CN117286156A - 一种狂犬病毒mRNA疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药和病毒学领域，具体涉及预防和/或治疗狂犬病毒感染的mRNA疫苗，特别是人用mRNA疫苗。特别地，本发明提供用于预防和/或治疗狂犬病毒感染的编码狂犬病毒糖蛋白G的多核苷酸(特别是mRNA)、组合物以及疫苗制剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药和病毒学领域，具体涉及预防和/或治疗狂犬病毒感染的人用mRNA疫苗。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)感染引起的一种病症严重、病死率极高的自然疫源性的人兽共患病，死亡率几乎100％，目前尚无有效的治疗措施，只能预防。在我国，暴露后免疫比暴露前预防的成本效益更高，成为主要的预防方式。狂犬病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，狂犬病毒属(Lyssavirus)，其病毒颗粒呈子弹状，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。病毒基因组为单链不分节段的负链RNA，大小12kb左右。狂犬病毒暴露后会有一个潜伏期，然后表现为流感样症状，最终由随后的进行性脑脊髓炎导致严重神经萎缩症状。
目前，我国人用狂犬病疫苗主要是灭活疫苗，如人二倍体细胞(HDC)疫苗和纯化的vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)。虽然这些疫苗能够有效预防狂犬病的传播，但是仍然存在不足之处，例如，HDC增殖缓慢、病毒产量低、疫苗成本高，以及纯化的vero细胞中DNA残留导致肿瘤的潜在风险。因此，需要一种制备安全、便捷，质量稳定的疫苗。而mRNA疫苗能很好地符合这些需要，因其体内重组突变风险低、免疫效力高、开发周期短、生产设施简便、疫苗生产周期短而前景广阔。
狂犬病毒糖蛋白(G蛋白)是狂犬病毒的主要免疫保护性抗原，是所有正在提议的新狂犬病疫苗中唯一存在的病毒成分。G蛋白比较保守，可以诱导特异性中和抗体的产生，也可刺激机体产生细胞免疫，在抵抗狂犬病毒的攻击中起到决定性的作用。目前一些包含狂犬病毒G蛋白编码区的人用mRNA疫苗正处于实验室或临床研究阶段，如德国CureVac公司、英国GSK公司、国内珠海丽凡达公司，但狂犬病的防控仍然需要更安全和有效的人用狂犬mRNA疫苗，其将会为防控狂犬病提供新的技术手段。
发明内容
本发明提供一种多核苷酸，其包含编码狂犬病毒糖蛋白G的编码区，其中所述糖蛋白G包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，并且其中所述编码区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10的核苷酸序列具有至少90％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述糖蛋白G包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述编码区包含选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10的核苷酸序列。
在一实施方案中，其中所述多核苷酸为RNA。
在一实施方案中，所述RNA进一步包含5’-UTR、3’-UTR和poly(A)序列中的一个或多个。优选地，所述RNA包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20和21中任一项的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明的多核苷酸。
在一实施方案中，所述组合物还包含包封所述多核苷酸的脂质。
在一实施方案中，所述组合物包含脂质纳米颗粒或脂质多聚复合物。
在一实施方案中，其中包封所述多核苷酸的脂质包含阳离子脂质、非阳离子脂质和聚乙二醇修饰的脂质；任选地，所述组合物还包含阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物与所述多核苷酸缔合为复合物，共同包封在脂质中形成脂质多聚复合物。
本发明还提供一种疫苗制剂，其包含本发明的多核苷酸或组合物。
在一实施方案中，其中包封所述多核苷酸的脂质包含10-70摩尔％的M5、10-70摩尔％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、10-70摩尔％的胆固醇和0.05-20摩尔％的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)2000；优选地，所述脂质为摩尔比为40:15:43.5:1.5的M5、DOPE、胆固醇和(DMG-PEG)2000，
在一实施方案中，所述疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
本发明提供本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂在制备用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的药物中的用途。
本发明还提供一种用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用本发明的多核苷酸(特别是RNA)、组合物或疫苗制剂。优选地，所述多核苷酸，组合物或疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
本发明还提供本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂，用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染。
本发明还提供一种暴露后预防的方法，所述方法包括：给有需要的受试者以1-1-1-1-1免疫程序、2-1-1免疫程序、2-2免疫程序或2-1免疫程序施用本发明的多核苷酸(特别是RNA)、组合物或疫苗制剂。
在一些实施方案中，所述有需要的受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
附图说明
图1显示狂犬病毒mRNA疫苗构建及其体外验证。(A)mRNA疫苗制备示意图。(B)通过流式细胞术分析LPP-mRNA(即Ori、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8、Opti-9)在HEK293细胞中的表达结果。以平均荧光强度(Median FluorescenceIntensity,MFI)进行比较分析，NC组为阴性对照组。
图2显示本发明的LPP-mRNA制剂在小鼠中是具有免疫原性的。(A)接种本发明的LPP-mRNA制剂(2μg)和辽宁成大人用狂犬病疫苗(0.2dose)的实验方案。(B)疫苗诱导的小鼠血清中针对狂犬病毒糖蛋白G的结合抗体的滴度水平。(C)疫苗诱导的小鼠血清中针对狂犬病毒糖蛋白G的中和抗体的滴度水平，结果显示为几何平均值±SEM，N＝5。
图3显示Opti-4LPP-mRNA制剂保护小鼠抵抗致死性的狂犬病病毒攻击感染。(A)显示通过三个不同剂量的Opti-4LPP-mRNA制剂(2μg，0.4μg，0.08μg)，辽宁成大人用狂犬病疫苗(Vero细胞)(1/25dose，1/125dose，1/125dose)免疫小鼠并进行标准攻毒株CVS-24攻毒的实验方案。(B)在初免后第14天，疫苗诱导的小鼠血清中针对狂犬病毒糖蛋白G的结合抗体的滴度水平(结果显示为几何平均值±SEM)。(C)在初免后第7天和第14天，疫苗诱导的小鼠血清中针对狂犬病毒糖蛋白G的中和抗体的滴度水平(结果显示为几何平均值±SEM)。(D)攻毒后21天小鼠的存活。(E)攻毒后21天小鼠的体重变化(结果显示为几何平均值±SEM)。N＝10。
图4显示Opti-4LPP-mRNA制剂(1μg/剂)在不同免疫程序下免疫小鼠所诱导的小鼠血清中针对狂犬病毒(RABV)假病毒的中和抗体滴度水平(结果显示为几何平均值±SEM)。(A)1-1-1-1-1免疫程序(在第0、3、7、14和28天分别注射1剂)。(B)2-1-1免疫程序(在第0天注射2剂，并在第7天和第21天分别注射1剂)。(C)2-2免疫程序(在第0天注射2剂，并在第7天注射2剂)。(D)2-1免疫程序(在第0天注射2剂，在第7天注射1剂)。
图5显示Opti-4LPP-mRNA制剂(0.4μg)通过不同施用途径(肌肉注射和腹腔注射)免疫小鼠所诱导的小鼠血清中针对狂犬病毒(RABV)假病毒的中和抗体滴度水平(结果显示为几何平均值±SEM)。
具体实施方案
一般定义和术语
本文引用的所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书和指南等，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不应理解为承认本公开无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学相关术语均为相应领域内广泛使用的术语(参见，例如，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，表述“包括”、“包含”、“含有”和“具有”是开放式的，表示包括所列举的元素、步骤或组分但不排除其他未列举的元素、步骤或组分。表述“由……组成”不包括未指定的任何元素、步骤或组分。表述“基本上由……组成”是指范围限于指定的元素、步骤或组分，加上不显著影响要求保护的主题的基本和新颖性质的任选存在的元素、步骤或组分。应当理解，表述“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖在表述“包含”的含义之内。
如本文所用，除非上下文另外指明，单数形式的表述“一个”、“一种”或“这个”包括复数指代。术语“一个或多个”或者“至少一个”涵盖1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个。
本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独列举地加入本说明书。除非明确指出相反，在本文示出的数值或范围均由“约”修饰，表示所列举或声称的数值或范围±20％、±10％、±5％或±3％。
除非另有说明，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。
如本文所用，术语“野生型”表示该序列是天然存在的并且未经人为修饰的，包括天然存在的突变体。
如本文所用，关于序列的术语“％相同性”是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。两个序列之间的差异可以分布在待比较序列的局部区域(区段)或整个长度上。通常在对区段或“比较窗口”最佳比对之后，确定两个序列之间的相同性。最佳比对可以手动进行，或者借助于本领域已知算法，包括但不限于Smith andWaterman,1981,Ads App.Math.2,482和Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443描述的局部同源性算法，Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444描述的相似性搜索方法，或使用计算机程序，例如Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA进行。例如，可以利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站公共可用的BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性。
通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用这个数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将这个结果乘以100，获得％相同性。在一些实施方案中，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的区域给出相同性程度。在一些实施方案中，对参考序列的整个长度给出相同性程度。可以用本领域已知的工具进行确定序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。
在本文中，“核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及其衍生物。如本文所用，“核糖核苷酸”是核糖核酸(RNA)的构成物质，由一分子碱基，一分子五碳糖，一分子磷酸组成，其是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2’位置具有羟基的核苷酸。而“脱氧核糖核苷酸”是脱氧核糖核酸(DNA)的构成物质，也由一分子碱基，一分子五碳糖，一分子磷酸构成，其是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2’位置的羟基被氢取代的核苷酸，是染色体的主要化学成分。“核苷酸”通常由代表其中碱基的单字母来指代：“A(a)”指含有腺嘌呤的脱氧腺苷酸或腺苷酸，“C(c)”指含有胞嘧啶的脱氧胞苷酸或胞苷酸，“G(g)”指含有鸟嘌呤的脱氧鸟苷酸或鸟苷酸，“U(u)”指含有尿嘧啶的尿苷酸，“T(t)”指含有胸腺嘧啶的脱氧胸苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，用于指脱氧核糖核苷酸的聚合物(脱氧核糖核酸，DNA)或核糖核苷酸的聚合物(核糖核酸，RNA)。“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可以互换使用，用来表示多核苷酸中核苷酸的排序。本领域人员应当理解，DNA编码链(有义链)与其编码的RNA可以看作具有相同的核苷酸序列，DNA编码链序列中的脱氧胸苷酸对应其编码的RNA序列中的尿苷酸。
如本文所用，RNA的“二级结构”主要取决于碱基组成，其是介于一级结构和三级结构之间的结构，能存储较多高级结构信息。RNA二级结构复杂，可以是各种特定的环、突起和螺旋类型。RNA二级结构可以从多方面影响细胞过程，包括影响RNA稳定性、RNA定位、RNA转录、RNA加工，甚至蛋白质的翻译等。携带更加稳定的二级结构的mRNA分子具有更高的体内稳定性。
如本文所用，术语“表达”包括核苷酸序列的转录和/或翻译。因此，表达可以涉及转录物和/或多肽的产生。术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录为RNA(转录物)的过程。术语“体外转录”指在不含细胞的系统中(例如在适当的细胞提取物中)体外合成RNA，特别是mRNA(参见，例如Pardi N.,Muramatsu H.,Weissman D.,KarikóK.(2013).In:Rabinovich P.(eds)Synthetic Messenger RNA and Cell MetabolismModulation.Methods in Molecular Biology(Methods and Protocols),vol 969.HumanaPress,Totowa,NJ.)。可以用于产生转录物的载体又称为“转录载体”，其中包含转录所需的调控序列。术语“转录”涵盖“体外转录”。
如本文所用，“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，比如基因，cDNA或者mRNA都能作为模板去合成其他生物过程中的多聚物和大分子，只要已经有明确的核苷酸序列或者有明确的氨基酸序列。因此一个基因编码蛋白是指基因的mRNA通过转录和翻译在细胞中或其它生物系统中产生蛋白。
如本文所用，术语“多肽”指包含通过肽键共价连接的两个以上氨基酸的聚合物。“蛋白”可以包含一条或多条多肽，其中多肽之间通过共价或非共价方式相互作用。除非另有说明，“多肽”和“蛋白”可以互换使用。
如本文所用，术语“宿主细胞”指用于接受、保持、复制、表达多核苷酸或载体的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是在其中表达本发明的多肽的细胞。
如本文所用，“抗原”是指进入机体后可以引起机体获得性免疫应答的分子，此免疫应答可能涉及抗体的产生，或特定的免疫原活性细胞，或者两者同时发生。本领域技术人员应当理解任何大分子，几乎包括所有蛋白质或肽段可以作为抗原。更进一步，抗原可以来自重组或者基因组DNA或RNA。本领域技术人员应当理解任何在本文的DNA或RNA，它们的核苷酸序列或者部分核苷酸序列可以编码能引起机体获得性免疫的蛋白。更进一步，本领域技术人员应当理解一个抗原不需要单独地只编码一个基因的全长核苷酸序列。显而易见地，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列形成不同的混合物去诱导应答的发生。更进一步，本领域技术人员应当理解抗原不需要完全被一个基因所编码。显而易见地，抗原可以被合成生成，也可以来源于生物样本。生物样本包括但不限于组织样本，肿瘤样本，细胞或生物流体。
如本文所用，“抗体”是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它是一种免疫球蛋白，由B淋巴细胞产生。抗体的单体是一个Y形的分子，有4条多肽链组成。其中包括两条相同的重链，以及两条相同的轻链，之间由双硫键连接在一起。每条重链50kDa，每条轻链25kDa，轻重链间存在二硫键链接。其独特之处在于对结合伙伴的高亲和力和特异性。
如本文所用，“疫苗”是指包含活性成分(例如本发明的多核苷酸)的组合物，它能通过接种引起接种对象免疫应答。在具体实施方案中，它诱导的免疫应答能提供免疫保护，并足以预防和/或减轻与病原体或疾病感染相关的至少一种症状。根据本发明，本文所述的多核苷酸或组合物可以作为疫苗，用于在有需要的受试者中提供针对狂犬病毒的预防性和/或治疗性免疫。
如本文所用，术语“中和抗体”是指能够中和，即防止、抑制、降低或干扰病原体在宿主(例如宿主生物体或宿主细胞)中引发和/或保持感染的能力的抗体或其片段。根据本发明，用本发明的疫苗进行接种的受试者中可以产生针对狂犬病毒糖蛋白G的中和抗体，例如在受试者的免疫血清中。可以使用本领域已知的方法测量免疫血清中的中和抗体滴度水平。
狂犬病毒
如本文所用，术语“狂犬病毒”是一种弹状病毒，包含单链不分节段的负链RNA，是狂犬病的病原体。其病毒RNA编码5种主要蛋白质：核蛋白(N-protein)、磷蛋白(P-protein)、基质蛋白(M-protein)、糖蛋白(G-protein)和RNA依赖的RNA聚合酶(L-protein)。
“糖蛋白”(简称G蛋白)是狂犬病毒颗粒表面的膜蛋白，大约67kD，以三聚体形式形成病毒的棘突，是病毒最重要的有效保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应。如本文所用，术语“CTN-1”是基于中国流行的狂犬病毒疫苗株，其为NCBI登记号FJ959397的CTN-1毒株。CTN-1毒株是符合国家和WHO相关人用疫苗生产要求和质量标准的疫苗株，其G蛋白如NCBI序列号ACR39382所示。
多肽
在一总的方面，本发明多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性。所述具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的狂犬病毒糖蛋白G是狂犬病毒疫苗株CTN-1的糖蛋白G。本发明的多核苷酸编码的多肽可以作为多肽抗原用于在受试者中诱导针对狂犬感染的保护性免疫应答。
多核苷酸
在另一方面，本发明提供编码本文所述多肽的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸包括但不限于DNA、cDNA、RNA(例如mRNA)、重组产生和化学合成的多核苷酸。多核苷酸可以包含在载体中。本发明的多核苷酸可以包括天然存在的、合成的和修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸用于在细胞中表达本文所述的多肽以提供多肽抗原。在一些实施方案中，所述多肽抗原可以在合适的受试者中诱导针对狂犬病毒糖蛋白G的免疫应答。
多核苷酸可以包含一个或多个区段(核苷酸片段)(例如1、2、3、4、5、6、7、8个区段)。多核苷酸可以包含编码感兴趣多肽(例如本文所述多肽和多肽抗原)的区段。在特定实施方案中，多核苷酸可以包含感兴趣多肽的编码序列以及调控序列(包括但不限于转录和翻译调控序列)。在一实施方案中，调控序列包含以下的一个或多个：启动子序列、5’非翻译区(5’UTR)序列、3’非翻译区(3’UTR)序列和poly(A)序列。
编码序列
如本文所用，“编码序列”是指多核苷酸中可以作为模板用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(例如tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列可以是DNA序列或RNA序列。如果对应于DNA序列(包括与mRNA序列相同的编码链和与之互补链的模板链)的mRNA在生物过程中翻译成多肽，可以认为所述DNA序列或mRNA序列编码所述多肽。
如本文所用，“密码子”指多核苷酸中三个连续的核苷酸序列(又称三联体密码)，其编码特定的氨基酸。同义密码子(编码相同氨基酸的密码子)在不同物种中使用的频率不同，称为“密码子偏好性”。通常认为，对于给定物种，使用其偏好的密码子的编码序列可以在该物种表达系统中具有较高的翻译效率和准确率。因此，可以对多核苷酸进行“密码子优化”，即改变多核苷酸中的密码子以反映宿主细胞偏好的密码子，而优选不改变其编码的氨基酸序列。本领域技术人员会理解，由于密码子的简并性，本发明的多核苷酸可以包含这样的编码序列，其与本文所述编码序列不同(例如与本文所述编码序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性)但编码相同的氨基酸序列。在特定实施方案中，本发明的RNA包含针对宿主(例如受试者，特别是人)细胞优化的密码子，使得本发明的多肽在宿主(例如受试者，特别是人)中最佳表达。
在一实施方案中，本发明的多核苷酸包含如本文所述多肽抗原的编码序列。在一实施方案中，本发明的多核苷酸包含与本文所述编码序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含如本文所述多肽的编码序列。在一实施方案中，编码序列在其5’端包含起始密码子，并且在其3’端包含终止密码子。在一实施方案中，编码序列包含本文所述的开放阅读框(ORF)。
在一实施方案中，本发明的编码序列编码多肽抗原，所述多肽抗原包含：
(1)SEQ ID NO:11的氨基酸序列；(2)与SEQ ID NO:11中的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列；(3)SEQ ID NO:11的氨基酸序列的免疫原性片段；或者(4)与SEQ ID NO:11中的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，本发明的编码序列编码多肽，所述多肽包含如上所述多肽抗原的氨基酸序列。
在一实施方案中，本文所述的多肽的编码序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含：(1)SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10之一的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10之一的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32和33之一的核苷酸序列；或者(4)与SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32和33中之一的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，本文所述的多肽的编码序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含：(1)SEQ ID NO:2的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列；(3)SEQ IDNO:25的核苷酸序列；或者(4)与SEQ ID NO:25的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。
RNA
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA。如本文所用，“RNA”的定义涵盖单链、双链、线性和环状RNA。本发明的RNA可以是通过化学合成的、重组产生的和体外转录的RNA。在一实施方案中，本发明的RNA用于在宿主细胞中表达本发明的多肽。
在一实施方案中，本发明的RNA是单链RNA。在一实施方案中，本发明的RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)。IVT-RNA可以通过RNA聚合酶利用DNA模板进行体外转录获得(例如如本文所述)。
在一些实施方案中，本发明的RNA是信使RNA(mRNA)。一般而言，mRNA可以包含5’-UTR序列、多肽的编码序列、3’-UTR序列和任选存在的poly(A)序列。mRNA可以例如通过体外转录或化学合成产生。在一实施方案中，本发明的mRNA通过RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)利用DNA模板进行体外转录获得。在一实施方案中，本发明的mRNA包含(1)5’-UTR、(2)编码序列、(3)3’-UTR和(4)任选存在的poly(A)序列。所述5’-UTR、编码序列、3’-UTR和poly(A)序列如本文所述。在一实施方案中，本发明的mRNA是核苷修饰的mRNA。在一实施方案中，本发明的mRNA包含任选存在的5’帽。
在一些实施方案中，本发明的RNA包含如本文所述多肽抗原的编码序列。在一些实施方案中，本发明的RNA包含如本文所述多肽的编码序列。
在一些实施方案中，本发明的RNA还包含有助于提高RNA的稳定性和/或翻译效率的结构元件，包括但不限于5’帽、5’-UTR、3’-UTR和poly(A)序列。
如本文所用，术语“非翻译区(UTR)”一般指RNA中(如mRNA)中不翻译为氨基酸序列的区域(非编码区)，或者DNA中的相应区域。通常，位于开放阅读框(起始密码子)的5’端(上游)的UTR可以称为5’非翻译区5’-UTR；位于开放阅读框(终止密码子)的3’端(下游)的UTR可以称为3’-UTR。在5’帽存在的情况下，5’-UTR位于5’帽的下游，例如，与5’帽直接相邻。在特定实施方案中，可以在5’-UTR中，例如在临近起始密码子的位置，包含优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。在poly(A)序列存在的情况下，3’-UTR位于poly(A)序列的上游，例如与poly(A)序列直接相邻。
在一些实施方案中，本发明的RNA包含5’-UTR。在一优选实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。在一优选实施方案中，3’-UTR包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的RNA包含5’-UTR和3’-UTR。在一具体实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列，3’-UTR包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。
如本文所用，术语“poly(A)序列”或“poly(A)尾”是指包含连续或不连续腺苷酸的核苷酸序列。poly(A)序列通常位于RNA的3’端，例如3’-UTR的3’端(下游)。在一些实施方案中，poly(A)序列在其3’端不包含腺苷酸以外的核苷酸。Poly(A)序列可以在制备IVT-RNA期间，由DNA依赖性RNA聚合酶根据DNA模板的编码序列转录产生，或者通过不依赖于DNA的RNA聚合酶(poly(A)聚合酶)连接至IVT-RNA的游离3’端，例如3’-UTR的3’端。
在一些实施方案中，本发明的RNA包含poly(A)序列。在一实施方案中，poly(A)序列包含连续的腺苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20、30、40、50、60、70、75、80、85、95或100以及多达120、150、180、200、300个腺苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列中的连续腺苷酸序列被包含U、C或G核苷酸的序列中断。优选地，poly(A)序列包含75个腺苷酸。
poly(A)序列可以包含至少20、30、40、50、60、70、75、80、85、95或100以及多达120、150、180、200、300个核苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列包含至少50个核苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列包含至少80个核苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约70、80、90、100、120或150个核苷酸。在一具体实施方案中，poly(A)序列包含75个核苷酸。
如本文所用，术语“5’帽”一般涉及通过5’至5’三磷酸键连接至mRNA的5’端的N7-甲基鸟苷结构(又称为“m7G帽”、“m7Gppp-”)。5’帽可以在体外转录中共转录加至RNA中(例如使用抗反向帽类似物“ARCA”)，或者可以利用加帽酶在转录后连接至RNA。
在一实施方案中，本发明的RNA包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10中任一个的核苷酸序列。在一实施方案中，本发明的RNA包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20和21中任一个的核苷酸序列。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:2或13的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:3或14的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:4或15的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:5或16的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:6或17的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:7或18的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:8或19的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:9或20的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:10或21的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％的相同性。
修饰的核苷酸
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如mRNA)中的核苷酸可以是天然存在的核苷酸(例如天然存在的核糖核苷酸)和修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可以是例如不存在于天然存在的RNA中的核苷酸，例如非标准核苷酸或脱氧核苷酸。核苷酸的修饰可以发生在核苷上，例如在核糖部分和/或核碱基部分上。修饰的核苷酸可以在转录(例如体外转录)过程中掺入，也可以在RNA化学合成的过程中添加。
在一实施方案中，所述RNA通过包含一个或多个修饰的核苷进行修饰。在一实施方案中，所述RNA通过用修饰的尿苷代替一个或多个尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，修饰的尿苷包括1-甲基假尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶或其组合。
修饰的尿苷的实例可以包括但不限于：1-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷、3-甲基-尿苷、3-甲基-假尿苷、2-甲氧基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲基酯、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷、5-甲基氨基甲基-尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷、5-氨甲酰基甲基-尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷、1-甲基-4-硫代-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷、5,2’-O-二甲基-尿苷、2’-O-甲基-假尿苷、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷、3,2’-O-二甲基-尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷、1-硫代-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
在一实施方案中，本发明的RNA(例如mRNA)通过包含一个或多个修饰的核碱基进行修饰。在一实施方案中，修饰的核碱基包括修饰的胞嘧啶、修饰的尿嘧啶或其组合。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶独立地选自假尿嘧啶、1-甲基-假尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶或其组合。在一实施方案中，修饰的胞嘧啶独立地选自5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或其组合。在一实施方案中，本发明的RNA中修饰的核碱基的比例为10％-100％，即本发明的RNA可以通过用修饰的核碱基代替其中10％-100％的核碱基来修饰。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如mRNA)通过用修饰的尿嘧啶代替一个或多个尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括1-甲基假尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶或其组合。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括假尿嘧啶。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括5-甲基-尿嘧啶。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括1-甲基-假尿嘧啶。
在一实施方案中，所述RNA通过用修饰的尿嘧啶代替至少一个尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，所述RNA通过用修饰的尿嘧啶代替所有尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，所述RNA中修饰的尿嘧啶的比例为10％-100％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一实施方案中，所述RNA中修饰的尿嘧啶的比例为20％-100％。在一实施方案中，所述RNA中20％-100％的尿嘧啶被1-甲基假尿嘧啶代替。在优选的实施方案中，所述RNA中100％的尿嘧啶被1-甲基假尿嘧啶代替。
1-甲基-假尿苷具有如下结构：
在一具体实施方案中，本发明的mRNA包含SEQ ID NO:12-21中任一个的核苷酸序列，并且其中100％的尿嘧啶被1-甲基假尿嘧啶代替。
DNA
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸是DNA。这样的DNA可以是例如用于在体外转录本发明的RNA的DNA模板或者用于在宿主细胞中表达多肽抗原的DNA疫苗。DNA可以是双链、单链、线性和环状DNA。
DNA模板可以在合适的转录载体中提供。一般而言，DNA模板可以是双链复合物，其包含与本文所述编码序列相同的核苷酸序列(编码链)和与本文所述编码序列互补的核苷酸序列(模板链)。如本领域技术人员已知的，DNA模板可以包含启动子、5’-UTR、编码序列、3’-UTR和任选存在的poly(A)序列。启动子可以是本领域技术人员已知的合适RNA聚合酶(特别是DNA依赖性RNA聚合酶)可用的启动子，包括但不限于SP6、T3和T7RNA聚合酶的启动子。在一些实施方案中，DNA模板中的5’-UTR、编码序列、3’-UTR和poly(A)序列为本文所述RNA中包含的相应序列或者与之互补。作为DNA疫苗的多核苷酸可以在质粒载体(例如环状质粒载体)中提供。
在一些实施方案中，本发明的DNA包含如本文所述多肽抗原的编码序列。在一些实施方案中，本发明的DNA包含如本文所述多肽的编码序列。在一些实施方案中，本发明的DNA从5’端至3’端包含如本文所述的(1)T7启动子、(2)5’-UTR、(3)编码序列、(4)3’-UTR和(5)任选存在的poly(A)序列。在一些实施方案中，本发明的DNA包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32和33的核苷酸序列。
组合物
本发明还提供一种组合物，其包含本发明的多核苷酸(特别是RNA)。在一实施方案中，本发明的组合物用于在受试者中提供针对狂犬病毒的预防性和/或治疗性免疫。在一些实施方案中，本发明的组合物包含本发明的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明的组合物包含本发明的DNA。在一些实施方案中，本发明的组合物包含本发明的RNA。在一实施方案中，所述RNA为体外转录的RNA。在一实施方案中，所述RNA为mRNA。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含如本文所述的多核苷酸(特别是RNA，例如mRNA)以及包封所述多核苷酸的脂质。
如本文所用，术语“脂质”是指包含疏水部分并且任选地还包含亲水部分的有机化合物。脂质通常难溶于水但可溶于许多有机溶剂。通常，包含疏水部分和亲水部分的两亲性脂质可以在水环境中组织为脂质双层结构，例如以囊泡形式存在。脂质可以包括但不限于：脂肪酸、甘油酯、磷脂、鞘脂、糖脂和类固醇和胆固醇酯等。
特别优选的核酸组合物可以是例如本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)和脂质多聚复合物(LPP)。制备这类组合物的方法可以参见例如Kaczmarek,J.C.et al.,2017,GenomeMedicine 9,60或者如本文所述。在一些实施方案中，本发明的组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)或脂质多聚复合物(LPP)。在一些实施方案中，本发明的组合物为包含本发明的RNA的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质多聚复合物(LPP)。
在一些实施方案中，包封多核苷酸的脂质包含阳离子脂质和非阳离子脂质。在一优选实施方案中，所述阳离子脂质为可离子化阳离子脂质。
在一实施方案中，阳离子脂质包含DOTMA、DOTAP、DDAB、DOSPA、DODAC、DODAP、DC-Chol、DMRIE、DMOBA、DLinDMA、DLenDMA、CLinDMA、DMORIE、DLDMA、DMDMA、DOGS、N4-胆固醇基-精胺、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA或其组合。
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含M5，其具有如下结构：
在一实施方案中，非阳离子脂质包含如本文所述的磷脂。在一实施方案中，非阳离子脂质包含如本文所述的类固醇。在一实施方案中，非阳离子脂质包含如本文所述的磷脂和类固醇。在一实施方案中，所述磷脂包含DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE和DSPE或其组合。在一实施方案中，所述类固醇为胆固醇。在一实施方案中，非阳离子脂质包含DOPE。在一实施方案中，非阳离子脂质包含DSPC。在一实施方案中，非阳离子脂质包含胆固醇。在一实施方案中，非阳离子脂质包含DOPE和胆固醇。在一实施方案中，非阳离子脂质包含DSPC和胆固醇。
在一实施方案中，阳离子脂质包含M5，非阳离子脂质包含DOPE和胆固醇。在一实施方案中，阳离子脂质包含M5，非阳离子脂质包含DSPC和胆固醇。
在一些实施方案中，包封多核苷酸的脂质进一步包含聚乙二醇修饰的脂质。在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质包含DMG-PEG(例如DMG-PEG 2000)、DOGPEG和DSPE-PEG或其组合。在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质包含DSPE-PEG。在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质包含DMG-PEG(例如DMG-PEG 2000)。
在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含阳离子聚合物，所述阳离子聚合物与所述多核苷酸缔合为复合物，共同包封在所述脂质中。
在一实施方案中，阳离子聚合物包含聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)或其组合。在一实施方案中，阳离子聚合物为鱼精蛋白。在一实施方案中，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。
在一实施方案中，组合物中脂质的量以摩尔百分比(摩尔％)来计算，所述摩尔百分比基于组合物中脂质的总摩尔来确定。
在一实施方案中，组合物中阳离子脂质的量为约10-约70摩尔％。在一些实施方案中，组合物中阳离子脂质的量为约20-约60摩尔％、约30-约50摩尔％、约35-约45摩尔％、约38-约45摩尔％、约40-约45摩尔％、约40-约50摩尔％或约45-约50摩尔％。
在一实施方案中，组合物中磷脂的量为约10-约70摩尔％。在一实施方案中，组合物中磷脂的量为约20-约60摩尔％、约30-约50摩尔％、约10-约30摩尔％、约10-约20摩尔％或约10-约15摩尔％。
在一实施方案中，组合物中胆固醇的量为约10-约70摩尔％。在一实施方案中，组合物中胆固醇的量为约20-约60摩尔％、约30-约50摩尔％、约35-约40摩尔％、约35-约45摩尔％、约40-约45摩尔％或约45-约50摩尔％。
在一实施方案中，组合物中聚乙二醇修饰的脂质的量为约0.05-约20摩尔％。在一实施方案中，组合物中聚乙二醇修饰的脂质的量为约0.5-约15摩尔％、约1-约10摩尔％、约5-约15摩尔％、约1-约5摩尔％、约1.5-约3摩尔％或约2-5摩尔％。
在一些实施方案中，本发明的RNA(特别是mRNA)配制为脂质纳米颗粒(LNP)。如本文所用，“脂质纳米颗粒”或“LNP”涉及由脂质形成的颗粒，核酸(例如mRNA)被包封在脂质中。
在一实施方案中，LNP包含本发明的RNA以及包封RNA的脂质，其中所述包封RNA的脂质包含阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质。在一实施方案中，所述阳离子脂质为M5。在一实施方案中，所述磷脂为DSPC。在一实施方案中，所述聚乙二醇修饰的脂质为DMG-PEG 2000。在一实施方案中，所述阳离子脂质为M5，所述磷脂为DSPC，所述聚乙二醇修饰的脂质为DMG-PEG 2000。
在一实施方案中，所述包封RNA的脂质包含50摩尔％的M5、10摩尔％的DSPC、38.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG 2000。
在一些实施方案中，本发明的RNA(特别是mRNA)配制为脂质多聚复合物(lipopolyplex，LPP)。如本文所用，“脂质多聚复合物”或“LPP”是指包含由脂质外壳包封的核酸内核的核壳结构，所述核酸内核包含与聚合物缔合的核酸(例如mRNA)。
在一实施方案中，LPP包含本发明的RNA，其与阳离子聚合物缔合为复合物；以及包封所述复合物的脂质，其中所述包封复合物的脂质包含阳离子脂质、非阳离子脂质和聚乙二醇修饰的脂质。在一实施方案中，所述非阳离子脂质包含磷脂和类固醇。在一实施方案中，所述非阳离子脂质包含选自1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)或其组合的磷脂以及胆固醇。在一实施方案中，所述阳离子聚合物包含鱼精蛋白。在一实施方案中，所述聚乙二醇修饰的脂质包含DMG-PEG 2000。
在一实施方案中，所述阳离子脂质包含M5，其具有如下结构：
所述非阳离子脂质包含选自1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)或其组合的磷脂以及胆固醇；
所述聚乙二醇修饰的脂质包含1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)；
所述阳离子聚合物包含鱼精蛋白。
在一实施方案中，所述阳离子聚合物为鱼精蛋白，所述阳离子脂质为M5，所述磷脂为DOPE，所述聚乙二醇修饰的脂质为DMG-PEG 2000。
在一实施方案中，所述包封复合物的脂质包含40摩尔％的M5、15摩尔％的DOPE、43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG 2000。
在一些实施方案中，本发明的疫苗制剂(又称为“疫苗试剂”)包含本文所述的多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的疫苗制剂(又称为“疫苗试剂”)包含本文所述的组合物，其中所述脂质包含10-70摩尔％的M5、10-70摩尔％的DOPE、10-70摩尔％的胆固醇和0.05-20摩尔％的DMG-PEG 2000，
其中所述多核苷酸编码本文所述的多肽。
在一实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10、SEQ IDNO:13、14、15、16、17、18、19、20和21或SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32和33中任一个的核苷酸序列。
在一实施方案中，所述疫苗制剂包含编码本文所述的多肽的多核苷酸以及包封所述多核苷酸的脂质，所述脂质包含10～70摩尔％的M5、10～70摩尔％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、10～70摩尔％的胆固醇和0.05～20摩尔％的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)2000，
在一实施方案中，所述多核苷酸SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10、SEQID NO:13、14、15、16、17、18、19、20和21或SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32和33中任一个的核苷酸序列。任选地，所述疫苗制剂还包含阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物与所述多核苷酸缔合为复合物，共同包封在脂质中形成脂质多聚复合物。
阳离子脂质
阳离子脂质是在指定pH下带有净正电荷的脂质。带有净正电荷的脂质可以通过静电相互作用与核酸缔合。
阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium-propane，DOTMA)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、双十烷基二甲基溴化铵(Didecyldimethylammonium bromide，DDAB)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺鎓三氟乙酸盐(2,3-dioleoyloxy-N-[2(spermine carboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanamium trifluoroacetate，DOSPA)、双十八烷基二甲基氯化铵(dioctadecyldimethyl ammonium chloride，DODAC)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane，DODAP)、3-(N—(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(3-(N—(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol，DC-Chol)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氨鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(N,N-dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine，DMOBA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯基氧基)丙烷(3-dimethylamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-oc-tadecadienoxy)propane，CLinDMA)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺鎓溴化物(N-(2-aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-aminium bromide，DMORIE)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)propan-1-amine，DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-amine，DMDMA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine，DOGS)、N4-胆固醇基-精胺(N4-cholesteryl-spermine)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane，DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate，DLin-MC3-DMA)、十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)(heptadecan-9-yl8-((2-hydroxyethyl)(6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl)amino)octanoate)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)。
在一些实施方案中，阳离子脂质优选为可离子化阳离子脂质。可离子化阳离子脂质在例如酸性pH下带有净正电荷，而在较高pH(例如生理pH)下是中性的。可离子化阳离子脂质的实例包括但不限于：双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycylspermine，DOGS)、N4-胆固醇基-精胺(N4-cholesteryl-spermine)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane，DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate，DLin-MC3-DMA)、十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)(heptadecan-9-yl8-((2-hydroxyethyl)(6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl)amino)octanoate)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)。
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含M5，其具有以下结构：
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非阳离子脂质
在本文中，“非阳离子脂质”是指在指定pH下不带有净正电荷的脂质，例如阴离子脂质和中性脂质。术语“中性脂质”指在生理pH下以不带电、中性或两性离子形式存在的脂质。中性脂质可以包括但不限于磷脂和类固醇。
磷脂的实例包括但不限于：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamine，POPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，DSPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二花生四烯酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二二十二酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、二二十三酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、二二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，POPC)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，DMPE)和二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，DLPE)。
类固醇的实例包括但限于例如胆固醇、胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、胆固醇基-2'-羟基乙基醚、胆固醇基-4'-羟基丁基醚、生育酚及其衍生物。
聚乙二醇修饰的脂质
如本文所用，术语“聚乙二醇修饰的脂质”是指包含聚乙二醇部分和脂质部分的分子。聚乙二醇修饰的脂质的实例包括但不限于：1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol，DMG-PEG)、1,2-二油酰基-rac-甘油,甲氧基-聚乙二醇(1,2-Dioleoyl-rac-glycerol,methoxypolyethylene Glycol，DOGPEG))和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Poly(ethylene glycol)，DSPE-PEG)。
在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质为DMG-PEG，例如DMG-PEG 2000。在一实施方案中，DMG-PEG 2000具有以下结构：
其中n的平均值为44。
阳离子聚合物
如本文所用，术语“阳离子聚合物”涉及在指定pH下能够带有净正电荷从而与核酸静电结合的任何离子聚合物。阳离子聚合物的实例包括但不限于：聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺(PEI)。聚乙烯亚胺可以是线性或支化的聚乙烯亚胺。
术语“鱼精蛋白”是指富含精氨酸的低分子量碱性蛋白，其存在于各种动物(特别是鱼)的精细胞中并代替组蛋白与DNA结合。在一优选实施方案中，阳离子聚合物为鱼精蛋白(例如硫酸鱼精蛋白)。
预防和/或治疗狂犬病毒感染
本发明提供本发明的多核苷酸(特别是RNA)、组合物或疫苗制剂，用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染。
本发明提供本发明的多核苷酸(特别是RNA)、组合物或疫苗制剂在制备用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的药物中的用途。
本发明提供一种用于在有需要的受试者中预防和/或狂犬病毒感染的方法，所述方法包括给受试者施用预防或治疗有效量的本发明的多核苷酸(特别是RNA)、组合物或疫苗制剂。在一实施方案中，所述方法包括施用预防或治疗有效量的包含本发明的mRNA的组合物，特别是包含如本文所述的LNP或LPP的组合物。
术语“预防或治疗有效量”是指足以预防或抑制疾病或症状的发生和/或减缓、减轻、延迟疾病或症状的发展或严重程度的量。预防或治疗有效量受到包括但不限于以下因素的影响：疾病或症状的发展速度和严重程度，受试者的年龄、性别、体重和生理状况，治疗的持续时间以及具体施用途径。预防或治疗有效量可以在一个或多个剂量中施用。预防或治疗有效量可以通过持续或间断施用实现。
在一些实施方案中，预防或治疗有效量在一次或多次施用中提供。在一些实施方案中，预防或治疗有效量在两次施用中提供。在一些实施方案中，预防或治疗有效量在三次施用中提供。在一些实施方案中，预防或治疗有效量在四次施用中提供。在一些实施方案中，预防或治疗有效量在五次施用中提供。优选地，在一些实施方案中，预防或治疗有效量在两次施用中提供。更优选地，在一些实施方案中，预防或治疗有效量在四次施用中提供。
狂犬病的暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)是对暴露于狂犬病毒的受试者进行的一组免疫接种，以预防(预防性地)疾病的发作。WHO推荐的PEP肌肉注射方案包括“5剂法(第0、3、7、14和28天各1剂，即1-1-1-1-1)”和“4剂法(第0天2剂，第7天和第21天各1剂，即2-1-1)”程序。其预防或治疗有效量分别是在四次或五次施用中提供。
本发明提供一种狂犬病暴露后预防的方法，所述方法包括给受试者以选自以下的免疫程序施用预防或治疗有效量的本发明的多核苷酸(特别是RNA)、组合物或疫苗制剂：1-1-1-1-1免疫程序(第0、3、7、14和28天各1剂)、2-1-1免疫程序(第0天2剂，第7天和第21天各1剂)、2-2免疫程序(第0天2剂，第7天2剂)和2-1免疫程序(第0天2剂，第7天1剂)。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂以1-1-1-1-1免疫程序施用。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂以2-2免疫程序施用。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂以2-1免疫程序施用。优选地，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂以2-1-1免疫程序施用。优选地，所述多核苷酸、组合物或疫苗制剂通过肌肉注射施用。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸、组合物或疫苗制剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法施用受试者，例如肠胃外、经口、经粘膜、经皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下或腹腔内。优选地，本发明的组合物或疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
如本文所用，术语“受试者”描述了可以对其提供使用本发明多核苷酸或组合物的预防或治疗免疫的生物体，例如哺乳动物。优选地，所述受试者是人。
本发明的实施方案可以列举如下：
1.一种多核苷酸，其包含编码狂犬病毒糖蛋白G的编码区，其中所述糖蛋白G包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，并且其中，所述编码区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10中的核苷酸序列具有至少90％相同性的核苷酸序列。
2.第1项的多核苷酸，其中所述糖蛋白G包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
3.第2项的多核苷酸，其中所述编码区包含选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10中的核苷酸序列。
4.第1-3中任一项的多核苷酸，其为RNA。
5.第4项的多核苷酸，其中所述RNA进一步包含5’-UTR；优选地，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
6.第4或5项的多核苷酸，其中所述RNA进一步包含3’-UTR；优选地，所述3’-UTR包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。
7.第4-6中任一项的多核苷酸，其中所述RNA进一步包含poly(A)序列；优选地，所述poly(A)序列包含75个腺苷核苷酸。
8.第4-7中任一项的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20和21中任一项的核苷酸序列。
9.一种组合物，其包含第1-8中任一项的多核苷酸。
10.第9项的组合物，其包含包封所述多核苷酸的脂质。
11.第9或10项的组合物，其包含脂质纳米颗粒或脂质多聚复合物。
12.第10或11项的组合物，其中包封所述多核苷酸的脂质包含阳离子脂质、非阳离子脂质和聚乙二醇修饰的脂质；任选地，所述组合物还包含阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物与所述多核苷酸缔合为复合物，共同包封在脂质中形成脂质多聚复合物。
13.一种疫苗制剂，其包含第1-8中任一项的多核苷酸或第9-12中任一项的组合物。
14.第13项的疫苗制剂，其中包封所述多核苷酸的脂质包含10-70摩尔％的M5、10-70摩尔％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、10-70摩尔％的胆固醇和0.05-20摩尔％的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)2000；优选地，所述脂质为摩尔比为40:15:43.5:1.5的M5、DOPE、胆固醇和(DMG-PEG)2000，
15.第13-14中任一项的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
16.第1-8中任一项的多核苷酸、第9-12中任一项的组合物或第13-15中任一项的疫苗制剂在制备用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的药物中的用途。
17.第16项的用途，其中所述有需要的受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
18.预防或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用第1-8中任一项的多核苷酸，第9-12中任一项的组合物，或第13-15中任一项的疫苗制剂；优选地，所述多核苷酸，组合物或疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
19.第18项的方法，其中所述有需要的受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
20.第1-8中任一项的多核苷酸，第9-12中任一项的组合物，或第13-15中任一项的疫苗制剂，其用于预防或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的用途。
21.第20项的用于所述用途的多核苷酸、组合物或疫苗制剂，其中所述有需要的受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
22.一种狂犬病暴露后预防的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者以选自以下的免疫程序施用第1-8中任一项的多核苷酸，第9-12中任一项的组合物，或第13-15中任一项的疫苗制剂：1-1-1-1-1免疫程序(第0、3、7、14和18天各1剂)、2-1-1免疫程序(第0天2剂，第7天和21天各1剂)、2-2免疫程序(第0天2剂，第7天2剂)和2-1免疫程序(第0天2剂，第7天1剂)；优选地，所述免疫程序为2-1-1免疫程序；优选地，所述多核苷酸、组合物或疫苗制剂通过肌肉注射施用。
有益效果
本发明的多核苷酸、组合物、疫苗制剂和方法具有以下有益效果中的至少一个：
(1)序列优化后，RNA稳定性增加，mRNA翻译效率提高；
(2)具有与天然序列相比相当或更高水平的细胞表面表达；
(3)在受试者中诱导高水平的针对狂犬病毒G蛋白的结合抗体和中和抗体。
(4)免疫剂量低，免疫效果优于市售灭活疫苗，表现在抗体水平高，在早期就能够诱发更强的中和抗体水平；
(5)对机体免疫副反应低，相较于灭活疫苗，安全性更高，表现为对受试者体重和体重增加的负面影响更小；
(6)腹腔注射能诱导强生物活性；
(7)能够以更优的免疫程序施用。
实施例
通过参考以下实施例进一步描述本发明。应当理解，这些实施例仅作为示例，而不对本发明构成限制。以下材料和仪器均是可商购的或根据本领域公知的方法制备。以下实验均按照制造商的说明书或根据本领域公知的方法和步骤进行。
以下实施例中，使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，数据表示为具有95％置信区间的几何平均值或具有标准误差的算术平均值。y轴上的虚线用于指示检测的测定限。双尾Mann-Whitney U检验用于比较两个实验组，双尾Wilcoxon符号秩检验用于比较不同时间点的相同动物。为了比较两个以上的实验组，应用了Kruskal-WallisANOVA和Dunn的多重比较检验。P值小于0.05被认为是显着的。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例1mRNA的制备
1.1.DNA模板的设计和合成
简言之，为了在人细胞中最佳表达和结构稳定性，发明人进行人源细胞密码子优化并且设计编码所述CTN-1疫苗株狂犬病毒糖蛋白G(SEQ ID NO:11的氨基酸序列)的DNA开放阅读框(ORF)序列。编码CTN-1疫苗株狂犬病毒糖蛋白G的核酸(Ori、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9)如表1所示，其中Ori是未经优化的野生型序列。
还设计T7启动子序列(TAATACGACTCACTATA)、5’-UTR序列(SEQ ID NO:34)、3’-UTR序列(SEQ ID NO:35)和poly(A)序列(75个腺苷核苷酸)。在5’-UTR序列(SEQ ID NO:34)中包含Kozak序列“GCCACC”。
然后按照T7启动子序列、5’-UTR序列、DNAORF、3’-UTR序列和poly(A)序列的顺序连接，以pUC57为载体进行全基因合成(苏州金唯智生物科技有限公司)，获得质粒DNA模板。
利用一对加尾PCR引物(上游引物：5’TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG 3’；和下游poly(T)长引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA3’)和基于高保真DNA聚合酶的PCR扩增试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司)进行PCR扩增获得DNA模板。
1.2.从DNA模板体外转录mRNA
以如实施例1.1制备的纯化后的PCR产物为模板，通过T7RNA聚合酶进行共转录加帽反应，进行体外转录RNA，从而产生Cap1mRNA。体外转录中使用1-甲基-假尿苷-三磷酸代替三磷酸尿苷(UTP)，因此，体外转录的Cap1mRNA中1-甲基-假尿嘧啶的修饰比例为100％。转录结束后，使用DNaseI(赛默飞世尔科技有限公司)消化DNA模板，以降低残余DNA模板带来的风险。
使用DynabeadsMyone(赛默飞世尔科技有限公司)对mRNA进行纯化。将纯化的mRNA溶解于1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.5+/-0.1)中，无菌过滤，并在-80℃下冷冻保存直至使用。所获得的mRNA序列如表1所示。
表1.核酸Ori、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9的序列
实施例2mRNA疫苗制剂的制备
2.1.实验材料
阳离子脂质M5为斯微生物合成；辅助磷脂(DOPE)采购自CordenPharma；胆固醇采购于Sigma-Aldrich；mPEG2000-DMG(即DMG-PEG 2000)采购于Avanti Polar Lipids,Inc.；PBS采购于Invitrogen；硫酸鱼精蛋白采购自北京斯利安药业有限公司。
2.2.mRNA的脂质多聚复合物(LPP)的制备
mRNA水溶液的配制：用10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)将如实施例1.2制备的每种mRNA稀释为0.2mg/mL的mRNA溶液。
脂质溶液的配制：将阳离子脂质(M5)：DOPE：胆固醇：DMG-PEG 2000以40:15:43.5:1.5的摩尔比溶解于无水乙醇，配制成10mg/mL的脂质溶液。
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：将硫酸鱼精蛋白溶解于无核酸酶水中配制成工作浓度为0.25mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液。
核纳米颗粒(core nanoparticle)溶液的制备：使用微流控技术(迈安纳(上海)科技股份有限公司，型号：Inano D)，在以下条件将硫酸鱼精蛋白溶液与mRNA溶液混合获得由鱼精蛋白和mRNA形成的核纳米颗粒溶液：Volume＝4.0mL；Flow rate ratio＝5(mRNA):1(鱼精蛋白溶液)，Total flow rate＝12mL/min，前废(start waste)＝0.35mL，后废(endwaste)＝0.1mL，室温。
LPP的制备：在以下条件下将核纳米颗粒溶液与脂质溶液进行二次混合：Volume＝4.0mL，Flow rate ratio＝1(脂质溶液):3(核纳米颗粒溶液)，Total flow rate＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温，使用PBS稀释，获得LPP溶液。
离心超滤：将LPP溶液通过超滤离心去除乙醇(转速3000rpm，离心时间60min，温度4℃)，获得Ori、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9的LPP制剂。
实施例3候选mRNA在细胞中的表达
HEK 293细胞(人肾上皮细胞系)在添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，在37℃和5％CO2条件下培养。
在HEK293细胞中验证如实施例2.2制备的10种候选LPP-mRNA的表达。具体方法如下：将HEK 293细胞以1.2×106细胞/孔种于6孔板中。在种细胞18小时后，使用转染试剂Lipofectamine MessengerMax(Invitrogen)，按制造商说明将1μg LPP-mRNA转染至HEK293细胞中。将转染后的细胞置于细胞培养箱中，在37℃5％CO2继续培养24小时。然后收集细胞进行流式分析。
将收集的细胞重悬在细胞染色缓冲液(BioLegend)中。用Fixable ViabilityStain(BD)对细胞进行染色以评估细胞活力并用FcR封闭试剂(Miltenyi)封闭。为了检测表面G蛋白的表达，细胞用抗狂犬病病毒(Millipore，货号MABF2073)在染色缓冲液中在4℃下染色30分钟。之后，用染色缓冲液洗涤细胞两次，然后在染色缓冲液中与PE-抗人IgGFc(Biolegend)在4℃下孵育30分钟。使用BD FACSDiva软件(版本8.0.1)在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行样品采集，并通过FlowJo软件(版本10.6.2，FlowJo,BDBiosciences)分析数据。对平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity,MFI)进行比较分析。
结果如图1B所示：Ori、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9的LPP-mRNA在细胞内均内正确地翻译为狂犬病毒G蛋白。此外，在LPP-mRNAOpti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9转染的HEK293细胞表面检测到的MFI值与LPP-mRNA Ori转染的HEK293细胞表面检测到的MFI值相当或更高，这说明优化后序列(即Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9)的翻译的水平相较于Ori(野生型)不变或增高。
实施例4候选mRNA疫苗制剂在小鼠体内诱导结合抗体和中和抗体
4.1实验小鼠
本实施例使用雌性，6周龄的Balb/c小鼠。Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories)在上海模式生物中心有限公司进行饲养和照料。动物研究严格按照《上海实验动物饲养管理和使用指南》中的建议进行。
4.2实验步骤与结果
本实施例使用如实施例2.2制备的LPP制剂免疫BALB/c小鼠，评估其在小鼠中诱导的结合抗体和中和抗体(Virus Neutralizing Antibodies，VNA)水平。
将小鼠随机分为12组(n＝5)，其中10组分别施用如实施例2.2制备的LPP制剂免疫(单次剂量为2μg/小鼠)，1组施用辽宁成大人用狂犬病疫苗(Vero细胞)(人用商品灭活疫苗，以下称为Benchmark，施用0.2dose)作为阳性对照，另一组施用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)作为阴性对照组。各组通过肌肉注射分别在第0天(初免)和第14天(二免)施用。在小鼠二免后的第14天(即第28天)眼眶取血收集小鼠血清，进行狂犬病毒的结合抗体和中和抗体检测。具体检测方法如下：
ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测结合抗体：使用ELISAcoating buffer稀释G蛋白抗原(购自金斯瑞)，以25ng/孔抗原包被高结合酶联免疫吸附试验板(Greiner)过夜；待检测样品室温平衡30分钟，将板在PBST(0.05％Tween-20)中洗涤并用PBST中的5％脱脂奶封闭。使用2.5％脱脂奶稀释样品血清，起始稀释滴度为50，后以2倍比稀释待检血清样品，在每块板中设置阴性血清对照。加入稀释的血清样品，每孔100μl，37℃(恒温箱)孵育1小时；弃去血清样品，使用排枪，每孔加入250μl PBST洗液，洗涤3次；每孔加入100μl稀释50000倍的goat anti-mouse IgG HRP(abcam)，37℃(恒温箱)孵育0.5小时；弃去二抗，使用排枪，每孔加入300μl PBST洗液，洗涤5次；清洗后，每孔加入100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(ebioscience)显色液避光显色5分钟；每孔加入100μl 2N H2SO4终止反应并检测；使用酶标仪(BioTek)在450nm波长处读取OD值。将终点滴度确定为最后一次稀释血清的倒数。样品OD450nm大于2.1倍阴性对照组OD450nm判定为阳性值。结果如图2B所示，LPP-mRNA Ori-LPP、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9加强免疫后，Day28时诱导产生的结合抗体几何平均滴度分别为720，1120，1120，1120，1280，1280，1120，1440，960，1280，0.2dose Benchmark诱导的结合抗体几何平均滴度为1440。
FAVN法(直接免疫荧光病毒中和实验)检测中和抗体：在96孔板上以100μL体积制备50μL连续3倍稀释的测试血清和标准血清。将每个样品添加到四个相邻的孔中。向每孔中加入50μL的50-200FFU的CVS-11病毒。然后将96孔板在37℃，5％CO2的培养箱中孵育1小时。1小时后，将含有2×104/50μL的BSR细胞悬液加入每孔中，并在34℃，5％CO2的培养箱中孵育60小时。孵育结束后，将96孔板用80％冰冷的丙酮在-20℃下固定30分钟。然后将细胞用FITC标记的RABV-N(Malvern,PA)抗体在37℃下染色45分钟。PBS洗涤3次后，用OlympusIX51荧光显微镜评估结果。VNA滴度以IU/mL表示，通过与每个测试中包括的参考血清(从国家生物标准和控制研究所获得，Herts，UK)的滴度进行比较。结果如图2C所示，二免14天后，Ori-LPP、Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9免疫小鼠后血清中抗CVS-11株的中和抗体几何平均滴度分别为：53.3，56.7，70.3，71.1，80.6，56.7，78.0，84.0，69.2，67.8IU/mL，0.2dose Benchmark诱导的中和抗体几何平均滴度为16.9IU/mL。
结果如图2所示：所有LPP制剂在小鼠中都有免疫原性，并且其中和抗体水平均高于WHO规定的保护水平0.5IU/mL；并且LPP制剂Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9免疫的小鼠中的结合抗体和中和抗体水平均高于LPP制剂Ori免疫的小鼠。LPP制剂Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9免疫的小鼠中的中和抗体水平均高于Benchmark组；其中Opti-4和Opti-7LPP-mRNA组产生最高的中和抗体水平。上述结果表明Opti-1、Opti-2、Opti-3、Opti-4、Opti-5、Opti-6、Opti-7、Opti-8和Opti-9LPP制剂在小鼠中的免疫原性优于市售疫苗(辽宁成大人用狂犬病疫苗(Vero细胞))，并且其中Opti-4和Opti-7LPP-mRNA具有最好的免疫原性。
实施例5候选mRNA疫苗制剂在小鼠体内免疫和病毒攻毒保护评估
5.1实验小鼠
本实施例使用雌性，6周龄的ICR小鼠。ICR小鼠(Charles River Laboratories)在上海模式生物中心有限公司进行饲养和照料。动物研究严格按照《上海实验动物饲养管理和使用指南》中的建议进行。
5.2实验步骤与结果
本实施例使用如实施例2.2制备的Opti-4LPP-mRNA制剂免疫ICR小鼠，并进行攻毒实验评估制剂对小鼠的保护。
将小鼠随机分为7组(n＝10)。在第0天(初免)和第7天(二免)通过肌肉注射施用所述LPP-mRNA制剂(Opti-4三组，分别施用2μg(高剂量)、0.4μg(中等剂量)、0.08μg(低剂量)LPP-mRNA/小鼠)，Benchmark(辽宁成大人用狂犬病疫苗，三组，分别施用1/25dose(高剂量)、1/125dose(中等剂量)、1/625dose(低剂量)/小鼠)和PBS。在二免后第7天(即第14天)进行标准攻毒株CVS-24小鼠脑内攻毒，每只以30μL(50倍)的半数小鼠脑内致死剂量(MICLD50)颅内注射，其中一组注射PBS的小鼠(Mock)不施用所述标准攻毒株。
在第7天和第14天收集小鼠血清用于检测血清中的结合抗体和中和抗体水平。具体结合抗体检测方法和中和抗体检测方法同上。抗体滴度如图3B和3C所示，Opti-4-LPP免疫后第14天的结合抗体几何平均滴度分别为：1530(2μg)，1830(0.4μg)和1440(0.08μg)，成大灭活苗免疫后第14天的结合抗体几何平均滴度分别为：1295(1/25dose)，2220(1/125dose)和1020(1/625dose)，而第7天的结合抗体滴度因为太低而无法检测(数据未显示)。Opti-4-LPP免疫后第7天的中和抗体几何平均滴度分别为：13.1IU/mL(2μg)，9.6IU/mL(0.4μg)和5.1IU/mL(0.08μg)，第14天的中和抗体水平升高至：67.7IU/mL(2μg)，50.8IU/mL(0.4μg)和47.3IU/mL(0.08μg)；成大灭活苗免疫后第7天的中和抗体几何平均滴度分别为：5.4IU/mL(1/25dose)，5.3IU/mL(1/125dose)和2.4IU/mL(1/625dose)，第14天的中和抗体水平升高至25.7IU/mL(1/25dose)，17.6IU/mL(1/125dose)和14.2IU/mL(1/625dose)。
上述结果表明，在免疫后第14天，Opti-4LPP-mRNA的高剂量组(2μg)和低剂量组(0.08μg)都分别有比市售成大灭活苗高剂量组(1/25dose)和低剂量组(1/625dose)更高的结合抗体水平。在免疫后第7天和第14天，Opti-4LPP-mRNA的高剂量组(2μg)、中等剂量组(0.4μg)和低剂量组(0.08μg)都分别有比市售成大灭活苗高剂量组(1/25dose)、中等剂量组(1/125dose)和低剂量组(1/625dose)更高的中和抗体水平。这说明了Opti-4LPP-mRNA以剂量依赖性方式诱导显著的中和抗体的产生。Opti-4LPP-mRNA相比市售成大疫苗有更好的免疫原性，表现在其免疫剂量低，中和抗体水平高，在早期就能够诱发更强的中和抗体水平。
有文献报道，由CureVac开发的通过LNP系统制备的狂犬病mRNA候选疫苗CV7202(0.5μg)在初次接种后在第21天诱导了高VNA滴度(10IU/mL)(Lutz,J.,et al.,UnmodifiedmRNA in LNPs constitutes a competitive technology for prophylacticvaccines.NPJ Vaccines,2017.2:p.29.)。相比之下，0.4μg Opti-4LPP-mRNA制剂在初免后的第7天就引发了相当的VNA滴度(9.6IU/mL)，并在第14天(50.8IU/mL)进一步增加。因此，与0.5μg CV7202相比，0.4μg Opti-4LPP-mRNA制剂可以更快地引发高滴度的中和抗体，更加有利于狂犬病毒暴露后的快速免疫。
此外，攻毒后所有小鼠连续观察21日，每日一次记录小鼠体重和生存状况并作图。
小鼠的存活如图3D所示，PBS组中的所有小鼠在攻毒后第11天全部死亡。低剂量Opti-4组，中剂量Opti-4组(0.4μg)和高剂量Opti-4组(2μg)在21天中都无小鼠死亡，生存率为100％。低剂量Benchmark组(1/625dose)在21天中有5只小鼠死亡，生存率为50％；中剂量Benchmark组(1/125dose)在21天中有3只小鼠死亡，生存率为70％；高剂量Benchmark组(1/25dose)在21天中都无小鼠死亡，保护率为100％。简而言之，最大免疫剂量的Benchmark灭活疫苗以及Opti-4LPP-mRNA制剂均可以对小鼠提供100％的保护；中间剂量的保护率则分别为：Benchmark灭活疫苗70％、Opti-4LPP制剂100％；最低剂量的保护率则分别为：Benchmark灭活疫苗50％、Opti-4LPP制剂100％。
小鼠的体重变化如图3E所示，相较Benchmark组，Opti-4的低、中、高三种剂量组的小鼠体重变化最为接近非攻毒组(Mock)，小鼠攻毒后的体重降低幅度最小，小鼠体重呈逐渐增加趋势，未受到攻毒影响。Benchmark低剂量组(1/625dose)中，小鼠在攻毒12天后体重才开始逐渐恢复。这再次说明Opti-4在攻毒实验中对小鼠提供了有效的保护，并且对于小鼠的副作用小，与Benchmark灭活疫苗相比，有更高的安全性。
综合以上实验结果，辽宁成大人用狂犬病疫苗(Vero细胞)和Opti-4都显示出对小鼠病毒攻毒的保护，但在中间剂量组和最低剂量组中，Opti-4的保护率最高。0.08μg的低剂量Opti-4LPP制剂就可以对小鼠提供100％的针对攻毒的保护，2μg和10μg也都提供了100％的保护，其优于Benchmark；并且Opti-4组小鼠体重降低幅度最小，显示更高的安全性。
实施例6不同免疫程序下Opti-4LPP-mRNA制剂的免疫原性
6.1实验小鼠
本实施例使用雌性，6周龄的ICR小鼠。ICR小鼠(Charles River Laboratories)在上海模式生物中心有限公司进行饲养和照料。动物研究严格按照《上海实验动物饲养管理和使用指南》中的建议进行。
6.2实验步骤与结果
狂犬病的暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)是对暴露于狂犬病毒的受试者进行的一组免疫接种，其在本质上是预防而不是治疗，由于狂犬病毒的潜伏期相对较长，即使患者从未接种过疫苗，在暴露于该病毒之后再实施PEP，绝大多数情况下仍能防止临床症状的出现。WHO推荐的PEP肌肉注射方案包括“5剂法(第0、3、7、14和28天各1剂，即1-1-1-1-1)”和“4剂法(第0天2剂，第7天和第21天各1剂，即2-1-1)”程序。此外，发明人还增加了第0天2剂和第7天2剂(即2-2)或1剂(即2-1)的免疫策略。本实施例以这4种免疫策略来比较评价Opti-4LPP-mRNA制剂的免疫原性。
将小鼠随机分为4组(每组，n＝5)，4组分别按照上述免疫策略施用如实施例2.2制备的Opti-4LPP-mRNA制剂免疫(单次剂量为1μg/小鼠)。各组通过肌肉注射免疫小鼠。在小鼠免疫后的第7、14、21、28、35和42天眼眶取血收集小鼠血清，进行假病毒中和检测。具体检测方法如下：
假病毒中和检测：根据制造商说明，通过假病毒中和检测(天坛生物)测定血清中和抗体滴度。简而言之，将狂犬病毒(RABV)假病毒与系列稀释的阳性对照或热灭活血清在Opti-MEM培养基中在37℃下预孵育1小时，然后添加到96孔板中的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)细胞中。孵育24小时后裂解细胞，然后与荧光素酶测定底物(PerkinElmer)一起孵育。通过酶标仪(BioTek)检测荧光信号。中和滴度(NT50)定义为与病毒对照孔相比，50％荧光素酶活性抑制所需的血清稀释度的倒数。
结果如图4所示，1-1-1-1-1和2-1-1程序均显示第7、14、21、28、35和42天的半数抑制浓度几何平均滴度(IC50GMT)稳定增加。对于1-1-1-1-1程序，IC50GMT分别为29998.7、13361.0、55582.0、80723.0、138583.6和143483.0。对于2-1-1程序，IC50GMT分别为1342.2、19156.3、46431.2、53615.2、77761.0和95800.3。相比之下，2-2和2-1程序的IC50GMT从第7天开始上升，并在第21天达到峰值，此后开始下降。对于2-2程序，IC50GMT分别为1445.8、42056.8、53252.8、22280.9、13143.0和5695.0。对于2-1程序，IC50GMT分别为1237.7、16634.7、46432.5、28184.3、8451.8和6349.4。
综合以上实验结果，相比2-2和2-1程序，采用1-1-1-1-1程序和2-1-1程序以施用Opti-4LPP-mRNA制剂能有更持久，更高的中和抗体滴度。考虑到临床依从性和经济成本，2-1-1程序可能为患者提供更好的选择标准。
实施例7不同施用途径(肌肉注射和腹腔注射)下Opti-4LPP-mRNA制剂的免疫原性7.1实验小鼠
本实施例使用雌性，6周龄的ICR小鼠。ICR小鼠(Charles River Laboratories)在上海模式生物中心有限公司进行饲养和照料。动物研究严格按照《上海实验动物饲养管理和使用指南》中的建议进行。
7.2实验步骤与结果
在本实施例中，发明人比较了Opti-4LPP-mRNA制剂在腹腔与肌肉两种接种途径情况下的免疫应答。
将小鼠随机分为2组(每组，n＝5)，2组分别在第0天和第7天以腹腔注射或肌肉注射施用如实施例2.2制备的Opti-4LPP-mRNA制剂(单次剂量为0.4μg/小鼠)。在小鼠免疫后的第7、14、21和28天眼眶取血收集血清，进行假病毒中和检测。具体检测方法同上述。
结果如图5所示，腹腔注射诱导的免疫后小鼠血清中半数抑制浓度几何平均滴度(IC50GMT)在第7、14、21和28天分别为2002.5、61995.8、92281.4和81892.5。而肌肉注射诱导的免疫后小鼠血清中IC50GMT在第7、14、21和28天分别为622.3、8447.9、26862.9和20665.6。
综合以上实验结果，腹腔注射和肌肉注射都诱导免疫后小鼠血清IC50GMT的稳定增加。相比之下，腹腔注射途径诱导比肌肉注射途径更高的中和抗体滴度。可见，Opti-4LPP-mRNA制剂通过腹腔注射能诱导更强的免疫应答。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
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Claims (21)
1.一种多核苷酸，其包含编码狂犬病毒糖蛋白G的编码区，其中所述糖蛋白G包含与SEQID NO:11的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，并且其中所述编码区包含与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10的核苷酸序列具有至少90％相同性的核苷酸序列。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述糖蛋白G包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述编码区包含选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9和10的核苷酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的多核苷酸，其为RNA。
5.权利要求4的多核苷酸，其中所述RNA进一步包含5’-UTR；优选地，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
6.权利要求4或5的多核苷酸，其中所述RNA进一步包含3’-UTR；优选地，所述3’-UTR包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。
7.权利要求4-6中任一项的多核苷酸，其中所述RNA进一步包含poly(A)序列；优选地，所述poly(A)序列包含75个腺苷核苷酸。
8.权利要求4-7中任一项的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20和21的核苷酸序列。
9.一种组合物，其包含权利要求1-8中任一项的多核苷酸。
10.权利要求9的组合物，其包含包封所述多核苷酸的脂质。
11.权利要求9或10的组合物，其包含脂质纳米颗粒或脂质多聚复合物。
12.权利要求10或11的组合物，其中包封所述多核苷酸的脂质包含阳离子脂质、非阳离子脂质和聚乙二醇修饰的脂质；任选地，所述组合物还包含阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物与所述多核苷酸缔合为复合物，共同包封在脂质中形成脂质多聚复合物。
13.一种疫苗制剂，其包含权利要求1-8中任一项的多核苷酸或权利要求9-12中任一项的组合物。
14.权利要求13的疫苗制剂，其中包封所述多核苷酸的脂质包含10-70摩尔％的M5、10-70摩尔％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、10-70摩尔％的胆固醇和0.05-20摩尔％的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)2000；优选地，所述脂质为摩尔比为40:15:43.5:1.5的M5、DOPE、胆固醇和(DMG-PEG)2000，
15.权利要求13-14中任一项的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
16.权利要求1-8中任一项的多核苷酸、权利要求9-12中任一项的组合物、或权利要求13-15中任一项的疫苗制剂在制备用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的药物中的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
18.预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用权利要求1-8中任一项的多核苷酸，权利要求9-12中任一项的组合物，或权利要求13-15中任一项的疫苗制剂；优选地，所述多核苷酸，组合物或疫苗制剂通过肌肉注射或腹腔注射施用。
19.权利要求18的方法，其中所述有需要的受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
20.权利要求1-8中任一项的多核苷酸、权利要求9-12中任一项的组合物、或权利要求13-15中任一项的疫苗制剂，其用于预防和/或治疗有需要的受试者狂犬病毒感染的用途。
21.权利要求20的用于所述用途的多核苷酸、组合物或疫苗制剂，其中所述受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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