶瘤呼肠孤病毒与ACT的组合(实心圆圈)在小鼠中治疗肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)的时间的函数。X轴示出了从治疗开始的时间。X轴下方的灰色三角形指示治疗天数。

图9提供了在实施例4的研究中使用的装置的设置示意图，所述装置用于实施包括超声激活和增强的ACT声孔效应操作)。数字表示如下：1-放大器，2-信号发生器，3-0.5至2.7MHz的开关盒，4-双频换能器，5-充水锥(Water filled cone)，6-充水袋，7-超声凝胶，8-处于俯卧位置的小鼠，9-耳朵固定杆(ear bar)，10-吸声垫。

图10提供了来自实施例4：ACT诱导的纳米粒穿过血脑屏障递送的研究结果的箱线图。上图：来自脑组织吸收CCPM纳米粒的近红外荧光(near infrared fluorescence，NIRF)成像的代表性图片。对照和在ACT处理之后1小时和24小时时的经ACT处理的大脑。左下图：Y轴示出了在ACT处理之后1小时和24小时时，对照和ACT组的通过NIRF测量的吸收作为注射剂量/克脑组织的百分比。黑色实心圆圈代表个体观察结果。线和星号指示从t-检验得出的组之间的统计学显著性(***p<0.001)。右下图：Y轴示出了在ACT处理之后1小时，对照和ACT组的通过共聚焦显微术测量的吸收作为包含纳米粒的脑面积的百分比。黑色实心圆圈代表个体观察结果。线和星号指示从Mann-Whitney秩和检验得出的组之间的统计学显著性(*p<0.05)。

图11提供了在用组合方案治疗期间进行的可能的ACT治疗的图，该组合方案包括：输注纳武单抗(nivolumab)30分钟，随后输注伊匹单抗(ipilimumab)90分钟。ACT操作在施用期间应用三次，如灰色声孔效应条所示。

图A：ACT操作，其包括a.：注射簇组合物，b.：用例如60秒的常规医学成像超声声波作用活化簇，以及c.：在例如5分钟的400至600kHz的超声声波作用(MI为0.1至0.3)下的增强步骤。

图B：y轴示出了施用的治疗剂的血浆浓度(以峰的百分比计)，并且x轴示出了时间(以分钟计)。在该实例中，在约30分钟、80分钟和120分钟下进行三个ACT操作以便覆盖两种药物并提供整个目的区域的治疗。

图12提供了在用组合方案治疗期间进行的可能的ACT治疗的图，所述组合方案包括用于治疗转移性鳞状非小细胞肺癌的标准护理组合免疫治疗加化学治疗方案；派姆单抗(pembrolizumab)，随后是紫杉醇和卡铂。

图A：如图11所详述的ACT操作。

图B：y轴示出了施用的治疗剂的血浆浓度(以峰的百分比计)，并且x轴示出了时间(以分钟计)。在该实施例中，在约160分钟、200分钟和240分钟下进行三个ACT操作，以便覆盖所有药物并提供整个目的区域的治疗。

图13提供了来自实施例6的研究的火山图，其示出了当ACT与同种型抗体(IgG)组合时，相对于用单独的IgG的治疗，ACT对肿瘤免疫原性状态的影响仅作为免疫基因的表达。

图14提供了两幅图，其示出了来自实施例6的研究的ACT的遗传作用，如由相对于用单独的IgG的治疗，当ACT与同种型抗体(IgG)组合时，由下调(A)或上调(B)的途径所示。x轴示出了：-log10(p值)。

图A：IgG+ACT的下调途径。

图B：IgG+ACT的上调途径。

这些字母表示如下：GO:0001666-对缺氧的响应，WP 4206-遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌途径，GO:0001525-血管生成，GO:0051235-位置的维持，GO:0061061-肌肉结构发育，GO:0006936-肌肉收缩，GO:0097435-超分子纤维组织，GO:0043462-ATP酶活性的调节，GO:0030199-胶原蛋白纤维组织，GO:0030239-肌原纤维组装，GO:0044057-系统过程的调节。

图15提供了来自全染色肿瘤切片自动分析的初步免疫组织化学结果的图，参见实施例6。按处理组示出了单个动物的CD8 T细胞染色呈阳性的细胞的比例(黑点)和组平均值(棒)和标准偏差(误差棒)。x轴示出了A：ACT+PD1/CTL4，B：PD1/CTL4，C：ACT+ISO，D：ISO，E：盐水。

具体实施方式

定义：

除非另有限定，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或供及时参考，本文中限定了具有通常理解含义的术语，并且本文中包含这样的定义不应一定被理解为代表超出本领域中通常理解的显著差异。

本文中使用的声束治疗(ACT)(其在下文进一步限定)包括施用与至少一种治疗剂组合的簇组合物(参见下文的定义)，以及随后向对象内的目的靶区域(例如肿瘤、间质组织或淋巴结)施加超声。术语“ACT治疗”或“ACT操作”用于描述簇的施用和声波作用，因此是本发明方法的步骤(ii)、(iii)和(iv)。

本文中使用的“对象”意指被选择用于治疗或疗法的任何人或非人动物个体，并且涵盖且可限于患者，特别是患有癌症或自身免疫病的对象。

本文中使用的短语“治疗有效量”意指在适用于任何治疗的合理效益/风险比下，在对象中有效产生所期望的治疗作用的治疗剂的量。

术语“微泡”或“常规造影微泡”在本文中用于描述直径为0.2至10微米，通常平均直径为2至3μm的微泡。“常规造影微泡”包括市售药剂，例如(GEHealthcare)、/>(GE Healthcare)、/>(Bracco Spa.)、/>(Lantheus Medical Imagin)、/>(VisualSonics Inc.)和Polyson/>(Miltenyi Biotec GmbH)。

术语HEPS/PFB微泡在本文中用于描述通过用2mL水重构第一组分(如实施例1中所提供的)形成的微泡。

本文中的术语“相转变泡”、“大的相转变泡”、“大的活化的泡”和“活化的泡”用于描述在超声(US)诱导活化簇组合物之后形成大的(>10μm)泡。

术语“微滴”在本文中用于描述直径为0.2至10微米的乳液微滴。

“声波作用”或“US声波作用”是用于描述暴露于超声或用超声处理的术语。

术语“常规医学成像超声”用于描述来自用于医学成像的现用US扫描仪和探针的超声。即频率为1至10MHz，并且MI<1.9，优选<0.7，并且更优选<0.4。

术语“沉积物示踪剂”在本文中与活化的相转变泡相关联使用，其含义是：微循环中大的泡的暂时机械捕获意味着组织中相转变泡的局部沉积将反映活化的泡沉积时流过该组织的微循环的血液量。因此，被捕获的“沉积物”相转变泡的数目将线性依赖于沉积时的组织灌注。

术语“相转变(过程)”在本文中用于描述物质从液态至气态的相变。具体地，在US声波作用下，簇组合物的微滴的油组分从液态至气态变化的转变(过程)。

在本文中，术语“治疗递送/治疗剂”和“药物递送/药物”二者都被理解为包括药物分子、纳米粒和纳米粒递送系统以及脂质体递送系统的递送，包括至少一种治疗活性剂。

术语“第1组分”(或第一组分，或C1)在本文中用于描述分散的气体(微泡)组分。术语“第2组分”(或第二组分，或C2)在本文中用于描述包含可扩散组分的分散的油相(微滴)组分。

术语“簇组合物”在本文中用于描述由第1(微泡)组分和第2(微滴)组分的组合(例如混合)产生的组合物。因此，具有如在本文中进一步描述的特征的簇组合物是指准备施用于对象并用于声束治疗的配制组合物。

术语“可扩散组分”在本文中用于描述第2组分的油相的化学组分，其能够在体内扩散到第1组分的微泡中，使其尺寸瞬时增大。

本文中使用的术语“药物组合物”具有其常规含义，并且特别地是以适于哺乳动物施用的形式。该组合物优选地包含两种单独的组合物：簇组合物(a)和治疗剂(b)，这二者都适于哺乳动物施用例如经由肠胃外注射、腹膜内注射或肌内注射，施用途径相同或不同。短语“以适于哺乳动物施用的形式”意指组合物是无菌的、无热原的、不含产生过量毒性或不良作用的化合物，并在是在生物相容的pH(约pH 4.0至10.5)下配制的。配制这样的组合物使得在与生物流体(例如血液)接触时不发生沉淀，仅包含生物相容的赋形剂，并且优选是等张的。

本文中的术语“声学测量(Sonometry)(系统)”是指使用声学技术对活化的相转变泡进行动态尺寸测量和计数的体外测量系统。

术语“反应性”在本文中用于描述第1组分中的微泡和第2组分中的微滴在混合时形成微泡/微滴簇的能力。库尔特(Coulter)计数适于对C1和C2中的微泡和微滴的浓度和尺寸分布进行定量，并用于表征簇组合物(药物产品，DP)中的颗粒。簇组合物的反应性(R)定义为：

R＝(C_c1+C_c2-C_DP)·100/(C_c1+C_c2)

其中C_C1、C_C2和C_DP分别是在C1、C2和DP中观察到的数浓度。因此，反应性是C1和C2中的单个微泡和微滴有多少是以簇的形式包含在DP中的量度。反应性还与这些簇有多大相关(即有多少单个微泡和微滴组成单个簇)。根据C1、C2和DP的库尔特分析，可容易地计算反应性。

术语“微泡/微滴簇”或“簇”在本文中是指微泡和微滴的组通过静电引力永久地保持在一起形成单个颗粒聚集实体。本文中的术语“聚集”是指其中第1组分中的微泡和第2组分的微滴形成簇的过程。

在医学超声中，声功率通常由“机械指数”(MI)来描述。该参数被定义为超声场中的峰负压(peak negative pressure，PNP)除以超声场中的中心频率(F_c)的平方根(以MHz计)[American Institute of Ultrasound in Medicine.Acoustic Output MeasurementStandard for Diagnostic Ultrasound Equipment.第1版.第2版.Laurel,MD:AmericanInstitute of Ultrasound in Medicine；1998,2003]。

医学US成像期间的调整要求是使用小于1.9的MI。在使用微泡造影剂的US成像期间，推荐MI低于0.7以避免有害的生物作用(例如微出血和不可逆的血管损伤)，并且使用低于0.4的MI被认为是“最佳实践”。应理解，当在本文中提及MI时其反映的是原位MI，即施加于目的靶区域的MI。

在本文中的ACT操作的背景下，术语“活化”或“活化步骤”是指通过超声(US)声波作用诱导微泡/微滴簇的相转变，即产生大的活化的泡。

术语频率被定义为每秒的(超声)周期数(Hz)。当在本文中使用时，该术语表示施加的声场的中心频率。

在本文中的ACT操作的背景下，术语“增强”或“增强步骤”是指通过US声波作用诱导大的、活化的泡的体积振荡和随之而来的生物力学作用。

当在本文中使用时，术语“共振频率”或“微泡共振频率”意在描述无限基质结构域中单个泡的声共振频率(忽略表面张力和黏性衰减的影响)。共振频率通过以下给出：

其中a是泡的半径，γ是多变系数，p_A是环境压力，并且ρ是基质的密度。

术语“免疫治疗剂”涉及旨在通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病或病症的治疗方式。其还涉及对免疫应答的操纵，使得在某些疾病的情况下，将不适当的免疫应答调节成更适当的免疫应答。

术语“分子靶标”应理解为人细胞中与特定的疾病过程例如病因学、进展和/或药物抗性内在相关的分子或分子组。要被称为靶标，必须有证据表明，通过用小分子、生物产品或其他干预处理靶标，产生了所期望的治疗作用，从而导致疾病过程的改变。在本文中，分子靶标根据人细胞分化分子(Human Cell Differentiation Molecule，HCDM)委员会命名法命名，该命名法是在正在进行的一系列人白细胞分化抗原(Human LeucocyteDifferentiation Antigen，HLDA)研讨会期间商定的，由国际免疫学会联盟(International Union of Immunological Society，IUIS)正式批准，并被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)认可。大多数情况下，本文中的分子靶标是通过如HCDM所公布的它们的分化簇(Cluster of Differentiation，CD)数来命名的。然而，也使用了其他科学上可接受的详细描述靶标性质的术语，例如CTLA-4(表示细胞毒性T淋巴细胞抗原4)和PD-1(表示程序性细胞死亡蛋白1)等。

本发明提供了簇组合物，其用于使用免疫治疗剂(ITA)治疗的方法，并且特别地用于治疗癌症和自身免疫病。本发明使用ACT技术在体内从包含微泡/微滴簇的施用药物组合物产生大的相转变泡，并且其有助于之前、和/或共同、和/或之后单独施用的治疗剂的递送和摄取。由于微脉管系统中的生物力学机制，治疗剂的治疗作用与施用单独的药剂相比显著提高，如下进一步说明的。本公开内容表明ACT技术的特定用途(包括在不同频率和机械指数下的两个超声声波作用步骤)能够提高单独施用的ITA的递送，并且还增强了活化的免疫细胞浸润。被活化的相转变泡的体积比典型的常规造影微泡大约1000倍(直径的10倍)。

本发明提供了簇组合物，其用于将至少一种ITA递送至靶组织间质的方法，并用于增强活化的免疫细胞浸润，其中所述方法包括相转变技术，以在体内从施用的簇组合物产生大的相转变泡，并且其有助于单独施用的ITA的递送和摄取。与不使用本发明组合物的治疗相比，本发明使用的组合物和方法增强了单独共同施用的治疗剂的治疗作用，提供了改善的治疗结局。

因此，在第一方面中，本发明提供了微泡/微滴簇组合物，其用于治疗哺乳动物对象的病理状况的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种免疫治疗剂(ITA)；

(ii)向所述对象施用所述微泡/微滴簇组合物；

该方法步骤(并且特别是步骤(iv))有助于步骤(i)中施用的ITA的外渗和活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润。

在一个实施方案中，微泡/微滴簇组合物和至少一种ITA可被视为药物组合物，优选包含这两种作为单独的组合物。因此，本发明提供了包含微泡/微滴簇组合物的药物组合物，其用于用至少一种ITA治疗哺乳动物对象的病理状况的方法，其中所述至少一种ITA在所述簇组合物之前、和/或与所述簇组合物共同、和/或在所述簇组合物之后单独地施用。

除了所需的步骤(i)至(iv)之外，该方法还可包括步骤(iib)：任选地使用超声成像对所述簇进行成像以确定所述对象内用于治疗的目的区域。这样的步骤应在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前进行。

本发明中使用的声束治疗技术是超声介导的靶向药物递送平台，其利用通过施加超声活化的微泡/微滴簇，在靶组织的脉管系统中产生局部开口或开窗术，导致血管渗透性的短暂提高，并从而允许药物和活化的免疫细胞更好地渗透病理性间质。因此，本发明的组合物和方法在内皮屏障中打开了开窗术，并且可改善活化的免疫细胞(例如T细胞)的外渗和瘤内分布，并且改善抗体的瘤内摄取和分布，以及刺激肿瘤抗原的释放。vanWamel的论文证明了ACT增强使用常规小分子化学治疗剂的治疗方案的潜力。然而，论文没有指出将ACT与较大的药物构建体(例如ITA)组合的可能性，而这种递送概念现在已被发现特别有用。此外，论文没有指出应用ACT用于治疗自身免疫病的可能性。并且最后，ACT在现有技术中一直被描述为增强药物分子向靶组织的局部递送的概念。本发明人已发现，由于ACT打开了内皮屏障中的开窗术，除了改善抗体的瘤内摄取和分布以及刺激肿瘤抗原的释放之外，还可应用该技术来改善活化的免疫细胞(例如T细胞)的外渗和瘤内分布。实质上，ACT概念解决了与使用常规造影微泡进行声孔效应相关的大多数限制属性；

1)其在体内产生是常规造影微泡的约三个数量级的大的活化的泡，发挥大得多的生物力学作用，

2)这些泡与内皮紧密接触，并因此更加有效，并且

3)它们在稳定的空化模式中发挥作用，使用低MI US场，避免了与惯性空化相关的安全问题和血管损伤。

本发明部分地基于来自数项临床前研究的发现。在实施例3中，本申请人研究了ACT在增强溶瘤病毒形式的ITA用于治疗肝细胞癌的治疗作用方面的能力。如可从表3中显示的结果和图8中看到的结果观察到的，当与盐水对照组相比时，用单独的呼肠孤病毒治疗在研究剂量下没有显示出对肿瘤生长的显著抑制。然而，当将相同剂量的病毒与ACT治疗组合时，观察到明显且显著的肿瘤抑制，其中与单独的病毒相比，在第25天肿瘤体积减小>95％。这项研究证明了ACT概念增强大的构建体ITA用于治疗局部病理状况的治疗效力的能力。

在实施例4中，申请人研究了ACT在递送细胞毒性纳米粒穿过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)方面的能力。BBB是内皮细胞的高度选择性半透性边界，其阻止循环血液中的溶质非选择性地穿过并进入到神经元所在的中枢神经系统的胞外液中。血脑屏障由毛细血管壁的内皮细胞、包盖毛细血管的星形胶质细胞末端脚(astrocyte end-feet)和嵌入毛细血管基底膜中的周细胞形成。该系统允许一些选定的小分子通过被动扩散通过，以及对神经功能至关重要的多种营养物、离子、有机阴离子、葡萄糖、水和氨基酸的选择性和主动运输。血脑屏障限制病原体的通过、血液中溶质的扩散以及大或亲水性分子向脑脊液中的扩散，同时允许小的疏水性分子和小的极性分子的扩散。该屏障还限制外周免疫因子(像信号传导分子、抗体和免疫细胞)进入CNS中，从而使大脑免受由于外周免疫事件而导致的损害。

因此，BBB代表了体内最紧密的血管屏障。在未受损的情况下，其对大于约4至500道尔顿的治疗剂完全关闭。实施例4证明了ACT能够将大的构建体(像纳米粒)摄取到脑组织中的能力，并间接证明了ACT概念用于局部递送大的ITA(例如mAb)穿过体内任何血管屏障的效用。与给药单独的纳米粒相比，当纳米粒与ACT组合时，观察到向脑组织的摄取提高了280％至290％。

在实施例2中，本申请人已经研究了在第二声波作用步骤(增强步骤)期间施加的US场的属性以及其对所施加操作的功能的影响。出乎意料且与WO2015/047103的教导(其中所公开的优选的频率范围为0.2至1MHz，并且建议MI<0.4)相反，本申请人发现该概念的功能对这些参数非常敏感。基于这些研究，本申请人已经发现优选的频率范围为0.4至0.6MHz，并且所施加的MI应保持大于0.1，但小于0.3。在增强步骤(步骤(iv))期间，在较低的频率和较高的MI的情况下，本申请人出乎意料地发现所诱导的活化的泡振荡太强，导致效力的显著损失和血管损伤。在另一方面，如从研究0.5MHz vs.0.9MHz的比较例所证明的(参见图3)，在较高的频率和较低的MI的情况下，诱导的泡振荡太小，导致缺乏足够的生物力学作用，并因此导致治疗效力的显著损失。

本申请人已发现，使用ACT概念的本发明的方法是克服生物学屏障以改善治疗剂和活化的免疫细胞的摄取的有效方式。已经发现，这对于使用免疫治疗剂的治疗特别有益，因为这类药剂通常表现出低的药物外渗率。本发明的方法，并且特别是增强步骤(iv)有助于步骤(i)中施用的ITA的外渗和活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润。

因此，所施用的微滴-微泡簇由局部声波作用方法(包括在不同频率下的超声声波作用)触发。当所述簇在超声下声波作用化(活化)时，振荡的微泡启动附着的微滴的瞬间气化(相转变)。已经显示放大的所得泡在体内毛细血管尺寸的血管中形成，并且被低频超声进一步激发以诱导有助于外渗和提高药物和/或细胞渗透到声波作用化组织中的生物力学作用。现在已经确定，治疗方法应该包括两个声波作用步骤，包括一个活化步骤和一个增强步骤。在这些声波作用步骤中使用不同的超声频率。在活化步骤(该方法的步骤(iii))期间，簇的微泡振荡并将能量转移至微滴，诱导液滴气化，形成被设计为瞬时驻留在微脉管系统中的大的ACT泡。因此，在施用之后，在成像控制下通过施加外部超声能量(例如来自临床超声成像系统的超声能量)活化所述簇以产生大的泡，其中在较低频率下的进一步声波作用诱导生物力学作用、外渗和提高的药物渗透。

本发明方法的步骤进一步描述如下：

施用，步骤i)和ii)：将簇组合物胃肠外(优选静脉内)施用于所述哺乳动物对象，并且将治疗剂作为单独的组合物在簇组合物之前、和/或与簇组合物共同、和/或在簇组合物之后单独地施用，如在本文中“施用途径”下进一步描述的。

任选的成像，步骤iib)：簇在低MI(低于约0.1的簇活化阈值)下不被活化，这允许进行标准医学超声造影剂成像，例如在不活化簇的情况下确定肿瘤微血管病理状况。因此，在一个实施例中，该方法包括成像步骤，在不活化簇的情况下使用低MI造影剂成像模式(MI<0.1)以对微泡组分(即分散气体)进行成像以确定用于治疗的病理位置。因此，由于簇在低MI(低于活化阈值)下不被活化，因此可在活化步骤之前进行标准医学超声造影剂成像，例如以确定肿瘤微血管病理状况。

活化，步骤iii)：簇的微泡组分的声共振频率在诊断频率范围(1至10MHz)内。当已将簇组合物施用于对象时，簇的活化易于通过用标准诊断超声成像脉冲(例如用于常规医学腹部超声和心脏应用)在低至中等范围的机械指数(即MI低于0.4但高于0.1)下对目的区域进行声波作用而获得。

激活相转变是通过以1至10MHz(例如更具体地以2至3MHz)的第一频率对所述对象内的目的区域进行超声声波作用来进行的。可通过采用成像脉冲，使用临床成像系统在毫米空间分辨率内实现活化簇相转变以产生较大(直径为10μm或更大)的活化的泡。在活化时，微滴中的油蒸发，并产生的大的活化的泡暂时沉积在微脉管系统中。

在一个实施方案中，活化(即以第一频率进行的US声波作用)在每次施用簇组合物之后(例如在20秒内)立即开始，并持续例如60至120秒。在一个实施方案中，当进行成像(步骤iib)时，这在注射簇组合物之前和期间进行，并随后当看到造影剂流入时启动活化时钟。

在医学超声成像控制下，使用成像脉冲进行活化使得被超声场询问的组织区域中的簇的空间靶向活化。在活化之后，产生的大的相转变泡由于其尺寸而被暂时捕获在目的靶区域的微脉管系统中。所得的大的相转变泡是气化的乳液微滴(来自2μm直径油微滴的20μm泡直径)体积的约1000倍。这些大的相转变泡的散射截面比在活化之前包含在簇中的微米尺寸微泡的散射截面大数个数量级。作为结果，大的相转变泡产生丰富的反向散射信号，并且易于用诊断成像系统以基本成像模式进行成像。大的相转变泡的共振频率也比在活化之前包含在簇中的微泡的共振频率低一个数量级(参见实施例2)。

增强，步骤iv)：该步骤使用第二频率，该频率低于活化步骤期间使用的频率，并诱导ACT-泡的受控体积振荡，从而在毛细管壁上施加生物力学力，并增强局部药物递送。这在活化和沉积之后进一步施加低频超声，通过有效地克服生物屏障来提高向空间靶标组织的药物递送效率，进而有助于增强递送机制。这些机制可包括声孔效应的过程，即其中血管隔室中微泡的声波作用和随后的体积振荡提高血管屏障的渗透性的过程。换言之，ACT操作提高了内皮壁的渗透性，并因此增强了治疗药物或活化的免疫细胞的外渗、分布和细胞摄取。也可诱导另一些机制，例如产生增强治疗作用的细胞信号传导、机械分解增强药物渗透的间质结构等。

应当理解，对于本发明所使用的组合物和方法，这在施加低频超声的情况下对大的活化的泡的进一步声波作用进一步增强了治疗剂或细胞的摄取。因此，已经发现，施加接近大的活化的泡的共振频率的低频超声可用于产生机械生物作用机制以增强脉管系统的渗透性和/或声孔效应和/或间质中的分布和/或胞吞作用，并因此增强治疗结局。

施加与较大的相转变泡的共振频率相当的声场在医学诊断范围内的MI下产生相对较大的径向振荡。因此，可施加0.2至1MHz，最优选0.4至0.6MHz范围的低频超声来产生增强所施用药物的摄取，并因此有助于外渗的生物作用机制。出乎意料地，如实施例2中所示，当通过施加例如0.4至0.6MHz(例如，如实施例中使用的500Hz)范围内的超声，使用0.1至0.3(例如0.2)的MI对活化的泡进行声波作用以诱导增强的摄取时，发现了更大的治疗益处。已经发现，在体内活化之后，被活化的泡的体积加权平均直径为约20μm。这种尺寸的游离微泡的共振频率为约0.33MHz。然而，当被捕获在微容器中时，预期这样的泡的共振频率稍高。因此，低频增强步骤的最优选频率范围为0.4至0.6MHz。利用活化的泡的共振作用允许以在比其他技术可能使用的更低的声强度和更低的频率下更好地控制这些生物作用的启动。与大的相转变泡在成像控制下被活化并沉积在组织微脉管系统中的事实(允许大的、活化的泡在组织中的空间靶向)以及其延长的停留时间相结合，使得药物递送机制的实施更有效和可控。

因此，在一个实施方案中，该方法包括以0.4至0.6MHz范围内的第二频率进行声波作用的增强步骤(步骤iv)。该增强步骤的MI优选低于0.3但高于0.1，优选高于0.15。如果在增强步骤期间施加的MI低于0.1，则预计产生的生物力学作用将不足，并因此显著降低治疗益处。如果在增强步骤期间施加的MI高于0.3，则预计产生的生物力学作用将会太强，并导致不希望的作用(例如血管损伤或关闭)，从而显著降低治疗益处。

用低频超声进行声波作用是在活化步骤之后，并且通常应持续3至10分钟，例如持续约5分钟。优选在步骤(iii)之后立即开始步骤(iv)。

在本发明的方法中，当通过对对象内的目的区域进行超声声波作用来激活簇组合物的第二组分的可扩散组分的相转变时，簇的微泡被可扩散组分放大以产生放大的泡，所述放大的泡由于瞬时捕获在目的区域处的微循环中而定位在目的区域。在低频下的进一步超声声波作用(步骤iv)有助于所施用治疗剂的外渗，和活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润。因此所述方法有助于增强之前、和/或共同、和/或之后单独施用的治疗剂的外渗和摄取，和/或增强已活化免疫细胞对靶标病理状况的浸润。因此，本发明提供了提高的血管屏障通透性、提高的共同施用的治疗剂和/或炎性细胞因子的外渗、和/或活化的免疫细胞的浸润，

因此，本发明还提供了微泡/微滴簇组合物，其用于至少一种之前、和/或共同、和/或之后单独施用的ITA和/或炎性细胞因子的外渗和摄取的方法，和/或增强已活化免疫细胞向哺乳动物对象的靶标病理状况的浸润的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种免疫治疗剂(ITA)；

(ii)向所述对象施用所述微泡/微滴簇组合物；

(iii)通过以1至10MHz的第一频率和0.1至0.4的第一机械指数对所述对象内的目的区域进行超声声波作用以活化来自步骤(i)的簇组合物中微滴的可扩散组分的相转变；

(iv)进一步用第二频率为0.4至0.600MHz且第二机械指数为0.1至0.3的超声进行声波作用。

同样，本发明提供了至少一种之前、和/或共同、和/或之后单独施用的ITA的外渗和摄取的方法，和/或增强已活化免疫细胞向哺乳动物对象的靶标病理状况的浸润的方法，所述方法包括上述步骤。改善或增强至少一种ITA的外渗和摄取，或者改善或增强活化的免疫细胞向靶标病理状况的浸润的上述方法的步骤和实施方案如针对涉及治疗的第一方面所公开。

在这些方法的一些实施方案中，递送治疗作用的不是ITA自身，而是炎性细胞因子(例如IL-1、IL-12、IL-18、TNFα或INFγ)和/或活化的免疫细胞(例如活化的T细胞，例如CD3、CD4或CD8阳性细胞)，其中ITA阻断受体并使得免疫细胞能够启动针对所涉及的病理细胞所需的细胞毒性过程。

簇组合物

在本发明的方法中，除单独施用一种或数种免疫治疗剂之外，还向对象施用预混合的簇组合物。施用的簇可以通过超声活化。簇组合物是微泡(第一组分)与微滴(第二组分)的预混合物，通过静电力产生保持在一起的小微泡-微滴簇。微滴通常包含沸点<50℃且低血液溶解度的油组分。簇组合物(即第一组分与第二组分的组合)包含气体微泡和油微滴的簇，即其是稳定微泡/微滴簇形式的单个微泡和微滴的混悬体或分散体。实施例1中描述了用于定量检测和表征所述簇的分析方法。在本文中，术语“簇”是指微泡和微滴的组通过静电引力永久地保持在一起形成单个颗粒聚集实体。簇组合物中簇的含量和尺寸在将第一组分与第二组分体外组合之后的一段时间内(例如>3小时)基本稳定，即它们不会自发地崩解、形成较大聚集体或自发地活化(相转变)，并且在稀释之后的一段时间内基本稳定，即使在持续搅拌期间也是如此。因此，可用需要稀释和/或搅拌的多种分析技术检测和表征簇组合物中的簇。此外，簇组合物的稳定性允许进行必要的临床操作(例如，重构、撤回剂量和施用)。第一组分和第二组分以及簇组合物根据良好生产规范(Good ManufacturingPractice，GMP)制备。

在一个实施方案中，簇组合物包含簇在水性生物相容介质中的混悬物，其中所述簇的平均直径为1至10μm且圆形度<0.9，并且包含：

(i)第一组分，其包含气体微泡和用来稳定所述微泡的第一稳定剂；和

(ii)第二组分，其包含含有油相的微滴和用来稳定所述微滴的第二稳定剂，其中所述油包含能够扩散至所述气体微泡中以至少瞬时增大其尺寸的可扩散组分；

其中所述第一组分和第二组分的微泡和微滴具有相反的表面电荷，并且通过吸引力静电相互作用形成所述簇。

在将第一组分与第二组分(体外)组合，例如通过用乳剂形式的微滴组分重构微泡组分(例如冻干微泡组分)之后，根据本发明制备的簇组合物显示出适于其预期用途的使用稳定性，并在合适的施用时间窗(例如自将组分组合开始超过1小时或优选超过3小时)内显示出稳定的特征。将在该时间窗内向对象施用簇组合物。

簇组合物中的每个簇包含至少一个微泡和一个微滴，通常为2至20个单独的微泡/微滴，并且簇的平均直径通常为1至10μm，并因此可在血管隔室中自由流动。通过圆形度参数对它们进一步表征并将其从单个微泡和微滴分离。二维形状(例如，微泡、微滴或微泡/微滴簇的投影)的圆形度是具有与所述形状相同面积的圆的周长除以所述形状的实际周长的比率。因此，完美圆形(即，球形微泡或微滴的二维投影)的理论圆形度值为1，并且任何其他几何形状(例如，簇的投影)的圆形度小于1。本发明所述簇的圆形度<0.9。在WO2015/047103中还提供了圆形度参数的定义。

根据本发明，包含平均尺寸为1至10μm，并且特别为3至10μm，并且由<0.9的圆形度限定的簇的组合物被认为是特别有用的，如在实施例中证明的。在一个实施方案中，平均簇直径为3至10μm，并且优选4至9μm，更优选5至7μm。在活化之前，该尺寸范围内的簇在脉管系统中自由流动，它们容易被US声波作用活化，并且它们产生活化的泡，所述泡足够大以暂时沉积和停留在微脉管系统中，例如如在癌组织或发炎组织中。簇中的微泡允许在诊断频率范围(1至10MHz)内(即在活化时)的超声能量的有效能量转移，并允许乳剂微滴在低MI(优选小于0.4，但大于0.1)下气化(相转变)，并且气化的液体扩散至微泡中和/或在蒸气泡与微泡之间融合。然后，活化的泡从基质气体(例如血液气体)的向内扩散进一步膨胀以达到体积加权的中位直径：大于10μm，但小于40μm。

这些簇的形成(即在施用之前由第一组分和第二组分制备簇组合物)是有效相转变事件的先决条件，并且它们的数目和尺寸特征与组合物的效力(即其在体内形成大的、活化的(即相转变的)泡的能力)密切相关，并且已被发现是其体内预期功能的先决条件。数目和尺寸特征可通过多种配制参数控制，例如但不限于：第一组分中的微泡与第二组分中的微滴之间的引力强度(例如，微泡与微滴之间表面电荷的差异)；微泡与微滴的尺寸分布；微泡与微滴之间的比率；以及水性基质的组成(例如pH、缓冲液浓度、离子组成和强度)。当已经制备簇组合物并将施用时，所形成簇的平均圆形当量直径应优选大于3μm，更优选为5至7μm，但小于10μm。

组合制剂(簇组合物)中簇的浓度应大于300万/mL，优选大于1000万/mL，更优选大于2000万/mL。如在实施例1中所示，在将第一组分与第二组分混合之后0至3小时测得根据本发明使用的簇组合物的簇浓度为4000至4400万/mL，并且平均直径为5.8至6.2μm。

申请人的WO2015047103的图11(左图)示出了在注射时超声信号的体内增强(以灰度单位的增加来衡量)与具有5至10μm的不同浓度的簇的簇组合物的活化之间的相关性。所观察到的GS增强水平是产生并保留在靶组织中的大的活化的泡的量的直接测量，并且代表了对提高的外渗和治疗益处(即产品效力)的潜力的直接测量。在一个实施方案中，施用的组合物应包含至少300万/mL的直径为5至10um的簇。根据申请人的WO2015047103的图11，这样的最小值将确保>150GS单位的增强，以及一定的最低水平的产品效力和治疗效益。在另一个实施方案中，尺寸范围为1至10μm的簇的浓度应为至少1000万/mL，例如至少约2500万/ml。

因此，根据本发明，将药物递送至靶标血管外组织并用免疫治疗剂进行治疗是通过使用二组分微泡/微滴制剂体系(即，簇组合物)来实现的，其中在施用之前，第一组分中的微泡通过静电引力物理地附着于第二组分中的微米尺寸的乳剂微滴。用于根据本发明的治疗方法的组合物提供了对至少一种ITA的改善的摄取，产生了有益的治疗，包括例如肿瘤体积减小或完全缓解。因此，本发明还提供了用于制备分散在水性生物相容性介质中的微泡/微滴簇的组合物的二组分制剂体系，所述制剂体系包含如以上所公开的第一组分和第二组分，其用于本发明的方法。

应当理解，尽管直接的作用机制，即所产生的机械和/或热生物作用提高了治疗剂的递送并增强分布，但这些生物-机械作用的性质是簇组合物的化学属性的直接结果，即簇的化学组成和特性的结果。例如，泡在水性基质中的寿命与所述气体在基质中的溶解度和扩散系数成反比，并与所述气体的密度成正比。因此，由具有低溶解度和扩散性的重气体制成的泡将比由具有高溶解度和扩散性的轻气体制成的泡生长得更大且持续更久。例如，与5μm空气微泡相比，5μm全氟丁烷微泡在水中将持续其500倍之久。因此，微滴组分的化学组成将影响活化的泡在体内的寿命，并且因此影响可被诱导的生物力学力的水平和可用ACT操作实现的治疗作用水平。由此，全氟油将在用于第二组分的微滴中特别地有用，因为来自这样的微滴的气体的水溶性和扩散性非常低，并且密度高。

如果将本发明的组合物和方法与其中使用自由流动的常规造影微泡的方法进行比较，则由施用本发明的簇在体内产生的大的相转变微泡被截留在血管区段中，并且活化的泡表面与内皮紧密接触。另外，活化的泡的体积通常是常规微泡的体积的1000倍。在相等的机械指数(MI)下，在接近两种泡类型的共振的频率(对于相转变微泡约0.5MHz，并且对于常规造影剂微泡约3MHz)下进行声波作用，已经显示出，在振荡期间相转变泡的绝对体积移位(即，所施加的生物力学力)比常规造影微泡的绝对体积移位大三个数量级。因此，相转变泡的声波作用将产生完全不同水平的生物力学作用，具有比在常规造影微泡的声波作用期间显著更大的作用尺寸和渗透深度，如在[Ng et al.,摘要A099:Acoustic ClusterTherapy enhances the efficacy of chemotherapeutic regimens in patient-derivedxenograft mouse models for pancreatic ductal adenocarcinoma,AACR Conferenceon Molecular Targets and Cancer Therapeutics,Boston,2019年10月]中所表明。在自由流动的常规造影微泡观察到的生物作用可能取决于空化机制，以及随之而来的安全问题，例如微出血和不可逆的血管损伤。然而，来自簇的较大相转变泡可以以更柔软的方式振荡(较低的MI，例如<0.3)，避免了空化机制，但仍然诱导足够的机械力以增强脉管系统对药物的摄取和药物进入靶组织。大相转变泡的捕获还将充当沉积物示踪剂。这进一步允许对活化簇的数目进行定量和对组织进行灌注，并允许对组织脉管系统进行造影剂成像以鉴定待治疗组织的空间范围。

所施用簇的化学组成以及在簇活化期间发生的过程对于簇的作用至关重要。例如，包封的油滴的化学组成影响在US声波作用时沉积的活化的泡的量以及其在体内的寿命。油的物理化学属性，例如蒸气压、沸点和水溶性，都与沉积的活化的泡的量和其保持沉积的时间相关。对于C4-C6同源物全氟烃链，随着水溶性和蒸汽压的降低以及沸点的升高，活化的泡的量及其寿命随着链的长度而提高。此外，应当注意，簇的活化的大泡机械地作用于脉管系统的细胞，潜在地产生生物化学信号，导致提高治疗剂的摄取。

簇组合物及其第一组分和第二组分被改造成以受控制的方式聚集和相转变。活化的泡的尺寸(在体内)可通过改变第1组分和第2组分的不同配制参数以及制备时簇的尺寸特征来改造(参见实施例1)。

当在靶组织处暴露于超声(例如标准医学成像频率和强度的超声)时，所施用簇组合物的微泡将声能转移至附着的油微滴，并且可充当气化种子，或与微泡合并以使油经受液-气相转变(气化)。所得泡由于油的气化而经受最初的快速膨胀，随后由于血液气体的向内扩散而经受较慢膨胀，并暂时阻断微循环(后微动脉和毛细管网络)持续约1分钟或更久，优选2至3分钟或更久，最优选3至6分钟或更久。在本发明的方法中，或对于所使用的组合物，还向对象施用治疗剂，例如与簇组合物共同施用、或在簇组合物之前施用、或在簇组合物之后施用。通过施加外部超声能量，簇被活化以产生大的泡，并且这些泡被捕获在靶组织(例如肿瘤或炎症部位)的微脉管系统中。在捕获之后进一步施加低频超声以促进治疗剂或活化的免疫细胞向靶组织的外渗。因此，现有技术在免疫治疗剂的有限外渗和摄取以及活化的免疫细胞的浸润方面的主要限制可通过本发明的技术来克服，因为已经发现，治疗剂或活化细胞对靶组织的可及性显著提高。大的活化的泡被暂时嵌入到受声波作用组织的微脉管系统中，并通过进一步施加低功率、低频超声以促进靶组织对药物或细胞的摄取。活化的相转变泡的直径是典型微泡的约10倍大，导致了：

-活化的泡在靶(即经受声波作用的)组织的微脉管系统中的瞬时沉积/捕获；

-活化的泡与内皮之间的紧密接触；

-与常规造影微泡相比，在活化后US治疗期间的生物力学作用大了数个数量级，避免了惯性空化机制。

上述属性导致显著增强了药物和免疫细胞的外渗、分布和摄取。

簇组合物的第一组分：

第一组分包含气体微泡和用来稳定该微泡的第一稳定剂。因此，第一组分是包含分散气体和用来稳定该气体的物质的可注射水性介质。微泡可能类似于已上市并被批准用于数种临床应用的常规超声造影剂，例如或或用于临床前应用的类似药剂，例如/>和Polyson/>任何生物相容性气体均可能存在于气体分散体中，本文中使用的术语“气体”包括在37℃的正常人体温度下至少部分地(例如基本上或完全)处于气态(包括蒸汽)形式的任何物质(包括混合物)。因此，所述气体可例如包括空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；惰性气体，例如氦、氩、氙或氪；氟化硫，例如六氟化硫、十氟化二硫或三氟甲基五氟化硫；六氟化硒；任选的卤代硅烷，例如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量烃(例如包含多至7个碳原子)，例如烷烃(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷)，环烷烃(例如环丙烷、环丁烷或环戊烷)，烯烃(例如乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯)，或炔烃(例如乙炔或丙炔)；醚(例如二甲醚)；酮；酯；卤代低分子量烃(例如包含多至7个碳原子)；或前述任何物质的混合物。优选地，所述气体是卤代气体，并且更优选全氟气体。有利地，卤代气体中的至少一些卤素原子是氟原子；因此，生物相容性卤代烃气体可例如，选自溴氯二氟甲烷、氯二氟甲烷、二氯二氟化甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷、氯三氟乙烯、氟乙烯、氟乙烷、1,1-二氟乙烷和全氟化碳。代表性的全氟化碳包括全氟烷烃，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选地与其他异构体(例如全氟异丁烷)混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃；全氟炔烃；和全氟环烷烃。

使用全氟气体，例如六氟化硫和全氟化碳(例如全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷和全氟己烷)是特别有利的，因为包含这样的气体的微泡在血流中具有公认的高稳定性。在一个实施方案中，第一组分的气体选自氟化硫和卤代低分子量烃(例如包含多至7个碳原子)的组。具有使得它们在血流中形成高度稳定的微泡的物理化学特征的其他气体可能同样有用。最优选地，所述分散气体包含六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷(即C3-6全氟化碳)、氮气、空气或其混合物。甚至更优选地，所述分散气体包含六氟化硫、全氟丙烷、或全氟丁烷、或其混合物。并且甚至更优选地，所述分散气体是全氟丁烷。

所述分散气体可以是任何方便的形式，例如使用任何合适的含气体超声造影剂制剂作为含气体组分，例如或/>或者临床前药剂，例如/>或PolySon/>第一组分还将包含用来稳定微泡分散体的物质，在本文中称为“第一稳定剂”。这样的制剂的代表性实例包括通过第一稳定剂来稳定(例如至少部分被包封)的气体微泡，所述第一稳定剂例如聚结-抗性表面膜(coalescence-resistant surface membrane)(例如明胶)、成膜蛋白(filmogenicprotein)(例如白蛋白，例如人血清白蛋白)、聚合物材料(例如合成的生物可降解聚合物、弹性界面合成聚合物膜、微粒生物可降解聚醛、聚氨基酸-多环酰亚胺的微粒N-二羧酸衍生物)、非聚合和不可聚合的壁形成物质、或表面活性剂(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂例如普朗尼克(Pluronic)、聚合物表面活性剂或成膜表面活性剂例如磷脂)。优选地，所述分散气体是磷脂、蛋白质或聚合物稳定的气体微泡的形式。因此，在一个实施方案中，第一稳定剂选自磷脂、蛋白质和聚合物的组。特别有用的第一稳定剂选自表面活性剂的组，所述表面活性剂包括包含具有净总负电荷的分子的磷脂，例如天然存在的(例如大豆或蛋黄来源的)、半合成的(例如部分或完全氢化的)和合成的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和/或心磷脂。或者，应用于稳定的磷脂可携带总中性电荷并且可添加阴性表面活性剂(例如脂肪酸)，例如添加有棕榈酸的磷脂酰胆碱，或者是不同带电荷磷脂的混合物，例如磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰胆碱和/或磷酸。对于第一稳定剂，即稳定第一组分的微泡，在WO2015/047103，实施例5以及表9和表10中示出了不同的实例，其中测试了具有不同赋形剂的多种微泡制剂。结果表明，本发明中使用的ACT概念适用于广泛多种微泡制剂，还适用于稳定膜的组合物。

分散气体组分的微泡尺寸应优选小于7μm，更优选小于5μm，并且最优选小于3μm，以便于不受阻碍地通过肺系统通道，甚至当在微泡/微滴簇中也是如此。

簇组合物的第二组分：

第二组分包含含有油相的微滴和用来稳定所述微滴的第二稳定剂，其中所述油包含可扩散组分。该可扩散组分能够扩散至第一组分的气体微泡中以至少瞬时增大其尺寸。对于第二组分，“可扩散组分”适当地是能够产生气体的气体/蒸汽、挥发性液体、挥发性固体或其前体，例如在施用时，首要要求是该组分应具有或者能够在体内产生足够的气体或蒸汽压(例如至少50托，并且优选大于100托)，以便能够促进气体或蒸汽分子向内扩散至分散气体中。优选将“可扩散组分”配制为在合适的水性介质中的微滴乳剂(即稳定的混悬剂)，因为在这样的体系中，可扩散组分水相中的蒸汽压将基本上等于纯组分物质的蒸汽压，即使在非常稀的乳剂中也是如此。

这样的微滴中的可扩散组分在处理和储存温度下有利地是液体，例如如果水相包含合适的防冻物质则温度可能低至-10℃，而在体温下为气体或者表现出相当大的蒸汽压。例如，合适的化合物可以选自在专利申请WO-A-9416379或WO2015/047103(其内容通过引用并入本文)中给出的可乳化低沸点液体的多个列表。可乳化可扩散组分的具体实例包括脂肪醚，例如二乙醚；多环油或醇，例如薄荷醇、樟脑或桉树脑；杂环化合物，例如呋喃或二烷；脂肪烃，其可以是饱和的或不饱和的并且可以是直链的或支链的；环脂烃，例如环丁烷、环丁烯、甲基环丙烷或环戊烷；和卤代低分子量烃，例如包含多至7个碳原子。代表性的卤代烃包括二氯甲烷、甲基溴、1,2-二氯乙烯、1,1-二氯乙烷、1-溴乙烯、1-氯乙烯、溴乙烷、氯乙烷、1-氯丙烯、3-氯丙烯、1-氯丙烷、2-氯丙烷和叔丁基氯。有利地，卤素原子中的至少一些是氟原子，例如如在以下中：二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、1,2-二氯-1,2-二氟乙烷、1,2-二氯-1,1,2,2-四氟乙烷、1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷、2-溴-2-氯-1,1,1-三氟乙烷、2-氯-1,1,2-三氟乙基二氟甲基醚、1-氯-2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚、部分氟化烷烃(例如五氟丙烷(例如1H,1H,3H-五氟丙烷)、六氟丁烷、九氟丁烷(例如2H-九氟叔丁烷)和十氟戊烷(例如2H,3H-十氟戊烷))、部分氟化烯烃(例如七氟戊烯(例如1H,1H,2H-七氟戊-1-烯)和九氟己烯(例如1H,1H,2H-九氟己-1-烯))、氟化醚(例如2,2,3,3,3-五氟丙基甲基醚或2,2,3,3,3-五氟丙基二氟甲基醚)以及更优选全氟化碳。全氟化碳的实例包括全氟烷烃，例如全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷(例如全氟-2-甲基戊烷)、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷和全氟癸烷；全氟环烷烃，例如全氟环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟环戊烷和全氟甲基环戊烷；全氟烯烃，例如全氟丁烯(例如全氟丁-2-烯或全氟丁-1,3-二烯)、全氟戊烯(例如全氟戊-1-烯)和全氟己烯(例如全氟2-甲基戊-2-烯或全氟4-甲基戊-2-烯)；全氟环烯烃，例如全氟环戊烯或全氟环戊二烯；和全氟醇，例如全氟叔丁醇。因此，第二组分的油(可扩散组分)可以选自脂肪醚、杂环化合物、脂肪烃、卤代低分子量烃和全氟化碳的组。在一个实施方案中，第二组分的油相包含全氟化碳。

在本发明中特别有用的是水性溶解度低于1·10^-4M，更优选低于1·10^-5M的可扩散组分。然而，应当注意，如果使用可扩散组分和/或共溶剂的混合物，则混合物的相当一部分可能包含水溶性更高的化合物。基于水溶性，合适的油(可扩散组分)的实例为：全氟二甲基环丁烷、全氟甲基环戊烷、2-(三氟甲基)全氟戊烷和全氟己烷。

应当理解，根据本发明可以使用两种或更多种可扩散组分的混合物(如果期望的话)；本文中提及的“可扩散组分”应解释为包括这样的混合物。

第二组分还将包含用来稳定微滴分散体的物质，在本文中称为“第二稳定剂”。第二稳定剂可与用于稳定气体分散体的任何物质例如表面活性剂(例如磷脂、聚合物或蛋白质)相同或不同。任何这样的物质的性质均可能显著影响以下因素，例如分散气相的生长速率。一般而言，广泛多种表面活性剂可用作稳定剂，并且可用的表面活性剂的代表性实例包括脂肪酸(例如直链饱和或不饱和脂肪酸，例如包含10至20个碳原子)及其碳水化合物和甘油三酯、磷脂(例如卵磷脂)、含氟磷脂、蛋白质(例如白蛋白，例如人血清白蛋白)、聚乙二醇和聚合物(例如嵌段共聚物表面活性剂(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(例如普朗尼克)、延伸聚合物(例如酰氧基酰基聚乙二醇，例如聚乙二醇甲基醚16-十六烷基桥氧基-十六烷酸酯，例如其中聚乙二醇部分的分子量为2300、5000或10000))、和含氟表面活性剂(例如以商标名称Zonyl和Fluorad销售)。特别有用的表面活性剂包括磷脂，并且特别是包含具有总中性电荷的分子的磷脂，例如二硬脂酰-sn-甘油-磷酰胆碱(distearoyl-sn-glycerol-phosphocholine，DSPC)。对于第二组分，可使用多种不同的稳定剂来稳定微滴。此外，可使用广泛多种离子(优选阳离子)物质，以促进合适的表面电荷。

应当理解，为促进吸引静电相互作用(attractive electrostatic interaction)以实现第一组分中微泡与第二组分中乳剂微滴之间的聚集，这些应具有相反的表面电荷。因此，如果第一组分的微泡带负电荷，则第二组分的微滴应带正电荷，反之亦然。在一个优选实施方案中，第一组分的微泡的表面电荷为负，且第二组分的微滴的表面电荷为正。为促进油微滴的合适表面电荷，可以将阳离子表面活性剂添加至稳定结构。可以使用多种阳离子物质，例如具有碱性氮原子的至少略微疏水的和/或基本上不溶于水的化合物，例如伯胺、仲胺或叔胺和生物碱。特别有用的阳离子表面活性剂是硬脂胺。在一个实施方案中，第二稳定剂是添加有阳离子表面活性剂的中性磷脂，例如包含硬脂胺的DSPC膜。

在一个实施方案中，第一稳定剂和第二稳定剂各自独立地包含磷脂、蛋白质、聚合物、聚乙二醇、脂肪酸、带正电荷的表面活性剂、带负电荷的表面活性剂或其混合物。更具体地，第一稳定剂包含磷脂、蛋白质或任选地添加带负电荷表面活性剂的聚合物，以及第二稳定剂包含磷脂、蛋白质或任选地添加带正电荷表面活化剂的聚合物。

在一个实施方案中，第一组分包含选自六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、氮气和空气或其混合物的组的分散气体，由选自磷脂、蛋白质和聚合物的组的第一稳定剂稳定；第二组分包含选自全氟化碳(例如全氟环烷烃)的组的可扩散组分，用选自表面活性剂(例如包括磷脂、聚合物和蛋白质)的组的第二稳定剂稳定。更具体地，稳定剂中的任一者选自磷脂。

在预期使用之前不久将二组分制剂体系的第一组分与第二组分组合，用于制备微泡/微滴簇的组合物，并用于根据本发明的方法在合适的时间窗内使用。还应当理解，第一组分与第二组分的混合可以根据组分的形式以多种方式实现；例如将两种流体组分混合、将干粉形式的一种组分用流体形式的一种组分重构、在用流体(例如注射用水或缓冲溶液)重构之前将两种干燥形式的组分混合。因此，在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在施用步骤(步骤ii)之前制备微泡/微滴簇组合物的步骤。在一个优选实施方案中，微泡/微滴簇组合物通过将干粉形式的第一组分(微泡)用流体形式的第二组分(微滴)重构来制备。更具体地，使用无菌的一次性注射器和针头，将包含第一组分的第一小瓶用取自第二小瓶的第二组分重构。注射器的内容物将通过第一小瓶的塞子(stopper)添加，并且例如通过手动混合将产生的簇组合物均质化。

还应理解，可能影响微泡和微滴在混合时形成簇的能力的其他组分包括但不限于；微泡/微滴的表面电荷水平、两种组分中微泡/微滴的浓度、微泡/微滴的尺寸、液体基质中离子的组成和浓度、pH、赋形剂的组成和浓度(例如缓冲组分或张力组分)等(参见WO2015/047103，实施例1)。组分和组合物的这样的特征还可能影响所产生簇的尺寸和稳定性(在体外和在体内二者)，并且可能是影响生物属性(例如效力和安全性谱)的重要因素。还应理解，并非簇组合物中的所有微泡/微滴均可以以簇形式存在，而是相当一部分微泡和/或微滴可能以游离(非簇)形式与微泡/微滴簇群体一起存在。另外，两种组分混合的方式可能影响这些方面，包括但不限于；在均质化期间施加的剪应力(例如软手动均质化或强机械均质化)和均质化的时间范围。簇组合物将在时间窗期间施用于对象，其中自将两种组分组合之后，例如在5小时内，例如在3小时内簇的特征基本上不变。申请人的使用稳定性研究表明，簇在至少3小时内显示出稳定的特征，请参见实施例1。

在预期用于静脉内注射的乳剂中分散的可扩散组分的微滴尺寸应优选小于7μm，更优选小于5μm，最优选小于4μm，并且应大于0.5μm，更优选大于1μm，最优选大于2μm，以便于不受阻碍地通过肺系统，但仍保持足以在微脉管系统中保留活化的泡的体积。

体内分散气相的生长可能例如伴随着任何包封材料的膨胀(在包封材料具有足够柔性的情况下)和/或伴随着过量表面活性剂被从所施用材料提取至增大中的气-液界面。然而还可能的是，包封材料的拉伸和/或材料与超声的相互作用可显著提高其孔隙率。尽管迄今为止，在许多情况下已经发现包封材料的这样的破坏通过向外扩散和由此暴露的气体的溶解导致回声反射的快速损失，但我们已经发现，当使用根据本发明的组合物时，暴露的气体表现出相当大的稳定性。虽然不希望受到理论计算的约束，但我们认为，暴露的气体(例如以释放的微泡的形式)可以通过由可扩散组分产生的过饱和环境来稳定(例如防止微泡坍塌)，这提供了向内的压力梯度以抵消微泡气体的向外扩散趋势。由于基本不存在包封材料，因此暴露的气体表面可使得活化的泡表现出如通过在典型诊断成像频率下的高反向散射(backscatter)和低能量吸收(例如，通过高反向散射:衰减比表示)所证明的极其有利的声学特性；该回声效应可持续相当长一段时间，甚至在持续的超声声波作用期间也是如此。

可以预期，用于将ITA和/或活化免疫细胞递送至靶组织的ACT概念(即本发明使用的组合物和方法)是适用于组分(第一和第二组分)的广泛组合的概念，并且还是适用于多种任选地与化学治疗剂组合的免疫治疗剂的概念。因此，所列出用于第一组分的任何成分(包括气体和第一稳定剂)均可以与所列出用于第二组分的成分(包括可扩散组分和第二稳定剂)组合。

总之，在一个实施方案中，用于制备根据本发明方法应用的微泡/微滴簇组合物的二组分制剂体系包含：

(i)第一组分，其包含气体微泡和稳定所述微泡的第一稳定剂，其中所述气体微泡的气体选自卤代气体的组，优选为全氟化气体，并且最优选为全氟丁烷；并且所述第一稳定剂选自磷脂、蛋白质和聚合物的组，任选地添加带负电荷的表面活性剂，并且更优选为磷脂，并且最优选为氢化卵磷脂酰丝氨酸-钠(hydrogenated egg phosphatidyl serine-sodium，HEPS-Na)；和

(ii)第二组分，其包含含有油相的微滴和稳定所述微滴的第二稳定剂，其中所述油包含能够扩散至所述气体微泡中以至少瞬时增大其尺寸的可扩散组分，其中所述油选自脂族醚、杂环化合物、脂族烃、卤代低分子量烃和全氟化碳的组，优选全氟化碳，并且最优选全氟甲基环戊烷(perfluoromethyl-cyclopentane，pFMCP)；并且所述第二稳定剂选自磷脂、聚合物和蛋白质的组，任选地添加带正电荷的表面活性剂，更优选为添加有带正电荷表面活性剂的磷脂，并且最优选为添加有硬脂胺(stearylamine，SA)的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)；其中第一组分和第二组分的微泡和微滴具有相反的表面电荷，并通过吸引静电相互作用形成所述簇。

治疗剂

根据本发明应用的一种或更多种治疗剂(也称为“药物”)选自免疫治疗剂(ITA)的组，任选地与来自化学治疗剂组中的药物组合。将这种或这些作为对于簇组合物的单独组合物施用。根据标准护理，即根据各自的产品特征概要(Summary of ProductCharacteristic，SmPC)施用治疗剂。

ITA类包括但不限于单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)、融合蛋白、可溶性细胞因子受体、重组细胞因子、小分子模拟物、细胞治疗、癌症疫苗和溶瘤病毒。术语“免疫肿瘤学药剂(Immune-oncology agent，IO)”倾向于用作统称ITA组的通用术语，因此可用于本发明的ITA类还包括(IO)，如以下进一步所述。

在肿瘤学中，ITA用于加强免疫系统以攻击癌细胞，而在自身免疫病的治疗中，其功能是抑制在体内攻击健康细胞的自身免疫应答。

在癌症治疗中，免疫治疗抗体与肿瘤抗原(分子靶标)结合，标记并识别癌细胞以供免疫系统抑制或杀伤。多种类别的癌症免疫治疗剂靶向多种肿瘤抗原。在下文中，分子靶标在药物名称后面的括号中说明。

免疫肿瘤学是快速发展的领域，并且靶向先前未探索抗原的药物正持续进入临床前和临床开发。本发明的一个实施方案是靶向所有和任何这样的抗原的新的IO剂的用途，所述抗原是根据人细胞分化分子(Human Cell Differentiation Molecule，HCDM)委员会命名法(Council nomenclature，CD1至CD371)鉴定和命名的，以及如在未来的人白细胞分化抗原(Human Leucocyte Differentiation Antigen，HLDA)研讨会期间鉴定和商定的。单克隆抗体(mAb)：

免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitor，ICI)是单克隆抗体药物，其阻断由一些类型的免疫系统细胞(例如T细胞)和一些癌细胞产生的被称为检查点的蛋白质。这些检查点帮助阻止免疫应答过强，并且有时可以阻止T细胞杀伤癌细胞。当这些检查点被阻断时，T细胞可以更好地杀伤癌细胞。存在于T细胞或癌细胞上的检查点蛋白质的实例包括PD-1(抗体)/PD-L1/PD-L2(抗原)和CTLA-4(抗体)/CD80/CD86(抗原)。ICI用于治疗多种癌性疾病，包括；黑素瘤、肺癌、肾癌、肺癌、淋巴瘤和尿路上皮癌症。ICI(例如抗PD-1/PD-L1剂)阻止肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1之间的相互作用，允许免疫系统发起抗肿瘤应答。在本发明中，ICI的递送，并且特别是抗PD1或抗PD-L1/L2剂的递送代表了优选的实施方案。ICI中的优选药剂包括但不限于；伊匹单抗(ipilimumab)(CTLA-4)、纳武单抗(nivolumab)(PD-1)、派姆单抗(pembrolizumab)(PD-1)、阿特珠单抗(atezolizumab)(PD-L1)、阿维单抗(avelumab)(PD-L1)、度伐单抗(durvalumab)(PD-L1)和西米普利单抗(cemiplimab)(PD-1)。在一个实施方案中，至少一种ITA是选自纳武单抗(PD-1)、派姆单抗(PD-1)、阿特珠单抗(PD-L1)、阿维单抗(PD-L1)、度伐单抗(PD-L1)和西米普利单抗(PD-1)的组的免疫检查点抑制剂。

针对另一些靶标的mAb：

代表本发明优选实施方案的针对多种内部和外部靶标(抗原)的多种其他IO剂包括但不限于；阿仑单抗(Alemtuzumab)(CD52)、利妥昔单抗(Rituximab)(CD20)、托西莫单抗(Tositumomab)(CD20)、奥滨尤妥珠单抗(Obinotuzumab)(CD20)、奥法木单抗(Ofatumumab)(CD20)、替伊莫单抗(Ibritumomab)(CD20)、地努图希单抗(Dinutuximab)(GD2)、博纳吐单抗(Blinatumumab)(CD19/CD3)、达雷妥尤单抗(Daratumumab)(CD38)、伊沙妥昔单抗(Isatuximab)(CD38)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(SLAMF7)、西妥昔单抗(Cetuximab)(EGFR)、帕尼单抗(Panitumumab)(EGFR)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、卡妥索单抗(Catumaxomab)(Ep CAM)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HER2)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)(HER2)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-Rα)、贝伐珠单抗(Bevasizumab)(VEGF)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)(VEGF R2)、咪喹莫特(Imiquimod)(TLR7)、托珠单抗(Tocilizumab)(IL-R6)，

药物缀合mAb：

另一类IO剂由药物-抗体缀合物表示。这些代表本发明的优选实施方案，并且包括但不限于；帕克莫单抗(Moxetumumab pasudotox-tdfk)(CD22)、维汀-布仑妥昔单抗(Brentuximab vedotin)(CD30)、恩美曲妥珠单抗(Trastuzumab emtancin)(HER2)、奥加伊妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin)(CD22)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab ozogamicin)(CD33)、Tagraxofusp-erzs(CD123)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab vedotin-piiq)(CD79B)、恩诺单抗(Erfortumab vedotin-ejfv)(Nectin 4)、Traztuzumab deruxtcan(HER2)、戈沙妥珠单抗(Sasituzumab govitecan-hziy)(Trop 2)。细胞因子治疗：

细胞因子是由肿瘤内存在的许多类型的细胞产生的蛋白质，其通常利用它们以允许肿瘤生长并降低免疫应答。这些免疫调节作用允许它们被用作药物以激发免疫应答。

白介素-2和干扰素-α是细胞因子，是调节和协调免疫系统行为的蛋白质，并且代表本发明的一些实施方案。它们具有增强抗肿瘤活性的能力并因此可以用作被动癌症治疗。干扰素-α用于治疗毛细胞白血病、AIDS相关的卡波西肉瘤(AIDS-related Kaposi'ssarcoma)、滤泡性淋巴瘤、慢性髓性白血病和恶性黑素瘤。白介素-2是用于恶性黑素瘤和肾细胞癌的经批准治疗。

细胞治疗：

CAR-T和其他细胞免疫治疗的前提是修饰免疫细胞以识别癌细胞，以便更有效地靶向和破坏它们。例如，从患者收获T细胞，对其进行遗传改变以添加特异性识别癌细胞的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，然后将其输注回患者内以攻击他们的肿瘤。代表本发明一些优选实施方案的该类别中的药剂包括但不限于；普罗文奇(Sipuleucel-T)(Provenge)、司利弗明(Tisangenlecleucel)(Kymriah)和阿基仑赛(Axicabtagene cilloucel)(Yescarta)。

溶瘤病毒：

溶瘤病毒是优先感染癌细胞并在癌细胞中复制的病毒。当受感染的癌细胞被溶瘤作用破坏时，它们释放出新的感染性病毒颗粒或病毒粒子(virion)以帮助破坏剩余的肿瘤。认为溶瘤病毒不仅导致直接破坏肿瘤细胞，而且还刺激宿主的抗肿瘤免疫应答以用于长期免疫治疗。溶瘤病毒还可以用作载体以用于将转基因递送至癌细胞，使得转基因产物能够局部表达。这样的编码产物包括抗体片段、双特异性抗体、T细胞接合配体、分泌的免疫调节剂或其他IO。

许多病毒(包括腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、鸡新城疫病毒和牛痘)已被临床测试为溶瘤剂，并且数种正在临床开发中。T-Vec(Talimogene laherparepvec)是当前仅有的FDA批准的溶瘤病毒(用于治疗黑素瘤)。然而，许多其他溶瘤病毒正在II-III期开发中，包括但不限于；Ad2/5dl1520(Onyx-015)、GLV-1h68(GL-ONC1)和CV706。溶瘤病毒的使用代表了本发明的一个优选实施方案。

癌症疫苗：

治疗性癌症疫苗是治疗现存癌症的疫苗。存在于细胞表面的抗原是人体认为有害的物质。免疫系统攻击抗原并且在大多数情况下清除它们。这为免疫系统留下了帮助其在未来对抗那些抗原的“记忆”。癌症治疗疫苗提高了免疫系统发现和破坏抗原的能力。通常，癌细胞在其表面上具有健康细胞所没有的被称为癌症特异性抗原的某些分子。当疫苗将这些分子给予人时，所述分子充当抗原。它们告诉免疫系统找到并破坏在其表面上具有这些分子的癌细胞。

两种治疗性癌症疫苗当前正用于临床实践中；用于治疗早期膀胱癌的卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)和用于治疗前列腺癌的普罗文奇。此外在俄罗斯，被批准用于治疗膀胱癌。多种另外的疫苗当前正在临床开发中。癌症疫苗的使用代表了本发明的一个优选实施方案。

新兴IO：

抗CD47治疗：许多肿瘤细胞过表达CD47以逃脱宿主免疫系统的免疫监测。CD47与其受体信号调节蛋白α(signal regulatory protein alpha，SIRPα)结合并下调肿瘤细胞的吞噬作用。因此，抗CD47治疗旨在恢复肿瘤细胞的清除。另外，越来越多的证据支持使用肿瘤抗原特异性T细胞应答以响应抗CD47治疗。许多治疗正在开发中，包括抗CD47抗体、经改造诱饵受体、抗SIRPα抗体和双特异性药剂。抗CD47治疗的使用代表了本发明的一个优选实施方案。

抗GD2抗体：细胞表面上的碳水化合物抗原可以用作免疫治疗的靶标。GD2是存在于许多类型的癌细胞的表面上的神经节苷脂，所述癌细胞包括神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、脑肿瘤，骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和另外的软组织肉瘤。它通常不在正常组织的表面上表达，这使其是免疫治疗的良好靶标。抗GD2剂的使用代表了本发明的一个优选实施方案。

抗TIM3：最近的研究已经强调，TIM3具有在T细胞耗竭中发挥的重要作用并且与抗PD-1治疗的结局相关。靶向TIM3可能是用于癌症免疫治疗的有前景的方法。抗TIM3剂的使用代表了本发明的一个优选实施方案。

抗LAG3：LAG3是对T细胞功能具有多种生物学作用的ICI。LAG3在多种类型的肿瘤浸润淋巴细胞中高度表达并且参与肿瘤的免疫逃逸机制。因此，当前正在将LAG3作为肿瘤预后的指示剂以及作为靶向肿瘤治疗进行临床探索。抗LAG3剂的使用代表了本发明的一个优选实施方案。

通常来说，IO方案包括组合治疗，其中将一种或数种化学治疗剂与IO剂结合给予。本发明的一个优选实施方案是应用这样的组合方案。下面列出了优选化学治疗剂的列表。

烷化剂：

氮芥类：盐酸氮芥

亚硝基脲类：卡莫司汀(Carmustine)、链脲霉素(Streptozocin)、洛莫司汀(Lomustine)

四嗪类：达卡巴嗪(Dacarbazine)、替莫唑胺

(Temozolomide)

氮丙啶类：塞替派(Thiotepa)、丝裂霉素(Mitomycin)、吖丙啶苯醌(Aziridinylbenzoquinon)

顺铂类：顺铂、卡铂(Carboplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)

抗代谢物类

抗叶酸剂类：甲氨蝶呤(Methotrexate)、培美曲塞(Pemetrexed)

氟嘧啶类：氟尿嘧啶(Fluorouracil)、卡培他滨(Capecitabine)

脱氧核苷酸类似物类：阿糖胞苷(Cytarabine)、地西他滨(Decitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、吉西他滨(Gemcitabine)、氟达拉滨(Fludarabine)、奈拉滨(Nelarabine)、喷司他丁(Pentostatin)

硫嘌呤类：硫鸟嘌呤、巯嘌呤

抗微管剂：

长春花生物碱类：长春瑞滨(Vinorelbine)、长春新碱(Vinicristine)、长春地辛(Vindesine)、长春氟宁(Vinflunine)

紫杉烷类：紫杉醇或白蛋白紫杉醇(nab-Paclitaxel)、卡巴他赛(Cabazitaxel)、多西他赛(Docetaxel)

鬼臼毒素：依托泊苷(Etoposide)、替尼泊苷(Teniposide)

拓扑异构酶抑制剂类

拓扑异构酶I：伊立替康(Irinotecan)或脂质体伊立替康、拓扑替康(Topotecan)

拓扑异构酶II：多柔比星(Doxorubicine)或脂质体阿霉素、米托蒽醌(Mitoxantrone)、替尼泊苷、Nobiocin、美巴龙(Merbarone)、阿克拉霉素(Aclarubicin)

细胞毒性抗生素类

蒽环类抗生素：多柔比星、柔红霉素(Daunorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)、博来霉素(Bleomycin)、丝裂霉素

根据本发明的ITA除在肿瘤学中使用之外，另一主要使用领域是用于治疗自身免疫病，包括但不限于；银屑病、狼疮、类风湿关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、多发性硬化和斑秃。该类药剂还通常用于避免器官移植之后的排斥。根据本发明方法治疗的病理学病症优选为癌症或自身免疫病。

用于治疗自身免疫病的免疫治疗是快速发展的领域，并且靶向先前未探索抗原的药剂正持续进入临床前和临床开发。本发明的一个实施方案是靶向这样的所有和任何抗原的新的ITA的用途，所述抗原是根据人细胞分化分子(HCDM)委员会命名法(CD1至CD371)鉴定和命名，以及如在未来的人白细胞分化抗原(HLDA)研讨会期间鉴定和商定的。因此，在一个实施方案中，用于本发明方法的至少一种ITA选自具有靶向被命名为CD1至CD371的任何抗原的能力的ITA。

根据本发明用于治疗自身免疫病的优选ITA包括但不限于；

小分子抑制剂，例如泼尼松(prednisone)、布地奈德(budesonide)、泼尼松龙(prednisolone)、托法替尼(tofacitinib)、环孢菌素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、硫唑嘌呤、来氟米特(leflunomide)和霉酚酸酯(mycophenolate)。

单克隆抗体和另一些生物制剂，例如阿巴西普(abatacept)(CD80和CD86)、阿达木单抗(adalimumab)(TNFα)、阿那白滞素(anakinra)(IL-1)、赛妥珠单抗(certolizumab)(TNFα)、依那西普(etanercept)(TNFα)、戈利木单抗(golimumab)(TNFα)、英夫利昔单抗(infliximab)(TNF)、依奇珠单抗(ixekizumab)(IL17A)、那他珠单抗(natalizumab)(α4-整联蛋白)、利妥昔单抗(CD20)、苏金单抗(secukinumab)(IL17A)、托珠单抗(tocilizumab)(IL-6)、乌斯他珠单抗(ustekinumab)(IL-12和IL-23)、维多珠单抗(vedolizumab)(整联蛋白α4β7)、巴利昔单抗(basiliximab)(CD25)和达利珠单抗(daclizumab)(CD 25)。这些单克隆抗体和生物制剂代表了本发明的一个优选实施方案。

因此，在一个实施方案中，免疫治疗剂选自IO、单克隆抗体(mAb)、融合蛋白、可溶性细胞因子受体、重组细胞因子、小分子模拟物、细胞治疗、癌症疫苗和溶瘤病毒的组。

在另一个实施方案中，将一种或更多种ITA用于组合治疗，其中将一种或数种化学治疗剂与一种或更多种ITA结合给予。因此，将用一种或更多种免疫治疗剂的治疗与用一种或更多种化学治疗剂的治疗组合，例如用于治疗癌症，其中化学治疗剂选自烷化剂、抗代谢物、抗微管物、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类抗生素和细胞毒性抗生素的非限制性组。

在另一个实施方案中，免疫治疗剂的分子量大于15.000道尔顿(Dalton)，优选大于30.000道尔顿，更优选大于50.000道尔顿，并且最优选大于100.000道尔顿。在一些实施方案中，免疫治疗剂的分子量高至1500道尔顿。

本发明使用的组合物和治疗方法可用于自身免疫病或癌症，或炎症部位(例如关节)。在一个实施方案中，组合物和使用/治疗方法用于治疗癌症，例如局部病理学病变(例如实体癌)或转移性癌症，例如以下中的任何：黑素瘤、肉瘤、前列腺癌、结肠癌、肛门癌、食道癌、胃癌、直肠癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、脑癌、胆管癌、头颈癌、淋巴瘤、尿路上皮癌、肾上腺皮质癌、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、甲状旁腺癌、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、膀胱癌、阴茎癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、腹膜癌、阴道癌和外阴癌。

在一个实施方案中，组合物和使用/治疗方法用于治疗自身免疫病，例如银屑病、狼疮、类风湿关节炎、克罗恩病、多发性硬化和斑秃中的任何。

在一个实施方案中，将胰腺癌，例如胰腺导管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDAC)排除在待通过本发明方法治疗的病理学病症之外。

在另一个实施方案中，组合物和使用/治疗方法用于在器官移植之后的治疗。

在一个实施方案中，将以下单克隆抗体中的任一者排除在本发明的用途和方法之外：贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗、依匹单抗、奥法木单抗、奥美珠单抗(Ocrelizumab)、帕尼单抗(Panitumab)、利妥昔单抗。

在一个实施方案中，将治疗剂配制在载剂中，例如包含在用作治疗剂的载剂的脂质体、缀合物、纳米粒或微球的形式中。因此，治疗剂可以是较大药物构建体(例如纳米药物，例如在脂质体或颗粒制剂中，或作为单克隆抗体)的一部分。因此，在一个实施方案中，将治疗剂配制在封闭的脂质球中(例如将治疗剂包含在脂质体制剂中)或配制在聚合物胶束中。

如由实施例3和4所表明，ACT概念特别可用于与较大药物分子或构建体的组合。

此外，优选一种或数种化学治疗剂与一种或数种免疫治疗剂之间的组合方案。此外，本发明涵盖了包含具有单一脂质体的两种抗癌药物的新一代脂质体，以及涵盖了包含与脂质体缀合的抗体的免疫脂质体。

在第二个优选实施方案中，治疗剂选自免疫治疗剂的组，免疫治疗剂例如溶瘤病毒，其包括但不限于腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、鸡新城疫病毒和牛痘。这些病毒可以导致癌细胞“破裂”，杀伤癌细胞并释放癌症抗原。然后这些抗原可以刺激免疫应答，可以找出并消除附近以及身体中可能其他任何地方的任何剩余肿瘤细胞。

在另一个实施方案中，将数种治疗剂(包含至少一种ITA)作为组合方案施用。合适的组合方案的实例包括但不限于：

1)所述组合方案包括派姆单抗，随后是紫杉醇和卡铂，以及

2)所述组合方案包括纳武单抗，随后是伊匹单抗。

因此，在所述方法的一个实施方案中，ITA选自单克隆抗体抗PD1、抗PDL1或CTLA4的组，并且与化学治疗剂组合使用，例如化学治疗派姆单抗与顺铂组合加奥沙利铂或卡培他滨。

否定声明：在一个实施方案中，化学治疗剂不是紫杉醇，即作为游离的非白蛋白结合形式。在一个实施方案中，治疗剂不是吉西他滨与白蛋白紫杉醇的组合。

否定声明：在一个实施方案中，待治疗疾病不是胰腺癌。

否定声明：在一个实施方案中，免疫治疗剂不靶向CTLA-4、CD-20、VEGF或EGF。

施用途径：

将簇组合物经肠胃外，优选静脉内施用于所述哺乳动物对象。施用途径还可以选自动脉内、肌内、腹膜内、肿瘤内或皮下施用。对于向对象的施用，将治疗剂作为单独组合物在簇组合物之前和/或与簇组合物共同和/或在簇组合物之后单独地施用。根据各自的批准的产品特征概要施用治疗剂。通常来说，所述途径选自包括但不限于静脉内、腹膜内、肿瘤内和肌内施用的组。因此，两种组合物，即簇组合物(a)和治疗剂组合物(b)可以通过相同或通过不同施用途径施用。

治疗计划：

应当理解，本发明的所使用组合物、用于治疗的方法和/或用于药物递送的方法可以例如用作多种药物治疗方案的一部分。在本发明的一个实施方案中，这包括使用多于一种治疗剂。这样的化学治疗组合方案可以包括例如紫杉醇和顺铂，加之至少一种ITA，例如派姆单抗。

申请人已出乎意料地发现，靶组织(例如肿瘤)中的灌注模式可能在短时间范围上变化。美国成像研究已表明，在同一对象和靶目的区域内，活化的泡的沉积模式因注射而显著变化，这可能是由于灌注模式中的时间变化。如果对靶组织区域多次治疗以增强整个组织体积内的外渗，则该变化指向治疗益处。此外，在许多情况下，治疗方案包括在方案中在不同时间点处施用数种治疗剂。这还指向数次进行ACT治疗以提供所有药剂的增强外渗的益处。

因此，在一个实施方案中，可以在施用治疗剂期间进行数次ACT治疗，例如如图11和图12所例示。在一个实施方案中，治疗方法包括1至5次，例如2至4次ACT治疗。“ACT治疗”或“ACT操作”包括至少施用簇组合物，通过常规医学成像US声波作用来激活簇，以及随后的低频US声波作用以诱导增强的摄取，即如在方法步骤ii)、iii)和iv)中所述。图11和图12提供了治疗计划的实例，其中使用了纳武单抗与伊匹单抗的组合，和派姆单抗随后是紫杉醇和卡铂。如本文所公开的可能地与化学治疗剂组合的其他ITA也可以与一种或更多种ACT治疗一起使用。

图11提供了在用组合方案治疗期间进行的根据本发明应用的可能ACT治疗的图，所述组合方案包括：30分钟输注纳武单抗，随后90分钟输注伊匹单抗。将ACT操作在施用期间应用三次，如灰色声孔效应条(sonoporation bar)所指示。

图11的图A：每个ACT操作由以下组成：

·a.：将簇组合物注射，

·b.：用60秒常规医学成像超声声波作用活化簇，以及

·c.：使用在0.1至0.3的MI下5分钟的400至600kHz的超声声波作用的增强步骤。

图11的图B：y轴以峰百分比示出所施用治疗剂的血浆浓度，以及x轴以分钟示出时间。在该实施例中，在约30分钟、80分钟和120分钟时进行三次ACT操作以覆盖两种药物并提供对整个目的区域的治疗。

图12提供了在用组合方案治疗期间进行的可能ACT治疗的图，所述组合方案包括标准护理组合免疫治疗加用于治疗转移性鳞状非小细胞肺癌的化学治疗方案；派姆单抗，随后是紫杉醇和卡铂。

图12的图A：如在图11中示出的ACT操作。图12的图B：y轴以峰百分比示出所施用治疗剂的血浆浓度，以及x轴以分钟示出时间。在该实施例中，在约160分钟、200分钟和240分钟时进行三次ACT操作以覆盖全部三种药物并提供对整个目的区域的治疗。

本发明人已发现，多次重复ACT操作是有益的，甚至当施用单一治疗剂时也是如此。在激活ACT期间使用US成像，本发明人已观察到ACT泡在肿瘤中沉积的显著作用。观察到在相同动物中沉积模式因注射而强烈变化；沉积的ACT泡的密度在肿瘤的不同区段之间相异，并且该模式在注射之间改变。尽管尚未完全阐明，但假设这些作用是由于对不同肿瘤区段灌注的时间变化。基于这些观察，为达到尽可能大的肿瘤体积，在实施例中，本发明人已连续三次紧接着应用ACT操作。这还表明了在临床使用期间应用数种ACT操作的益处，如以上在图11和12中所示方案所指出。

因此，在一个实施方案中，在一定时间跨度内(例如在长至3小时内)将多于一种治疗剂(例如1至5种治疗剂)同时或依次地施用，其中在同一时间段期间进行至少一种(例如1至5种)ACT治疗(ACT操作)。

在一个实施方案中，提供了ACT操作，包括以下步骤：

施用(例如静脉内施用)簇组合物，随后用常规医学成像US对目的组织区域进行局部US声波作用(激活)，随后是低频US声波作用以诱导药物或活化免疫细胞的增强外渗。将这些步骤进行连续2至5次，例如连续3次。因此，将步骤(ii)至(iv)重复一至四次。将这些步骤与一种或更多种治疗剂(包括至少一种ITA)的施用结合进行。激活(即初始US声波作用)应在每次施用簇组合物之前或之后立即开始(例如在20秒内)，并持续例如30至120秒。用低频超声的声波作用是在激活步骤之后，并且通常应持续3至10分钟，例如约5分钟。优选在步骤(iii)之后立即开始步骤(iv)。双频换能器可以有益地用于治疗中，用于激活步骤和增强步骤二者。通过使用这样的，可以在没有任何延迟的情况下进行从步骤(iii)中激活声波作用至步骤(iv)中增强声波作用的转换。在激活之后立即施加增强场对于所产生治疗益处可能是重要的。在该方面中，使用宽带或双频US换能器来施加活化和增强声波作用将是有益的。即，能够在所述优选范围所需的所有频率下提供足够的US压力(即MI)的换能器。例如能够在1至10MHz下和在0.1至1MHz下二者，更优选0.4至0.6MHz下，提供高至0.4的MI的换能器。

此外，同时或间歇地施加激活和增强声波作用场可能是有益的，例如使用能够同时发射两个场或在短时间序列中发射两个场的换能器(例如，1秒的激活场随后是一秒的增强场，随后是一秒激活场等)。

在另一个实施方案中，多药物方案包括抗PD1、抗PDL1或CTLA4单克隆抗体和化学治疗剂，例如派姆单抗+顺铂加奥沙利铂或卡培他滨。因此，可以使用数种治疗药物，并且在治疗方案期间可以应用数种ACT操作。在一个优选实施方案中，当活性治疗分子在施用后在血液中显示出最大或接近最大浓度时进行ACT操作。因此，ACT治疗的时间可能根据治疗剂的药代动力学而变化。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于将治疗剂递送至靶组织，特别是递送至被诊断患有癌症或自身免疫病的对象。所使用的组合物和使用ACT技术的组合物提供了治疗剂的位点特异性递送，以达到治疗剂的有效局部浓度，并且还提供了在目的区域对该治疗剂和活化免疫细胞的改善的摄取。

因此，本发明还提供了微泡/微滴簇组合物用于将至少一种ITA局部递送至对象的方法，其中该方法包括以下步骤：

(i)向对象施用至少一种ITA；

(ii)向对象施用簇组合物；

其中至少一种治疗剂是在簇组合物之前、和/或与簇组合物共同和/或在簇组合物之后施用的；

(iii)通过以1至10MHz的第一频率和0.1至0.4的第一机械指数对所述对象内的目的区域进行超声声波作用，激活来自步骤(i)的簇组合物的微滴的可扩散组分的相转变；

(iv)进一步以第二频率为0.4至0.6MHz和第二机械指数为0.1至0.3的超声进行声波作用。

同样地，本发明提供了将至少一种ITA递送至哺乳动物对象的方法，其包括以下步骤：

(i)向对象施用至少一种ITA；

(ii)向对象施用微泡/微滴簇组合物；

其中至少一种ITA是在簇组合物之前、和/或与簇组合物共同和/或在簇组合物之后施用的；

(iv)进一步以第二频率为0.4至0.6Hz和第二机械指数为0.1至0.3的超声进行声波作用。

同样，对于应用的该组合物和用于递送至少一种ITA的方法，该方法的步骤可包括步骤(iib)，任选地使用超声成像对簇进行成像，以识别所述对象内待治疗的目的区域。

该用途和方法有助于增强之前、和/或共同、和/或之后单独施用的ITA的外渗和摄取，和/或活化免疫细胞对靶病变的增强浸润。在该方法中，治疗剂在簇组合物之前、和/或与簇组合物共同和/或在簇组合物之后施用，并且在步骤ii)至iv)之前或步骤ii)至iv)中的任何一个之后。

在一些实施方案中，仅向对象施用簇组合物而不施用治疗剂，用于随后施用治疗剂的对象的准备。在这样的实施方案中，簇组合物的施用是这样的，使得施用不是治疗而是治疗的准备，例如用ITA治疗的准备。

本发明的应用的方法和组合物可伴随诊断成像，例如通过进行超声成像，包括使用簇的微泡作为造影剂，如上所述，但也可与其他类型的成像研究组合，通常以诊断和/或评估治疗结果。这样的成像可以包括腹部计算机断层扫描(computed tomography，CT)，例如作为识别靶病变的初始测试，或者腹部磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、腹部超声检查(ultrasonography，US)、和内窥镜超声(endoscopic ultrasound，EUS)。

本发明不应限于所示的实施方案和实施例。尽管本文中描述了本公开内容的多个实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的实施方案仅通过实施例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，对本文中所述的实施方案的许多修改和改变以及变化和替换对于本领域技术人员来说将是显而易见的。应当理解，在实践本公开内容中可以采用本文中所述的实施方案的多个替代实施方案。

应当理解，针对一个方面所公开的每个实施方案同样良好适用于另一些方面。因此，例如，针对在治疗中应用的组合物所公开的特征也适用于局部递送的方法以及提高活化免疫细胞的摄取和活化免疫细胞增强浸润的方法。

应当理解，本公开内容的每个实施方案可以任选地与本文中所述的其他实施方案的任何一个或更多个组合。

应当理解，本文中所公开的每种组分、化合物、或参数应被解释为单独使用或与本文中所公开的每个和每种其他组分、化合物或参数中的一种或更多种组合使用。还应当理解，本文中所公开的每种组分、化合物或参数的每个量/值或量/值的范围应被解释为还与本文中所公开的任何其他组分、化合物或参数的每个量/值或量/值的范围组合来公开，并且出于本说明书的目的，本文中所公开的两种或更多种组分、化合物或参数的量/值或量/值的范围任何组合因此也彼此组合来公开。本文中所述的任何和所有特征，以及这样的特征的组合都包括在本发明的范围内，前提是所述特征不是相互不一致的。

应当理解，对于相同的组分、化合物或参数，本文中公开的每个范围的各自下限应被解释为与本文中公开的每个范围的各自上限组合。因此，两个范围的公开内容将被解释为通过将每个范围的各自下限与每个范围的各自上限组合而推导出的四个范围的公开内容。三个范围的公开内容将被解释为通过将每个范围的各自下限与每个范围的各自上限等组合而推导出的九个范围的公开内容。此外，说明书或实施例中公开的组分、化合物或参数的具体量/值应被解释为范围的下限或上限的公开内容，并且因此可以与本申请中其他地方所公开的相同组分、化合物或参数的任何其他下限或上限或范围或特定量/值组合，以形成该组分、化合物或参数的范围。

在一个方面(例如针对涉及在治疗中应用的组合物的方面)的上下文中描述的实施方案和特征，也适用于本发明的涉及用于递送或用于治疗或递送的方法的其他方面。

以下实施例是根据本发明的原理来提供的以举例说明本发明，但不应被解释为以任何方式进行限制。

实施例

实施例1.簇制备、分析工具和基本特征

参考了申请人的申请WO2015/047103，并且特别是其实施例1和2，其内容在本文中通过引用进行了总结，提供了用于表征簇组合物的分析方法、使用簇的结果等的描述。

在下文中，第一组分被命名为C1，第二组分被命名为C2，并且簇组合物(即由第一组分和第二组分的组合产生的组合物)被命名为DP(drug product，药物制品)。在组合C1和C2时形成的微泡/微滴簇(即存在于DP中)对组合物的关键质量属性是至关重要的，即其用于药物的递送的功能。因此，关于浓度和尺寸表征和控制所形成的簇的分析方法是评估本发明以及药物质量控制(Quality Control，QC)的必要工具。我们已经确定了三种不同的分析工具，可以用于这一目的；Coulter计数、流动粒子图像分析(Flow Particle ImageAnalysis，FPIA)和显微术/图像分析。

除了这些应用于表征簇组合物中的簇的技术外，还开发了分析方法来研究簇的体外激活，即在超声辐照下产生大的活化的泡。这种方法；“Sonometry”在WO2015/047103的E1至6中进行了详细说明。来自Sonometry分析的主要报告响应是衰减谱和活化的泡的数量和体积及其尺寸分布，二者与激活之后的时间。激活响应也可以通过显微术/图像分析来探索，如WO2015/047103的E1至5中详细说明的。

组分和组合物：

在所包括的实施例中研究的组合物中的第一组分(C1)由全氟丁烷(per-fluorobutane，PFB)微泡组成，所述微泡由氢化卵磷脂酰丝氨酸钠(hydrogenated eggphosphatidyl serine-sodium，HEPS-Na)膜稳定并包埋在冻干蔗糖中。HEPS-Na携带带负电荷的头基，其中随后的微泡带负表面电荷。每小瓶C1含有约16μL或2 10⁹个微泡，平均直径约为2.0μm。冷冻干燥制剂在室温下储存时显示出较长的保质期，更具体是3年。

本实施例中研究的组合物中的第二组分(C2)由全氟甲基环戊烷(perfluoromethyl-cyclopentane，pFMCP)微滴组成，所述微滴由1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)膜稳定，并添加3％mol/mol硬脂胺(SA)以提供正表面电荷。将C2中的微滴分散在5mM TRIS缓冲液中。这些研究中研究的C2标准制剂含有约4μL或0.8 10⁹个微滴/mL，平均直径约为1.8μm。第二组分在冷藏储存时显示出较长的保质期，更具体的是18个月或更长时间。

在一些情况下，为了阐明对簇特征的作用，以受控制的方法改变了多个制剂变量，如SA含量、微滴尺寸、微滴浓度、TRIS浓度和pH。在使用了这样的样品的情况下，这些方面在文本中进行了详细说明。

簇组合物(DP)是通过用以下重构小瓶C1无菌制备的，2mL C2随后手动均质化30秒。使用无菌一次性注射器和针头从C2小瓶中取出2mL。通过C1小瓶的塞子添加注射器的内容物，并将所得DP均质化，制备用于施用的组合物。所制备的簇组合物在本文中也称为PS101。

如WO2015/047103所示，第一组分和第二组分，即微泡制剂和微滴制剂可以变化。例如，如WO2015/047103的表9和表10所示，可以改变第一组分的气体和稳定膜二者，以制备具有合适特性的簇，预期可用于根据本发明的治疗。

分析期间簇组合物中簇的稳定性：

DP中的簇是通过微泡和微滴之间的静电吸引所形成的并结合在一起。这些力是有限的，并且簇在形成之后可通过多种途径/影响(例如机械应力或热(Brownian)运动)而破裂。为了精确和准确地表征，在分析的时间期间簇保持稳定是重要的。这种稳定性已经用上述所有方法进行了研究。为了评价稳定性，在单个DP样品上重复3至5次分析，覆盖时间跨度＞5分钟。在这些重复中，没有观察到浓度和尺寸的显著变化，证明微泡、微滴和簇在规定的分析条件下(即在PBS或水中稀释之后，以及在连续均质化(搅拌)下)稳定持续＞5分钟。

制剂方面：

可以探索许多不同的制剂方面，以控制DP中的簇含量和尺寸，并以针对所靶向的最佳特性。可用于设计簇含量和尺寸分布的参数包括但不限于：微泡和微滴之间表面电荷的差异例如SA％；C2的微滴尺寸；pH；C2中TRIS的浓度；以及微泡和微滴的浓度。另外，组分的化学降解，例如在高温下长时间储存期间，可影响C1和C2在DP制备期间形成簇的能力。

从WO2015/047103中报道的30种不同组合物的体外表征中，可以提取出阐明系统性质和特征的数个重要相关性。我们发现，形成的簇的尺寸也与系统的反应性强相关。在相对较低的反应性水平(例如＜20％)下，仅形成小簇(即1至5μm)和中等尺寸的簇(即5至10μm)。随着反应性的提高，更大的簇开始形成；在R＞约20％时，10至20μm的簇开始形成，而在R＞约50％时，20至40μm的簇开始形成。当形成较大的簇时，其以较小的和中等尺寸的簇为代价；我们发现簇浓度为1至5μm和5至10μm时，含量与反应性明显最佳。我们发现，较大簇(即大于10μm或大于20μm)的形成对组合物的效力是有害的，并且必须相应地平衡簇的潜力。

基于申请人的实验以及WO2015/047103的表5和表6中所示的结果，簇组合物的效力(灰度单位(Grey Scale，GS)的线性增强)与簇平均尺寸和簇的浓度(百万/ml)相关。灰度增强是在体内施用和激活簇组合物之后，通过US成像观察到的亮度(对比度)的提高，并且是成像组织中活化的泡的量的量度。其报告的结果来自在i.v.施用簇组合物和在左心室中激活时，不同尺寸类别的簇对来自犬心肌的超声信号中的线性增强的贡献(灰度单位)的多变量主成分分析(principal component analysis，PCA)，请参见WO2015/047103的实施例2。对30个样品的数据进行PCA，详见其表5和表6。结果表明，较小的和中等尺寸的簇(＜10μm)对簇组合物的效力有显著贡献，而较大的簇(＞10μm)则没有。这些结果和结论也适用于本发明。PCA分析的结果如下表1所示。图1示出了基于表1中数据的簇尺寸与产品效力的可视化，表明平均直径在3至10μm范围内的簇具有最佳效力。因此，在图1中提供了产品效力与簇直径。Y轴示出了在注射和激活左心室中的簇之后犬心肌的US成像的灰度增强的相关系数，并反映了沉积的活化的泡的量。x轴示出簇的直径，单位为μm。灰色框表示评价的不同簇尺寸的区块(bin)：1至5μm、5至10μm、10至20μm和20至40μm。实线表示效力与簇直径的连续函数。误差棒为标准误差。图1是WO2015/047103的图12(左侧)的替代可视化。可以观察到，平均簇直径应在3至10μm的范围内，并且优选4至9μm，更优选5至7μm。

表1：WO2015/047103中报告的簇的效力与平均直径。

对根据实施例1制备的簇组合物的簇浓度和平均直径进行分析，并发现簇浓度约为4000至4400万/mL，并且簇平均直径约为5.8至6.2μm，持续数小时。结果如下表2所示，并且与WO2015/047103的表6的结果一致。表2的数据表明，制备的簇组合物具有可接受的稳定性，并且能够实现簇的最佳尺寸和浓度。

表2：制备簇组合物之后不同时间点处的簇浓度和平均直径。

应用本发明的概念，即通过在施用前由C1和C2制备簇组合物，从而形成微泡/微滴簇，而不是如WO/9953963所教导的两种组分的共注射，能够提高效力＞10倍。在第一组分和第二组分组合时形成微泡/微滴簇，并施用这些预制簇，是其体内预期功能的先决条件。簇组合物将在簇的特性基本不变的时间窗期间施用于对象，例如从组合两种组分之后的3小时内。

实施例2.用于增强步骤的频率和机械指数。

如前所述，在激活大的ACT泡之后施加进一步的US声波作用，即增强步骤，导致药物从血管腔隙至靶组织间质外渗的提高，以及活化的免疫细胞浸润的提高。

然而，该增强场关于频率和MI的属性可能会强烈影响操作的效力。为了诱导渗透性的提高，需要一定的最低水平的生物力学作用，但如果过强，惯性空化机制可能会诱导随后的血管损伤和效力降低。

泡振荡的水平将取决于数个参数，最重要的是US频率和压力，后者由机械指数(MI)定义。为了研究频率和MI对诱导的泡振荡性质和ACT操作效力的影响，已经进行了5项研究：

·测量了活化的泡群体的衰减谱。

·使用改进的Rayleigh Plesset模型[Postema and Schmitz,Ultrasonicbubbles in medicine:influence of the shell,Ultrason Sonochem,2007.14(4):p.438-44]，针对一系列频率和MI对增强步骤期间诱导的静止直径为20μm的典型活化的泡的径向振荡进行了建模。

·在增强步骤的US频率为0.5MHz的情况下，药物模拟发色团(伊文思蓝(EvansBlue))的组织摄取已被探索为MI的函数。对于这项研究，使用改进的Rayleigh-Plesset模型对泡振荡进行了建模。

·在0.5和0.9MHz下在增强MI均为0.2的情况下，探索了用nab-紫杉醇±ACT治疗小鼠中的前列腺癌的治疗效力。

·在0.1和0.2的MI下在增强频率为0.5MHz下，探索了用nab-紫杉醇±ACT治疗小鼠中的乳腺癌的治疗效力。

材料和方法：

所研究的簇组合物是如在实施例1中详细说明的。

如WO2015/047103的E1至6详细说明的，通过Sonometry测量活化的泡群体的衰减谱。

通过在MATLAB 2020b(MathWorks，Natick，MA，USA)中求解偏微分修正的RayleighPlesset方程，对作为频率和MI函数的泡振荡进行建模。具体地，使用可忽略的壳体刚度和C4F10气体特性在血液中模拟直径为20μm的泡。使用具有3个周期的开始和结束高斯斜坡的正弦波来模拟线性超声脉冲。

为了研究US增强场的MI变化的作用，在小鼠皮下前列腺癌模型(PC3)中研究了伊文思蓝(Evans Blue，EB，荧光染料)的肿瘤特异性摄取。研究了增强声波作用MI为0、0.1、0.2、0.3和0.4的5组，每组N＝3只动物。在EB的i.v.注射之后，立即给予单剂量的簇组合物(2mL/kg，(i.v.))，随后给予45秒的激活US(2.25MHz，MI 0.4)和5分钟的增强US(0.5MHz，可变MI)，聚焦于肿瘤体积。处理之后30分钟，切除肿瘤，并通过分光光度法在620nm处测量EB的量。

在皮下前列腺癌模型(PC3)中研究了具有2mL簇分散体/kg的nab-紫杉醇(ABR)±ACT在小鼠中用于治疗人前列腺癌的治疗作用。每周施用ABR(12mg/kg，i.v.)持续4周，每次随后立即进行三次连续的ACT操作。每组N＝9至12只动物。另外，进行了生理盐水对照组(N＝4)。激活US由2.5MHz，MI＝0.4下45秒的声波作用组成，而增强US由0.5或0.9MHz下的5分钟声波作用组成，二者的MI均为0.2。终点是总存活。当肿瘤达到1000mm³的最大体积时，处死动物。

在皮下乳腺癌模型(Ca-MDA-MB231)中研究了具有2mL簇分散体/kg的nab-紫杉醇(ABR)±ACT在小鼠中用于治疗人乳腺癌的治疗作用。每周施用ABR(12mg/kg，i.v.)持续4周，每次随后立即在MI为0.1或0.2下立即进行三次连续的ACT操作。另外，研究了单独药物组。每组N＝9至12只动物。激活US由8MHz，MI＝0.33下45秒的声波作用组成，而增强US由0.5MHz，MI为0.1或0.2下5分钟的声波作用组成。终点是用卡尺测量肿瘤体积(每天)，通过处理第一天的肿瘤体积进行归一化。当肿瘤达到1000mm³的最大体积时，处死动物。

结果：

活化的泡的衰减谱。

测量了典型激活ACT泡群体的衰减谱，并且结果如图2所示。可以注意到，共振频率被确定为约0.3MHz。本质上，衰减谱描述了泡群体和入射US场之间的耦合；在共振频率或接近共振频率时，泡在衰减方面最有效，因此，在将入射US能量转换为体积振荡和生物力学作用方面最有效。值得注意的是，谱表明，泡对约0.15MHz到0.6MHz范围外的频率的响应非常有限。然而，这是泡分散在一个几乎无限的矩阵中时的情况，而不是当泡滞留在微血管中时的情况。在这种情况下，与血管壁的接触将抑制泡响应，并使衰减谱向上移动，这取决于血管的直径和弹性。很难提供这样的减弱作用的精确建模，然而，基于经验，共振频率移动至约0.5MHz是合理的估计。因此，ACT泡之间的最佳耦合，以及随后的生物力学作用的最佳产生，预计将发生在约0.4至0.6MHz。这随后表示本发明下增强步骤的优选频率范围。

泡振荡作为频率和MI函数的建模。

在MI为0.1、0.2、0.3和0.4时，对300、400、600和900kHz的泡振荡进行建模如图3所示。强烈的振荡是诱导生物力学作用提高的证据。然而，尖锐的锯齿波响应(sawtoothresponse)表示非线性和/或惯性空化行为的开始。可以注意到，在900kHz下，对于所有MI，径向振荡都很小。与上述衰减谱的预测一致，并且可能太过有限而无法诱导产生显著治疗作用所需的必要生物力学作用。另一方面，对于300kHz，即使对于低MI，径向振荡也是非常强和非线性的，可能导致一定水平的惯性空化并诱导血管损伤。然而，对于400至600kHz的频率，径向振荡似乎满足诱导足够的生物力学功以诱导治疗作用的要求，同时避免过多的非线性行为和血管损伤。

伊文思蓝的组织摄取和泡振荡作为MI的函数。

结果示出在图4中。可以注意到，组织摄取从无US(MI＝0)至MI＝0.1时提高，并且在MI＝0.2时进一步增加，但是随后在MI＝0.3时再次下降，并且在M＝0.4时进一步下降。在MI为0.2时，与MI＝0(无超声)时相比，观察到肿瘤特异性摄取提高了近60％。同时，从嵌入泡振荡组来看，最大径向振荡从MI＝0.1时的约3μm提高至MI＝0.2时的约6μm，再到MI＝0.3时的约10μm，在MI＝0.4时增加至超过20μm。重要地，随后组织摄取减少的开始(从MI＝0.2至MI＝0.3)与显著非线性行为的开始同时发生，其中惯性空化开始发生。

nab紫杉醇±ACT用于治疗前列腺癌的治疗作用——增强步骤期间US频率的作用

示出总存活与时间的结果示出在图5中。可以注意到，对于ACT(0.5MHz组)，100％的动物存活到研究结束，其中80％的动物处于稳定、完全缓解(即无癌症)中。虽然ACT(0.9MHz)组与单独药物相比也显示出治疗益处，但作用明显不如ACT(0.5MHz)。在0.9MHz的情况下，大多数肿瘤开始重新生长，仅25％的肿瘤处于稳定、完全缓解中，并且研究结束时存活率为57％。这些结果表明，需要一定的、最小的径向振荡来诱导最佳的治疗作用。

作为本研究的初步调查，为了评价是否可以应用更高的MI，还在0.9MHz下测试了0.40的MI。然而，在该MI下，观察到浅表大出血的明显证据。

nab紫杉醇±ACT治疗乳腺癌的治疗作用——增强步骤期间MI的作用

显示肿瘤生长率与时间的结果示出在图6中。可以注意到，对于ACT(MI 0.1)组，观察到肿瘤生长率的轻微而不显著的降低，在第31天，与单独药物相比，肿瘤生长抑制为仅8％。然而，对于ACT(MI 0.2)组，观察到肿瘤生长率显著下降，在第31天，与单独药物相比，肿瘤生长抑制率为52％。同样，这些结果表明，需要一定的、最小的径向振荡来诱导治疗益处。

结论：

基于这些实施例中产生的结果，已经表明ACT概念的功能对增强步骤期间应用的频率和MI的变化非常敏感。基于这些研究，得出的结论是，优选的频率范围为0.4至0.6MHz，与所应用的0.1至0.3的MI组合。在增强步骤期间应用较低的频率和较高的MI的情况下，令人惊讶的是，已经表明所诱导的活化的泡振荡太强，导致显著的效力损失和血管损伤。另一方面，在较高的频率和较低的MI的情况下，所诱导的泡振荡太小，导致缺乏足够的生物力学作用，并从而导致治疗效力的显著损失。

实施例3.肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)的皮下小鼠模型中的治疗作用-用呼肠孤病毒±声束治疗的癌症免疫治疗。

本实施例报道了ACT与溶瘤病毒组合用于治疗HCC的作用。

溶瘤病毒是一种使用病毒感染并破坏癌细胞的癌症免疫治疗。病毒是感染或进入我们的细胞的颗粒，并随后使用细胞的遗传机制复制它们自身并随后传播至周围未感染的细胞。最近，病毒被用来靶向和攻击已经形成的肿瘤。这些病毒被称为溶瘤病毒，并且它们代表了一种有前景的治疗癌症的方法。癌细胞通常具有受损的抗病毒防御，这使它们容易受到感染。在感染之后，这些溶瘤病毒能够导致癌细胞“破裂”，杀伤癌细胞并释放癌症抗原。然后，这些抗原能够刺激免疫应答，其寻找并消除附近和身体可能其他任何地方的任何残留肿瘤细胞。

来自呼肠孤病毒家族(呼肠孤病毒)的病毒已被广泛探索用于治疗癌症(NCT01280058，NCT02620423，NCT03723915)，具有明确的证据或治疗益处。然而，可降低呼肠孤病毒效力的因素是癌细胞的摄取有限。在这方面，可以设想，将ACT与病毒治疗组合可以强烈提高病毒摄取，并且从而导致治疗效力的提高。

材料和方法：

研究了声束治疗(ACT)和根据本发明应用的组合物(称为ACT)与溶瘤呼肠孤病毒组合的治疗作用水平。

所研究的簇组合物是如在实施例1中详细说明的。簇组合物以2mL/kg静脉内施用，并随后用45秒的US激活场(2.7MHz，MI 0.3)对肿瘤进行局部超声(US)声波作用，然后用5分钟的US增强场(500kHz，MI 0.2)。该操作在每个处理日施用呼肠孤病毒之后立即连续进行3次。

通过在balb/C小鼠中皮下注射植入HCC肿瘤异种移植物。将1×10⁷个癌细胞注射在胁腹中，并允许其自由生长约21天，然后加入研究。将小鼠(每组N＝5)用单独的呼肠孤病毒处理或与ACT组合处理。另外，对磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline，PBS)对照组进行了研究。将病毒在第0、5、7、10、14和16天施用6次。在ACT治疗之前立即静脉内注射1×10⁷个噬斑形成单位(Plaque Forming Unit，PFU)/天的剂量。在研究期间(25天)，通过卡尺测量，每周对动物进行两次体重和肿瘤尺寸(体积)监测。

结果

平均肿瘤体积和平均值标准误差(standard error of the mean，SEM)的结果见下表3，并示出于图8中。

表3.处理组的平均肿瘤体积和平均值标准误差(SEM)与时间的结果如详细所示。

图8提供了ACT与溶瘤呼肠孤病毒组合治疗肝细胞癌的治疗效力。Y轴显示肿瘤体积，单位为mm³。X轴显示从研究开始的时间(天)。x轴下方的灰色三角形表示处理天数。处理组为：生理盐水对照(倒三角形)、溶瘤呼肠孤病毒生理盐水(填充正方形)和溶瘤呼肠孤病毒与ACT(填充圆形)。

如能够从表3所示和图8所示的结果中观察到的，当与PBS对照组相比时，在所研究的剂量下，用单独的呼肠孤病毒处理对肿瘤生长没有显示出显著的抑制。然而，当将相同剂量的病毒与ACT治疗组合时，观察到明显且显著的肿瘤抑制，与单独的病毒相比，在第25天的肿瘤体积降低了＞95％。在第25天，使用95％置信区间的双尾ANOVA检验(使用Dunns多重比较校正的非参数Kruskal-Wallis检验)计算p值至p＝0.037。结论：

因此，该研究确认了当将免疫治疗处理(例如呼肠孤病毒)与根据本发明的ACT组合时具有强的协同作用。用其他类型的免疫治疗剂治疗其他疾病(例如癌症和自身免疫病)预期产生类似的协同作用。

实施例4.纳米药物穿过血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)的递送。

本实施例研究了ACT递送大的纳米构建体穿过BBB的能力，施加了根据本发明的US场。

材料和方法：

所研究的ACT簇组成物是如实施例1中详细说明的。

所研究的纳米粒是来自Cristal Therapeutics(Maastricht,The Netherlands)的核心交联聚合物胶束(core-crosslinked polymeric micelle，CCPM)。这些CCPM直径为70nm，出于成像目的用罗丹明(rhodamine)B Cy7标记，并且制剂含有44mg/ml聚合物和40nmol/ml Cy7。

使用近红外荧光(near infrared fluorescence，NIRF)成像对健康小鼠脑中CCPM的外渗进行测量，并且通过激光共聚焦扫描显微术(confocal laser scanningmicroscopy，CLSM)对CCPM在脑切片中的微观分布进行成像。

将在其6至8周龄时购买的十三只雌性白化BL6小鼠(Janvier labs,France)，在没有特定病原体的条件下，以5只为一组，放置在单独通风的笼子里。笼内添加槽(housing)、筑巢材料和咬棒，以昼夜周期12小时置于受控制的环境(20℃至23℃、湿度50％至60％)中。动物可以自由获得食物和无菌水。所有实验操作都由挪威食品安全局(Norwegian FoodSafety Authority)批准。

超声装置的图解如图9所示。将定制的双频换能器(中心频率0.5MHz和2.7MHz)[Andersen et al.,A Harmonic Dual-Frequency Transducer for Acoustic ClusterTherapy,Ultrasound Med Biol 2019Sep；45(9):2381-2390]安装在充满脱气水的定制锥体顶部。换能器的直径为42mm，在距离换能器表面220mm处，0.5和2.7MHz的光束剖面的-3dB宽度分别为16mm和6mm。用信号发生器(33500B,Agilent Technologies,USA)产生信号，并用50dB RF放大器(2100L,E&I,USA)放大。放大器连接至开关盒，开关盒允许从激活US场切换至增强US场。锥体的底部覆盖着一层光学和声学可穿透的塑料薄膜(Jula Norge AS,Norway)，形成袋。将动物俯卧位放置在吸声材料(Aptflex F28,Precision Acoustics,UK)的顶部，其中超声凝胶用于在吸声器、动物头部和声学可穿透薄膜之间进行耦合。

所使用的ACT操作包括激活和增强步骤。在0.5MHz和2.7MHz频率下，通过鼠头骨的衰减分别测量为约21±17％和42±21％。这些数字用于计算原位声压/MI。以下超声参数用于每个步骤：

·激活：中心频率为2.7MHz，对应于0.18的机械指数(MI)的平均原位声压，8个周期脉冲长度，脉冲重复频率为1kHz，以及声波作用时间为60秒。

·增强：中心频率为0.5MHz，对应于0.15的MI的平均原位声压，4个周期脉冲长度，脉冲重复频率为1kHz，以及声波作用时间为300秒。

一轮ACT由推注静脉内注射2mL/kg簇组合物然后360秒声波作用组成。每只动物接受3轮ACT，导致总计75μl的ACT制剂和18分钟的超声。在第一次ACT过程之前立即i.v.注射CCPM。

在医用空气(78％)和氧气(20％)中使用2％异氟烷对动物进行麻醉(Baxter,USA)，之后对动物的尾侧静脉进行插管。用毛发修剪器和脱毛膏除去毛发(Veet,Canada)。在ACT操作期间，在医用空气中使用1.5％至2％的异氟烷对动物进行麻醉。使用压敏探针(SA instruments,USA)监测呼吸速率，并用外部加热维持体温。每只动物在注射CCPM之后直接接受3轮ACT。将对照动物以与ACT接受动物相同的方式处理，但接受3次间隔6分钟的50μl生理盐水注射，而不是簇组合物。

研究了两个时间点：ACT治疗结束之后1小时和24小时。在这些时间点，通过腹膜内注射戊巴比妥(200μl)并保持麻醉直至呼吸停止对动物实施安乐死。然后将动物用30mlPBS经心脏灌注，之后切除脑并用NIRF成像仪成像。分组为：对照/1小时N＝3、对照/24小时N＝3、ACT/1小时N＝5和ACT/24小时N＝2。

将切除的脑置于NIRF成像仪(Pearl Impulse Imager,LI-COR BiosciencesLtd.,USA)中，以评估在脑中的积累。脑在785nm处被激发，并且在820nm处检测到荧光发射。使用ImageJ(ImageJ 1.51j,USA)对图像进行分析。绘制脑周围的目的区域(Region of Interest，ROI)，并获取脑的总荧光强度并将其归一化为脑的湿重。使用标准曲线将总荧光强度转换为每克脑组织注射剂量的百分比(％ID/g)。按时间点和处理组绘制结果。

对于共聚焦显微术，将切除的脑横向安装在具有最佳切割温度组织Tek的一块软木(Sakura,The Netherlands)上，然后将样品缓慢浸入液氮中。在冷冻的脑中，从顶部除去前500μm，之后横向切割5×10μm厚的切片和5×25μm厚的切片。在整个脑中每800μm重复一次。

结果：

为了研究提高的渗透性是否会促进CCPM的外渗，在NIRF成像仪中对切除的脑进行成像。对照和注射有纳米粒的动物的代表性NIRF图像如图10(上图)所示。可以注意到，与对照脑相反，在接受ACT的脑中可以观察到明显的积累。

NIRF图像的定量分析显示，在两个时间点，ACT和对照动物之间的积累(％ID/g)在统计学上显著提高(图10，左下图)。与对照相比，其中ACT的中位％ID/g在ACT之后1小时从0.9％ ID/g提高至2.6％ ID/g，并且在ACT之后24小时从0.8％ ID/g提高至2.2％ ID/g。观察到％ID/g分别提高了290％和280％。

为了验证ACT治疗之后脑组织中CCPM积累的提高，并研究CCPM相对于血管的位置，通过CLSM对脑切片进行成像。经ACT治疗的脑的tilescans显示出数朵荧光“云”，其未在对照动物的脑中观察到。在ACT之后24小时，经ACT治疗的脑的tilescans显示出与1小时处理组相似的云图案。从对照和经ACT治疗的动物二者的阈值tilescans中，提取表示CCPM的像素数目，并通过用于描绘半球轮廓的ROI尺寸进行归一化。如从图10(右下图)可以注意到的，与对照组脑相反，在经ACT治疗之后1小时的切片中可以观察到明显且在统计学上的4.7倍的提高。

获取了对照脑和经ACT治疗的脑二者中不同位置处的高放大倍率CLSM图像，以研究CCPM相对于血管的位置。在经ACT治疗的脑中，CCPM明显外渗，而在对照脑中，主要观察到CCPM在血管内或从血管染色中的移位极小。

结论：

当应用本发明的两步声波作用的方法时，ACT明显提高了BBB对大纳米粒构建体(如所研究的70nm CCPM化合物)的渗透性。ACT导致了CCPM至脑实质的改善的积累、渗出和渗透。因此，其表明ACT递送大药物分子或构建体(例如ITA)穿过身体任何血管屏障的能力。

实施例5(前瞻性).具有PD-1抗体的声束治疗(ACT)在黑素瘤的同基因小鼠模型中的初步研究。

直至最近，远处转移性黑素瘤被认为对全身治疗是难治性的。更好地了解肿瘤、免疫系统和T细胞调节机制之间的相互作用，导致了免疫检查点抑制剂的开发。尽管这类免疫治疗剂改善了患者的临床结果，但响应率仍在30％至40％的范围，因此，显然有改进这种治疗方案的药学需要。

通过使用ACT方法提高脉管系统渗透性，其能够潜在地提高活化的T细胞浸润，并提高免疫治疗剂的递送以改善T细胞活化。因此，这可能会对黑素瘤患者的免疫治疗结果导致重大影响。

本研究的目的是在黑素瘤的同基因小鼠模型中评价ACT与PD-1抗体组合的抗肿瘤活性。簇组合物和所应用的ACT操作将如实施例1和3中所述。

材料和方法：

将B16-F1细胞皮下植入到具有免疫能力的C57BL/6J Black 6小鼠中，并且将通过每周的原发性肿瘤卡尺测量来监测疾病进展。当肿瘤体积达到30至40mm³时，将小鼠(每组n＝12)随机分为六组：对照(生理盐水)、US+PS101、抗小鼠PD-1(CD279)、同种型抗体对照、抗小鼠PD-1+US+PS101和同种型抗体对照+US+PS101。

研究持续将直至肿瘤体积达到150mm³。在第7天，将在每组中处死四只动物用于基因表达RNA序列分析(参见3.b)。在研究期间，抗小鼠PD-1或同种型抗体将以200μg/小鼠i.p.施用，每周两次，然后施用PS101。终点是原发肿瘤体积、体重曲线和总存活。

在第7天，将在每组中处死四只动物，并切除肿瘤用于全转录组mRNA分析(NanoString分析)。基于来自分析的结果，将在研究结束时对所切除的肿瘤进行所选定的免疫途径的免疫组织化学(immuno-histochemistry，IHC)分析，例如F4/80、CD3、CD4、CD8和Foxp3抗体。终点将是在第7天的mRNA分析，和在研究结束时的IHC分析。

结果(前瞻性)：

结果将显示，与单独的抗PD1处理相比，与ACT的组合导致满足以下治疗效力终点的一个或更多个：肿瘤生长抑制显著提高，中位总存活显著提高，免疫细胞的肿瘤浸润显著提高。

因此，本研究将确定当将免疫治疗剂(例如抗PD1单克隆抗体)与根据本发明的ACT组合时具有强协同作用。

实施例6.声束治疗(ACT)与免疫肿瘤学(immuno-oncology，IO)之间协同作用的初步研究

该研究的目的是在皮下黑素瘤模型(B16-F1，ATCC)中测试免疫检查点抑制剂与ACT组合的效力。初步探索有两个目标：

a)测试在皮下黑素瘤模型中ACT是否增强免疫检查点抑制剂的效力，基于ACT应增强检查点抑制剂向肿瘤的递送的概念，如其增强对化学治疗的递送，以及

b)是否能够获得表明ACT刺激肿瘤中的免疫原性反应的任何初步证据(即，使成为免疫学上“冷”的肿瘤或更免疫学上“热”的肿瘤)。

方法：

本研究以两部分进行。首先，进行了抑制剂发现研究，以在所提出的模型(B16-F1，具有免疫能力的C57BL/6J Black 6小鼠中的ATCC)中确定最佳检查点抑制剂，是抗PD-1、抗CTLA4，还是抗PD-1与抗CTLA 4的组合。对数据进行了分析，以确定当与ACT组合时最有可能允许改善效力表明的方案，基础是这是当所选定的仅含抑制剂的方案显示出仅中等效果时。为简洁起见，以下不报告这部分研究的结果。他们允许决定在研究的第二部分中使用抗PD-1和抗CTLA4的组合作为检查点抑制剂，这是在添加ACT的情况下进行的。

簇组合物如实施例1中所述。“US+PS101”意指如本文所公开的超声和簇组合物在ACT治疗中的使用。

对以下处理组(n＝12)的肿瘤体积、小鼠体重和存活进行监测：

i)对照(生理盐水)，

ii)检查点抑制剂，

iii)同种型抗体对照(例如InVivoMab大鼠IgG2a)，

iv)检查点抑制剂(抗PD-1和抗CTLA4)+US+PS101(ACT)，以及

v)同种型抗体对照(IgG2a)+US+PS101(ACT)

对数据进行了分析，以确定与单独检查点抑制相比是否增强检查点抑制的效力。

为了测试肿瘤免疫原性状态的任何受刺激的变化，在第7天，在每组中处死四只动物用于转录组mRNA(用于20000个基因)分析和免疫组织化学(IHC)，用于所选定的免疫途径生物标志物的分析。在研究结束时将所切除的肿瘤固定并储存用于潜在的回顾性RNA序列分析和IHC。

该模型遇到了多个问题，包括黑小鼠尾静脉插管的难度(其在每次随后的插管难度都会提高，尤其是难以触诊和用卡尺测量的柔软的高度细胞性肿瘤，使得其难以在处理开始时尺寸匹配)，以及肿瘤之间高度可变的快速生长率。这产生了显著的肿瘤间变异性，其限制了解释结果的能力。生长率的肿瘤间显著变化，以及可能的处理起始肿瘤体积的肿瘤间显著变化，在生长曲线中产生了显著异质性。尽管如此，虽然不同处理组所有小鼠的平均倍数生长差异在统计学上不显著，但观察到了谨慎解释的趋势。相对于生理盐水对照，仅用同种型抗体IgG2a的处理显示出具有与仅用检查点抑制剂组合抗PD-11和抗CTLA-4的处理类似的治疗作用。ACT的添加似乎轻微改善了同种型和检查点抑制剂二者的平均治疗效力。尽管这些结果的进一步分析可能包括计算肿瘤倍增时间，以查看是否出现任何显著差异，但对单个肿瘤生长曲线的检查表明，处理组之间的差异可能更多地在于经处理的小鼠之间生长率分布的差异，而不是在于平均值之间的差异。在添加ACT的情况下，趋势朝向表现出改善的响应的小鼠异常值数量提高，或者甚至表明了双峰分布的产生。有了这个模型，需要具有更多小鼠的研究，以确认这是否是真实的观察结果。

关于存活曲线的观察结果与平均倍数生长的观察结果是类似的，即同种型抗体似乎具有作用，并且非显著趋势表明ACT可能延长存活。

选择用于处死和肿瘤遗传学和IHC分析的小鼠的亚组的生长曲线表明了类似的情况，其中向同种型的趋势引发了响应，并且ACT改善了响应。在这里，看起来进一步的分析(例如计算肿瘤倍增时间)可能再次是重要的以确定各组之间是否出现任何显著性。

所选定的免疫途径生物标志物(基因)的免疫组织化学(IHC)分析：

为处理组准备了IHC和归一化基因表达的热图和其他图表。由于图和图表包含颜色，因此不适合纳入，并且研究结果总结如下。

-一项分析提供的热图示出了每个处理组的免疫途径基因表达相对于在所有动物之间的平均表达的强度。所选定的基因为：BCR信号传导、M1激活、MHC I类抗原呈递、T细胞检查点信号传导、IFNg基因、CTLA4信号传导、MHC II类抗原呈递，PP1信号传导、TLR信号传导。热图清楚地示出，对于用检查点抑制剂(抗PD-1和抗CTLA4)和ACT治疗的处理组iv)，所有生物标志物都被激活，在热图中显示为红色。其他处理组的所有基因都呈黄色或蓝色的色调，显示出较少或没有激活。

-另一项分析提供了显示与以下特定免疫类型细胞相关的基因表达强度的热图；不同处理组的T细胞、CD8 T细胞、单核细胞、成纤维细胞、NK细胞、Masaat细胞、淋巴、B衍生内皮细胞、血管。热图清楚地示出，对于用检查点抑制剂(抗PD-1和抗CTLA4)和ACT治疗的处理组iv)，特别是T细胞，CD8 T细胞和单核细胞被活化，在热图中显示为红色。

在没有用单独的ACT治疗的处理组的情况下，ACT引起肿瘤免疫原性状态变化的可能性被评估为用单独的同种型抗体处理和用同种型加ACT治疗之间的差异(log2倍变化)基因表达。图13提供了“火山图”，示出了当ACT与同种型抗体(IgG)组合时，相对于用单独的IgG处理，ACT对肿瘤免疫原性状态的影响，作为仅免疫基因的表达。示出了中位值。没有表现出显著差异表达的基因没有被标记，并且仅被绘制为点(B)，而那些显著的基因被绘制为点并被标记。相对较少的免疫基因显示出达到统计学显著性的差异表达，这突出强调需要具有更多的动物、更少的异质性模型和用单独的ACT治疗的组的研究。

就生化途径而言，对差异表达的进一步分析表明，相对于单独的同种型抗体，ACT与同种型的组合倾向于显著(-log10(P)＞1.3)下调一些途径，包括对低氧的响应，并上调另一些途径。在考虑这些发现的重要性之前，建议进行一项更大规模的且使用单独ACT组的研究。然后存在随后进行相关成像的可能性(例如，使用体内光声成像，或定量形态测定组织学)，以确定基因表达与表型特征相关。

图14提供了ACT的遗传效应，如通过当ACT与同种型抗体(IgG)组合时，相对于用单独的IgG处理，下调(A)或上调(B)的途径所指示的。x轴显示：-log10(p值)。

图A：IgG+ACT中的下调途径。

图B：IgG+ACT中的上调途径。

字母表示以下：

GO：0001666-对低氧的响应，

WP4206-遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌途径，

GO：0001525-血管生成，

GO：0051235-位置维持，

GO：0061061-肌肉结构发育，

GO：0006936-肌肉收缩，

GO：0097435-超分子纤维组织，

GO：0043462-ATP酶活性的调节，

GO：0030199-胶原原纤维组织，

GO：0030239-肌原纤维组装，

GO：0044057-系统过程的调节

图15提供了来自全染色肿瘤切片的自动分析的免疫组织化学结果。CD8 T细胞的染色阳性的细胞比例由个体动物的处理组(黑点)、和组平均值(条)以及标准偏差(误差棒)显示。x轴显示处理组，其中A：ACT+PD1/CTL4、B：PD1/CTL4、C：ACT+ISO、D：ISO、E：生理盐水。

虽然ACT显示出提高了免疫途径基因表达的平均归一化强度，但这是由于单个肿瘤的增加，并且在小鼠之间可以看到大的组内遗传差异，其在其他基因中是重复的。这样的遗传异质性是癌症的特征，并且见于患者的肿瘤样品。当分析来自患者的肿瘤样品时，先前的研究通过如RECIST(肿瘤缩小)标准(Ref.)定义的极端应答者和非应答者的基因表达得出了有用的结论。本文中的类似方法，或者甚至将特定基因的组的表达强度与从个体动物的生长曲线所测量的响应进行比较，可能有助于未来的研究，但会需要比在这项初步研究中用于遗传分析的四只动物更多的动物。更容易处理并产生更少异质性生长曲线的肿瘤模型的使用也可允许组之间的平均值方面的差异更显著。

组织炎症标记(tissue inflammation signature，TIS)基因和与免疫类型细胞相关的基因出现了类似的模式。TIS正在开发，以指导潜在的治疗。

在这项初步研究中，迄今为止，IHC分析仅限于CD8 T细胞的染色，但是切片仍可用于进一步染色(例如CD4的染色等)。CD8对对于介导适应性免疫重要的T细胞亚群进行染色，包括细胞毒性(所谓的“杀伤”)T细胞。我们的研究结果必须再次提出动物数量少的警告以及相应的缺乏显著性，但值得注意的是，在用检查点抑制剂或同种型处理中添加ACT显示出增加具有高百分比CD8阳性T细胞的肿瘤数目。

尽管所获得的许多个体结果缺乏显著性，但综合起来，其显示出代表ACT可以提高检查点抑制剂的治疗有效性并导致肿瘤产生提高的免疫原性响应的模式。

实施例7(前瞻性).具有多种微泡及微滴组分的簇组合物的制造。

为了显示出本发明适用于第一组分和第二组分(C1和C2)的多种化学组合物，可以在商业上生产或采购数种制剂，并探索所得簇组合物的体外属性。

C1实施例：

可商购微泡US成像剂(Bracco Spa,Italy)和/>(VisualSonics Inc.,USA)可作为C1组分采购和使用。Sonovue是六氟化硫微泡，其用二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油钠、棕榈酸和PEG4000膜稳定，并且以冻干形式存在以用5mL水性基质重构。Micromarker是全氟丁烷/氮微泡，其用磷脂、聚乙二醇和脂肪酸稳定，并且以冻干形式存在以用0.7mL水性基质重构。

C2实施例：

具有可扩散组分的微滴(C2)组分；

a)全氟二甲基环丁烷、b)2-(三氟甲基)全氟戊烷和c)全氟己烷可以如下制造：

将790mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)和8.1mg硬脂胺(stearylamine，SA)称重至250ml圆底烧瓶中并添加50ml氯仿。将样品在热自来水下加热，直至获得澄清的溶液。将氯仿通过以下移除：在旋转蒸发器上在350mm Hg和40℃下蒸发至干燥，然后在干燥器中在50mm Hg下进一步干燥过夜。然后，添加160ml水并且将烧瓶再次置于旋转蒸发器上，并通过全转速和80℃水浴温度将脂质再水化25分钟。将所得脂质分散体转移至合适的小瓶中并储存在冰箱中直至使用。

乳剂是通过将1ml冷的脂质分散体的等分试样转移至2ml色谱小瓶中来制备的。6个小瓶中的每个都添加了100μl的氟碳油，如上所详细说明的。将色谱小瓶在CapMix(Espe，GmbH)上振荡75秒。将所得乳剂通过离心和除去清液(infranatant)然后添加等体积的5mMTRIS水性缓冲液洗涤三次。将小瓶立即在冰上冷却，合并并保持冰冷直至使用。

进行Coulter计数器分析，以确定微滴的体积浓度和直径，并随后将乳剂用5mMTRIS缓冲液稀释至分散相浓度为4μl微滴/ml。

簇组合物的制备通过分别用5mL或0.7mL上述每种C2组分重构Sonovue或Micromarker来进行。

结果(前瞻性)。

将组分C1和C2混合之后，所有六种组合预期每毫升包含超过1000万个簇，其中平均直径为3至10μm。

Claims

1.微泡/微滴簇组合物，其用于治疗哺乳动物对象的病理状况的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种免疫治疗剂(ITA)；

(ii)向所述对象施用所述微泡/微滴簇组合物；

(iii)通过以1至10MHz的第一频率和0.1至0.4的第一机械指数对所述对象内的目的区域进行超声声波作用来激活来自步骤(ii)的所述簇组合物中微滴的可扩散组分的相转变；

(iv)进一步用第二频率为0.4至0.6MkHz且第二机械指数为0.1至0.3的超声进行声波作用。

2.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述步骤(ii)至(iv)重复1至4次。

3.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至2中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中步骤(iii)的声波作用在步骤(ii)之后立即开始，并且紧接着是步骤(iv)的声波作用。

4.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至3中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中步骤(iii)的声波作用持续30至120秒，随后是步骤(iv)的声波作用，其持续3至10分钟。

5.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至4中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其用作多药物治疗的一部分。

6.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至5中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中包括所述至少一种ITA的1至5种治疗剂在一定时间的跨度内同时或依次地施用，其中包括步骤(ii)至(iv)的至少一种，例如1至5种ACT治疗在同一时期期间进行。

7.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至6中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述方法有助于增强之前、和/或共同、和/或之后单独施用的ITA和/或炎性细胞因子的外渗和摄取，和/或增强已活化免疫细胞向靶标病理状况的浸润。

8.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至7中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中在步骤(iii)的激活声波作用和步骤(iv)的进一步声波作用二者中均使用宽带或双频US换能器。

9.权利要求1所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中簇的平均直径为3至10μm，并且优选为4至9μm。

10.权利要求1或9所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中尺寸范围为1至10μm的簇的簇浓度为至少2500万/ml。

11.权利要求1、9或10所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中微泡/微滴簇中微泡的气体包含六氟化硫或C3-6全氟化碳或者其混合物。

12.权利要求1和9至11中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中微泡/微滴簇中微滴的油相包含部分卤代烃或完全卤代烃或者其混合物。

13.权利要求1和9至12中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述微泡包含含有磷脂、蛋白质或聚合物的第一稳定剂，任选地添加有带负电荷的表面活性剂，并且所述微滴包含含有磷脂、蛋白质或聚合物的第二稳定剂，任选地添加有带正电荷的表面活性剂。

14.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述治疗剂被配制在载剂中，例如以脂质体、胶束、缀合物、纳米粒、核心交联聚合物胶束(CCPM)或微球的形式包含在内。

15.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8或14中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述至少一种ITA选自以下的组：免疫肿瘤学药剂、单克隆抗体(mAb)、融合蛋白、可溶性细胞因子受体、重组细胞因子、小分子模拟物、细胞治疗剂、癌症疫苗和溶瘤病毒。

16.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求15所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述免疫治疗剂选自单克隆抗体的组。

17.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8或14至16中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中将使用至少一种ITA的治疗与使用一种或更多种化学治疗剂的治疗组合。

18.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8或14至17中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述一种或更多种ITA选自能够靶向名为CD1至CD371的抗原中的任一种的ITA。

19.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8或14至18中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述ITA选自单克隆抗体抗PD1、抗PDL1和CTLA4的组，并且与化学治疗剂组合使用。

20.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至8中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中一种或更多种ITA选自免疫检查点抑制剂的组。

21.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至20中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述ITA或所述ITA的经配制形式的分子量大于15.000道尔顿。

22.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，其中用途是用于癌症或自身免疫病的治疗。

23.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，其中用途是用于癌症的治疗，例如局部病理性病变、实体癌的治疗，例如黑素瘤、肉瘤、前列腺癌、结肠癌、肛门癌、食管癌、胃癌、直肠癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、脑癌、胆管癌、头颈癌或淋巴瘤的治疗；或用于自身免疫病的治疗，例如银屑病、狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化或斑秃的治疗；或者用于避免器官移植之后的排斥。

24.权利要求1和9至13中任一项所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求1至23中任一项所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述簇组合物在从将制备所述微泡/微滴簇组合物的第一组分的微泡与第二组分的微滴组合时起3小时的时间窗内施用。

25.微泡/微滴簇组合物，其用于至少一种之前、和/或共同、和/或之后单独施用的免疫治疗剂(ITA)和/或炎性细胞因子的外渗和摄取的方法，和/或增强已活化免疫细胞向哺乳动物对象的靶标病理状况的浸润的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种ITA；

(ii)向所述对象施用微泡/微滴簇组合物；

其中所述至少一种ITA在所述簇组合物之前、和/或与所述簇组合物共同、和/或在所述簇组合物之后施用；

(iv)进一步用第二频率为0.4至0.6Hz且第二机械指数为0.1至0.3的超声进行声波作用。

26.权利要求25所述的微泡/微滴簇组合物，根据权利要求25所述应用的微泡/微滴簇组合物，其中所述方法步骤和簇组合物如权利要求1至24中任一项中所限定。

27.向哺乳动物对象递送至少一种免疫治疗剂(ITA)的方法，其包括以下步骤：

(i)向所述对象施用至少一种ITA；

(ii)向所述对象施用微泡/微滴簇组合物；

28.权利要求27所述的用于递送至少一种ITA的方法，其中所述方法步骤和簇组合物如权利要求1至24中任一项所限定。