CN117292748A - 一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法 - Google Patents
一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117292748A CN117292748A CN202311238199.7A CN202311238199A CN117292748A CN 117292748 A CN117292748 A CN 117292748A CN 202311238199 A CN202311238199 A CN 202311238199A CN 117292748 A CN117292748 A CN 117292748A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- influence
- factor
- curve
- value
- obtaining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 title claims abstract description 171
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 96
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 title claims abstract description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 84
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 33
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 24
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 claims description 13
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 claims description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 claims description 5
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 abstract description 22
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 abstract description 22
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108010036164 Glutathione synthase Proteins 0.000 description 5
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 3
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000002225 anti-radical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- -1 gamma-glutamine amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06N—COMPUTING ARRANGEMENTS BASED ON SPECIFIC COMPUTATIONAL MODELS
- G06N3/00—Computing arrangements based on biological models
- G06N3/02—Neural networks
- G06N3/08—Learning methods
- G06N3/084—Backpropagation, e.g. using gradient descent
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Evolutionary Computation (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Software Systems (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Artificial Intelligence (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Databases & Information Systems (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Computational Linguistics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Computing Systems (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Bioethics (AREA)
Abstract
本发明涉及微生物与酶技术领域，提出了一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，包括：获取影响酶活性的影响因素，获得影响因素的影响曲线，将影响曲线分为第一影响曲线和第二影响曲线，根据第一影响曲线和第二影响曲线得到每个影响点的同质距离，根据同质距离‑得到每种影响因素同质独立系数；获得影响因素的三维响应曲面和等高线图，根据每个影响因素的三维响应曲面和等高线图得到每个影响因素的显著值，得到每个影响因素的优化权重和优化顺序，得到每个影响因素的最佳参数，根据优化顺序和最佳参数完成谷胱甘肽生产中酶活性的优化。本发明获取了生产工艺优化的先后顺序，提高了谷胱甘肽双功能合成酶GshF的催化效率和谷胱甘肽含量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物与酶技术领域，具体涉及一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法。
背景技术
谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性三肽，几乎存在身体的每一个细胞内，谷胱甘肽通常呈白色或者无色结晶粉末状，谷胱甘肽具有多方面的生理功能，例如抗自由基，抗衰老，提高人体免疫力，抗氧化作用等等，因此谷胱甘肽被广泛应用在医药、美白产品、食品等多个领域内。根据是否具有活性，谷胱甘肽被分为还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽。
谷胱甘肽的生产方法很多，有化学合成法、萃取法、酶法和发酵法等，其中化学合成法适合大规模谷胱甘肽的生产，但化学合成的谷胱甘肽分离十分困难，造成产品纯度不同且成本高；发酵法是目前工业上生产谷胱甘肽的主要方法；萃取法是目前使用较少的方法；酶法是指利用酶来催化三种氨基酸合成谷胱甘肽，主要由制作合成酶，合成酶分步催化两个流程，在酶法合成的过程中，随着生成的谷胱甘肽逐渐增多，生成的谷胱甘肽会与合成酶发生反应，就会造成中间产物积累导致谷胱甘肽产量降低的问题。另一方面在酶催化的过程中，诱导温度、诱导时机和诱导剂浓度会影响到合成酶的活性，现有的对诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度等条件进行优化时，需要人为进行大量对照组实验，优化过程复杂且精度较低，因此对谷胱甘肽合成酶表达条件的优化是酶法制谷胱甘肽的关键环节。
发明内容
本发明提供一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，以解决现有的对诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度等条件进行优化时，需要人为进行大量对照组实验，优化过程复杂且精度较低的问题，所采用的技术方案具体如下：
本发明提供了一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，该方法包括以下步骤：
获取影响酶活性的影响因素，采集每个影响因素在工艺生产中的取值范围；
根据每个影响因素的取值范围获得影响曲线，影响曲线上的点为影响点，将影响曲线分为第一影响曲线和第二影响曲线，根据第一影响曲线的酶活性最大值和第一影响曲线的酶活性最大值与第一影响曲线每个影响点的酶活性值的差值、第二影响曲线的酶活性最大值和第二影响曲线的酶活性最大值与第二影响曲线每个影响点的酶活性值的差值得到每个影响点的同质距离，根据第一影响曲线和第二影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离以及第一影响曲线与第二影响曲线中所有影响点的同质距离的累加和的乘积得到两种影响因素之间的影响相关系数，根据第一影响曲线和所有第二影响曲线的影响相关系数得到每个影响因素同质独立系数；
将任意一个影响因素记为第一影响因素，另外一个影响因素记为第二影响因素，获得第一影响因素与每个第二影响因素的三维响应曲面和等高线图，根据每个影响因素的所有三维响应曲面的曲率最大值、等高线图中相邻等高线欧式距离最小值得到每个影响因素的显著值，根据每个影响因素的显著值和同质独立系数得到每个影响因素的优化权重；
根据每个影响因素的优化权重得到每个影响因素的优化顺序，根据每个影响因素的同质独立系数得到每个影响因素的最佳参数，根据每个影响因素的优化顺序和最佳参数估计谷胱甘肽在大规模生产中的总体产量，完成谷胱甘肽生产中酶活性的优化。
优选的，所述影响曲线的横坐标为每种影响因素的值，纵坐标为酶活性值，影响曲线的横坐标范围为每个影响因素在工艺生产中的取值范围，得到取值范围内每个影响因素的值对应的酶活性值。
优选的，所述根据第一影响曲线的酶活性最大值和第一影响曲线的酶活性最大值与第一影响曲线每个影响点的酶活性值的差值、第二影响曲线的酶活性最大值和第二影响曲线的酶活性最大值与第二影响曲线每个影响点的酶活性值的差值得到每个影响点的同质距离的方法为：
将第一影响曲线的酶活性最大值与每个影响点的最大值作差记为第一差值，将第一影响曲线的酶活性最大值与第一差值的比值记为第一比值，将第二影响曲线的酶活性最大值与每个影响点的最大值作差记为第二差值，将第二影响曲线的酶活性最大值与第二差值的比值记为第二比值，将同一个影响点的第一比值的绝对值与第二比值的绝对值作差得到影响点的同质距离。
优选的，所述根据第一影响曲线和第二影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离以及第一影响曲线与第二影响曲线中所有影响点的同质距离的累加和的乘积得到两种影响因素之间的影响相关系数的方法为：
式中，i表示第i个影响因子，j表示第j个影响因子，为第一影响曲线li和第二影响曲线lj上第x个影响点对应的同质距离，X是第一影响曲线li上点的影响点的数量，γ(li,lj)表示第一影响曲线li和第二影响曲线lj的豪斯多夫Haudorff距离，Oi,j为第i种影响因素与第j种影响因素之间的影响相关系数。
优选的，所述根据第一影响曲线和所有第二影响曲线的影响相关系数得到每个影响因素同质独立系数的方法为：
将第一影响因素与所有第二影响因素之间的影响相关系数相加获取第一影响因素的同质独立系数。
优选的，所述获得第一影响因素与每个第二影响因素的三维响应曲面和等高线图的方法为：
将第一影响因素和第二影响因素作为响应面分析算法的两个自变量，将酶活性作为因变量，使用响应面分析算法获取第一影响因素和第二影响因素的三维响应曲面和等高线图。
优选的，所述根据每个影响因素的所有三维响应曲面的曲率最大值、等高线图中相邻等高线欧式距离最小值得到每个影响因素的显著值的方法为：
式中，表示以影响因素i，j为自变量时对应影响曲面中曲率的最大值，Mi,j是以影响因素i，j为自变量时对应的等高线图，dmin(Mi,j)是等高线图Mi,j中相邻等高线欧式距离的最小值，n是影响因素的数量，ωi是影响因素i的显著值。
优选的，所述根据每个影响因素的显著值和同质独立系数得到每个影响因素的优化权重的方法为：
将第一影响因素的显著值与其余所有第二影响因素的显著值作差后相加得到第一加值，将所述第一加值与第一影响因素的同质独立系数的乘积记为第一影响因素的优化权重。
优选的，所述根据每个影响因素的同质独立系数得到每个影响因素的最佳参数的方法为：
利用BP神经网络得到影响因素的最佳参数，优化算法为Adam算法，神经网络的输入为每种影响因素的同质独立系数，神经网络的输出为每种影响因素的最佳参数。
优选的，所述根据每个影响因素的优化顺序和最佳参数估计谷胱甘肽在大规模生产中的总体产量的方法为：
将影响因素的优化权重按照从大到小的方式排序，将此排序结果作为生成谷胱甘肽过程中的生产工艺的优化顺序，按照优化权重的排列结果，在酶法生成谷胱甘肽的流程中依次对影响因素的参数进行设置，使参数为最佳参数，使用荧光实验法对谷胱甘肽含量进行检测。
本发明的有益效果是：本发明提出了一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，传统酶法生成谷胱甘肽的条件优化是通过控制变量法实现的，忽略了多种酶活力影响因素之间的相关关系且没有考虑多种影响因素之间的优化顺序。针对上述问题，本发明在单因素实验基础上利用响应面分析RSM算法对多种因素之间的相关关系进行分析并构建同质独立系数和优化权重，同质独立系数考虑多种对谷胱甘肽双功能合成酶GshF酶活性具有相似影响关系的影响因素和不相似影响关系的影响因素之间的相关关系，优化权重的有益效果在于对影响谷胱甘肽双功能合成酶GshF酶活性的多种影响因素进行排序，获取了生产工艺优化的先后顺序，避免了无顺序优化时影响因素之间的关联对酶活性的影响，提高了谷胱甘肽双功能合成酶GshF的催化效率和谷胱甘肽含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的一个实施例所提供一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法的流程示意图；
图2为诱导温度的影响曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
酶法合成谷胱甘肽的关键在于筛选获得高性能的谷胱甘肽合成酶系和高效率的ATP再生体系，其中ATP是合成酶生产谷胱甘肽过程中大量消耗的能量提供者。选择以谷胱甘肽双功能合成酶GshF作为酶法生产谷胱甘肽中的反应酶可以有效避免中间产物的影响，而谷胱甘肽双功能合成酶GshF的性能高低可以通过酶活性进行评价，在酶法合成谷胱甘肽的过程中，存在多种影响酶活性的因素，这些因素通过影响酶活性从而影响生产的谷胱甘肽含量。本发明中针对影响因素包括：诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、PH大小、ATP浓度、Mg2+浓度。
请参阅图1，其示出了本发明一个实施例提供的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法流程图，该方法包括以下步骤：
步骤S001，采集每个影响因素在工艺生产中的取值范围。
酶法生产谷胱甘肽的主要步骤有：首先在体外选择L-Glu、L-Cys和Gly三种氨基酸或者对应盐为底物；选择谷胱甘肽合成酶系为催化剂；利用合成酶的两步催化消耗ATP生成GSH。合成酶的两步催化过程如下：
第一步是在γ-谷氨基酸半胱氨酸合成酶的作用下，将L-Glu与L-Cys合成谷氨基酸半胱氨酸；
第二步是在谷胱甘肽合成酶的作用下，将谷氨基酸半胱氨酸与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。
对于影响因素来说，每种影响因素对生成谷胱甘肽含量的影响是不同的，因此本实施例根据酶法生成谷胱甘肽的工艺的生产标准获取每种影响因素的取值范围作为初始数据，所述取值范围都可以通过对应传感器获取，例如温度传感器获取温度的取值范围等等，对于诱导温度获取最低温度tmin和最高温度tmax作为温度的取值范围[tmin,tmax]，对于PH浓度获取最小值pmin和最大值pmax作为取值范围[pmin,tmax]，将诱导时机、诱导剂浓度、ATP浓度、Mg2+浓度取值范围分别记为[smin,smax]、[jmin,jmax]、[amin,amax]、[gmin,gmax]。
至此，基于各类传感器采集待分析的每种影响因素的取值范围作为初始数据。
步骤S002，获取每个影响因素的影响曲线，根据影响曲线的中影响点的同质距离和影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离计算每种影响因素的同质独立系数。
由于多种影响因素对酶活性的影响不同，因此首先对每种影响因素，在相应的取值范围内进行单因素的测试实验，单因素实验是只有一个自变量对应一个因变量的实验，在本实施例中，自变量分别是诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、PH大小、ATP浓度、Mg2+浓度，因变量是谷胱甘肽双功能合成酶GshF的活性。根据上述获取的各影响因素的取值范围分别进行单因素实验，将实验结果以曲线形式记录，每个实验结果中，横坐标是自变量的取值，纵坐标是谷胱甘肽双功能合成酶GshF的酶活性，在此以诱导温度作为自变量说明，诱导温度对酶活性的实验结果如图2所示，将图中曲线记为影响曲线Lt，其余影响因素对应的实验结果按照相同的形式保存，每种影响因素都会对应一个影响曲线，单因素实验为公知技术，具体过程不再详细赘述。
根据单因素的实验结果，获取每个影响因素对酶活性的影响力曲线，得到每个影响因素对酶活性之间的相关关系分别是：随着诱导时机、诱导温度、PH、ATP浓度的逐渐增大酶活性从低到高上升到最大值后逐渐减小；随着Mg2+浓度的逐渐增大酶活性从低到高上升到最大值后趋于稳定。
根据上述得到的每个影响因素的取值范围通过单因素实验得到每个影响因素对应的酶活性的取值范围。
除此之外，温度的高低会影响到谷胱甘肽双功能合成酶GshF自身的稳定性，当诱导温度较高时，稳定性随时间的增加大幅度下降，酶活性也大幅度下降；当诱导温度较低时，稳定性随时间增大小幅度下降到稳定值后趋于稳定。
根据上述步骤获取了每种影响因素对谷胱甘肽双功能合成酶GshF酶活性的具体影响关系后可以看出，部分影响因素对酶活性的影响关系是类似的，因此本实施例考虑各种影响因素之间的相关关系，如果两种或多种影响因素之间互不影响且对酶活性的影响关系又比较接近，那么这类影响因素之间的优化顺序只需要考虑哪种影响因素能更快使得酶活性达到最大值，加快谷胱甘肽双功能合成酶GshF的催化效率，如果两种或多种影响因素之间相互影响，那么在优化过程中还需要考虑多种因素对合成酶稳定性的综合影响。
基于上述分析构建同质独立系数H，用于表征多种影响因素之间的相关关系，以第i种影响因素对应的同质独立系数为例，记第i种影响因素对应的影响曲线为第一影响曲线，其余的曲线为第二影响曲线，将影响曲线的横坐标点记为影响点，将影响曲线进行归一化，本实施例中利用多曲线最大值归一化方法将影响曲线的横坐标归一化到相同范围内，多曲线最大值归一化方法的原理是将多条曲线的横坐标映射到[0,1]的范围内，多曲线最大值归一化可以利用Origin软件实现，具体过程不再赘述。
根据第一影响曲线和第二影响曲线的酶活性最大值，每个影响点的酶活性值得到每个影响点的同质距离，公式如下：
式中，Di,max为第一影响曲线li的酶活性最大值，Dj,max为第二影响曲线lj的酶活性最大值，Di,x为第一影响曲线li上第x个影响点的酶活性值，Dj,x为第二影响曲线lj上第x个影响点的酶活性值，为第一影响曲线li和第二影响曲线lj上第x个影响点对应的同质距离。/>的作用是表征两条影响曲线上相同顺序的点对酶活性影响大小的差异。
计算第一影响曲线和第二影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离，豪斯多夫Haudorff距离的计算为公知技术，具体过程不再赘述，根据第一影响曲线和第二影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离、第一影响曲线和第二影响曲线中所有影响点的同质距离得到两种影响因素之间的影响相关系数，将第一影响曲线和所有第二影响曲线的影响相关系数的和得到同质独立系数，公式如下：
式中，为第一影响曲线li和第二影响曲线lj上第x个影响点对应的同质距离，X是第一影响曲线li上点的影响点的数量，γ(li,lj)表示第一影响曲线li和第二影响曲线lj的豪斯多夫Haudorff距离，Oi,j为第i种影响因素与第j种影响因素之间的影响相关系数，n为影响因素的数量，Hi为第i个影响因素的同质独立系数，在本实施例中影响因素为：诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、PH大小、ATP浓度、Mg2+浓度，因此本发明中n的值为6。
同质独立系数反映了第i种影响因素对酶活性的影响关系与剩余几种影响因素的相关关系，第i种影响曲线上的影响点与第j种影响曲线上的影响点对酶活力的影响程度越相似，同质距离越小；两条影响曲线之间的距离越小，说明两条影响曲线结构越相似，对酶活性的影响程度越相似，影响相关系数Oi,j越小，两种影响因素之间对酶活性的影响越是不会相互干扰，同质独立系数Hi越大，在生产工艺优化过程中越应该考虑第i种影响因素对酶活性的影响程度，因为它对酶活性的影响独立于其他相同影响作用的影响因素。同质独立系数的有益效果在于在优化过程中考虑了多种影响因素之间的相关关系，避免在生成谷胱甘肽过程中出现优化多种影响因素之间相互抑制导致酶活性变化缓慢的问题。
至此，通过对多条影响因素的影响曲线的处理，获得每种影响因素的同质独立系数。
步骤S003，获得任意一个影响因素和其余每个影响因素的三维响应曲面和等高线图，基于三维响应曲面和等高线图获得每个影响因素的优化权重。
在上述单因素实验的基础上获取酶活性的取值范围，其次基于所有影响因素进行响应面分析RSM算法，响应面分析RSM算法是一种多个自变量对应一个因变量的算法，通过确定性实验模拟真实极限状态曲面。响应面分析RSM算法的输出为三维响应曲面和等高线图，三维响应曲面和等高线图能直观反应交互作用对响应值的影响程度，曲面越陡，等高线越密集，则影响越显著，假如诱导温度，ATP浓度作为自变量得到的等高线图中线比较密集，说明诱导温度，ATP浓度对酶活性的影响程度越大，越应该优先优化这两个影响因素，避免后续优化过程中，这些影响因素轻微变动导致酶活性出现巨大波动。在本发明中响应面分析实验的设计过程为，每次选取任意两个影响因素作为自变量，需要说明的是，任意选取的两个影响因素不能为同一影响因素，本发明中有6种影响因素，一个因变量，即酶活性。每次响应面分析实验都会得到对应的三维响应曲面和等高线图。
根据三维响应曲面中的曲率最大值、等高线图中相邻等高线欧氏距离的最小值以及每种影响因素的同质独立系数得到每种影响因素的优化权重，公式如下：
式中，表示以影响因素i，j为自变量时对应影响曲面中曲率的最大值，Mi,j是以影响因素i，j为自变量时对应等高线图，dmin(Mi,j)是等高线图Mi,j中相邻等高线欧式距离的最小值，欧式距离的计算为公知技术，具体过程不再详细赘述。n是本发明中影响谷胱甘肽双功能合成酶GshF酶活性的影响因素的种类，ωi是影响因素i的显著值，ωj是影响因素j的显著值，ωi的含义是影响因素对酶活性影响的显著程度，ωi越大，影响越显著。Hi是影响因素i的同质独立系数，Wi是影响因素i的优化权重。
至此，通过响应面分析RSM算法的处理，得到影响因素i在生成谷胱甘肽工艺优化过程中的优化权重。
步骤S004，根据同质独立系数得到最佳参数，并且将优化权重排序，根据优化权重的排列结果输入最佳参数得到的结果比例估计谷胱甘肽在大规模生产中的总体产量。
根据上述步骤获取每个影响因素对应的同质独立系数和优化权重，影响因素的优化权重越大，说明同等条件下，此影响因素对生成谷胱甘肽含量的影响程度越大，在工业生产中越应该首先优化。分别计算每个影响因素的优化权重，并按照从大到小的顺序排序，将排序结果作为生成谷胱甘肽过程中的生产工艺的优化顺序。本发明中利用神经网络获取每种影响因素的最佳参数，本发明中所述神经网络为BP神经网络，以Adam算法为优化算法，神经网路的输入为每种影响因素的同质独立系数，神经网络的输出为每种影响因素的最佳参数，所述最佳参数为酶活性达到最大值时各影响因素对应的参数值，神经网络的训练为公知技术，具体过程不再赘述。
利用神经网络获取谷胱甘肽合成酶生产过程中每个影响因素的最佳参数后，按照优化权重的排列结果，在酶法生成谷胱甘肽的流程中依次对影响因素的参数进行设置，使参数为最佳参数，并对生产的谷胱甘肽含量进行测定，谷胱甘肽含量的测量方法主要有HPLC高效液相色谱法、紫外分光光度法、荧光实验法三种。其中荧光实验法具有操作简便、灵敏度高、反应快、生产物稳定等优点，因此本发明利用荧光实验法分别对生产工艺优化前后的谷胱甘肽含量进行检测，具体的检测流程为：将O－邻苯二甲醛(OPA)作为络合剂，将络合剂与生产的谷胱甘肽在偏磷酸－磷酸钠－EDTA缓冲液(PH8.0)中进行反应，最后通过测定生成的荧光物质OPA的波长来判断谷胱甘肽含量。获取多次生产工艺优化后谷胱甘肽含量与优化前谷胱甘肽含量的对比结果，根据对比结果获取合成酶生产工艺优化后谷胱甘肽含量的提升比例，利用提升比例估计谷胱甘肽在大规模生产中的总体产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
获取影响酶活性的影响因素，采集每个影响因素在工艺生产中的取值范围；
根据每个影响因素的取值范围获得影响曲线，影响曲线上的点为影响点，将影响曲线分为第一影响曲线和第二影响曲线，根据第一影响曲线的酶活性最大值和第一影响曲线的酶活性最大值与第一影响曲线每个影响点的酶活性值的差值、第二影响曲线的酶活性最大值和第二影响曲线的酶活性最大值与第二影响曲线每个影响点的酶活性值的差值得到每个影响点的同质距离，根据第一影响曲线和第二影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离以及第一影响曲线与第二影响曲线中所有影响点的同质距离的累加和的乘积得到两种影响因素之间的影响相关系数，根据第一影响曲线和所有第二影响曲线的影响相关系数得到每个影响因素同质独立系数；
将任意一个影响因素记为第一影响因素，另外一个影响因素记为第二影响因素，获得第一影响因素与每个第二影响因素的三维响应曲面和等高线图，根据每个影响因素的所有三维响应曲面的曲率最大值、等高线图中相邻等高线欧式距离最小值得到每个影响因素的显著值，根据每个影响因素的显著值和同质独立系数得到每个影响因素的优化权重；
根据每个影响因素的优化权重得到每个影响因素的优化顺序，根据每个影响因素的同质独立系数得到每个影响因素的最佳参数，根据每个影响因素的优化顺序和最佳参数估计谷胱甘肽在大规模生产中的总体产量，完成谷胱甘肽生产中酶活性的优化。
2.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述影响曲线的横坐标为每种影响因素的值，纵坐标为酶活性值，影响曲线的横坐标范围为每个影响因素在工艺生产中的取值范围，得到取值范围内每个影响因素的值对应的酶活性值。
3.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述根据第一影响曲线的酶活性最大值和第一影响曲线的酶活性最大值与第一影响曲线每个影响点的酶活性值的差值、第二影响曲线的酶活性最大值和第二影响曲线的酶活性最大值与第二影响曲线每个影响点的酶活性值的差值得到每个影响点的同质距离的方法为：
将第一影响曲线的酶活性最大值与每个影响点的最大值作差记为第一差值，将第一影响曲线的酶活性最大值与第一差值的比值记为第一比值，将第二影响曲线的酶活性最大值与每个影响点的最大值作差记为第二差值，将第二影响曲线的酶活性最大值与第二差值的比值记为第二比值，将同一个影响点的第一比值的绝对值与第二比值的绝对值作差得到影响点的同质距离。
4.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述根据第一影响曲线和第二影响曲线的豪斯多夫Haudorff距离以及第一影响曲线与第二影响曲线中所有影响点的同质距离的累加和的乘积得到两种影响因素之间的影响相关系数的方法为：
式中，i表示第i个影响因子，j表示第j个影响因子，为第一影响曲线li和第二影响曲线lj上第x个影响点对应的同质距离，X是第一影响曲线li上点的影响点的数量，γ(li,lj)表示第一影响曲线li和第二影响曲线lj的豪斯多夫Haudorff距离，Oi,j为第i种影响因素与第j种影响因素之间的影响相关系数。
5.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述根据第一影响曲线和所有第二影响曲线的影响相关系数得到每个影响因素同质独立系数的方法为：
将第一影响因素与所有第二影响因素之间的影响相关系数相加获取第一影响因素的同质独立系数。
6.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，
所述获得第一影响因素与每个第二影响因素的三维响应曲面和等高线图的方法为：
将第一影响因素和第二影响因素作为响应面分析算法的两个自变量，将酶活性作为因变量，使用响应面分析算法获取第一影响因素和第二影响因素的三维响应曲面和等高线图。
7.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述根据每个影响因素的所有三维响应曲面的曲率最大值、等高线图中相邻等高线欧式距离最小值得到每个影响因素的显著值的方法为：
式中，表示以影响因素i，j为自变量时对应影响曲面中曲率的最大值，Mi,j是以影响因素i，j为自变量时对应的等高线图，dmin(Mi,j)是等高线图Mi,j中相邻等高线欧式距离的最小值，n是影响因素的数量，ωi是影响因素i的显著值。
8.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述根据每个影响因素的显著值和同质独立系数得到每个影响因素的优化权重的方法为：
将第一影响因素的显著值与其余所有第二影响因素的显著值作差后相加得到第一加值，将所述第一加值与第一影响因素的同质独立系数的乘积记为第一影响因素的优化权重。
9.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，
所述根据每个影响因素的同质独立系数得到每个影响因素的最佳参数的方法为：
利用BP神经网络得到影响因素的最佳参数，优化算法为Adam算法，神经网络的输入为每种影响因素的同质独立系数，神经网络的输出为每种影响因素的最佳参数。
10.根据权利要求1所述的一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法，其特征在于，所述根据每个影响因素的优化顺序和最佳参数估计谷胱甘肽在大规模生产中的总体产量的方法为：
将影响因素的优化权重按照从大到小的方式排序，将此排序结果作为生成谷胱甘肽过程中的生产工艺的优化顺序，按照优化权重的排列结果，在酶法生成谷胱甘肽的流程中依次对影响因素的参数进行设置，使参数为最佳参数，使用荧光实验法对谷胱甘肽含量进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311238199.7A CN117292748B (zh) | 2023-09-25 | 一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311238199.7A CN117292748B (zh) | 2023-09-25 | 一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117292748A true CN117292748A (zh) | 2023-12-26 |
| CN117292748B CN117292748B (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010078585A (ko) * | 2001-06-20 | 2001-08-21 | 복성해 | 효소역학을 이용한 산화형·환원형 글루타치온의 정량적고속측정방법 |
| CN101955890A (zh) * | 2010-10-12 | 2011-01-26 | 天津科技大学 | 一株镉盐抗性面包酵母及其应用 |
| CN102220400A (zh) * | 2011-05-12 | 2011-10-19 | 北京化工大学 | 一种体外合成谷胱甘肽的方法 |
| CN103627691A (zh) * | 2012-08-24 | 2014-03-12 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用 |
| US20150141617A1 (en) * | 2013-09-18 | 2015-05-21 | Universität Bielefeld | Production and purification of active eukaryotic formylglycinegenerating enzyme (fge) variants |
| CN109414491A (zh) * | 2016-05-10 | 2019-03-01 | 免疫医疗有限责任公司 | 预防蛋白质二硫键还原 |
| CN116042545A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-05-02 | 江南大学 | 一种酶活性提高的谷胱甘肽双功能合成酶突变体s722a及其应用 |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010078585A (ko) * | 2001-06-20 | 2001-08-21 | 복성해 | 효소역학을 이용한 산화형·환원형 글루타치온의 정량적고속측정방법 |
| CN101955890A (zh) * | 2010-10-12 | 2011-01-26 | 天津科技大学 | 一株镉盐抗性面包酵母及其应用 |
| CN102220400A (zh) * | 2011-05-12 | 2011-10-19 | 北京化工大学 | 一种体外合成谷胱甘肽的方法 |
| CN103627691A (zh) * | 2012-08-24 | 2014-03-12 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 一种固定化谷胱甘肽合成酶及其制备和应用 |
| US20150141617A1 (en) * | 2013-09-18 | 2015-05-21 | Universität Bielefeld | Production and purification of active eukaryotic formylglycinegenerating enzyme (fge) variants |
| CN109414491A (zh) * | 2016-05-10 | 2019-03-01 | 免疫医疗有限责任公司 | 预防蛋白质二硫键还原 |
| CN116042545A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-05-02 | 江南大学 | 一种酶活性提高的谷胱甘肽双功能合成酶突变体s722a及其应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 刘晓冬: "谷胱甘肽双功能合成酶的定向进化及酶法合成谷胱甘肽的研究", 中国优秀硕士电子期刊网, no. 01, 15 January 2019 (2019-01-15) * |
| 廖鲜艳;朱至;陈坚;堵国成;: "响应面分析法优化重组大肠杆菌生物合成谷胱甘肽的条件", 工业微生物, no. 06, 15 December 2007 (2007-12-15) * |
| 时新玲, 李志军, 王锐: "土壤磷扩散的影响因素研究", 水土保持通报, no. 05, 30 October 2003 (2003-10-30) * |
| 李佳慧: "新型双功能谷胱甘肽合成酶在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达及条件优化", 中国优秀硕士电子期刊网, no. 03, 15 March 2020 (2020-03-15) * |
| 王大慧, 卫功元: "谷胱甘肽的应用前景及生产研究现状", 化学与生物工程, no. 03, 25 June 2004 (2004-06-25) * |
| 罗星;袁中一;罗贵民;赵辅昆;: "S-腺苷甲硫氨酸合成酶反应条件的优化", 工业微生物, no. 02, 15 April 2008 (2008-04-15) * |
| 陈颖;陈荣;: "海洋双壳类谷胱甘肽S-转移酶活性测定条件的优化", 海洋环境科学, no. 04, 15 August 2007 (2007-08-15) * |
| 黄仁贵;刘佳;: "提取方法对植物多糖生物活性的影响研究进展", 食品与机械, no. 11, 28 November 2016 (2016-11-28) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lin et al. | Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose‐limited fed‐batch cultivations of Escherichia coli | |
| Komives et al. | Bioreactor state estimation and control | |
| Yu et al. | Effective and stable porcine interferon-α production by Pichia pastoris fed-batch cultivation with multi-variables clustering and analysis | |
| Schaub et al. | Advancing biopharmaceutical process development by system-level data analysis and integration of omics data | |
| Yan et al. | Recent progress of commercially available biosensors in china and their applications in fermentation processes | |
| Ding et al. | Enhancing L-malate production of Aspergillus oryzae FMME218-37 by improving inorganic nitrogen utilization | |
| CN107408161B (zh) | 用于创建发酵模型的计算机实现的方法 | |
| CN117292748B (zh) | 一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法 | |
| CN117292748A (zh) | 一种用于酶法生产谷胱甘肽的酶活性优化方法 | |
| CN110462018A (zh) | 用于控制生物技术过程的方法 | |
| Giuseppin et al. | Metabolic modeling of Saccharomyces cerevisiae using the optimal control of homeostasis: a cybernetic model definition | |
| Zhu et al. | Microbial transglutaminase production by Streptoverticillium mobaraense: Analysis of amino acid metabolism using mass balances | |
| Jia et al. | Evaluation of the sub-optimal induction strategies for heterologous proteins production by Pichia pastoris Mut+/Mut S strains and related transcriptional and metabolic analysis | |
| Wang et al. | A method of graphically analyzing substrate‐inhibition kinetics | |
| Ye et al. | L-Glutamate biosensor using a novel L-glutamate oxidase and its application to flow injection analysis system | |
| Cunha et al. | Indirect method for quantification of cellular biomass in a solidscontaining medium used as pre-culture for cellulase production | |
| Christensen et al. | Growth and proton exchange in recombinant Escherichia coli BL21 | |
| CN104450499A (zh) | 一种基于支持向量机的毕赤酵母发酵过程预警方法 | |
| Yoo et al. | Fed‐batch fermentation for the production of α‐amylase by Bacillus amyloliquefaciens | |
| JP6014426B2 (ja) | 高効率バイオエタノール製造方法 | |
| CN104593306A (zh) | 一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法 | |
| Náhlík et al. | On-line parameter and state estimation of continuous cultivation by extended Kalman filter | |
| Ritzka et al. | Fermentation monitoring and process control | |
| Borowiak et al. | A straightforward logistic method for feeding a fed-batch baker's yeast culture | |
| CN103509883A (zh) | 新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240517 Address after: 518000, Building 4B, Phase III, Baishida Garden, No. 3033 Taibai Road, Luohu District, Shenzhen, Guangdong Province Applicant after: Cheng Jingwei Country or region after: China Address before: 450000 no.379, north section of Mingli Road, Zhengdong New District, Zhengzhou City, Henan Province Applicant before: Henan University Country or region before: China |
|
| GR01 | Patent grant |