CN117295517A - 自然杀伤细胞的活化和扩增方法以及与双特异性抗体的组合 - Google Patents

Abstract

本公开内容的实施方案涉及与组合免疫疗法的制备和使用相关的方法和组合物。在具体实施方案中，包含以特定方式制备的NK细胞的组合物还包含某些抗体。这些组合物用于治疗，例如用于癌症治疗。在具体的实施方案中，组合物包含NK细胞和抗体的复合物，其中抗体与NK细胞结合并且还可以与另一种抗原例如癌细胞上的抗原结合。

Description

自然杀伤细胞的活化和扩增方法以及与双特异性抗体的组合

本申请要求2021年4月8日提交的美国临时专利申请系列号63/172,402的优先权，并且还要求2021年8月3日提交的美国临时专利申请系列号63/228,991的优先权，这些申请均通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学(包括癌症医学)领域。

背景技术

在自然杀伤(NK)细胞作为治疗的领域中，某些障碍阻碍了它们的使用，包括由于数量有限而需要离体扩增，此外它们的持久性不足影响了它们作为抗癌治疗的功效。细胞因子刺激是增强NK细胞响应肿瘤靶细胞的功能能力的重要信号。此外，用IL-18、IL-15和IL-12的组合预活化NK细胞过夜已被证明产生在再刺激后具有增强的细胞因子产生的长寿命的记忆样NK细胞(Leong等人,2014)。然而，在没有离体扩增的情况下使用来自外周血(PB)的预活化NK细胞的程序需要繁琐的程序才能产生足够的数量供临床使用。此外，还存在与NK细胞的癌症识别缺陷和NK细胞活化不良相关的其他障碍。因此，对改进策略以产生足够用于治疗应用的数量并且在癌症抗原靶向方面特别有效的高功能预活化NK细胞的需求尚未得到满足。

发明内容

本公开内容的实施方案涉及与医学病况的免疫疗法相关的方法和组合物。免疫疗法可用于任何医学病况，其中需要破坏的细胞的靶向在临床上是有用的并且在靶细胞上存在抗体和/或细胞可能对其具有特异性的特定抗原。在具体实施方案中，免疫疗法包括过继细胞疗法和被配置为结合细胞的抗体、由其组成或基本上由其组成。在具体实施方案中，过继细胞疗法包括NK细胞并且抗体可以是多特异性的，包括至少双特异性的。因此，在具体的实施方案中，组合物用于组合NK细胞和抗体两者的疗法，并且该组合可以被配置为使得抗体能够结合NK细胞上的表面抗原，并且在治疗上利用组合的该复合物。

在具体实施方案中，用于所述方法和组合物的NK细胞可以在使用前以特定方式制备，包括在与抗体(任何类型)的组合之前。在特定的实施方案中，NK细胞以特定的方式扩增并且任选地以特定的方式预活化。例如，除了将NK细胞任选地暴露于一种或多种细胞因子作为预活化步骤之外，还可以在特定的培养条件下在特定抗原呈递细胞的存在下扩增NK细胞。

在具体的实施方案中，包含NK细胞和抗体的复合物的组合物的功效与它们的单独使用相比得到增强。在特定情况下，当作为复合物使用时，NK细胞和抗体的功效是协同的，尽管在其他情况下，NK细胞和抗体的功效是相加的。

本公开内容的实施方案涉及组合物，其包含(1)一种或多种脐带血、干细胞(包括iPSC)或外周血来源的自然杀伤(NK)细胞；和(2)一种或多种抗体分子，其中：(a)所述抗体是单特异性的，其中单特异性抗体的Fc区结合NK细胞并且单特异性抗体的抗原结合结构域结合靶抗原；或(b)所述抗体是多特异性的，并且所述抗体的一个或多个抗原结合结构域结合靶抗原，并且所述抗体的另一个或多个抗原结合结构域结合NK细胞表面抗原。NK细胞可以经扩增或可以不经扩增。NK细胞可以经预活化，或可以未经预活化。在一些情况下，多特异性抗体是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在特定情况下，在(a)中，通过单特异性抗体的Fc区与NK细胞的结合，组合物被进一步定义为NK细胞和单特异性抗体之间的复合物。在具体情况下，在(b)中，通过结合一种或多种NK细胞表面抗原的多特异性抗体的一个或多个抗原结合结构域的结合，组合物被进一步定义为NK细胞和多特异性抗体之间的复合物。靶抗原可以是干细胞抗原、自身抗原或选自以下的癌抗原：CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、CD22、CD70、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD38、CD56、CD70、CD38、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA、HLA-G、TROP2、CD99及其组合。NK细胞表面抗原可以是CD16、CS1、CD56、NKG2D、NKG2C或任何c型凝集素、共刺激分子例如DNAM、2B4、CD2、NCR或KIR。在组合物的一些情况下，脐带血的来源是来自1个供体的脐带血或汇集自2个或更多个个体脐带血单位。CB可以汇集自3、4、5、6、7或8个单独的脐带血单位。NK细胞(可以是CD56+)可以源自脐带血单核细胞、源自脐带血造血干细胞、源自iPSC、源自外周血或源自NK细胞系。该组合物可以新鲜使用或冷冻保存。NK细胞的来源可以是新鲜来源或冷冻保存的储存库。在一些情况下，当NK细胞源自冷冻保存时，所述NK细胞冷冻保存在包含至少一种冷冻保护剂、至少一种血清或血清的非血清替代物的培养基中。在某些实施方案中，可以将至少一种细胞因子和/或至少一种生长因子添加到低温保存培养基中。冷冻保护剂可以是二甲基亚砜(DMSO)、丙三醇、甘油、羟乙醇淀粉、葡聚糖海藻糖或其组合。非血清替代物可包括血小板裂解物和/或血液产品裂解物或人或动物血清白蛋白。在一些情况下，至少一种细胞因子(其可以是白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、干扰素、肿瘤坏死因子、干细胞因子、FLT3-配体、APRIL、血小板生成素、促红细胞生成素或其组合)是天然蛋白质、重组蛋白质、合成蛋白质或其混合物。NK细胞可以通过人工以一种或多种方式修饰，例如通过包含一种或多种工程改造的抗原受体，包括嵌合抗原受体或T细胞受体，或CD16、CD32和/或CD64受体。NK细胞可以表达异源细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或IL-23。另外或可替代地，NK细胞可以表达自杀基因。组合物可以包含在包含一种或多种冷冻保护剂的溶液或固体中。组合物可以包含在药学上可接受的载体中。

在一个实施方案中，存在一种产生本文涵盖的任何组合物的方法，包括以下步骤：(a)任选地在包含有效量的以下物质的培养物中扩增NK细胞：(1)选自IL-2、IL-15和/或IL-21的细胞因子；和(2)抗原呈递细胞/饲养细胞或NK活化珠；和(b)向NK细胞提供抗体分子，并且当扩增时在扩增之前和/或之后向NK细胞提供抗体分子。在一些情况下，所述方法包括在扩增步骤之前和/或之后的预活化步骤，其中NK细胞在包含有效浓度的IL-2、IL-12、IL-15和IL-18中的一种或两种或三种或更多种的培养物中预活化。在某些情况下，在培养物中使用IL-12代替IL-15。提供步骤可以进一步定义为将所述NK细胞与所述抗体分子一起培养特定的持续时间(例如，约5分钟至约24小时或更长)或紧接在输注之前将所述NK细胞和所述抗体分子组合。培养物可以包含或可以不包含Plasma-Lyte A和/或人血清白蛋白。培养后，组合物可以或可以不被输注到受体受试者中，而不首先清洗。NK细胞可以耗尽CD3+、CD14+和/或CD19+细胞。耗尽步骤可以发生在预活化步骤之前，和/或在用饲养细胞和/或NK细胞活化珠扩增之前，和/或在用一种或多种细胞因子培养之前，和/或在输注之前。在一些情况下，所述方法进一步包括从脐带血获得NK细胞的步骤，其中所述脐带血不包含脐带组织。

对于生产方法，抗原呈递细胞可以是人工的(aAPC)，并且可以表达CD137配体。aAPC还可表达一种或多种膜结合细胞因子，例如膜结合IL-21(mIL-21)和/或膜结合IL-15(mIL-15)。aAPC可以基本上不表达内源性I类HLA、II类HLA和/或CD1d分子。在一些情况下，aAPC表达ICAM-1(CD54)和/或LFA-3(CD58)和/或CD48。aAPC可以进一步定义为白血病细胞来源的aAPC，并且白血病细胞来源的aAPC可以是K562细胞，例如经工程改造以表达CD137配体和/或mIL-21。在任何情况下，aAPC可以通过任何类型的载体(包括病毒或非病毒载体，并且包括逆转录病毒转导)的转移而被工程改造。aAPC可以经辐照或可以不经辐照。预活化步骤可以持续10-20小时、14-18小时或16小时。用于预活化步骤的培养物可以包含浓度为1-1000ng/mL的IL-18和/或IL-15。用于预活化步骤的培养物可以包含浓度为0.1-1000ng/mL的IL-12。用于预活化步骤的培养物可以包含浓度为1-1000ng/mL的IL-12，包括10ng/mL。在一些情况下，所述方法还包括在扩增步骤之前和/或之后洗涤预活化的NK细胞，并且洗涤可以进行一次或可以进行多次。扩增时，扩增时间可以为5-60天，包括12-16天，例如18-24天。在一些情况下，预活化的NK细胞和aAPC以3:1至1:3的比例(包括1:2的比例)存在于扩增培养物中。扩增培养物可以或可以不进一步包含IL-2，例如浓度为10-500U/mL，包括100-300U/mL，例如200U/mL。在所述方法的任何方面，IL-12、IL-18、IL-15和/或IL-2可以是或可以不是重组的。在一些情况下，每2-3天在所述扩增培养物中补充IL-2。IL-2或IL-15或IL-18或细胞因子的任何组合可以至少第二次添加至所述扩增培养物中。可以至少第二次将APC添加至所述扩增培养物中。在一些情况下，所述方法的一个或多个步骤在无血清培养基中进行。

在一个实施方案中，存在一种治疗受试者(包括哺乳动物，例如人)的疾病或病症的方法，包括施用治疗有效量的本文涵盖的任何组合物，并且所述组合物的NK细胞对于所述受试者可以是自体的或同种异体的。疾病或病症可以是癌症(血液癌症或实体瘤)、炎症、移植物抗宿主病、移植排斥、自身免疫病症、免疫缺陷疾病、B细胞恶性肿瘤或感染。血液癌症包括选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)的白血病。病症可以是移植物抗宿主病(GVHD)、多发性硬化症、炎症性肠病、类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、接触性超敏反应、哮喘和/或干燥综合征。

在一些情况下，所述方法还包括向受试者施用至少第二治疗剂，例如治疗有效量的一种或多种抗癌剂(例如，化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗-血管生成疗法和/或免疫疗法)、一种或多种免疫调节剂和/或一种或多种免疫抑制剂，例如钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗体、化疗剂、辐射、趋化因子、白介素或者趋化因子或白介素的抑制剂中的一种或多种。用于任何疾病的任何第二药剂可以是抗体，包括单克隆、双特异性、三特异性或四特异性抗体。

在任何方法中，组合物(和/或至少第二治疗剂)可以静脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌内、内窥镜下、病灶内、经皮、皮下、局部地或通过直接注射或灌注或输液施用。

上文已经相当广泛地概述了本公开内容的特征和技术优点，以便可以更好地理解下面的详细描述。附加的特征和优点将在下文中描述，其形成本文权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，所公开的构思和具体实施方案可以容易地用作修改或设计其他结构的基础，以实现与本设计相同的目的。本领域技术人员还应当认识到，这样的等同构造并不脱离所附权利要求中阐述的精神和范围。从以下描述中将更好地理解被认为是本文所公开的设计的特征的新颖特征(关于组织和操作方法)以及进一步的目的和优点。然而，应当明确地理解，提供本公开内容仅用于说明和描述的目的，并且不旨在作为对本公开内容的限制的定义。

附图简要说明

为了更完整地理解本公开内容，现在参考结合附图进行的以下描述。

图1.详细描述扩增脐带血来源的NK细胞并用抗体对其进行预负载的实验计划的一个实施方案的示意图。

图2.与正常扩增的NK细胞相比，玛格妥昔单抗(Margetuximab)与P+E NK细胞的结合具有更高的亲和力。

图3.在长期Xcelligence杀伤测定中，负载玛格妥昔单抗的NK细胞显示出针对HER2+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。

图4A-4C.负载玛格妥昔单抗的NK细胞在HER2+卵巢癌(SKOV3)的NSG小鼠模型中导致增强的肿瘤控制。

图5.与正常扩增的NK细胞相比，埃万妥单抗(Amivantamab)以更高的亲和力与P+ENK细胞结合。

图6.在短期51Cr释放杀伤测定中，负载埃万妥单抗的NK细胞显示出针对EGFR+/cMET+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。

图7A-7C.在长期Xcelligence杀伤测定中，负载埃万妥单抗的NK细胞显示出针对EGFR+/cMET+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。

图8A-8C.负载埃万妥单抗的NK细胞在EGFR+/c-MET+卵巢癌(SKOV3)的NSG小鼠模型中导致增强的肿瘤控制。

图9.与正常扩增的(NE)NK细胞相比，伊马曲单抗(Imgatuzumab)以更高的亲和力与预活化和扩增的(PE)NK细胞结合。

图10.在短期⁵¹Cr释放杀伤测定中，负载伊马曲单抗的NK细胞显示出针对EGFR+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。

图11A-11C.在长期Xcelligence杀伤测定中，负载伊马曲单抗的NK细胞显示出针对EGFR+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。

图12A-12C.负载伊马曲单抗的NK细胞在EGFR+卵巢癌(SKOV3)的NSG小鼠模型中导致增强的肿瘤控制。

发明详述

与长期存在的专利法惯例一致，词语“一个”和“一种”在本说明书(包括权利要求)中与词语“包括”一起使用时表示“一个或多个/一种或多种”。本公开内容的一些实施方案可以由或基本上由本公开内容的一个或多个元素、方法步骤和/或方法组成。预期本文描述的任何方法或组合物可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施，并且可以组合不同的实施方案。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或元素或者步骤或元素组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素组。“由……组成”的意思是包括并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”指示所列出的元素是必需的或强制性的，并且可以不存在其他元素。“基本上由......组成”是指包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或促成在本公开内容中针对所列元素指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由......组成”指示所列出的元素是必需的或强制性的，但是没有其他元素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。

本说明书通篇提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“另外的实施方案”或“进一步的实施方案”或其组合意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的各个地方的前述短语的出现不一定都指同一实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。

如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述彼此组合或互斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预期的是，x、y或z可以被明确地从实施方案中排除。

可以预期的是，本说明书中讨论的任何实施方案可以关于本发明的任何方法或组合物来实现，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。

在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的简单和普通含义来使用，以指示值包括用于确定值所采用的装置或方法的误差的标准偏差。

本文使用的术语“工程改造的”是指由人工产生的实体，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，工程改造的实体是合成的并且包括并非天然存在或以其在本公开内容中使用的方式配置的元件。在具体实施方案中，通过重组核酸技术工程改造载体，并且通过工程改造的载体的转染或转导来工程改造细胞。

如本文所用，术语“负载”、“负载的”或“装载”是指在细胞表面上具有与细胞结合的一种或多种抗体的过继细胞治疗细胞。

短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当时施用至动物(例如人)时不产生副作用、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员来说是已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解制剂应满足FDA生物标准办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水性溶液、盐溶液、胃肠外媒介物，例如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，诸如此类的材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的。药物组合物中各种组分的pH和准确浓度根据众所周知的参数进行调节。

如本文所用，术语“预活化的”或“预活化”是指将NK细胞暴露于IL-12、IL-15或IL-2、和/或IL-18，导致与NK细胞效应功能相关的信号传导途径增加，例如参与IFN-γ反应、TNF信号传导、IL-2/STAT5信号传导、IL-6/JAK/STAT3信号传导、mTOR途径的基因和/或与炎症免疫反应相关的基因的富集。在特定情况下，TRAIL、NKp44和/或CD69的表达增加。

如本文所用，术语“预负载”、“预负载的”或“预装载”是指在以任何理由使用细胞之前在细胞表面上已具有结合至细胞的一种或多种抗体的过继细胞治疗细胞。

如本文所用，“预防”和类似词语例如“防止”、“阻止”等表示用于预防、抑制疾病或病况例如癌症的发生或复发或减少疾病或病况例如癌症发生或复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病况的发作或复发或者延迟疾病或病况的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病况发作或复发之前降低疾病或病况的强度、影响、症状和/或负担。

本文所用的术语“受试者”一般指患有或疑似患有癌症的个体。受试者可以是作为方法或材料的对象的任何生物体或动物受试者，包括哺乳动物，例如人类、实验动物(例如灵长类动物、大鼠、小鼠、兔)、家畜(例如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家庭宠物(例如狗、猫和啮齿动物)、马和转基因非人类动物。受试者可以是患者，例如患有或疑似患有疾病(可以称为医学病况)，例如良性或恶性瘤形成或癌症。受试者可以正在接受或已经接受治疗。受试者可能没有症状。受试者可以是健康个体但希望预防癌症。至少在某些情况下，术语“个体”可以互换使用。如本文所用的“受试者”或“个体”可以或可以不被安置在医疗机构中并且可以被作为医疗机构的门诊病人来治疗。个体可以通过互联网接收一种或多种药物组合物。个体可以包括任何年龄的人类或非人类动物，因此包括成人和青少年(即，儿童)和婴儿，并且包括子宫内个体。该术语并不意味着需要医学治疗，因此，个体可以自愿或非自愿地参与临床实验或支持基础科学研究。

如本文所用，“治疗”或“医治”包括对疾病或病理状况的症状或病理学的任何有益或期望的效果，并且可以包括所治疗的疾病或病况例如癌症的一种或多种可测量标志物的甚至最小程度的减少。治疗可以任选地包括减少或改善疾病或病况的一种或多种症状，或者延迟疾病或病况的进展。“治疗”不一定表示疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。

I.自然杀伤(NK)细胞和生产方法

NK细胞正在成为恶性血液病以及实体瘤患者的细胞免疫治疗的令人兴奋的来源；然而，大多数使用过继转移NK细胞的研究都受到持久性不足、体内扩增不良以及输注细胞的令人失望的抗肿瘤活性的限制。因此，NK免疫治疗领域需要克服的一个障碍是需要生物学驱动的方法来增加NK细胞的抗肿瘤功能，例如通过在施用为治疗前对细胞进行操作。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了用于产生与未经如此操作的NK细胞相比具有任何种类的增强功效的NK细胞的方法。本公开内容的一些实施方案涉及NK细胞的分离、活化和扩增，包括用于癌症免疫治疗。

在具体的实施方案中，本公开内容涵盖通过本发明的方法产生的负载的、预活化的(任选地)和扩增的(任选地)NK细胞，其表现出针对癌症的增强的抗肿瘤功能。在具体实施方案中，预活化和扩增的NK细胞还表现出增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

A.NK细胞概述

在某些实施方案中，方法中使用的NK细胞可以源自任何合适的来源，例如脐带血(CB)，包括人CB。在特殊情况下，NK细胞并非源自脐带组织(脐带血管周围的绝缘材料(即沃顿胶))。在替代实施方案中，NK细胞源自人外周血单核细胞(PBMC)、未刺激的白细胞分离产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导多能干细胞(iPSC)和/或骨髓，或通过本领域熟知的方法衍生自患者的NK细胞系，例如NK-92。在具体的实施方案中，NK细胞是从汇集的CB中分离的。CB可以由2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个单元汇集而成。NK细胞对于受体个体来说可以是自体的或同种异体的。分离的NK细胞可能或可能不与接受细胞治疗的受试者单倍型匹配。NK细胞可能或可能不会被特定的表面标记物(例如人类中的CD16和/或CD56)检测到。在一些情况下，NK细胞针对一种或多种表面标记物的存在进行耗尽，例如针对CD3+、CD14+和/或CD19+细胞进行耗尽。在具体实施方案中，NK细胞是CD3-CD56+。

在某些方面，NK细胞通过先前描述的NK细胞离体扩增方法分离(Spanholtz等人，2011；Shah等人，2013)。在此方法中，CB单核细胞通过聚蔗糖密度梯度离心分离。细胞培养物可以耗尽表达CD3的任何细胞，并且可以被表征以确定CD56⁺/CD3^-细胞或NK细胞的百分比。在其他方法中，脐带CB用于通过分离CD34⁺细胞来衍生NK细胞。

B.NK细胞的负载

在特定实施方案中，NK细胞在使用前负载抗体。NK细胞可以以任何特定方式负载，包括在培养物中或在输注前立即负载，例如以产生NK细胞与抗体的复合物。条件是足以允许有效量的抗体与NK细胞表面结合。在使用单特异性抗体的情况下，单特异性抗体的Fc区结合NK细胞，而单特异性抗体的抗原结合结构域自由结合其靶抗原。在使用多特异性抗体的情况下，抗体的一个或多个抗原结合结构域例如通过NK细胞表面上的抗原结合NK细胞的表面，并且另一个抗原结合结构域自由结合其靶抗原。

NK细胞负载的培养条件可以是或可以不是具有一个或多个特定参数的特定类型。在特定实施方案中，NK细胞的负载在特定温度下在培养物中发生，例如37℃，但在替代实施方案中，温度为36℃或38℃，或更低或更高。负载步骤的持续时间可以是任何合适的时间量，例如在1分钟至24小时或更长的范围内。例如，该范围可以在1分钟至24小时、1分钟至18小时、1分钟至12小时、1分钟至6小时、1分钟至1小时、30分钟至24小时、30分钟至18小时、30分钟至12小时、30分钟至6小时、30分钟至1小时、1-24小时、1-18小时、1-12小时、1-6小时、6-24小时、6-18小时、6-12小时、12-24小时、12-18小时或18-24小时的范围内。在具体实施方案中，细胞培养基是基础培养基或复合培养基。在一些情况下，培养物包含在预活化和/或扩增步骤期间使用的一种或多种试剂，而在其他情况下培养物不包含。在具体实施方案中，培养物包含一种或多种细胞因子，包括例如IL-12、IL-15、IL-2和IL-18中的一种或多种。在一些实施方案中，培养物包含任何种类的APC。

将有效量的组合物的抗体暴露于有效量的本公开内容的NK细胞，从而产生“嵌合抗原受体样”的复合物。具体地，抗体的抗原结合结构域例如通过作为细胞表面蛋白的抗原与NK细胞结合。多种抗体可以经历多种NK细胞，从而存在多种细胞/抗体复合物。抗体可以是任何时间的，包括单特异性、双特异性或多特异性，并且在特定情况下，抗体通过抗体的抗原结合结构域(例如使用本领域中的接合体，其是由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白)接合NK细胞和靶抗原。在其中抗体是单特异性的实例中，抗体的抗原结合结构域结合靶抗原，例如癌抗原，并且抗体的另一部分结合NK细胞，例如抗体的Fc区。在其中抗体是多特异性的情况下，抗体的一个或多个抗原结合结构域结合NK细胞(例如通过NK细胞表面抗原)并且抗体的一个或多个抗原结合结构域结合一种或多种靶抗原。多特异性抗体可以是例如双特异性、三特异性或四特异性的。在抗体是三特异性或四特异性的情况下，额外的抗原结合结构域可以结合其他细胞，例如干细胞。

在具体的实施方案中，抗体可以结合NK细胞上的任何NK细胞表面抗原(可以是或可以不是受体)，例如CD16(包括CD16a或CD16b)、CD56、c型凝集素例如NKG2D、NKG2C、共刺激分子例如CS1、DNAM、2B4、CD2、NCR或KIR，并且将NK细胞重定向至靶点，从而提高针对不同肿瘤的反应和特异性。

复合物的产生可以通过任何合适的方式进行，使得条件足以允许抗体的合适区域结合NK细胞的合适表面区域。在某些情况下，可以使用任何特定培养基。在特定情况下，使用Plasma-Lyte A和/或人血清白蛋白，而在其他情况下则不使用。一旦复合物在培养物中形成，它们在施用给受试者(例如通过输注)之前可以清洗或可以不清洗。在替代实施方案中，NK细胞和抗体分开施用，并且复合物在体内形成。

C.预活化

在一些实施方案中，NK细胞在施用于受体个体之前被预活化。预活化步骤可以或可以不发生在任何扩增步骤之前。在具体实施方案中，NK细胞用一种或多种细胞因子预活化，并且在具体实施方案中，NK细胞用IL-12、IL-15、IL-2和IL-18中的一种或多种并且包括两种、三种或更多种预活化。在使用IL-12、IL-15、IL-2和IL-18中少于全部三种的情况下，可以是IL-12和IL-15，但不是IL-18；或IL-12和IL-18，但不是IL-15；或IL-15和IL-18，但不是IL-12。IL-2可以或可以不替代IL-15。

在具体实施方案中，预活化细胞因子可以是IL-12、IL-15和IL-18。一种或多种另外的细胞因子可以用于预活化步骤。预活化可以持续较短的时间，例如5-72小时，例如10-50小时，特别是10-20小时，例如12、13、14、15、16、17、18、19、或20小时，并且特别地在某些情况下大约16小时。预活化培养物可以包含浓度为10-100ng/mL，例如40-60ng/mL，特别是45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55ng/mL，特别地约50ng/mL的IL-18和/或IL-15。在一些情况下，预活化培养物包含浓度为0.1-150ng/mL，包括浓度为1-20ng/mL，例如浓度为10ng/mL的IL-12。在替代实施方案中，可以用IL-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-21等)刺激NK细胞，并且这可以是除了IL-12、IL-15和IL-18之外的或作为其中一种或多种的替代物。在这种情况下，预活化培养物可以包含浓度为0.1-150ng/mL，例如0.5-50ng/mL，特别是1-20ng/mL，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15ng/mL，特别地约10ng/mL的IL-12。

D.扩增

在特定的实施方案中，在施用于有需要的个体之前，NK细胞被扩增以增加其数量。扩增的细胞可以是或可以不是源自预活化的NK细胞，使得预活化步骤可以在扩增步骤之前发生。NK细胞扩增步骤可以是任何合适的，以使得NK细胞群体扩增，但在特定情况下，扩增步骤利用特定的一种或多种试剂，例如在培养物中，以增强它们的扩增。在某些情况下，NK细胞可以不被扩增。IL-2或IL-15或IL-18或细胞因子的任何组合可以在扩增之前或期间添加到扩增培养物中。在具体实施方案中，NK细胞可以在烧瓶中或使用培养基/添加剂的连续灌注在几种不同的生物反应器配置之一中离体扩增。

在特定情况下，可以在扩增之前和/或之后洗涤(例如，用PBS或Plasma Lyte或人血清白蛋白或培养基或其组合)NK细胞(无论是否预活化)，例如2、3、4或5次，特别是3次。在具体实施方案中，NK细胞在人工抗原呈递细胞(aAPC)的存在下扩增。aAPC可经工程改造以表达CD137配体和/或膜结合细胞因子。膜结合细胞因子可以是膜结合IL-21(mIL-21)或膜结合IL-15(mIL-15)。在具体实施方案中，aAPC经工程改造以表达CD137配体和mIL-21。aAPC可以源自癌细胞，例如白血病细胞。aAPC可能不表达内源性I类HLA、II类HLA或CD1d分子。它们可能表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)或CD48。具体地，aAPC可以是K562细胞，例如被工程改造为表达CD137配体和mIL-21的K562细胞。工程改造可以通过本领域已知的任何方法进行，例如逆转录病毒转导，尽管可以利用任何病毒或非病毒载体。aAPC可以被辐照或可以不被辐照。扩增可以持续特定的持续时间，例如约2-30天，例如3-20天，特别是12-16天，例如12、13、14、15、16、17、18或19天，特别地大约14天。预活化的NK细胞和aAPC可以以约3:1-1:3的比例存在，例如2:1、1:1、1:2，特别是约1:2。扩增培养物还可包含一种或多种促进扩增的细胞因子，例如IL-2。IL-2可以以约10-500U/mL、例如100-300U/mL、特别是约200U/mL的浓度存在。IL-2可以在扩增培养物中补充，包括以一定频率，例如每2-3天补充。aAPC可以至少第二次添加到培养物中，例如在扩增约7天时。用于预活化和/或扩增步骤的任何细胞因子可以是重组人细胞因子。

扩增后，NK细胞可以以任何方式立即使用，例如与一种或多种抗体复合，或者它们可以被储存，例如通过冷冻保存。在某些方面，细胞可以在约1、2、3、4或5天内作为大量群体离体增殖数天、数周或数月。

活化和/或扩增的NK细胞可以分泌I型细胞因子，例如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其活化先天性和适应性免疫细胞以及其他细胞因子和趋化因子。这些细胞因子的测量可用于确定NK细胞的活化状态。另外，本领域已知的用于确定NK细胞活化的其他方法可以用于表征本公开内容的NK细胞。

因此，关于本公开内容的特定预活化和扩增方面，在具体实施方案中，用IL-12、IL15和IL-18预活化，随后用aAPC(例如表达mIL-21和CD137配体的K562细胞)扩增的NK细胞提供高效的细胞产品。因此，提供了使用本发明的NK细胞治疗各种疾病(例如癌症患者的免疫治疗)的方法。在示例性方法中，分离的NK细胞可以用细胞因子的组合(例如白介素-12(IL-12)、IL-15和/或IL-18)进行短暂(例如约16小时)的预活化，然后使用人工抗原呈递细胞(aAPC)(例如表达膜结合IL-21和CD137配体的K562饲养细胞)和/或外源IL-2进行扩增。IL-2或IL-15或IL-18或细胞因子的任何组合可以至少第二次添加到扩增培养物中。

E.其他修饰

在一些实施方案中，与天然NK细胞相比，NK细胞以一种或多种方式被修饰。NK细胞可以被人工操纵以经工程改造以表达一种或多种异源蛋白质。可替代地或另外地，可修饰NK细胞以减少或抑制一种或多种内源基因的表达。在其他情况下，NK细胞被修饰以表达一种或多种细胞因子或自杀基因。

1.工程改造的抗原受体

NK细胞可以被遗传修饰以表达一种或多种工程改造的抗原受体，包括至少一种或多种嵌合抗原受体(CAR)和/或一种或多种TCR。在具体实施方案中，工程改造的抗原受体针对靶向一种或多种癌抗原，并且该抗原可以或可以不是多特异性抗体(例如接合物)所针对的相同抗原。

NK细胞可以被修饰以编码至少一种CAR，并且CAR可以是例如第一代、第二代、或第三代或后续代。CAR针对两种或多种不同抗原可以是或可以不是双特异性的。CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。NK细胞还可以被修饰以表达受体(例如CD16、CD32和/或CD64受体)以增强其与抗体的结合。每个共刺激结构域可例如包含例如TNFR超家族成员、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD27、NKG2D、2B4M、CD40或其组合中的任何一种或多种的共刺激结构域。在具体实施方案中，CAR包含CD3ζ。在某些实施方案中，CAR缺乏一个或多个特定的共刺激结构域；例如，CAR可能缺少4-1BB和/或缺少CD28。

在具体实施方案中，细胞中的CAR多肽包含连接抗原结合结构域和跨膜结构域的胞外间隔结构域，并且这可以称为铰链。胞外间隔结构域可包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工间隔区序列或其组合。胞外间隔结构域的实例包括但不限于CD8-α铰链、CD28、由多肽例如Gly3制成的人工间隔区或IgG(例如人IgG1或IgG4)的CH1、CH3结构域。在具体情况下，胞外间隔结构域可以包含(i)IgG4的铰链、CH2和CH3区，(ii)IgG4的铰链区，(iii)IgG4的铰链和CH2，(iv)CD8-α或CD4的铰链区，(v)IgG1的铰链、CH2和CH3区，(vi)IgG1的铰链区或(vii)IgG1的铰链和CH2，(viii)CD28的铰链区，或其组合。在具体的实施方案中，铰链来自IgG1，并且在某些方面，CAR多肽包含特定的IgG1铰链氨基酸序列或由特定的IgG1铰链核酸序列编码。

CAR中的跨膜结构域可以衍生自天然来源或合成来源。当来源是天然的时，结构域在某些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自T细胞受体、CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D和DAP分子例如DAP10或DAP12的α、β或ζ链(即至少包含其跨膜区)的那些。或者，一些实施方案中的跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可存在于合成跨膜结构域的每一端。

在某些实施方案中，CAR可以与一种或多种细胞因子共表达，以在存在低量肿瘤相关抗原时改善持久性。例如，CAR可以与一种或多种细胞因子共表达，例如IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-23、IL-18、IL-21、IL-7、GMCSF或其组合。在一些实施方案中，表达CAR的NK细胞经工程改造以表达一种或多种异源细胞因子和/或经工程改造以上调一种或多种异源细胞因子的正常表达。细胞可以或可以不在与其他基因相同的载体上转导或转染一种或多种细胞因子。

编码嵌合受体的开放阅读框的序列可以从基因组DNA来源、cDNA来源获得，或者可以合成(例如，通过PCR)，或其组合。根据基因组DNA的大小和内含子的数量，可能需要使用cDNA或其组合，因为发现内含子稳定mRNA。而且，使用内源或外源非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。

预期嵌合构建体可以作为裸露DNA或在合适的载体中引入任何类型的免疫细胞中。使用裸露DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸露DNA通常是指以适当的表达方向包含在质粒表达载体中的编码嵌合受体的DNA。

或者，病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)可用于将嵌合构建体引入免疫细胞中。根据本公开内容的方法使用的合适的载体在免疫细胞中是非复制性的。已知大量基于病毒的载体，其中细胞中维持的病毒拷贝数足够低以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。非病毒载体包括质粒、转座子、纳米颗粒、脂质体、脂质、金属或其组合。

在一些实施方案中，基因工程抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指含有可变a链和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ链和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)，并且能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR是αβ形式。

通常，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖位置或功能。TCR可以存在于细胞表面或以可溶形式存在。一般来说，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)的表面，在那里其通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如Janeway等人，1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可拥有一个N端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白相关。除非另有说明，术语“TCR”应当理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。

因此，出于本文的目的，提及TCR包括任何TCR或功能片段，例如与MHC分子中结合的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可以互换使用，是指含有TCR结构域的一部分但结合全长TCR结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在某些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变a链和可变β链，其足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点，例如通常在其中每条链包含三个互补决定区时。

在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点来赋予抗原识别并确定肽特异性。通常，像免疫球蛋白一样，CDR由框架区(FR)分隔(参见例如Jores等人，1990；Chothia等人，1988；Lefranc等人，2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方案中，β-链的可变区可以含有另外的高变(HV4)区。

在一些实施方案中，TCR链含有恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如α链、β链)的胞外部分可以含有两个免疫球蛋白结构域，在N末端的可变结构域(例如V_a或Vp；通常是基于Kabat编号(Kabat等人,"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,USDept.Health and Human Services,Public Health Service NationalInstitutes of Health,1991,5^th ed.)的氨基酸1至116)，以及邻近细胞膜的一个恒定结构域(例如，a链恒定结构域或C_a，通常是基于Kabat的氨基酸117至259，β-链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，两条链形成的TCR的胞外部分包含两个近膜恒定结构域和两个含有CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，构成两条链之间的连接。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。

在一些实施方案中，TCR链可以含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在某些情况下，TCR链包含胞质尾部。在某些情况下，该结构允许TCR与如CD3的其他分子结合。例如，具有跨膜区的含有恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。

一般而言，CD3是多蛋白复合物，其可以拥有哺乳动物中的三个不同的链(γ、δ和ε)和ζ链。例如，在哺乳动物中，复合物可以包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这一特性使这些链能够与带正电荷的T细胞受体链结合。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各自包含一个保守基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM，而每个CD3δ链都有三个。一般来说，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区域，并在将信号从TCR传播到细胞中发挥作用。CD3-和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。

在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有例如通过一个或多个二硫键连接的两条单独的链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴定靶抗原(例如，癌抗原)的TCR并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，例如通过公开可获得的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公开可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，可以从患者分离高亲和力T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，靶抗原的TCR克隆已在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程改造的转基因小鼠中产生。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人，2009和Cohen等人，2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人，2008和Li，2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识合成产生。

本公开内容的CAR和TCR靶向一种或多种特定抗原。基因工程改造的抗原受体靶向的抗原是在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病况或细胞类型的背景下表达的抗原。疾病和病况包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症、免疫系统癌症，例如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，例如B、T和髓细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病况的细胞(例如肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程改造的细胞上表达。

在本方法中可以靶向任何合适的抗原。在某些情况下，抗原可能与某些癌细胞相关，但与非癌细胞不相关。示例性抗原包括但不限于来自感染原的抗原分子、自身/自体抗原、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新抗原(Linnemann等人，2015)。在特定方面，抗原包括CD19、EBNA、CD123、HER2、CA-125、TRAIL/DR4、CD20、CD70、CD38、trop2、HLA-G、CD123、CLL1、癌胚抗原、甲胎蛋白、CD56、AKT、Her3、上皮肿瘤抗原、CD319(CS1)、ROR1、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、CD5、CD23、CD30、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA、CD99、p53、突变p53、Ras、突变ras、c-Myc、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如A-Raf、B-Raf和C-Raf、细胞周期蛋白依赖性激酶)、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、黑素瘤相关抗原、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MC1R、mda-7、gp75、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、TRK受体、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、肾母细胞瘤抗原(WT1)、AFP、-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HAGE、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCR-ABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RAR、肿瘤相关钙信号转导器1(TACSTD1)TACSTD2、受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体(EGFR)(特别是EGFRvIII))、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))、VEGFR2、细胞质酪氨酸激酶(例如src家族、syk-ZAP70家族)、整合素连接激酶(ILK)、信号传导与转录活化因子STAT3、STATS和STATE、缺氧诱导因子(例如HIF-1和HIF-2)、核因子κB(NF-B)、Notch受体(例如Notch1-4)、NY ESO1、c-Met、雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)及其调节亚基、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、肾细胞癌-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250)、STEAD、TEL/AML1、GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤易位断点、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NY-BR-1、RGsS、SAGE、SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆荚蛋白、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2、fos相关抗原1、CBX2、CLDN6、SPANX、TPTE、ACTL8、ANKRD30A、CDKN2A、MAD2L1、CTAG1B、SUNC1和LRRN1。抗原序列的实例是本领域已知的，例如在数据库中：CD19(登录号NG_007275.1)、EBNA(登录号NG_002392.2)、WT1(登录号NG_009272.1)、CD123(登录号NC_000023.11)、NY-ESO(登录号NC_000023.11)、EGFRvIII(登录号NG_007726.3)、MUC1(登录号NG_029383.1)、HER2(登录号NG_007503.1))、CA-125(登录号NG_055257.1)、WT1(登录号NG_009272.1)、Mage-A3(登录号NG_013244.1)、Mage-A4(登录号NG_013245.1)、Mage-A10(登录号NC_000023.11)、TRAIL/DR4(登录号NC_000003.12)和/或CEA(登录号NC_000019.10)。

肿瘤相关抗原可源自例如前列腺、乳腺、结肠直肠、肺、胰腺、肾、间皮瘤、卵巢、肝、脑、骨、胃、脾、睾丸、子宫颈、肛门、胆囊、甲状腺或黑素瘤癌症。示例性的肿瘤相关抗原或肿瘤细胞来源的抗原包括MAGE1、3和MAGE4(或其他MAGE抗原，例如国际专利公开号WO99/40188中公开的那些)；PRAME；BAGE；RAGE、Lage(也称为NY ESO 1)；SAGE；以及HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性实例在多种肿瘤类型中表达，例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。参见例如美国专利号6,544,518。前列腺癌肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸盐、NKX3.1和前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)。

其他肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。另外，肿瘤抗原可以是自肽激素，例如全长促性腺激素释放激素(GnRH)，一种短的10个氨基酸的长肽，可用于治疗许多癌症。

抗原可以包括源自肿瘤细胞中突变的基因或源自肿瘤细胞中与正常细胞相比以不同水平转录的基因的表位区或表位肽，例如端粒酶、存活蛋白、间皮素、突变的ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P450 1B1和异常表达的内含子序列，例如N-乙酰葡萄糖氨基转移酶-V；在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特的独特型的免疫球蛋白基因的克隆重排；肿瘤抗原，其包括源自肿瘤病毒过程的表位区或表位肽，例如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；Epstein bar病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变癌胚蛋白，例如癌胚抗原和甲胎蛋白。

2.自杀基因

在具体的实施方案中，自杀基因与抗体组合疗法结合使用以控制其使用并允许在期望的事件和/或时间终止细胞疗法。将自杀基因用于转导的细胞中的目的是在需要时引发转导的细胞死亡。已被修饰以携带本公开内容所涵盖的载体的本公开内容的细胞可以包含一种或多种自杀基因。在一些实施方案中，本文所用的术语“自杀基因”定义为在施用前药或其他试剂后实现基因产物转变为杀死其宿主细胞的化合物的基因。在其他实施方案中，自杀基因编码基因产物，当需要时，该基因产物被靶向自杀基因产物的试剂(例如抗体)靶向。

在一些情况下，当接受细胞疗法和/或已经接受细胞疗法的个体表现出一种或多种不良事件的一种或多种症状(例如细胞因子释放综合征、神经毒性、过敏反应/过敏和/或中靶/脱靶肿瘤毒性(作为例子))或被认为有出现一种或多种症状的风险(包括即将出现的症状)时，细胞疗法可以经历任何种类的一种或多种自杀基因的利用。自杀基因的使用可以是计划的治疗方案的一部分，或者可以仅在认识到需要使用时才使用。在一些情况下，由于不再需要治疗，因此通过使用靶向自杀基因或其基因产物的药剂来终止细胞治疗。

自杀基因的利用可以在个体发生至少一种不良事件时发起，并且该不良事件可以通过任何方式来识别，包括根据可以或可以不从开始细胞疗法时连续的常规监测来识别。不良事件可以通过检查和/或测试来检测。在其中个体患有细胞因子释放综合征(其也可称为细胞因子风暴)的情况下，个体可能例如具有升高的炎性细胞因子(仅作为示例：干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10、IL-6和TNF-α)；发烧；疲劳；低血压；缺氧，心动过速；恶心；毛细管渗漏；心/肾/肝功能障碍；或其组合。在其中个体具有神经毒性的情况下，个体可能患有精神错乱、谵妄、发育不全和/或癫痫发作。在一些情况下，对个体进行与细胞因子释放综合征的发作和/或严重程度相关的标记物(例如C反应蛋白、IL-6、TNF-α和/或铁蛋白)的测试。

自杀基因的实例包括工程改造的不可分泌的(包括膜结合的)肿瘤坏死因子(TNF)-α突变体多肽(参见PCT/US19/62009，其通过引用整体并入本文)，并且它们可能受到结合TNF-α突变体的抗体的递送的影响。可以使用的自杀基因/前药组合的例子是单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和放线菌酮；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)和AZT；以及脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿拉伯糖苷。可以利用大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，一种所谓的自杀基因，其将前药6-甲基嘌呤脱氧核苷转化为有毒的嘌呤6-甲基嘌呤。其他自杀基因包括例如CD20、CD52、诱导型半胱天冬酶9、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α,γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。

在具体实施方案中，编码CAR的载体或本文涵盖的NK细胞中的任何载体包括一种或多种自杀基因。自杀基因可能与CAR位于同一载体上，也可能不在同一载体上。在自杀基因与CAR存在于同一载体上的情况下，自杀基因和CAR可以例如通过IRES或2A元件分开。

3.细胞因子

在一些实施方案中，表达NK细胞的细胞经工程改造以表达一种或多种异源细胞因子和/或经工程改造以上调一种或多种异源细胞因子的正常表达。细胞可以或可以不在与其他基因相同的载体上转导或转染一种或多种细胞因子。

一种或多种细胞因子可以从载体共表达，包括作为与工程改造的抗原受体和/或自杀基因分开的多肽。例如，白介素15(IL-15)是组织限制性的，只有在病理条件下才能在血清中或全身观察到它的任何水平。IL-15具有多种适合过继治疗的特性。IL-15是一种稳态细胞因子，其诱导自然杀伤细胞的发育和细胞增殖，通过减轻肿瘤驻留细胞的功能抑制来促进根除已形成的肿瘤，并抑制活化诱导的细胞死亡(AICD)。除了IL-15之外，还设想了其他细胞因子。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子和有助于用于人类应用的细胞的活化和增殖的其他分子。表达IL-15的NK细胞能够持续支持细胞因子信号传导，这对于它们在输注后的存活很有用。

在具体实施方案中，细胞表达一种或多种外源提供的细胞因子。作为一个实例，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-23、GMCSF或其组合。细胞因子可以外源地提供给NK细胞，因为它是由细胞内的表达载体表达的。在另一种情况下，细胞中的内源细胞因子在操纵内源细胞因子的表达的调节(例如在细胞因子的启动子位点处的基因重组)后被上调。在其中细胞因子在表达构建体上提供给细胞的情况下，细胞因子可以由与自杀基因和/或CAR相同的载体编码。在一些实施方案中，本公开内容涉及CAR与IL-15和任选的自杀基因的共同利用。

4.内源基因的敲除或敲低

本公开内容的NK细胞生产方法可以包括NK细胞的基因编辑以去除NK细胞中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源基因。在一些情况下，基因编辑发生在表达一种或多种异源抗原受体的NK细胞中，而在其他情况下，基因编辑发生在不表达异源抗原受体但至少在某些情况下最终将表达一种或多种异源抗原受体的NK细胞中。在具体实施方案中，基因编辑的NK细胞是扩增的NK细胞。

在特定情况下，NK细胞的一种或多种内源基因被修饰，例如表达被破坏，其中表达部分或全部降低。在特定情况下，使用本公开内容的方法敲低或敲除一种或多种基因。在特定情况下，多种基因在与本公开内容的方法相同的步骤中被敲低或敲除。在NK细胞中编辑的基因可以是任何种类的，但在具体实施方案中，该基因是其基因产物抑制NK细胞的活性和/或增殖的基因。在特定情况下，NK细胞中编辑的基因使NK细胞能够在肿瘤微环境中更有效地工作。在具体情况下，所述基因是NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、TDAG8、CD5、CD7、SLAMF7、CD38、LAG3、TCR、β2-微球蛋白、HLA、CD73和CD39中的一种或多种。在具体实施方案中，TGFBR2基因在NK细胞中被敲除或敲低。

在一些实施方案中，使用一种或多种DNA结合核酸进行基因编辑，例如通过RNA引导的核酸内切酶(RGEN)进行改变。例如，可以使用成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白来进行改变。一般而言，“CRISPR系统”统指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源CRISPR系统的背景下包括“同向重复序列”和tracrRNA处理的部分同向重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔区”)，和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。利用CRISPR系统的方法是本领域众所周知的。

F.冷冻保存

在特定情况下，本公开内容的NK细胞和/或抗体被保存在冷冻保存介质组合物中，所述组合物包含至少一种冷冻保护剂、血清(人或动物血清)或血清的非血清替代物(不是人血清或动物血清)，和至少一种细胞因子和/或至少一种生长因子。在一些情况下，冷冻保护剂是二甲亚砜(DMSO)、丙三醇、甘油、羟乙醇淀粉或其组合。非血清替代物可以是任何种类，至少包括血小板裂解物和/或血液产品裂解物(例如，人血清白蛋白)。在其中使用一种或多种(包括两种或多种)细胞因子的组合物的实施方案中，细胞因子可以是天然的或重组的或合成的蛋白质。至少一种细胞因子可以是食品和药物管理局(FDA)批准的细胞因子。细胞因子和生长因子的实例至少包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、干扰素、肿瘤坏死因子、干细胞因子、FLT3-配体、APRIL、血小板生成素、促红细胞生成素或其组合。对于血清实施方案，血清可以是动物来源的血清，例如人血清(包括人AB血清)或牛血清。当使用时，DMSO和其他冷冻保护剂可构成4-10％、4-6％、4-8％、5-10％、5-8％、6-10％、6-8％、8-10％和等等的组合物。对于其中采用血清的实施方案，血清可构成5-99％、5-95％、5-90％、5-85％、5-80％、5-75％、5-70％、5-65％、5-60％、5-55％、5-50％、5-45％、5-40％、5-35％、5-30％、5-25％、5-20％、5-15％、5-10％、10-99％、10-95％、10-90％、10-85％、10-80％、10-75％、10-70％、10-65％、10-60％、10-55％、10-50％、10-45％、10-40％、10-35％、10-30％、10-25％、10-20％、10-15％、20-99％、20-95％、20-90％、20-85％、20-80％、20-75％、20-70％、20-65％、20-60％、20-55％、20-50％、20-45％、20-40％、20-35％、20-30％、20-25％、30-99％、30-95％、30-90％、30-85％、30-80％、30-75％、30-70％、30-65％、30-60％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、40-99％、40-95％、40-90％、40-85％、40-80％、40-75％、40-70％、40-65％、40-60％、40-55％、40-50％、40-45％、50-99％、50-95％、50-90％、50-85％、50-80％、50-75％、50-70％、50-65％、50-60％、50-55％、60-99％、60-95％、60-90％、60-85％、60-80％、60-75％、60-70％、60-65％、70-99％、70-95％、70-90％、70-85％、70-80％、70-75％、80-99％、80-95％、80-90％、80-85％、90-99％、90-95％或95-99％的组合物。组合物可以包含至少或不超过10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的血清。在具体的实施方案中，组合物包含可以在组合物中处于任何浓度的血小板裂解物，但在某些实施方案中，血小板裂解物构成5-99％、5-95％、5-90％、5-85％、5-80％、5-75％、5-70％、5-65％、5-60％、5-55％、5-50％、5-45％、5-40％、5-35％、5-30％、5-25％、5-20％、5-15％、5-10％、10-99％、10-95％、10-90％、10-85％、10-80％、10-75％、10-70％、10-65％、10-60％、10-55％、10-50％、10-45％、10-40％、10-35％、10-30％、10-25％、10-20％、10-15％、20-99％、20-95％、20-90％、20-85％、20-80％、20-75％、20-70％、20-65％、20-60％、20-55％、20-50％、20-45％、20-40％、20-35％、20-30％、20-25％、30-99％、30-95％、30-90％、30-85％、30-80％、30-75％、30-70％、30-65％、30-60％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、40-99％、40-95％、40-90％、40-85％、40-80％、40-75％、40-70％、40-65％、40-60％、40-55％、40-50％、40-45％、50-99％、50-95％、50-90％、50-85％、50-80％、50-75％、50-70％、50-65％、50-60％、50-55％、60-99％、60-95％、60-90％、60-85％、60-80％、60-75％、60-70％、60-65％、70-99％、70-95％、70-90％、70-85％、70-80％、70-75％、80-99％、80-95％、80-90％、80-85％、90-99％、90-95％或95-99％的组合物。组合物可以包含至少或不超过10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的血小板裂解物。

组合物可以具有一定浓度的组分，包括细胞因子和/或生长因子。在特定情况下，任何细胞因子，包括例如IL-2、IL-21和/或IL-15，以特定浓度存在于组合物中。IL-2可以例如以1-5000、1-1000、1-500、1-100、100-5000、100-500、500-5000、500-1000或1000-5000U/mL的浓度存在。在具体情况下，IL-2以至少或不超过100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000U/mL的浓度存在于组合物中。在具体的实施方案中，IL-21以10-3000、10-2000、10-1000、10-500、10-100、100-3000、100-2000、100-1000、500-3000、500-2000、500-1000、1000-3000、1000-2000或2000-3000ng/mL的浓度存在于组合物中。IL-21在组合物中的浓度可以是至少或不超过1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750或3000ng/mL。IL-15可以以1-2000、1-1000、1-500、1-100、100-2000、100-1000、100-500、500-2000、500-1000或1000-2000ng/mL的浓度存在于组合物中。IL-15可以以至少或不超过10、50、100、500、1000、1500或2000ng/mL的浓度存在于组合物中。

包含至少一种冷冻保护剂、血清或血清的非血清替代物以及至少一种细胞因子和/或至少一种生长因子的本文涵盖的组合物还可包含多种免疫细胞和/或干细胞，各自是任何种类的细胞。在具体实施方案中，细胞是NK细胞、T细胞、B细胞、衍生自成熟骨髓或外周血细胞的NKT细胞、细胞系例如肿瘤细胞系(例如NK92或其他NK系)、造血干细胞、诱导的多能干细胞、MSC(文献中也称为“间充质干细胞”和“间充质基质细胞”的细胞群)或其混合物，其可以源自骨髓、外周血、皮肤、脂肪组织或它们的组合。在利用NK细胞的实施方案中，NK细胞可以是或可以不是扩增的NK细胞。本公开内容的实施方案还涵盖药物组合物，其包含本公开内容的任何组合物和合适的药学上可接受的载体。

在具体实施方案中，本公开内容的细胞在任何步骤被保存在以下用于低温保存介质的特定制剂中：

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具有一定浓度的特定制剂的实例可以如下使用：

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II.使用方法

本公开内容的实施方案涉及使用包含本文提供的NK细胞和抗体的组合物来治疗或预防医学疾病或病症的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的负载的、任选预活化的和任选扩增的NK细胞以及抗体，从而治疗或预防受试者的疾病，包括降低疾病的风险、降低疾病的严重程度、和/或延迟疾病的发作。在本公开内容的某些实施方案中，通过转移包含NK细胞群和抗体的组合物来治疗癌症或感染。至少在某些情况下，由于NK细胞释放促炎细胞因子，NK细胞可以逆转抗炎肿瘤微环境，并通过促进分化、活化和/或将辅助免疫细胞募集到恶性肿瘤部位来增强适应性免疫反应。

本发明的治疗方法可用于的癌症包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些。示例性实体瘤可以包括但不限于选自胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房的器官的肿瘤。示例性血液肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的进一步实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑素瘤。

癌症可以具体地具有以下组织学类型，但不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸癌；嗜氧腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性细胞瘤，恶性；sertoli细胞癌；leydig细胞肿瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；恶性雀斑黑素瘤；肢端雀斑黑素瘤；结节性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿样瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低等级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中等级/滤泡性NHL；中等级弥散性NHL；高等级免疫母细胞性NHL；高等级淋巴母细胞性NHL；高等级小非裂解细胞NHL；巨大疾病(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓细胞性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓细胞样白血病(AML)；和慢性成髓细胞白血病。

特定的实施方案涉及治疗白血病的方法。白血病是血液或骨髓的癌症，其特征在于血细胞(通常是白血细胞(白细胞))的异常增殖(通过繁殖产生)。它是被称为血液肿瘤的广泛疾病组的一部分。白血病是涵盖一系列疾病的广义术语。白血病在临床和病理上分为急性和慢性形式。

急性白血病的特征在于未成熟血细胞的快速增殖。这种拥挤使骨髓无法产生健康的血细胞。急性白血病可发生于儿童和年轻人。事实上，它是美国儿童比任何其他类型的恶性疾病更常见的死亡原因。急性白血病需要立即治疗，因为恶性细胞会迅速发展和积累，然后溢出到血液中并扩散到身体的其他器官。尽管这种疾病偶尔会导致颅神经麻痹，但中枢神经系统(CNS)受累并不常见。慢性白血病的特征是相对成熟但仍然异常的血细胞过度积聚。通常需要数月至数年的时间才能进展，细胞的产生速度比正常细胞高得多，导致血液中出现许多异常白细胞。慢性白血病主要发生在老年人中，但理论上可以发生在任何年龄组。急性白血病必须立即治疗，而慢性白血病有时会在治疗前进行一段时间的监测，以确保治疗的最大效果。

此外，这些疾病被分为淋巴细胞性或成淋巴细胞性，这表明癌变发生在通常会形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中；以及骨髓性或髓样，这表明癌变发生在通常会形成红细胞、某些类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中(参见淋巴细胞与骨髓细胞)。

急性淋巴细胞性白血病(也称为急性成淋巴细胞性白血病或ALL)是幼儿中最常见的白血病类型。这种疾病也会影响成年人，尤其是65岁及以上的老年人。慢性淋巴细胞性白血病(CLL)最常影响55岁以上的成年人。有时会发生在较年轻的成年人中，但几乎不会影响儿童。急性髓性白血病(也称为急性髓细胞样白血病或AML)在成人中比在儿童中更常见。这种类型的白血病以前被称为“急性非淋巴细胞白血病”。慢性髓性白血病(CML)主要发生在成人中。极少数儿童也会患这种疾病。

淋巴瘤是起源于淋巴细胞(脊椎动物免疫系统中的一种白细胞)的癌症类型。淋巴瘤有多种类型。根据美国国立卫生研究院的数据，淋巴瘤约占美国所有癌症病例的5％，尤其是霍奇金淋巴瘤占美国所有癌症病例的不到1％。由于淋巴系统是人体免疫系统的一部分，因此免疫系统较弱的患者(例如HIV感染或某些药物或药品治疗导致的免疫系统减弱)也有较高的淋巴瘤发病率。

在本公开内容的某些实施方案中，将包含NK细胞和抗体的组合物递送至有需要的个体，例如患有癌症或感染的个体。至少在某些情况下，这些细胞可以增强个体的免疫系统来攻击相应的癌症或致病细胞。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的包含NK细胞和抗体的组合物。在向个体提供两个或多个剂量的NK细胞/抗体的情况下，施用之间的持续时间应当足以允许在个体中繁殖的时间，并且在具体实施方案中，剂量之间的持续时间是1、2、3、4、5、6、7或更多天。

预活化(任选地)和扩增的NK细胞来源可以是任何种类，但在具体实施方案中，细胞获自例如脐带血、外周血、人胚胎干细胞库，或诱导的多能干细胞。用于治疗效果的合适剂量将是例如每剂至少10⁵个或约10⁵个至约10¹²个细胞，优选在一系列给药周期中。示例性给药方案由四个递增剂量的一周给药周期组成，在第0天至少从约10⁵个细胞开始，例如在开始患者内剂量递增方案的几周内逐渐增加至约10¹²个细胞的目标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过储库接入装置)、腹膜内和直接注射到肿瘤块中。

包含根据本发明的方法产生的NK细胞和抗体的组合物具有许多潜在用途，包括实验和治疗用途。特别地，设想这样的细胞群可用于抑制不期望的或不适当的免疫反应。在此类方法中，从患者体内取出少量NK细胞，然后在将它们重新输注到患者体内之前进行离体操作和扩增。可以以这种方式治疗的疾病的例子是自身免疫性疾病和病况，其中需要抑制免疫活性，例如对于同种异体移植耐受。治疗方法可包括从哺乳动物获得NK细胞；根据本文所述的本方法的方法离体扩增NK细胞；在足够的条件下将NK细胞暴露于抗体；以及向待治疗的哺乳动物施用包含扩增的NK细胞/抗体的组合物。

本公开内容的药物组合物可以单独使用或与可用于治疗癌症的其他公认的药剂组合使用。无论是单独递送还是与其他药剂组合递送，本公开内容的药物组合物可以通过各种途径递送至哺乳动物、特别是人体内的各个部位以实现特定效果。本领域技术人员将认识到，尽管可以使用多于一种途径进行施用，但是特定途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。例如，皮内递送可以比吸入更有利地用于治疗黑素瘤。局部或全身递送可以通过施用来完成，包括将制剂施用或滴入体腔、吸入或吹入气雾剂，或通过肠胃外引入，包括肌内、静脉内、门内、肝内、腹膜、皮下或皮内施用。

在一个实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包括：斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合症，自身免疫性艾迪生氏病，肾上腺自身免疫性疾病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性卵巢炎和睾丸炎，自身免疫性血小板减少症，白塞氏病，大疱性类天疱疮，心肌病，乳糜泻性皮炎(celiac spate-dermatitis)，慢性疲劳免疫功能障碍综合症(CFIDS)，慢性炎症性脱髓鞘性多神经病，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，CREST综合征，冷凝集素病，克罗恩病，盘状狼疮，特发性混合冷凝球蛋白血症，纤维肌痛-纤维肌炎；肾小球肾炎，格雷夫斯病，Guillain-Barre，桥本氏甲状腺炎，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA神经病，幼年型关节炎，扁平苔藓，红斑狼疮，Meniere病，混合性结缔组织病，多发性硬化，1型或免疫介导的糖尿病，重症肌无力，肾病综合征(例如轻微变化疾病，局灶性肾小球硬化或膜性肾病)，寻常型天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多软骨炎，多腺体综合征，风湿性多肌痛，多肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，牛皮癣，牛皮癣关节炎，雷诺现象，雷特综合征，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病，干燥综合征，僵硬综合征，系统性红斑狼疮，红斑狼疮，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，脉管炎(例如结节性多动脉炎，大动脉炎，颞动脉炎/巨细胞性动脉炎或疱疹样皮炎性血管炎)，白癜风和韦格纳肉芽肿病。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫疾病的一些实例包括但不限于多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，I型糖尿病，克罗恩病；溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球肾炎，强直性脊柱炎，血管炎或牛皮癣。受试者还可以患有过敏性病症，例如哮喘。

在另一个实施方案中，受试者是移植的器官或干细胞的接受者，并且本公开内容的扩增的NK细胞/抗体用于预防和/或治疗排斥。在特定的实施方案中，受试者患有移植物抗宿主病或处于发展移植物抗宿主病的风险。GVHD是使用或包含来自相关或不相关供体的干细胞的任何移植物的可能并发症。有两种GVHD，急性的和慢性的。急性GVHD出现在移植后的前三个月内。急性GVHD的体征包括手和脚上出现红色的皮疹，该皮疹可能扩散并变得更严重，具有皮肤剥落或起泡。急性GVHD也可影响胃和肠，在这种情况下会出现痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛的发黄(黄疸)指示急性GVHD已经影响了肝脏。慢性GVHD根据其严重程度进行分级：阶段/等级1是轻度的；阶段/等级4是严重的。慢性GVHD在移植后三个月或之后发展。慢性GVHD的症状与急性GVHD的症状相似，但此外，慢性GVHD可能还会影响眼睛的粘液腺、口腔的唾液腺以及润滑胃粘膜和肠道的腺体。可以利用本文公开的任何NK细胞群体。移植的器官的实例包括实体器官移植物，例如肾脏、肝脏、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或细胞移植物，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或造血或其他干细胞。移植物可以是复合移植物，例如面部组织。NK细胞，例如免疫抑制性CD19+细胞，可以在移植之前、移植的同时和/或移植之后与抗体一起施用。在一些实施方案中，包含NK细胞和抗体的组合物在移植前施用，例如在移植前至少1小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1周，至少2周，至少3周，至少4周或至少1个月施用。在一个具体的非限制性实例中，治疗有效量的包含NK细胞和抗体的组合物的施用在移植前3-5天进行。

施用至正在接受移植的患者的NK细胞/抗体可以在施用之前用对移植材料特异的抗原致敏。根据该实施方案，移植受者对移植材料的免疫/炎症反应将降低，因此，移植组织排斥的可能性被最小化。类似地，对于移植物抗宿主疾病的治疗，NK细胞可以用宿主特异性抗原致敏。根据该实施方案，接受者对自身抗原的免疫/炎症反应将降低。

在进一步的实施方案中，向受试者施用治疗有效量的包含NK细胞和抗体的组合物治疗或抑制受试者的炎症。因此，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含NK细胞和抗体的组合物以抑制炎症过程。炎性病症的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾病、败血性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨质溶解和慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。本文公开的方法还可用于治疗过敏性疾病。

每当需要免疫抑制或炎症抑制时，例如在疾病或炎症的最初体征或症状时，都可以使用包含NK细胞和抗体的组合物的施用。这些症状可能是一般性的，例如疼痛、水肿、体温升高，或可能是与受影响器官功能障碍相关的特定体征或症状。例如，在肾移植排斥反应中，可能会出现血清肌酐水平升高，而在GVHD中，可能会出现皮疹，在哮喘中，可能会出现呼吸短促和喘息。

包含NK细胞和抗体的组合物的施用还可用于预防感兴趣的受试者中的免疫介导的疾病。例如，包含NK细胞和抗体的组合物可以在移植前施用于将成为移植受体的受试者。在另一个实例中，将包含NK细胞和抗体的组合物施用于接受同种异体骨髓移植但没有T细胞耗尽的受试者。在进一步的实例中，包含NK细胞和抗体的组合物可以施用于具有糖尿病家族史的受试者。在其他实例中，将包含NK细胞和抗体的组合物施用于患有哮喘的受试者以预防哮喘发作。在一些实施方案中，在症状出现之前向受试者施用治疗有效量的包含NK细胞和抗体的组合物。与接受不包括包含NK细胞和抗体的组合物的其他治疗的患者相比，包含NK细胞和抗体的组合物的施用导致随后的免疫事件或症状(例如哮喘发作)的发生率或严重性降低，或改善的患者存活率。

在某些实施方案中，包含NK细胞和抗体的组合物与第二治疗剂组合施用。例如，第二治疗剂可以包括T细胞、免疫调节剂、单克隆抗体、化疗剂、激素、任何种类的药物、手术、放射等。在非限制性实例中，免疫调节剂是来那度胺，单克隆抗体为利妥昔单抗、奥法木单抗或鲁米利昔单抗，化疗药物为氟达拉滨或环磷酰胺。

本公开内容的组合物可以以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位(例如注射剂)单独或与其他活性剂适当组合的含有预定量的组合物。本文使用的术语单位剂型是指适合作为用于人类和动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有单独的或与其他活性剂组合的预定量的本公开内容的组合物，以足以产生所需效果的量计算，在适当时与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合。本公开内容的单位剂型的规格取决于与特定受试者中的药物组合物相关的特定药效学。

理想地，组合物中存在有效量或足够数量的分离的转导的NK细胞，并将其引入受试者体内，从而建立长期的、特异性的抗肿瘤应答，以减小肿瘤的大小或消除肿瘤生长或再生长比不进行此类处理时的结果要好。期望地，与不存在NK细胞的在其他方面相同的条件相比，重新引入受试者的NK细胞的量引起肿瘤大小的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的减少。

因此，施用的包含NK细胞和抗体的组合物的量应当考虑施用途径并且应当使得将引入足够数量的包含NK细胞和抗体的组合物，以便实现期望的治疗响应。此外，本文所述的组合物中包含的每种活性剂的量(例如，每个待接触的细胞的量或每特定体重的量)可以在不同的应用中变化。一般而言，NK细胞的浓度理想地应当足以在正在治疗的受试者中提供至少约1×10⁶至约1×10¹²个NK细胞，甚至更理想地，约1×10⁷至约5×10¹⁰个NK细胞，尽管可以使用更高例如大于5×10⁸个细胞或者更低例如小于1×10⁷个细胞的任何合适的量。给药方案可以基于良好建立的基于细胞的疗法(参见例如美国专利号4,690,915)，或者可以采用替代的连续输注策略。

这些值提供了由实施者在优化本公开内容的方法以实施本发明方法时使用的包含NK细胞和抗体的组合物范围的一般指导。本文列举的此类范围决不排除使用更高或更低量的组分，如在特定应用中可能保证的那样。例如，实际剂量和时间表可以根据组合物是否与其他药物组合物联合施用，或者根据药代动力学、药物分布和代谢的个体间差异而变化。本领域技术人员可以容易地根据特定情况的紧急情况做出任何必要的调整。

III.抗体

本公开内容的方面涉及抗体或其功能片段在还包含某些NK细胞的组合物中的使用。术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其片段，其可以与完整抗体竞争与靶抗原的特异性结合，例如通过抗原结合结构域，并且包括嵌合的、人源化的、完全人的、单特异性和多特异性(至少包括双特异性和三特异性等)抗体。本文所用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，是指作为动物免疫应答的一部分起作用的几类结构相关的蛋白质中的任一种，包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白质，以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。在具体实施方案中，抗体包含scFv。

术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(例如抗体)结合的分子或分子的一部分。抗原可以拥有一个或多个能够与不同抗体相互作用的表位。

术语“表位”包括能够通过与免疫球蛋白或T细胞受体结合而引发免疫应答的分子的任何区域或部分。表位决定簇可以包括化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。一般而言，对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先识别复杂混合物内靶抗原上的表位。

给定多肽的表位区域可以使用本领域众所周知的许多不同的表位作图技术来鉴定，包括：X射线晶体学、核磁共振波谱学、定点诱变作图、蛋白质展示阵列，参见，例如，Epitope Mapping Protocols,(Johan Rockberg和Johan Nilvebrant,Ed.,2018)HumanaPress,New York,N.Y。此类技术是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号4,708,871；Geysen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1984)；Geysen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:178-182(1985)；Geysen等人,Molec.Immunol.23:709-715(1986参见，例如，Epitope Mapping Protocols，同上。此外，还可以使用标准抗原性和亲水图来预测和鉴定蛋白质的抗原区域。

完整抗体通常由两条全长重链和两条全长轻链组成，但在一些情况下可以包括更少的链，例如天然存在于骆驼科动物中的抗体可以仅包含重链。本文公开的抗体可以仅源自单一来源或者可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以源自两种不同的抗体。例如，可变区或CDR区可以源自大鼠或鼠源，而恒定区源自不同的动物源，例如人。抗体或结合片段可以在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。除非另有说明，术语“抗体”包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其例子描述在下文中(Sela-Culang等人,Front Immunol.2013；4:302；2013)。

术语“轻链”包括全长轻链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链具有约25,000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VL)和恒定区结构域(本文缩写为CL)。轻链有两种分类，分别为kappa(κ)和lambda(λ)。术语“VL片段”是指单克隆抗体的轻链片段，其包括全部或部分轻链可变区，包括CDR。VL片段还可包括轻链恒定区序列。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。

术语“重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链具有约50,000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VH)和三个恒定区结构域(本文缩写为CH1、CH2和CH3)。术语“VH片段”是指单克隆抗体的重链片段，其包括全部或部分重链可变区，包括CDR。VH片段还可包括重链恒定区序列。重链恒定区结构域的数量将取决于同种型。VH结构域位于多肽的氨基末端，CH结构域位于羧基末端，其中CH3最接近-COOH末端。抗体的同种型可以是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE，并且由重链定义，其中有五种分类：分别是mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)链。IgG有多种亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM1和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。

抗体可以是任何同种型或分类的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对两种或更多种抗原具有特异性的杂合抗体。它们也可以是片段(例如，F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括杂合片段。免疫球蛋白还包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白质，它们通过与特定抗原结合形成复合物而像抗体一样发挥作用。术语抗体包括基因工程改造或其他修饰形式的免疫球蛋白，例如以下。

术语“单体”是指仅含有一个Ig单位的抗体。单体是抗体的基本功能单位。术语“二聚体”是指含有通过抗体重链恒定结构域(Fc或片段可结晶区)彼此连接的两个Ig单位的抗体。该复合物可以通过连接(J)链蛋白来稳定。术语“多聚体”是指含有多于两个通过抗体重链恒定结构域(Fc区)彼此连接的Ig单元的抗体。该复合物可以通过连接(J)链蛋白来稳定。

术语“二价抗体”意指包含两个抗原结合位点的抗体。两个结合位点可以具有相同的抗原特异性，或者它们可以是双特异性的，这意味着两个抗原结合位点具有不同的抗原特异性。

双特异性抗体是一类具有两个互补位的抗体，所述两个互补位具有针对两个或更多个不同表位的不同结合位点。在一些实施方案中，双特异性抗体可以是双互补位的，其中双特异性抗体可以特异性识别来自相同抗原的不同表位。在一些实施方案中，双特异性抗体可以由被称为“纳米抗体”的一对不同的单结构域抗体构建。单结构域抗体源自软骨鱼和骆驼科动物并经过修饰。可以使用对本领域技术人员来说典型的技术通过接头将纳米抗体连接在一起；此类用于选择和连接纳米抗体的方法描述于PCT公开号WO2015044386A1、WO2010037838A2和Bever等人,Anal Chem.86:7875-7882(2014)，每一篇都通过引用整体并入本文。

双特异性抗体可以构建为：完整IgG、Fab'2、Fab'PEG、双抗体，或者可选地为scFv。双抗体和scFv可以在没有Fc区的情况下构建，仅使用可变结构域，从而可能减少抗独特型反应的影响。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如，Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)，其中每一篇均通过引用整体并入。

在某些方面，通过与结合不同抗原的VH和VL区对多聚化，抗原结合结构域可以是多特异性的或异种特异性的。例如，抗体可以与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的Fc受体、或(c)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，各方面可包括但不限于针对表位和其他靶标(例如效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，可以使用多特异性抗体，并且使用本领域已知的常规方法通过短的柔性多肽链直接连接。一个这样的例子是双抗体，其是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，并且利用太短而不允许同一链上的结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，形成两个抗原结合位点。接头功能性适用于三抗体、四抗体和更高阶抗体多聚体的实施方案。(参见，例如，Hollinger等人,ProcNatl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Polijak等人,Structure 2:1121-1123(1994)；Todorovska等人,J.Immunol.Methods 248:47-66(2001))。

与双特异性完整抗体相比，双特异性双抗体也可能是有利的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。使用噬菌体展示(WO94/13804)可以容易地从文库中选择具有适当结合特异性的双抗体(和其他多肽，例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对蛋白质的特异性，则可以制备文库，其中改变另一臂并选择具有适当特异性的抗体。双特异性完整抗体可以通过如Ridgeway等人(Protein Eng.,9:616-621,1996)和Krah等人(N Biotechnol.39:167-173,2017)中所述的替代工程改造方法来制备，上述文献中的每一个都通过引用全文并入本文。

异源缀合抗体由具有不同特异性的两个共价连接的单克隆抗体组成。参见例如美国专利6,010,902，其全部内容通过引用并入本文。

以高特异性结合抗原表位的抗体分子的Fv片段的部分在本文中称为“互补位”。互补位由与抗原表位接触以促进抗原识别的氨基酸残基组成。抗体的两个Fv片段中的每一个均由二聚化构型的两个可变结构域VH和VL组成。每个可变结构域的一级结构包括三个由框架区(FR)分隔且侧接的高变环。高变环是来自任何哺乳动物的抗体分子中一级序列变异性最高的区域。术语高变环有时与术语“互补决定区(CDR)”互换使用。高变环(或CDR)的长度因抗体分子而异。来自给定哺乳动物的所有抗体分子的框架区具有高度的一级序列相似性/共有性。本领域技术人员可以使用共有的框架区来鉴定框架区和散布在框架区之间的高变环(或CDR)。高变环被赋予识别名称，以区分它们在多肽内的位置以及它们出现在哪个结构域上。VL结构域中的CDR被识别为L1、L2和L3，其中L1出现在最远端，L3出现在最靠近CL结构域的位置。CDR还可以被命名为CDR-1、CDR-2和CDR-3。L3(CDR-3)通常是给定生物体产生的所有抗体分子中变异性最高的区域。CDR是在一级结构中线性排列的多肽链区域，并通过框架区彼此分开。VL链的氨基末端(N末端)被命名为FR1。被识别为FR2的区域出现在L1和L2高变环之间。FR3出现在L2和L3高变环之间，FR4区域最靠近CL结构域。VH链重复此结构和命名法，其中包括三个标识为H1、H2和H3的CDR。可变结构域或Fv片段(VH和VL)中的大部分氨基酸残基是框架区的一部分(约85％)。抗体分子的三维或三级结构使得框架区位于分子的更内部并提供大部分结构，而CDR位于分子的外部表面。

已经开发了几种方法并且本领域技术人员可以使用这些方法来鉴定构成这些区域中的每一个的准确氨基酸。这可以使用多种多序列比对方法和算法中的任何一种来完成，这些方法和算法识别构成框架区的保守氨基酸残基，从而识别长度可能不同但位于框架区之间的CDR。已开发出三种常用的方法来鉴定抗体的CDR：Kabat(如T.T.Wu和E.A.Kabat,“AN ANALYSIS OF THE SEQUENCES OF THE VARIABLE REGIONS OF BENCEJONES PROTEINS AND MYELOMA LIGHT CHAINS AND THEIR IMPLICATIONS FOR ANTIBODYCOMPLEMENTARITY,”J Exp Med,vol.132,no.2,pp.211-250,Aug.1970中所述))；Chothia(如C.Chothia等人,“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions,”Nature,vol.342,no.6252,pp.877-883,Dec.1989中所述)；和IMGT(如M.-P.Lefranc等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomainsand Ig superfamily V-like domains,”Developmental&Comparative Immunology,vol.27,no.1,pp.55-77,Jan.2003中所述)。这些方法各自包括用于识别构成可变区的氨基酸残基的独特编号系统。在大多数抗体分子中，实际接触抗原表位的氨基酸残基出现在CDR中，尽管在某些情况下，框架区内的残基有助于抗原结合。

本领域技术人员可以使用多种方法中的任一种来确定抗体的互补位。这些方法包括：1)根据抗体可变区氨基酸序列的化学性质和表位的组成，计算预测抗体/表位结合相互作用的三级结构；2)氢氘交换和质谱；3)多肽片段化和肽作图方法，其中从全长多肽生成多个重叠的肽片段，并评估这些肽与表位的结合亲和力；4)抗体噬菌体展示文库分析，其中哺乳动物的抗体Fab片段编码基因由噬菌体表达，从而掺入噬菌体的外壳中。然后，允许表达Fab的噬菌体群体与已固定的或可以通过不同的外源表达系统表达的抗原相互作用。非结合Fab片段被洗掉，从而仅留下附着于抗原的特异性结合Fab片段。可以容易地分离结合的Fab片段并确定编码它们的基因。该方法还可用于Fab片段的较小区域，包括Fv片段或特定的VH和VL结构域(视情况而定)。

在某些方面，亲和力成熟的抗体通过其一个或多个CDR中的一种或多种修饰而增强，与不具有这些改变的亲本抗体相比，所述修饰导致抗体对靶抗原的亲和力提高。某些亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生，例如Marks等人,Bio/Technology 10:779(1992)描述了通过VH和VL结构域改组来实现亲和力成熟，噬菌体展示中使用的CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Rajpal等人,PNAS.24:8466-8471(2005)和Thie等人,Methods Mol Biol.525:309-22(2009)，其与如Tiller等人,Front.Immunol.8:986(2017)所述的计算方法结合。

嵌合免疫球蛋白是源自不同物种的融合基因的产物；“人源化”嵌合体通常具有来自人免疫球蛋白的框架区(FR)，并且一个或多个CDR来自非人类来源。

在某些方面，重链和/或轻链的部分与来自另一特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源的，只要它们表现出所需的生物活性。美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)。对于与嵌合抗体相关的方法，参见例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1985)，其每一篇均通过引用整体并入本文。CDR移植描述于例如美国专利号6,180,370,5,693,762,5,693,761,5,585,089和5,530,101，出于所有目的将其全部通过引用并入本文。

在一些实施方案中，最小化来自非人物种的抗体多肽序列优化嵌合抗体功能并降低免疫原性。来自非人抗体的非抗原识别区的特定氨基酸残基被修饰为与人抗体或同种型中的相应残基同源。一个例子是“CDR移植”抗体，其中抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个CDR，而抗体链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。为了用于人类，由非人免疫球蛋白的轻链和重链可变区的CDR1、CDR2和部分CDR3组成的V区被移植了人抗体框架区，取代了具有非人CDR的人抗体的天然存在的抗原受体。在一些情况下，相应的非人残基取代人免疫球蛋白的框架区残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基以进一步改进性能。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的)的至少一部分。参见例如Jones等人,Nature 321:522(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593(1992)；Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.1:105(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23；1035(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428(1994)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-36(1988)。

胞内抗体是结合细胞内抗原的细胞内定位的免疫球蛋白，这与结合细胞外空间中的抗原的分泌抗体相反。

多克隆抗体制剂通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。为了产生多克隆抗体，用抗原或抗原片段免疫宿主，例如兔或山羊，通常与佐剂一起，并且如果需要的话，与载体偶联。随后从宿主血清中收集针对该抗原的抗体。多克隆抗体可以针对抗原进行亲和纯化，使其具有单特异性。

单克隆抗体或“mAb”是指从来自排他性亲本细胞的同质抗体群体获得的抗体，例如，除了可能存在少量的天然存在的突变之外，该群体是相同的。每种单克隆抗体针对单一抗原决定簇。

可以利用功能性抗体片段和抗原结合片段。某些方面涉及抗体片段，例如结合和/或中和炎症介质的抗体片段。术语功能性抗体片段包括保留特异性结合抗原的能力的抗体的抗原结合片段。这些片段由可变区重链(VH)和/或轻链(VL)的各种排列构成；在一些实施方案中，包括恒定区重链1(CH1)和轻链(CL)。在一些实施方案中，它们缺少由重链2(CH2)和3(CH3)结构域构成的Fc区。抗原结合片段及其修饰的实施方案可包括：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段类型；(ii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段类型；(iii)由VH和VL结构域构成的Fv片段类型；(iv)由单个VH或VL结构域构成的单结构域片段类型dAb(Ward，1989；McCafferty等人，1990；Holt等人，2003)；(v)分离的互补决定区(CDR)区域。此类术语描述于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,NY(1989)；Molec.Biology and Biotechnology:A Comprehensive DeskReference(Myers,R.A.(ed.),New York:VCH Publisher,Inc.)；Huston等人,CellBiophysics,22:189-224(1993)；Pluckthun和Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)和描述于Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,2d ed.,Wiley-Liss,Inc.New York,N.Y.(1990)；Antibodies,4:259-277(2015)。本段中的引文全部通过引用并入。

抗原结合片段还包括准确保留至少或至多1、2或3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR)的抗体片段。含有CDR的序列与Fc区(或其CH2或CH3区)的融合物包括在该定义的范围内，包括例如直接或间接与Fc区融合的scFv也包括在本文中。

术语Fab片段意指含有VL、VH、CL和CH1结构域的抗体的单价抗原结合片段。术语Fab'片段意指大于Fab片段的单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab'片段包括VL、VH、CL和CH1结构域以及全部或部分铰链区。术语F(ab')2片段意指包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab'片段的单克隆抗体的二价抗原结合片段。F(ab')2片段包括例如两个VH和VL结构域的全部或部分，并且可以进一步包括两个CL和CH1结构域的全部或部分。

术语Fd片段意指单克隆抗体的重链片段，其包括全部或部分VH，包括CDR。Fd片段还可包括CH1区序列。

术语Fv片段意指单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括全部或部分VL和VH，并且不存在CL和CH1结构域。VL和VH包括例如CDR。单链抗体(sFv或scFv)是Fv分子，其中VL区和VH区通过柔性接头连接形成单条多肽链，从而形成抗原结合片段。单链抗体详细讨论于国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203，其公开内容通过引用并入本文。术语(scFv)2意指二价或双特异性sFv多肽链，其在其C末端包括寡聚化结构域，通过铰链区与sFv分开(Pack等人1992)。寡聚结构域包含自缔合的α-螺旋，例如亮氨酸拉链，其可以通过额外的二硫键进一步稳定。(scFv)2片段也称为“微型抗体”或“微型体”。

单结构域抗体是仅含有VH或VL结构域的抗原结合片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。

在一些情况下，利用片段可结晶区域Fc。Fc区含有两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。本文使用的术语“Fc多肽”包括源自抗体Fc区的多肽的天然形式和突变蛋白形式。包括含有促进二聚化的铰链区的此类多肽的截短形式。在一些实施方案中，可以利用掺入细胞因子(包括本文提及的那些)的抗体(例如与TRIKE一起)。

IV.药物组合物

本公开内容的药物组合物包含有效量的组合物，所述组合物包含分散在药学上可接受的载体中的NK细胞和抗体。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当时施用至动物例如人时不产生副作用、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含所述组合物的药物组合物的制备对于本领域技术人员来说是已知的，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.Lippincott Williamsand Wilkins,2005所例示的，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解制剂应满足FDA生物标准办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，其通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在药物组合物中的用途。

药物组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气雾剂形式施用，以及对于诸如注射的施用途径是否需要无菌。本公开内容的组合物可以静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、粘膜、口服、局部、区域性、吸入(例如，气雾吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜中、在脂质组合物(例如，脂质体)中、或通过普通技术人员已知的其他方法或前述方法的任何组合施用(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEd.Mack Printing Company,1990，其通过引用并入本文)。

包含NK细胞和抗体的组合物可以配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。适当时，药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的盐，或与无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。该制剂容易以多种剂型施用，例如配制用于肠胃外施用，例如可注射溶液或用于递送至肺部的气雾剂，或配制用于食物施用，例如药物释放胶囊等。

进一步根据本公开内容，适合于施用的本公开内容的组合物在具有或不具有惰性稀释剂的药学上可接受的载体中提供。载体应当是可同化的并且包括液体、半固体即糊剂或固体载体。除了任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者或其中所含组合物的治疗效果有害之外，其在用于实践本发明方法的可施用组合物中的使用是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等、或其组合。该组合物还可以包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可以通过防腐剂例如各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，所述防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

根据本公开内容，组合物与载体以任何方便且实用的方式组合，即通过溶液、悬浮液、乳化、混合、包封、吸收等。这样的程序对于本领域技术人员来说是常规的。

在本公开内容的具体实施方案中，将组合物与半固体或固体载体组合或充分混合。混合可以以任何方便的方式进行，例如研磨。还可以在混合过程中添加稳定剂，以保护组合物免于失去治疗活性，即在胃中变性。用于组合物的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等。

在进一步的实施方案中，本公开内容可以涉及药物脂质媒介物组合物的使用，所述药物脂质媒介物组合物包括含有NK细胞和抗体以及任选地水性溶剂的组合物。如本文所用，术语“脂质”将被定义为包括特征上不溶于水且可用有机溶剂萃取的多种物质中的任一种。这一大类化合物是本领域技术人员众所周知的，并且当本文使用术语“脂质”时，其不限于任何特定结构。例子包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或生产的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域众所周知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、血溶性脂质、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质、以及它们的组合。当然，本领域技术人员理解为脂质的除本文具体描述的化合物之外的化合物也包括在本发明的组合物和方法中。

本领域普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在纳米颗粒或脂质媒介物中的一系列技术。例如，包含NK细胞和抗体的组合物可以分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价键合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束或脂质体中或与胶束或脂质体复合，或者通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散体可能会或可能不会导致脂质体的形成。

施用给动物患者的本公开内容的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来确定，例如体重、病况的严重程度、所治疗的疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病和施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可以根据受试者的反应而变化。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度以及对于个体受试者的适当剂量。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物例如可占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及其中可得出的任何范围。当然，每种治疗有用的组合物中的活性化合物的量可以以使得在任何给定的化合物单位剂量中将获得合适的剂量的方式制备。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑因素诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。

在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000毫克/kg/体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在可从本文列出的数字得出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围可以基于上述数字来施用。

包含本发明的NK细胞和抗体的治疗组合物可以静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，抗生素通过静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。合适的剂量可以根据待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的反应以及主治医师的判断来确定。

治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治疗组合物。待施用的量以及具体途径和制剂在临床领域技术人员的技术范围内确定。单位剂量不需要作为单次注射施用，而是可以包括在设定的时间段内连续输注。在一些实施方案中，单位剂量包括单次可施用剂量。

根据治疗次数和单位剂量的待施用量取决于所需的治疗效果。有效剂量被理解为是指实现特定效果所需的量。在实践中，在某些实施方案中，预期10mg/kg至200mg/kg范围内的剂量可以影响这些试剂的保护能力。因此，预期剂量包括约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195和200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/天或mg/天或其中可导出的任何范围的剂量。此外，这样的剂量可以在一天内和/或在数天、数周或数月多次施用。

在某些实施方案中，药物组合物的有效剂量是可以提供约1μM至150μM的血液水平的剂量。在另一个实施方案中，有效剂量提供约4μM至100μM；或约1μM至100μM；或约1μM至50μM；或约1μM至40μM；或约1μM至30μM；或约1μM至20μM；或约1μM至10μM；或约10μM至150μM；或约10μM至100μM；或约10μM至50μM；或约25μM至150μM；或约25μM至100μM；或约25μM至50μM；或约50μM至150μM；或约50μM至100μM(或其中可导出的任何范围)的血液水平。在其他实施方案中，该剂量可以提供由施用至受试者的治疗剂产生的以下药剂血液水平：约、至少约、或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μM或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，施用至受试者的治疗剂在体内代谢为代谢的治疗剂，在这种情况下，血液水平可以指该药剂的量。或者，就治疗剂不被受试者代谢的程度而言，本文讨论的血液水平可以指未代谢的治疗剂。

A.食物组合物和制剂

在本公开内容的具体实施方案中，包含NK细胞和抗体的组合物被配制为通过食物途径施用。食物途径包括其中组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。具体地，本文公开的药物组合物可以口服、含服、直肠或舌下施用。因此，这些组合物可以用惰性稀释剂或可同化的食用载体配制，或者可以将它们封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将它们压制成片剂，或者可以将它们直接掺入饮食中的食物。

在某些实施方案中，活性化合物可以与赋形剂合并，并以可摄取片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、薄片(wafers)等形式使用(Mathiowitz等人，1997；Hwang等人，1998；美国专利号5,641,515；5,580,579和5,792,451，各自通过引用整体并入本文)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下物质：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、橙子调味剂等。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。当剂型是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有载体，例如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以是肠溶包衣的。肠溶衣防止组合物在pH呈酸性的胃或上肠中变性。参见，例如，美国专利号5,629,001。当到达小肠时，其中的碱性pH溶解包衣并允许组合物释放并被特殊细胞例如上皮肠细胞和Peyer's patch M细胞吸收。酏剂的糖浆可含有作为甜味剂的活性化合物蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，例如樱桃或橙子调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应当是药学纯的并且在所使用的量下基本上无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制备物和制剂中。

对于口服施用，本公开内容的组合物可以可选地以漱口剂、洁牙剂、口腔片剂、口腔喷雾剂或舌下口服施用制剂的形式与一种或多种赋形剂合并。例如，可将所需量的活性成分掺入适当的溶剂例如硼酸钠溶液(Dobell's溶液)中来制备漱口剂。或者，可以将活性成分掺入口服溶液中，例如含有硼酸钠、丙三醇和碳酸氢钾的口服溶液，或分散在洁牙剂中，或以治疗有效量添加到可包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂和保湿剂的组合物中。或者，可将组合物制成片剂或溶液形式，其可以被置于舌下或以其他方式溶解在口腔中。

适合于其他食物施用模式的另外的制剂包括栓剂。栓剂是用于插入直肠的各种重量和形状的固体剂型，通常含药。插入后，栓剂软化、熔化或溶解在腔液中。一般而言，对于栓剂，传统载体可包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以由含有例如约0.5％至约10％、优选约1％至约2％范围内的活性成分的混合物形成。

B.肠胃外组合物和制剂

在进一步的实施方案中，组合物可以通过肠胃外途径施用。如本文所用，术语“胃肠外”包括绕过消化道的途径。具体地，本文公开的药物组合物可以例如但不限于静脉内、皮内、肌内、动脉内、静脉内、鞘内、心室内、肿瘤内、皮下或腹膜内施用。美国专利号6,613,308；5,466,468；5,543,158；5,641,515；和5,399,363(各自特别地通过引用整体并入本文)。

游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在储存和使用的普通条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468，其特别地通过引用整体并入本文)。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须流动性达到易于注射的程度。它在制造和储存条件下必须稳定，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。

例如，对于水溶液中的肠胃外施用，如果需要的话溶液应当适当地进行缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就这一点而言，根据本公开内容，本领域技术人员将已知可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在等渗NaCl溶液中，并且添加皮下注射液或在所提议的输注部位注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,第1035-1038和1570-1580页)。取决于接受治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责施用的人员将为个体受试者确定适当的剂量。此外，对于人体施用，制剂应符合FDA生物制品办公室标准要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

通过将所需量的活性化合物与上文列举的各种其他成分(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。一般而言，分散体通过将各种无菌活性成分掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。将粉末状组合物与液体载体(例如水或盐溶液)在有或没有稳定剂的情况下组合。

C.各种药物组合物和制剂

在本公开内容的其他具体实施方案中，包含NK细胞和抗体的活性化合物组合物可以配制用于通过各种不同途径施用，例如局部(即经皮)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。

用于局部施用的药物组合物可以包括配制用于药物应用的活性化合物，例如软膏、糊剂、霜剂或粉末。软膏包括用于局部施用的所有油质、吸附性、乳液和水溶性基组合物，而霜剂和洗剂是仅包含乳液基质的那些组合物。局部施用的药物可能含有渗透促进剂，以促进活性成分通过皮肤的吸收。合适的渗透促进剂包括丙三醇、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和月桂氮卓酮(luarocapram)。用于局部施用的组合物的可能的基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和凡士林以及任何其他合适的吸收性、乳液或水溶性软膏基质。局部制剂还可以包括必要的乳化剂、胶凝剂和抗菌防腐剂，以保存活性成分并提供均匀的混合物。本发明的透皮施用还可以包括使用“贴剂”。例如，贴剂可以在固定的时间段内以预定的速率并以连续的方式提供一种或多种活性物质。

在某些实施方案中，药物组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气雾剂递送媒介物来递送。用于通过鼻气溶胶喷雾将组合物直接递送至肺部的方法已经描述于例如美国专利号5,756,353和5,804,212(各自通过引用整体并入本文)。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利号5,725,871，特别通过引用将其全部内容并入本文)的药物的递送在药物领域也是众所周知的。同样地，以聚四氟乙烯支持基质形式的经粘膜药物递送描述于美国专利号5,780,045中(特别通过引用将其全部内容并入本文)。

术语气溶胶是指分散在液化或加压气体推进剂中的液体颗粒的细碎固体的胶体系统。本发明的典型的吸入气雾剂由活性成分在液体推进剂或液体推进剂与合适溶剂的混合物中的悬浮液组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力要求而变化。气雾剂的施用将根据受试者的年龄、体重以及症状的严重程度和反应而有所不同。

V.组合疗法

在某些实施方案中，本发明的实施方案的组合物和方法涉及除包含NK细胞和抗体的组合物之外的癌症疗法。另外的疗法可以是放射疗法，手术(例如，肿块切除术和乳房切除术)，化学疗法，基因疗法，DNA疗法，病毒疗法，RNA疗法，免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法，单克隆抗体疗法、激素疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。

在一些实施方案中，另外的疗法是小分子酶抑制剂或抗转移剂的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是副作用限制剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是伽马辐照。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径疗法，HSP90抑制剂，微管蛋白抑制剂，细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。

可以相对于另外的癌症疗法(例如免疫检查点疗法)在之前、期间、之后或以各种组合施用免疫细胞疗法(除了本公开内容的组合物之外)。施用间隔可以从同时至数分钟至数天至数周。在其中免疫细胞疗法与本公开内容的组合物分开地提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，使得两种化合物将仍然能够发挥对患者有利的联合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更具体地在彼此约6-12小时内为患者提供免疫疗法和公开的组合物。在某些情况下，可能期望将治疗时间显著延长，其中在各自施用之间流逝几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

考虑到试剂的毒性(如果有的话)，本发明的实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。

A.化学疗法

根据本发明的实施方案，可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的活动方式(例如，它们是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期)进行分类。可替代地，药剂可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来进行表征。

化疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基氨基吖啶(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)，三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan))；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlornaphazine)，氯磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，甲氮芥(mechlorethamine)，盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)，美法仑(melphalan)，新恩比兴(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼氮芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，和尿嘧啶氮芥；亚硝基尿素，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲霉素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γII和卡奇霉素ωII)；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团，aclacinomysin，放线菌素(actinomycin)，安曲霉素(authrarnycin)，重氮丝氨酸，博来霉素(bleomycins)，放线菌素C(cactinomycin)，卡拉比辛(carabicin)，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素D(dactinomycin)，道诺霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星，氰基吗啉基-多柔比星，2-吡咯啉基-多柔比星，和deoxydoxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(esorubicin)，去甲氧正定霉素(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素例如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalarnycin)，橄榄霉素(olivomycins)，培洛霉素(peplomycin)，紫菜霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链唑霉素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，蝶罗呤(pteropterin)，和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯嘌呤，硫咪嘌呤，和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨(enocitabine)，和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，和睾内脂(testolactone)；抗肾上腺，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；磨茹多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼类；甲基苄肼；PSK多糖复合物；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素，黏液霉素A，杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；氮烯唑胺(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位复合物例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；能灭瘤(novantrone)；鬼臼噻吩甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；伊利替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂，甲基苄肼(procarbazine)，plicomycin，吉西他滨，那韦尔滨(navelbine)，法呢基蛋白转移酶抑制剂，跨铂(transplatinum)和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

B.放射疗法

引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也可以考虑其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最有可能的是所有这些因素影响对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持的广泛损害。X射线的剂量范围从长时间(3-4周)的50至200伦琴的每日剂量到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐照的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

C.免疫疗法

本领域技术人员将理解，其他免疫疗法(在所公开的细胞疗法之外)可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗是这样的实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化疗剂，放射性核素，蓖麻毒蛋白A链，霍乱毒素，百日咳毒素等)缀合，并用作靶向剂。可替代地，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞，除了具有TGF-βR2的敲低或敲除的细胞。

抗体-药物缀合物已成为癌症治疗剂开发的突破性方法。抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀细胞药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物结合在一起，从而产生了“经武装的”MAb，其可将有效载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送还将其在正常组织中的暴露降至最低，从而降低了毒性并改善了治疗指数。FDA批准的两种ADC药物，2011年的(本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年的/>(曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或T-DM1)验证了该方法。目前有超过30种ADC候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(Leal等人，2014)。随着抗体工程改造和接头有效负载优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的识别和验证以及靶向MAb的生成。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中的上调/高水平表达和强大的内化。

在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标志物物，即其在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标志物，并且在本发明的实施方案的背景下，这些肿瘤标志物中的任何一种都可能适于靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20，癌胚抗原，酪氨酸酶(p97)，gp68，TAG-72，HMFG，唾液酸化的路易斯抗原，MucA，MucB，PLAP，层粘连蛋白受体，erbB和p155。免疫疗法的可选择的方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，γ-IFN，趋化因子，例如MIP-1，MCP-1，IL-8和生长因子，例如FLT3配体。

目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如任何种类的干扰素、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可能被免疫检查点阻滞靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)，B7-H3(也称为CD276)，B和T淋巴细胞弱化剂(BTLA)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)，淋巴细胞激活基因-3(LAG3)，程序性死亡1(PD-1)，T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

D.手术

大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断或分期性、治愈性和姑息手术。治愈性手术包括切除(其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏)，并且可以与其他疗法(例如本发明的实施方案的治疗，化学疗法，放射疗法，激素疗法，基因疗法，免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理切除。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。

在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。可以通过使用其他抗癌疗法对该区域进行灌注、直接注射或局部应用来完成治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。

E.其他药剂

预期可以将其他药剂与本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药剂，细胞生长抑制剂和分化剂，细胞粘附抑制剂，增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接数增加细胞间信号转导将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明的实施方案的某些方面结合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附的抑制剂可改善本发明的实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑了可以将增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)与发明本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。

VI.本公开内容的试剂盒

在一些实施方案中，提供了可以包括例如NK细胞、任选地一种或多种用于产生NK细胞的培养基和组分、一种或多种抗体或用于产生抗体的试剂等的试剂盒。在一些实施方案中，制剂可以包含因子的混合物，包括适合与NK细胞组合的形式。在适当的情况下，试剂系统或任何试剂盒组分可以包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，可以将组分放入其中并且优选地适当等分。当试剂盒中存在多于一种组分时，试剂盒通常还将包含第二、第三或其他附加容器，附加组分可单独放置在其中。然而，小瓶中可以包含各种组分的组合。试剂盒的组分可以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉末形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以想到，溶剂也可以提供在另一容器装置中。试剂盒通常还包括用于将试剂盒组分封闭起来以供商业销售的装置。这样的容器可以包括所需的小瓶被保留在其中的注塑或吹塑塑料容器。试剂盒还可以包括使用说明书，例如印刷的或电子格式的，例如数字格式的。

在具体的实施方案中，试剂盒可以包含一种或多种细胞因子，包括至少IL-12、IL-15、IL18和/或IL-2，包括本文别处描述的特定浓度。试剂盒可包含任何类型的介质、冷冻保存介质的任何组分，如本文别处所述。该试剂盒可包含脐带血(包括汇集的脐带血)、任何种类的抗原呈递细胞、用于消除特定NK细胞(如本文所述)的珠子、编码一种或多种如本文所述的蛋白质的载体、NK细胞、抗体或用以产生抗体的试剂等。

个体组分也可以以浓缩的量提供在试剂盒中；在一些实施方案中，以与在具有其他组分的溶液中的浓度相同的浓度单独提供组分。组分的浓度可以提供为1x、2x、5x、10x、或20x或更高。

实施例

包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，以及因此可以认为构成其实践的优选方式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍可获得类似或相似的结果。

实施例1

组合物的制备和使用

制备包含特定NK细胞以及能够结合NK细胞的抗体的组合物，并且在特定情况下，将其以有效量给予需要治疗的个体。在具体实施例中，将对于个体来说是自体或同种异体的NK细胞以有效量施用于个体，并且NK细胞特别是脐带血细胞。NK细胞可能来自或可能不来自冷冻保存库，并且在某些情况下被冷冻保存在特定的冷冻保存介质中。在允许抗体通过适当的抗原结合NK细胞的条件下，在将有效量的NK细胞暴露于抗体之前，任选地预活化并且任选地扩增NK细胞。此后，向有需要的个体提供有效量的组合物。

实施例2

单克隆抗体和NK细胞

本实施例涵盖预载有抗体的NK细胞的制备和使用。图1显示了NK细胞扩增和抗体负载的实验程序的一个例子。NK细胞可以从已处理的血液中获得，并且在具体实施方案中分离某些NK细胞，例如在具体实施方案中是CD3-CD56+的那些。任选地，例如在IL-2和通用抗原呈递细胞或其他饲养细胞的存在下扩增NK细胞，并且扩增步骤可以具有任何合适的持续时间，例如在特定情况下长达约14天。在另一个任选的实施方案中，NK细胞在扩增之前被预活化。尽管可利用任何预活化步骤，但在具体实施方案中，预活化步骤涵盖暴露于一种或多种细胞因子，例如IL-12、IL-15和/或IL-18中的一种或多种。预活化步骤可以采取任何合适长度的持续时间，但在具体实施方案中，其长达约16小时。在该步骤之后，可以任选地扩增NK细胞，包括例如在通用抗原呈递细胞和IL-2的存在下。在扩增过程中，可以用IL2、IL-18或IL-15或这些细胞因子的任何组合再次活化培养的细胞。扩增后，NK细胞在足够使得抗体通过该抗体所针对的特定抗原结合到NK细胞的外部的条件下暴露于适量的抗体。在特定情况下，抗体是单克隆抗体。将抗体负载到NK细胞上的条件可以是在特定温度下持续特定持续时间，例如在37℃下一小时。

图2提供了与NK细胞结合的玛格妥昔单抗(抗HER2单克隆抗体)的验证。NK细胞源自脐带血，并用经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞：NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)以50:50的Click's/RPMI培养基进行正常扩增(NE)或用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)洗涤和扩增(PE)。在Click’s/RPMI培养基中，在37℃下使NK细胞负载1μg/ml玛格妥昔单抗，持续一小时，并在使用流式细胞术验证玛格妥昔单抗与NK细胞的结合之前进行清洗。未负载的NE和PE NK细胞用作阴性对照。使用Alexa-Fluor647亲和纯化的F(ab')2片段山羊抗人IgG(H+L)抗体，通过流式细胞术染色检测玛格妥昔单抗结合。该图显示，与NE NK细胞相比，PE NK细胞显示出更高水平的玛格妥昔单抗结合。直方图提供来自3个不同脐带血NK细胞捐献者的数据。

负载玛格妥昔单抗的NK细胞显示针对HER2+肿瘤细胞的增强的细胞毒性(图3)。其中提供了Xcelligence细胞毒性测定，其显示单独培养或与NK细胞以2:1的效应器与靶标(E:T)比率一起培养的HER2+SKOV3(卵巢癌)的标准化细胞指数。NK细胞正常扩增(NE)或经预活化并扩增(P+E)。将NE NK细胞与经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞:NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)一起在50:50Click’s/RPMI培养基中培养，PE细胞用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)洗涤和扩增。NK细胞不负载，或在Click’s/RPMI培养基中于37℃下负载1μg/ml玛格妥昔单抗持续1小时，然后在测定前洗涤。数据表明，玛格妥昔单抗负载增强了NE和PE NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

负载玛格妥昔单抗的NK细胞导致HER2+卵巢癌(SKOV3)的NSG小鼠模型中的肿瘤控制增强(图4)。在图4A中，存在SKOV3小鼠模型的实验计划的图解的一个例子。在图4B中，生物发光成像显示移植有用萤火虫萤光素酶(FFluc)转导的SKOV3并且未经处理或用单独的NK细胞、单独的玛格妥昔单抗或预负载有玛格妥昔单抗的NK细胞处理的小鼠中肿瘤随时间的生长。图4C提供了显示图4A中描述的四组小鼠随时间变化的平均辐照度的图。

在图5中，证明了埃万妥单抗(EGFR-MET双特异性抗体)与NK细胞结合的验证。NK细胞源自脐带血，并用经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞:NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)在50:50Click’s/RPMI培养基中正常扩增(NE)或用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后洗涤并用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)扩增(PE)。将NK细胞在37℃下在Click's/RPMI培养基中负载1μg/ml埃万妥单抗持续一小时，并进行洗涤，然后使用流式细胞术验证埃万妥单抗与NK细胞的结合。未负载的NE和PENK细胞用作阴性对照。使用Alexa-Fluor647亲和纯化的F(ab')2片段山羊抗人IgG(H+L)抗体，通过流式细胞术染色检测埃万妥单抗结合。该图显示，与NE NK细胞相比，PE NK细胞显示出更高水平的埃万妥单抗结合。直方图显示来自3个不同脐带血NK细胞供体的数据。

负载埃万妥单抗的NK细胞显示针对EGFR+/cMET+肿瘤细胞的增强的细胞毒性(图6)。铬释放测定显示，提供了以各种效应器与靶标(E:T)比例(20:1、10:1、5:1、1:1)使用3种不同的脐带血NK细胞(每次测定N＝3)的3种EGFR+/c-MET+癌细胞系SKOV3(卵巢癌)、UMRC3(肾细胞癌)、PATC148(胰腺导管腺癌)的特异性裂解。NK细胞正常扩增(NE)或经预活化并扩增(P+E)。将NE NK细胞与经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞:NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)一起在50:50Click’s/RPMI培养基中培养，PE细胞用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后洗涤并用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)洗涤和扩增。NK细胞未负载或在Click’s/RPMI培养基中于37℃下用1μg/ml埃万妥单抗负载一小时，然后在测定前洗涤。埃万妥单抗负载增强了NE和PE NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

在图7A和7B中，负载埃万妥单抗的NK细胞显示针对EGFR+/cMET+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。Xcelligence细胞毒性测定显示以2:1的效应器与靶标(E:T)比例使用3种不同的脐带血NK细胞(每次测定N＝3)的2种EGFR+/c-MET+癌细胞系SKOV3(卵巢癌；图7A)和PATC148(胰腺导管腺癌；图7B)的标准化细胞指数。NK细胞正常扩增(NE)或经预活化并扩增(P+E)。将NE NK细胞与经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞:NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)一起在50:50Click’s/RPMI培养基中培养，PE细胞用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后洗涤并用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)扩增。NK细胞未负载或在Click’s/RPMI培养基中于37℃下用1μg/ml埃万妥单抗负载一小时，然后在测定前洗涤。埃万妥单抗的负载增强了NE和PE NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

负载埃万妥单抗的NK细胞导致EGFR+/c-MET+卵巢癌(SKOV3)的NSG小鼠模型中增强的肿瘤控制(图8)。图12A提供了SKOV3小鼠模型的实验计划的图解的实例。在图8B中，生物发光成像显示移植有用萤火虫萤光素酶(FFluc)转导的SKOV3并且未经处理或用单独的NK细胞、单独的埃万妥单抗或预负载有埃万妥单抗的NK细胞处理的小鼠中肿瘤随时间的生长。图8C提供了显示图8A中描述的四组小鼠随时间变化的平均辐照度的图。

NK细胞负载有抗体的一个实例(图9)，伊马曲单抗(一种抗EGFR单克隆抗体)。NK细胞源自脐带血，并用经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞:NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)在50:50Click’s/RPMI培养基中正常扩增(NE)或用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后洗涤并用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)扩增(PE)。NK细胞在Click’s/RPMI培养基中于37℃下用1μg/ml的伊马曲单抗负载1小时，并在使用流式细胞术验证伊马曲单抗与NK细胞的结合之前进行洗涤。未负载的NE和PE NK细胞用作阴性对照。使用Alexa-Fluor647亲和纯化的F(ab')2片段山羊抗人IgG(H+L)抗体，通过流式细胞仪染色检测伊马曲单抗结合。该图显示，与NE NK细胞相比，PE NK细胞显示出更高水平的伊马曲单抗结合。直方图显示来自3个不同脐带血NK细胞供体的数据。

负载伊马曲单抗的NK细胞显示针对肿瘤细胞的增强的细胞毒性(图10)。铬释放测定显示以各种效应器与靶标(E:T)比例(20:1、10:1、5:1、1:1)使用3种不同的脐带血NK细胞(每次测定N＝3)对3种EGFR+癌细胞系(SKOV3(卵巢癌)、UMRC3(肾细胞癌)、PATC148(胰腺导管腺癌))的特异性裂解。NK细胞正常扩增(NE)或经预活化并扩增(P+E)。将NE NK细胞与经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞:NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)一起在50:50Click's/RPMI培养基中培养，PE细胞用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后洗涤并用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)扩增。NK细胞未负载或在Click’s/RPMI培养基中于37℃下用1μg/ml伊马曲单抗负载1小时，然后在测定前洗涤。数据显示，伊马曲单抗负载增强了NE和PE NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

在图11A-11C中，负载伊马曲单抗的NK细胞显示针对EGFR+肿瘤细胞的增强的细胞毒性。该图显示了Xcelligence细胞毒性测定，证明了以2:1的效应器与靶标(E:T)比例使用3种不同的脐带血NK细胞(每次测定N＝3)的3个EGFR+癌细胞系SKOV3(卵巢癌；图11A)、PATC148(胰腺导管腺癌；图11B)和UMRC3(肾细胞癌；图11C)的标准化细胞指数。NK细胞正常扩增(NE)或经预活化并扩增(P+E)。将NE NK细胞与经辐照(100Gy)的uAPC饲养细胞(饲养细胞：NK比例为2:1)和重组人IL-2(200U/ml)一起在50:50Click's/RPMI培养基中培养，PE细胞用IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)和IL-18(50ng/ml)预活化16小时，然后洗涤并用经辐照的uAPC和IL-2(200U/ml)扩增。NK细胞未负载或在Click’s/RPMI培养基中于37℃下用1μg/ml伊马曲单抗负载1小时，然后在测定前洗涤。数据表明，伊马曲单抗负载增强了NE和PENK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

负载伊马曲单抗的NK细胞导致EGFR+卵巢癌(SKOV3)的NSG小鼠模型中增强的肿瘤控制(图12)。图12A是SKOV3小鼠模型的实验计划的图解的一个例子。图12B提供了生物发光成像，显示移植有用萤火虫萤光素酶(FFluc)转导的SKOV3并且未经处理或用单独的NK细胞、单独的伊马曲单抗或预负载有伊马曲单抗的NK细胞处理的小鼠中肿瘤随时间的生长。图12C是显示图12A中描述的四组小鼠随时间变化的平均辐照度的图。

尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的设计的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围无意限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组合物、装置、方法和步骤的特定实施方案。正如本领域普通技术人员从本公开内容中将容易理解的那样，可以根据本公开内容利用目前存在的或以后将开发的与本文描述的相应实施方案执行基本上相同的功能或实现基本上相同的结果的过程、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤包括在其范围内。

Claims (97)

1.一种组合物，其包含：

(1)一个或多个脐带血来源的自然杀伤(NK)细胞；和

(2)一种或多种抗体分子，其中：

(a)所述抗体是单特异性的，其中单特异性抗体的Fc区结合NK细胞并且单特异性抗体的抗原结合结构域能够结合靶抗原；或者

(b)所述抗体是多特异性的，并且所述抗体的一个或多个抗原结合结构域结合靶抗原，并且所述抗体的另一个或多个抗原结合结构域能够结合NK细胞表面抗原。

2.权利要求1的组合物，其中所述NK细胞经扩增或未经扩增。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述NK细胞经预活化或未经预活化。

4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述多特异性抗体是双特异性的、三特异性的或多特异性的。

5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中在(a)中，通过单特异性抗体的Fc区与NK细胞的结合，组合物被进一步定义为NK细胞和单特异性抗体之间的复合物。

6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述复合物还包含与其靶抗原结合的单特异性抗体的抗原结合结构域。

7.权利要求1-4中任一项的组合物，其中在(b)中，通过结合一种或多种NK细胞表面抗原的多特异性抗体的一个或多个抗原结合结构域的结合，组合物被进一步定义为NK细胞和多特异性抗体之间的复合物。

8.权利要求1-4和7中任一项的组合物，其中所述抗体的一个或多个抗原结合结构域与其靶抗原结合。

9.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述靶抗原是干细胞抗原、自身抗原或选自以下的癌抗原：CD19、CD319(CS1)、ROR1、CD20、CD22、CD70、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD5、CD123、CD23、CD30、CD38、CD56、CD70、CD38、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、TRAIL/DR4、VEGFR2、CD33、CD47、CLL-1、U5snRNP200、CD200、BAFF-R、BCMA、CD99、HLA-G、Trop2及其组合。

10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述NK细胞表面抗原是CD16、CS1、CD56、NKG2D、NKG2C、DNAM、2B4、CD2、NCR或KIR。

11.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述脐带血的来源是来自1个供体的脐带血或汇集自2个或更多个个体脐带血单位。

12.权利要求11的组合物，其中CB汇集自3、4、5、6、7或8个单独的脐带血单位。

13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述NK细胞源自脐带血单核细胞或源自脐带血造血干细胞。

14.权利要求1-13中任一项的组合物，其中所述NK细胞是CD56+、CD3-或两者。

15.权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述组合物新鲜使用或冷冻保存。

16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述NK细胞的来源是新鲜来源或冷冻保存的储存库。

17.权利要求15或16的组合物，其中当所述NK细胞源自冷冻保存时，所述NK细胞在包含至少一种冷冻保护剂、至少一种血清或血清的非血清替代物以及任选地至少一种细胞因子和/或至少一种生长因子的培养基中冷冻保存。

18.权利要求17的组合物，其中所述冷冻保护剂是二甲亚砜(DMSO)、丙三醇、甘油、羟乙醇淀粉、葡聚糖海藻糖或其组合。

19.权利要求17或18的组合物，其中所述非血清替代物包括血小板裂解物和/或血液产品裂解物或人或动物血清白蛋白。

20.权利要求17-19中任一项的组合物，其中所述至少一种细胞因子是天然蛋白质、重组蛋白质、合成蛋白质或其混合物。

21.权利要求17-20中任一项的组合物，其中所述至少一种细胞因子是白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、干扰素、肿瘤坏死因子、干细胞因子、FLT3-配体、APRIL、血小板生成素、促红细胞生成素或其组合。

22.权利要求1-21中任一项的组合物，其中所述NK细胞包含一种或多种工程改造抗原受体。

23.权利要求22的组合物，其中所述工程改造抗原受体是嵌合抗原受体、T细胞受体或两者。

24.权利要求1-23中任一项的组合物，其中所述NK细胞表达异源细胞因子。

25.权利要求24的组合物，其中所述异源细胞因子是IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或IL-23。

26.权利要求1-25中任一项的组合物，其中所述NK细胞表达一种或多种受体以增强它们与抗体的结合。

27.权利要求26的组合物，其中所述受体是Fc受体。

28.权利要求26的组合物，其中所述受体是CD16、CD32、CD64或其组合。

29.权利要求1-28中任一项的组合物，其中所述NK细胞表达自杀基因。

30.权利要求1-29中任一项的组合物，其中所述组合物包含在包含一种或多种冷冻保护剂的溶液或固体中。

31.权利要求1-30中任一项的组合物，其中所述组合物包含在药学上可接受的载体中。

32.一种产生权利要求1-31中任一项的组合物的方法，包括以下步骤：

(a)任选地在包含有效量的以下物质的培养物中扩增NK细胞：

(1)选自IL-2、IL-15、IL-18、IL-21及其组合的细胞因子；和

(2)抗原呈递细胞/饲养细胞或NK活化珠；和

(b)向NK细胞提供抗体分子，并且当扩增时在扩增之前和/或之后向NK细胞提供抗体分子。

33.权利要求32的方法，其中所述方法包括在扩增步骤之前和/或之后的预活化步骤，其中所述NK细胞在包含有效浓度的IL-2、IL-12、IL-15和IL-18中的一种或多种的培养物中预活化。

34.权利要求33的方法，其中所述培养物包含有效浓度的IL-2、IL-12、IL-15和IL-18中的两种或更多种。

35.权利要求33或34的方法，其中所述培养物包含有效浓度的IL-2、IL-12、IL-15和IL-18中的三种或更多种。

36.权利要求32-35中任一项的方法，其中所述培养物包含有效浓度的IL-12、IL-15和IL-18。

37.权利要求32-36中任一项的方法，其中在培养物中使用IL-12代替IL-15。

38.权利要求32-37中任一项的方法，其中提供步骤进一步定义为将所述NK细胞与所述抗体分子一起培养特定的持续时间或紧接在输注之前将所述NK细胞和所述抗体分子组合。

39.权利要求38的方法，其中所述持续时间为约5分钟至约24小时或更长。

40.权利要求38或39的方法，其中培养物包含Plasma-Lyte A和/或人血清白蛋白。

41.权利要求32-40中任一项的方法，其中在培养后，将所述组合物输注至受体受试者中而不首先清洗。

42.权利要求32-40中任一项的方法，其中在培养后，在一次或多次洗涤后将所述组合物输注至受体受试者中。

43.权利要求32-42中任一项的方法，其中所述NK细胞耗尽CD3+、CD14+和/或CD19+细胞。

44.权利要求43的方法，其中所述耗尽步骤发生在所述预活化步骤之前，和/或在用饲养细胞和/或NK细胞活化珠扩增之前，和/或在用一种或多种细胞因子培养之前，和/或在输注之前。

45.权利要求32-44中任一项的方法，还包括从脐带血获得NK细胞的步骤，其中所述脐带血不包含脐带组织。

46.权利要求32-45中任一项的方法，其中所述抗原呈递细胞是人工的(aAPC)。

47.权利要求46的方法，其中所述aAPC表达CD137配体。

48.权利要求46或47的方法，其中所述aAPC还表达膜结合细胞因子。

49.权利要求48的方法，其中所述膜结合细胞因子是膜结合IL-21(mIL-21)或膜结合IL-15(mIL-15)。

50.权利要求46-49中任一项的方法，其中所述aAPC基本上不表达内源性I类HLA、II类HLA或CD1d分子。

51.权利要求46-50中任一项的方法，其中所述aAPC表达ICAM-1(CD54)和/或LFA-3(CD58)或CD48。

52.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述aAPC进一步定义为白血病细胞来源的aAPC。

53.权利要求52的方法，其中所述白血病细胞来源的aAPC是经工程改造以表达CD137配体和/或mIL-21的K562细胞。

54.权利要求53的方法，其中所述K562细胞经工程改造以表达CD137配体和mIL-21。

55.权利要求46-54中任一项的方法，其中所述aAPC已通过逆转录病毒转导进行工程改造。

56.权利要求46-55中任一项的方法，其中所述aAPC是经辐照的。

57.权利要求32-56中任一项的方法，其中所述预活化步骤持续10-20小时。

58.权利要求32-57中任一项的方法，其中所述预活化步骤持续14-18小时。

59.权利要求32-58中任一项的方法，其中所述预活化步骤持续16小时。

60.权利要求32-59中任一项的方法，其中用于所述预活化步骤的培养物包含浓度为1-1000ng/mL的IL-18和/或IL-15。

61.权利要求32-60中任一项的方法，其中用于所述预活化步骤的培养物包含浓度为1-1000ng/mL的IL-18和/或IL-15。

62.权利要求32-61中任一项的方法，其中用于所述预活化步骤的培养物包含浓度为1-1000ng/mL的IL-18和/或IL-15。

63.权利要求32-62中任一项的方法，其中用于所述预活化步骤的培养物包含浓度为0.1-1000ng/mL的IL-12。

64.权利要求32-63中任一项的方法，其中用于所述预活化步骤的培养物包含浓度为1-1000ng/mL的IL-12。

65.权利要求32-64中任一项的方法，其中用于所述预活化步骤的培养物包含浓度为10ng/mL的IL-12。

66.权利要求32-65中任一项的方法，还包括在所述扩增步骤之前和/或之后洗涤预活化的NK细胞。

67.权利要求32-66中任一项的方法，其中在所述扩增步骤期间用IL-12、IL-15、IL-18、IL-2或其任何组合活化NK细胞至少两次或更多次。

68.权利要求67的方法，其中洗涤进行多次。

69.权利要求34-68中任一项的方法，其中扩增持续5-60天。

70.权利要求32-69中任一项的方法，其中所述扩增持续12-16天。

71.权利要求32-69中任一项的方法，其中所述扩增持续18-24天。

72.权利要求32-71中任一项的方法，其中所述预活化的NK细胞和aAPC以3:1至1:3的比例存在于扩增培养物中。

73.权利要求72的方法，其中所述预活化的NK细胞和aAPC以1:2的比例存在于扩增培养物中。

74.权利要求32-73中任一项的方法，其中扩增培养物还包含IL-2。

75.权利要求74的方法，其中所述IL-2以10-500U/mL的浓度存在。

76.权利要求75的方法，其中所述IL-2以100-300U/mL的浓度存在。

77.权利要求76的方法，其中所述IL-2以200U/mL的浓度存在。

78.权利要求32-77中任一项的方法，其中所述IL-12、IL-18、IL-15和/或IL-2是重组的。

79.权利要求32-78中任一项的方法，其中每2-3天在所述扩增培养物中补充IL-2。

80.权利要求32-79中任一项的方法，其中至少第二次将APC添加至所述扩增培养物中。

81.权利要求32-80中任一项的方法，其中所述方法的一个或多个步骤在无血清培养基中进行。

82.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-31中任一项的组合物。

83.权利要求82的方法，其中所述疾病或病症是癌症、炎症、移植物抗宿主疾病、移植排斥、自身免疫病症、免疫缺陷疾病、B细胞恶性肿瘤或感染。

84.权利要求82或83的方法，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。

85.权利要求84的方法，其中所述血液癌症是选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)的白血病。

86.权利要求82-85中任一项的方法，其中所述NK细胞对于所述受试者是同种异体的。

87.权利要求82-86中任一项的方法，其中所述NK细胞对于所述受试者是自体的。

88.权利要求82的方法，其中所述病症是移植物抗宿主病(GVHD)。

89.权利要求82的方法，其中所述病症是多发性硬化症、炎性肠病、类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、接触性超敏反应、哮喘或干燥综合征。

90.权利要求82-89中任一项的方法，其中所述受试者是人。

91.权利要求82-90中任一项的方法，进一步包括向所述受试者施用至少第二治疗剂。

92.权利要求91的方法，其中所述至少第二治疗剂是治疗有效量的一种或多种抗癌剂、一种或多种免疫调节剂和/或一种或多种免疫抑制剂。

93.权利要求92的方法，其中所述抗癌剂是化学疗法、放射疗法、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。

94.权利要求92的方法，其中所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗体、化疗剂、辐射、趋化因子、白介素或者趋化因子或白介素的抑制剂。

95.权利要求91-94中任一项的方法，其中所述组合物和/或所述至少第二治疗剂静脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌内、内窥镜下、病灶内、经皮、皮下、局部地或通过直接注射或灌注施用。

96.权利要求91-95中任一项的方法，其中所述第二治疗剂是抗体。

97.权利要求96的方法，其中所述抗体是单克隆、双特异性或多特异性抗体。