CN117279670A - 用于糖尿病的hb-egf基因治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的治疗手段,其侵入性相对较低并且能够对包括T1D的糖尿病施加期望的治疗效果。具体地,提供了一种用于保护和/或再生患有糖尿病的哺乳动物中的胰腺β细胞的制剂,其包含编码肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB‑EGF)的核酸,其中所述制剂是全身给药的。还提供了上述制剂与编码肝细胞生长因子(HGF)的核酸的组合。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够确保治疗效果的糖尿病基因治疗剂。更具体地,本发明涉及用于保护和/或再生患有糖尿病的哺乳动物中的胰腺β细胞的制剂,所述制剂包含编码肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)的核酸等。
背景技术
根据国际糖尿病联合会(IDF)的一份报告,截至2019年,全球糖尿病患者人数已达4.63亿,如果人数继续以这种速度增长,预计到2045年将达到7亿。在占所有糖尿病90%的2型糖尿病(T2D)中,当胰岛素敏感性因遗传易感性和环境因素(生活方式)而降低时,胰腺β细胞试图通过胰岛素的代偿性高分泌来弥补胰岛素作用的不足。如果这种状态持续很长时间,β细胞就会耗尽,无法分泌足够的胰岛素,从而导致高血糖。
另一方面,1型糖尿病(T1D)是一种由于自身免疫机制破坏胰腺β细胞而导致胰岛素分泌减少,从而导致高血糖的疾病。在很小的时候就能患上T1D,其机制的细节尚不清楚。
T1D患者需要在余生中自我注射胰岛素来控制血糖。然而,即使进行严格的胰岛素治疗,血糖控制也很困难,高血糖和严重低血糖复发,难以防止并发症的进展。因此,需要一种能够完全治愈T1D的创新治疗方法。
作为一种完全治愈T1D的治疗方法,人们对再生和重建失去器官功能的再生医学的期望越来越高。其中之一是通过胰岛移植补充β细胞治疗,据报道这种治疗方法对改善葡萄糖代谢有效。然而,由于T1D患者在胰岛移植后必须使用免疫抑制剂,并且胰岛移植供体短缺,因此该技术的实际应用受到限制。此外,由于T1D中发生了针对β细胞的持续自身免疫反应,因此即使找到了供体,也有必要多次重复移植。
因此,作为T1D再生医学的另一种方法,已经尝试通过体内基因治疗直接“保护(抗细胞死亡诱导)和/或增殖(再生)(再生愈合诱导)”(以下有时统称为“保护和/或再生”)患者体内剩余的β细胞。例如,已经报道了一些使用肝细胞生长因子(HGF)作为T1D的治疗基因的研究。鉴于最近在使用高剂量腺相关病毒(AAV)载体的基因治疗的临床试验中报告了三例由于严重不良事件而死亡的病例,本发明人最近开发了一种可以低剂量给药并发挥保护和/或再生胰腺β细胞作用的HGF基因治疗剂,并提交了专利申请(专利文献1)。
肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)是一种属于EGF家族的生长因子。众所周知,它首先被合成为膜结合型前体(proHB-EGF),在膜旁结构域被特定的金属蛋白酶切割,所得的可溶性HB-EGF对许多类型的细胞显示出促有丝分裂作用。然而,HB-EGF基因治疗T1D的研究很少。仅仅有报道称在四氧嘧啶部分胰腺灌注的T1D模型小鼠中,通过逆行胰管注射局部给予编码HB-EGF的腺病毒(Ad)载体,腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)的结果表明,新分化或增殖的胰岛素产生细胞可以分泌胰岛素来响应葡萄糖刺激(专利文献1)。然而,由于IPGTT中0分钟时的血糖(空腹血糖)即使在未治疗组中也显示出正常值,并且在HB-EGF给药组和未治疗组之间没有观察到显著差异,因此该动物模型没有显示出T1D病理。此外,由于高血糖即使在30分钟后也不能被抑制,当胰岛素分泌水平被认为增加到最大值时,可以解释为葡萄糖反应性胰岛素分泌没有改善以对T1D产生治疗效果。此外,由于其高侵袭性和复杂的操作,这种给药方法对于人类的临床应用是不现实的。
[引用列表]
[专利文献]
[PTL1]
日本专利申请No.2020-192844
[非专利文献]
[NPL1]
Kozawa,J.等人,Pancreas,31:32-42(2005)
发明内容
因此,本发明的目的是提供一种新的治疗手段,其侵袭性相对较低并且能够对包括T1D在内的糖尿病施加期望的治疗效果。
[问题的解决方案]
为了实现上述目的,本发明人进行了深入的研究。结果,当通过全身给药而不是通过胰腺局部给药将HB-EGF基因给药于T1D模型小鼠时,在小鼠中,在给药后至少10周的较长时期内抑制血糖升高。此外,在IPGTT中,葡萄糖给药后血糖升高受到抑制,在胰岛素分泌反应中,也证实了葡萄糖给药之后分泌水平增加。HGF基因与HB-EGF基因联合给药具有协同作用,并且高血糖被长期显著抑制。此外,在IPGTT中,血糖升高被显著抑制,胰岛素分泌水平被显著维持。在下述实施例中,尽管使用了转基因瞬时表达的Ad载体(通常为2-3周),但令人惊讶的是,本发明人成功地实现了持续的高血糖抑制作用和葡萄糖耐量改善作用,远远超过了预测的表达期。
同时,在以下提及的实施例中,在测试期间(包括随后的观察期)未观察到由于载体施用Ad载体而引起的不良事件。
基于这些发现,本发明人成功地提供了一种对包括T1D在内的糖尿病有效的新型基因治疗,其中全身给药(例如,静脉给药)HB-EGF基因,优选进一步的HGF基因,其是低侵袭性的,并且允许保护和/或再生保持其正常功能的β细胞,从而完成了本发明。
因此,本发明如下。
[项目1]
一种用于在患有糖尿病的哺乳动物中保护和/或再生胰腺β细胞的制剂,包括编码肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的核酸,其中所述制剂是全身给药的。
[项目2]
根据第1项所述的制剂,与编码肝细胞生长因子(HGF)的核酸组合。
[项目3]
根据第1或2项所述的制剂,其中所述胰腺β细胞保留葡萄糖反应性胰岛素的分泌能力。
[项目4]
根据第1-3项中任一项所述的制剂,其中所述全身给药是静脉给药。
[项目5]
根据第1-4项中任一项所述的制剂,其中所述核酸携带在病毒载体上。
[项目6]
根据第5项所述的制剂,其中所述病毒载体是腺病毒(Ad)载体或腺相关病毒(AAV)载体。
[项目7]
根据第6项所述的制剂,其中所述制剂以单剂量给药或以至少60天间隔的多剂量给药。
[项目8]
根据第5至7项中任一项所述的制剂,其中所述病毒载体以1×1010至2×1012个病毒颗粒(vp)/kg体重的剂量给药。
[项目9]
根据第1-8项中任一项所述的制剂,其中所述糖尿病为1型糖尿病。
[项目10]
根据第1至9项中任一项所述的制剂,其中所述哺乳动物是人。
[项目11]
一种在患有糖尿病的哺乳动物中保护和/或再生胰腺β细胞的方法,包括向哺乳动物全身给予有效量的编码HB-EGF的核酸。
[项目12]
根据第11项所述的方法,进一步包括向哺乳动物施用有效量的编码HGF的核酸。
[发明的有利效果]
根据本发明,即使在安全性和低侵袭性的情况下,也可以在长时间内实现保护和/或再生胰腺β细胞的所需效果。因此,需要胰岛素给药的糖尿病(包括T1D)的体内高QOL基因治疗成为可能,并且可以增强这种治疗在人类临床实践中的应用的可实现性。
附图说明
[图1]
图1A示出了当腺病毒载体从尾静脉注射到通过链脲佐菌素(STZ)给药产生T1D的小鼠时,第-7天至第7天之间血糖水平的每日变化。施用腺病毒载体的日期是第0天。图1B示出了用腺病毒载体给药的上述T1D模型小鼠在第-7天至第70天之间血糖水平的每周变化。在图中,横轴表示病毒载体给药后的天数(天),纵轴表示血糖水平(mg/dl)。
[图2]
图2示出了IPGTT在与图1相同的小鼠中的结果(在Ad载体给药后16天)。在施用葡萄糖(2g/kg体重)时、施用后30、60和120分钟采集血液,并测量血糖水平和血浆胰岛素水平。图2A示出了葡萄糖施用后血糖水平(mg/dl)的时间历程变化,图2B示出了葡萄糖施用后血浆胰岛素水平(ng/ml)的时间进程变化。
[图3]
图3示出了IPGTT在与图1相同的小鼠中的结果(在Ad载体给药后60天)。在施用葡萄糖(2g/kg体重)时、施用后30、60和120分钟采集血液,并测量血糖水平和血浆胰岛素水平。图3A示出了葡萄糖施用后血糖水平(mg/dl)的时间-进程变化,图3B示出了葡萄糖施用后血浆胰岛素水平(ng/ml)的时间进程变化。
[图4]
图4示出了生化分析的结果,其中测量了与图1中相同的5组小鼠在第3天、第5天、第7天和第14天的血浆AST水平和血浆ALT水平。纵轴表示血浆AST水平(IU/L)或血浆ALT水平(IU-L)。
[图5]
图5示出了病毒给药后使用样本(肝脏)的组织学分析(HE染色)。
[图6]
图6示出了使用来自施用Ad.CA-HB-EGF和Ad.CA-HGF的小鼠和施用Ad.CA-LacZ的小鼠的样品(肝脏)的组织学分析(HE染色)。
具体实施方式
1.本发明保护和/或再生β细胞的制剂(I)
本发明提供了一种用于在患有糖尿病的哺乳动物中保护和/或再生胰腺β细胞的制剂,其包含编码HB-EGF的核酸(以下也称为“本发明保护和/或再生β细胞(I)的制剂”)。用于保护和/或再生β细胞的制剂的特征在于通过全身给药将其施用于靶哺乳动物。
在本说明书中,“保护和/或再生胰腺β细胞”是指保留剩余β细胞的功能和/或增殖β细胞(包括现有β细胞的自我再生和从干细胞或内分泌祖细胞分化),与对照组相比,至少高血糖的急性期被显著抑制在不进行治疗的情况下,并且在此后的长期(例如,不少于60天,优选不少于75天,更优选不少于90天,进一步优选不少于120天)内保持抑制趋势,而不引起β细胞的胰岛素代偿性高分泌,同时保持正常的胰岛素分泌。本发明中的“保护和/或再生胰腺β细胞”不可避免地涉及“高血糖的抑制”,因此,“本发明保护和/或再生β细胞的制剂”也可以是“高血糖抑制制剂”。此外,由于抑制高血糖和控制血糖在治疗糖尿病和抑制并发症进展中是最重要的,因此“本发明保护和/或再生β细胞的制剂”也是“治疗糖尿病的制剂”。根据上述非专利文献1,当使用Ad载体通过逆行胰管注射对通过四氧嘧啶部分胰腺灌注治疗的小鼠局部施用HB-EGF基因时,已经报道了与未治疗(施用LacZ基因)组相比,观察到空腹血糖没有显著差异。由于未治疗组的空腹血糖为正常值,因此建议使用的动物模型从未显示出T1D病理(能够分泌胰岛素的β细胞被维持到可以抑制空腹高血糖的程度)。因此,现有技术的参考文献未能证明对T1D的治疗效果。另一方面,在下述实施例中,本发明证明,未治疗组的空腹血糖(IPGTT中0分钟时的血糖)显示出显著高于正常小鼠的值(即,动物模型清楚地显示出T1D病理),并且HB-EGF基因给药组的空腹葡萄糖与未治疗组相比降低。因此,本发明保护和/或再生β细胞的制剂(I)可以抑制空腹高血糖,对已知的HB-EGF基因治疗剂具有有利的作用。
优选地,“胰腺β细胞的保护和/或再生”是指保留对葡萄糖刺激分泌胰岛素和通过葡萄糖负荷抑制血糖升高功能的β细胞的防护和/或更新,即葡萄糖反应性胰岛素的分泌能力。即使通过保护残留的β细胞和/或分化新的β细胞增殖来保留β细胞的数量,当β细胞葡萄糖反应性胰岛素的分泌能力较低时,餐后高血糖可能无法抑制,也可能无法实现充分的血糖控制。例如,在上述非专利文献1中,通过四氧嘧啶部分胰腺灌注测试处理的小鼠被认为保留了能够分泌胰岛素的β细胞,直到空腹血糖维持在正常水平,然而,直到葡萄糖负荷后至少60min,HB-EGF基因给药组和未给药组之间的血糖变化没有观察到显著差异,这表明胰腺局部给药HB-EGF对餐后高血糖没有充分的抑制作用。另一方面,本发明保护和/或再生β细胞的制剂(I)在IPGTT中发挥基于其的葡萄糖反应性胰岛素分泌作用和餐后高血糖抑制作用已被证明,并且其长期保持这种作用。
本发明中使用的“编码HB-EGF的核酸”可以是DNA或RNA,或DNA/RNA嵌合体。优选地,可以指DNA。此外,核酸可以是双链的或单链的。当它是双链时,它可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂交体。当它是单链时,它可以是有义链(即编码链)或反义链(如非编码链)。作为编码HB-EGF的DNA,可以指基因组DNA、来源于人或其他哺乳动物细胞或组织的cDNA(cRNA)、合成DNA(RNA)等。
本发明中使用的“编码HB-EGF的核酸”至少包括编码分泌型可溶性HB-EGF。优选地,“编码HB-EGF的核酸”包括编码proHB-EGF(其为膜结合的HB-EGF)的核苷酸序列,并且更优选地包括编码proHB-EGF(该proHB-EEGF为在N-末端包含信号序列的初始翻译产物)的核苷酸序列。HB-EGF首先被合成为含有信号序列的前体,之后信号序列在内质网中被切割以形成膜结合的proHB-EGF,其被膜旁结构域中的特定金属蛋白酶进一步切割以成为可溶性HB-EGF。在本发明中,通过全身给药进入血流的编码HB-EGF的核酸被递送到核酸或载体(例如病毒载体)靶向的器官,例如肝脏。当靶器官不是胰腺时,器官细胞表达和分泌的可溶性HB-EGF被认为是通过血流输送到胰腺的,主要对β细胞发挥保护和/或再生作用。因此,只要至少包含编码可溶性HB-EGF的核苷酸序列,就可以通过将其插入含有适当信号序列的分泌表达载体中而直接表达和分泌为可溶性HB-EGF。然而,由于人工分泌表达机制有可能不能很好地发挥作用,因此优选首先表达膜结合的proHB-EGF,然后通过利用给药对象哺乳动物内源性蛋白酶的作用产生可溶性HB-EGF。尽管通过用天然信号序列以外的序列代替信号序列可以提高分泌效率,但分泌效率也可能降低。因此,在优选的实施方案中,可以使用编码包括天然信号序列的preproHB-EGF的核酸。
更具体地说,作为“编码HB-EGF的核酸”,包含在严格条件下与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补链序列杂交的核苷酸序列的核酸[对应于在GenBank中以登录号NM_001945登记的人HB-EGF mRNA序列的276至902位的核苷酸序列(CDS)(第276至第332位对应于信号密码子,第333至第461位对应于前肽编码区,第462至第719位对应可溶性HB-EGF编码区)],并且其编码具有与HB-EGF相当的活性(例如胰腺β细胞保护和/或再生活性)的蛋白质可以被提及。
在严格条件下与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补链序列杂交的核酸的实例(前提是当核酸是RNA时,碱基序列中的“t”被“u”取代)包括含有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列显示出约60%或更高、优选约70%或更高、更优选约80%或更高、特别优选约90%或更高、最优选约95%或更高同一性的核苷酸序列的核酸等。
核酸编码与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列显示出约90%或更高、优选约95%或更高、进一步优选约97%或更高、特别优选约98%或更高同一性的氨基酸序列,使得含有氨基酸序列的蛋白质具有与含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白基本相同的活性(例如胰腺β细胞保护和/或再生活性)。
本说明书中碱基序列的同一性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST(国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具)在以下条件下计算(预期值=10;允许空位;过滤=ON;匹配分数=1;错配分数=-3)。
本说明书中氨基酸序列的同一性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST在以下条件下计算(预期值=10;允许空位;矩阵=BLOSUM62;过滤=OFF)。
杂交可以根据本身已知的方法或基于此的方法进行,例如,在MolecularCloning,第2版(J.Sambrook等,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)等中描述的方法。当使用市售文库时,杂交可以根据附在说明书中的方法进行。杂交可以优选在严格的条件下进行。
严格的条件例如特征如下的反应条件:(1)低离子强度和高温,例如0.015M氯化钠/0.015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠在50℃,用于洗涤,和(2)变性剂如甲酰胺,例如50%(v/v)甲酰胺以及含有0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/750mM氯化钠和75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)在42℃。或者,严格条件可以是如下条件:在42℃下使用50%甲酰胺、5×SSC(0.75M氯化钠、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5×Denhart’s溶液、超声处理三文鱼精子DNA(50g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖、并在55℃用0.2×SSC和50%甲醛进行洗涤,随后在55℃下用包括含有0.1×SSC的EDTA进行高强度洗涤。本领域普通技术人员可以通过基于诸如探针长度之类的因素适当地调节杂交反应和/或洗涤时的温度、缓冲液的离子强度等来容易地实现期望的严格性。
在非人哺乳动物中,编码HB-EGF的核酸可以是由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的核酸的直系同源物。例如,希望使用编码源自哺乳动物的HB-EGF的核酸作为给药对象。给予本发明保护和/或再生β细胞的药剂的哺乳动物没有特别限制,只要其患有糖尿病,并且包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴子等,优选人。因此,在优选实施方案中,编码HB-EGF的核酸是编码人HB-EGF(即,由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质)的核酸。
编码HB-EGF的核酸可以通过例如使用具有HB-EGF基因的CDS区的核苷酸序列的一部分的合成DNA引物通过PCR方法扩增来克隆,或通过将掺入适当表达载体中的DNA与含有HB-EGF基因CDS区核苷酸序列的标记DNA片段或合成DNA杂交。杂交可以根据例如MolecularCloning,第二版(ibidem)等中描述的方法进行。当使用市售文库时,杂交可以根据文库附带的说明书中描述的方法进行。
DNA的核苷酸序列可以根据本身已知的方法,例如ODA-LA PCR法、Gapped双链法、Kunkel法等,或基于此的方法,使用公知的试剂盒,例如MutanTM-super-Express Km(Takara Shuzo有限公司)、MutanTM-K(Takara Shuzo有限公司)等进行转换。
克隆的DNA可以按原样使用,或者在用限制性核酸内切酶消化或根据需要添加接头后使用,这取决于其用途。DNA可以在其5’端具有翻译起始密码子ATG,在其3’端具有转译终止密码子TAA、TGA或TAG。这些翻译起始密码子和翻译终止密码子可以使用合适的合成DNA接头添加。
可以通过例如从编码HB-EGF基因的CDS区的核酸中切出所需的DNA片段,并将启动子下游的DNA片段连接到合适的表达载体中,来制备含有编码HB-EGF的核酸的表达载体。
表达载体没有特别限制,只要其通常用于基因治疗即可。例如,可以使用病毒载体如腺病毒(Ad)载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、辛德毕斯病毒载体、狂犬病病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体和非病毒载体如动物细胞表达质粒(例如,pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。从基因转移表达效率高、染色体整合频率和无插入突变风险低、引入非分裂细胞的能力、转基因的中长期表达能力等方面来看,优选使用Ad载体或AAV载体。
Ad载体的转基因表达期(一般为2-3周)短于AAV载体和染色体整合载体。然而,由于HB-EGF对胰腺β细胞的保护和/或再生作用持续时间远远超过基因表达期(至少60天或更长,优选75天或更长、更优选90天或更长,进一步优选120天或更长),这可能是相当有利的,因为可以降低或避免由于HB-EGF的长期表达引起的副作用(例如致癌作用)的风险。尽管AAV载体可携带的基因的大小小至4.7kb,但由于HB-EGF编码序列(CDS)为624kb,并且包括启动子、终止子等的整个表达盒约为1-2kb,因此其使用没有问题。
已知Ad载体在肝脏中积聚。即使HB-EGF被引入并在其他器官的细胞中表达,细胞外分泌的可溶性HB-EGF也可以通过血流输送到胰腺。此外,AAV载体根据血清型具有不同的组织嗜性,并且具有胰腺嗜性的血清型包括例如类型6、8和9。然而,所使用的血清型没有特别的限制,因为当使用普遍存在的启动子时,在其他器官的细胞中引入、表达和分泌的可溶性HB-EGF仍然可以通过血流输送到胰腺。相反,在某些情况下,可能优选在其他器官的细胞中表达HB-EGF,因为当病毒载体在胰腺中积聚时,β细胞可能会受到病毒衣壳抗原特异性杀伤T细胞的攻击。
启动子可以是任何启动子,只要它适合用于表达基因的宿主。
例如,当它是哺乳动物动物细胞时,可用的启动子包括病毒启动子,例如来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子(例如,CMV直接早期启动子)、来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)的启动因子(例如,HIV LTR)、来源于劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子(例如,RSV LTR)、来源于Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)的启动子(例如,MoMLV-LTR)、来源于单纯疱疹病毒(HSV)的启动基因(例如,HSV胸苷激酶(TK)启动子)、来源于猿猴病毒40(SV40)的启动子(例如,SV40早期启动子)、来源于Epstein-Barr病毒(EBV)、来源于腺病毒(AdV)的启动子(Ad2或Ad5主要晚期启动子)等,以及哺乳动物的组成蛋白基因启动子,如β-肌动蛋白基因启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)基因启动子和转铁蛋白基因启动子等。
当使用病毒载体作为载体时,需要低剂量给药以降低不良事件的风险。然而,为了在低剂量下提供所需的治疗效果,有必要在启动子的下游负载编码HB-EGF的核酸,该核酸具有能够达到治疗有效的血液HB-EGF水平的转录活性。例如,可以使用转录活性比在病毒载体的基因治疗中经常使用的CMV启动子和RSV启动子更强的启动子。作为这种高活性启动子,CA启动子和与其具有同等转录活性的启动子,例如普遍存在的启动子,如多肽链延伸因子1α1(EF1A)启动子、多肽链延长因子1α短(EFS)启动子、CBh启动子(CMV即时早期增强子和修饰鸡β-肌动蛋白启动子不同CA启动子的杂交启动子),可以提及脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、小鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、SV40增强子/早期启动子、PGK启动子、泛素C(UBC)启动子等。
此外,当使用具有高组织嗜性的高病毒载体时,或在局部给药的情况下,在靶器官的组织或细胞中特异性且高表达的启动子(例如,在肝脏中;在胰腺β细胞中的白蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白启动子等,在肌肉中的胰岛素启动子、Pdx1启动子、Ins2启动子等;肌原蛋白启动子、骨骼肌肌动蛋白α1(ACTA1)启动子、MHCK7启动子、SM22a启动子,包括对表达和分泌的HB-EGF可以通过血流从其递送到胰腺的任何器官的组织或细胞特异性的启动子)。
表达载体优选在编码HB-EGF的核酸的下游含有转录终止信号,即终止区。此外,当需要时,它可以进一步包含增强子、剪接信号、用于选择转化细胞的选择标记基因、SV40复制起点等。选择标记基因的实例包括提供对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素和磷虾毒素等药剂有抗性的基因、补充营养缺陷型突变的基因等。
必要时,可将编码适合宿主的信号序列(信号密码子)的核苷酸序列添加到编码HB-EGF的DNA的5’端侧。例如,可以使用胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
可以使用常规基因工程技术、细胞培养技术和病毒制备技术来制备含有编码HB-EGF的核酸的表达载体[例如,Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人,eds.(1994)John Wiley&Sons,Inc.;Molecular Cloning(a Laboratory Manual),3rded.Volume 1-3,Josseph Sambrook&David W Russeleds.,Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor,New York)(2001);Culture of Animal Cells;AManual of Basic Technique,R.Freshney eds.,2nd ed.(1987),Wiley-Liss;FrankL.Graham,Manipulation of adenoviral vector,Chapter 11.p109-p128;E.J.Murrayeds.,Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transfer and ExpressionProtocols(1991);Chen,S-H.等人,Combination gene therapy for liver metastasesof colon carcinoma in vivo.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92,2477-2581,等]。
当使用非病毒载体作为包含编码HB-EGF的核酸的表达载体时,可以通过使用聚合物载体如聚-L-赖氨酸-核酸复合物或通过将载体包封在脂质体中来进行表达载体的引入。脂质体是由粒径为几十至几百纳米的磷脂组成的胶囊,其内部可以封装载体,例如编码HB-EGF的质粒。
本发明保护和/或再生β细胞的制剂(I)可以在维持正常胰岛素分泌的同时长期抑制高血糖。因此,它可用于治疗T1D和其他糖尿病(如T2D,其中胰岛素抵抗进展,β细胞因代偿性胰岛素分泌过多而耗尽,导致胰岛素分泌受损并最终导致β细胞死亡),由于胰腺β细胞的破坏而需要胰岛素给药,以及用于抑制进展为并发症。
在本发明保护和/或再生β细胞的制剂(I)中,本发明表达HB-EGF的病毒载体可以原样使用,或者在必要时可以与药理学上可接受的载体混合,并配制成各种形式的制剂,如注射等,并用作药物。
这里,作为药理学上可接受的载体的例子,可以提到传统上用作药物制备材料的各种有机或无机载体物质,并且在液体制剂中,这些载体物质被配制为溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂和舒缓剂等。此外,根据需要,可以使用药物制剂添加剂,例如防腐剂、抗氧化剂、着色剂等。
作为合适的溶剂的实例,可以提及注射用水、生理盐水、林格溶液、醇类、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油、棉籽油等。
作为合适的增溶剂的实例,可以提及聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等。
作为合适的悬浮剂的实例,表面活性剂如硬脂基三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苯扎氯化铵和单硬脂酸甘油酯;亲水性聚合物,例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素;可以提及聚山梨醇酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油等。
作为合适的等渗剂的实例,可以提及氯化钠、甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、葡萄糖等。
作为合适的缓冲剂的实例,可以提及磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲溶液。
作为合适的舒缓剂的实例,可以提及苄醇等。
作为合适的防腐剂的实例,可以提及对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
作为合适的抗氧化剂的实例,可以提及硫化物、抗坏血酸盐等。
作为合适的着色剂的实例,水溶性食品焦油色素(例如,食品色素,如食品红2号和3号、食品黄4号和5号以及食品蓝1号和2号)、不溶于水的色淀色素(例如,上述水溶性食品焦油色素的铝盐等)、天然色素(例如,β-胡萝卜素、叶绿素、氧化铁红等)等。
作为上述药物组合物的剂型的实例,可以提及非口服制剂,例如注射(例如,皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射等)、滴剂等。
本发明保护和/或再生β细胞的制剂(I)可以通过制剂技术领域中常规使用的方法生产,例如日本药典中描述的方法。作为制剂中的活性成分的病毒载体的含量根据活性成分的剂型、剂量等而变化,例如为约0.1至100wt%。病毒滴度可以适当调整为例如1010-1011pfu/ml(因为物理滴度比生物滴度高出几到100倍或更多,就病毒颗粒而言,为2×1010-2×1013vp/ml),但不限于此范围。
适用于肠外给药(例如,静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内给药等)的制剂的实例包括水性和非水性等渗无菌注射液体,其中可含有抗氧化剂、缓冲剂、抗病毒剂、等渗剂等。实例还包括任选含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等的水性和非水性无菌悬浮液。本发明中最优选的剂型是注射液体。
制剂的剂量取决于载体的种类、启动子活性、给药途径、疾病的严重程度、给药对象的动物种类、药物可接受性、体重、年龄等。例如,当使用Ad载体作为HB-EGF表达载体时,在过去的临床研究中,已经报道了在肝动脉给药6×1011个病毒颗粒(vp)/kg体重(总量3.8×1013vp)后由于急性肝损伤导致的死亡(Mol Genet Metab 2003;80:148-158)。由于Ad载体在肝脏中高度积累,在肝动脉给药的情况下,预计更高剂量的Ad载体会在肝脏中积累。因此,假设Ad载体可以安全地用于其他全身给药,最高可达剂量的10倍或5×1012vp/kg体重,特别是当Ad载体通过外周静脉给药时。例如,单次剂量为约5×109-约5×1012vp/kg体重,优选约1×1010-约2×1012vp/kg体重。此外,当AAv载体用作HB-EGF表达载体时,在最近的临床研究中,在高剂量(3×1014vp/kg体重)给药组中已经报道了由于严重肝病而导致的死亡(Audentes Therapeutics致MTM疾病社区的信)。https://myotubulartrust.org/audentes-therapeutics-letter-23-june-2020/;Hum Gene Ther 2020;31:695-696)。然而,在同一项临床研究中,低剂量(1×1014vp/kg体重)组尽管患有肝病,但没有发生任何肝脏不良事件,这表明1014vp/kg体重或更低的剂量可以安全使用。例如,单次剂量为约5×109-约5×1013vp/kg体重,优选约1×1010-约1×1013VP/kg体重。
例如,在下面提到的实施例中,以约5×1012vp/kg体重尾静脉施用Ad载体证明了HB-EGF基因治疗对T1D的作用。在上述非专利文献1中,通过逆行胰管注射将Ad载体的生物学效价为4×108pfu(约2×1010pfu/kg体重)给予小鼠。由于vp:pfu比率由于病毒提取方法等而变化很大,因此物理滴度方面的剂量是未知的;然而,当vp:pfu比率为100倍或更高时,估计约为2×1012vp/kg体重或更高。与全身给药相比,逆行胰管注射可以显著减少剂量,因为其基因转移仅限于胰腺。因此,令人惊讶的是,与逆行胰管注射相比,以相当于逆行胰管注入的剂量全身给药可以产生更优越的抑制血糖升高的效果。
另一方面,当使用包封在脂质体中的非病毒载体作为HB-EGF表达载体时,由于通过静脉注射666μg的DNA,该量可以用作粗略的标准剂量。例如,成人的单次剂量为约2至约10mg,优选约5至约8mg。
本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(I)通过注射、导管、球囊导管等非肠道(例如,静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内等)全身给药。如本文所用,“全身给药”可以是胰腺局部给药以外的给药方法,如静脉给药、肌肉内给药、腹膜内给药,只要给药制剂中编码HB-EGF的核酸和/或由核酸产生和分泌的可溶性HB-EGF进入血流并在全身循环,从而有助于胰腺β细胞的保护和/或再生。
胰管局部给药被认为是明显有利的,因为可以避免由于基因转移到多个器官而导致的不良事件的风险,因为通过给药进行的基因转移几乎仅限于胰腺。然而,考虑到β细胞可能被杀伤性T细胞对转基因和病毒的攻击所破坏的风险,允许基因转移到其他器官的全身给药在临床上是有利的。
当逆行胰管注射应用于人类临床实践时,即使不需要剖腹手术,也必须通过内镜逆行胰胆管造影(ERCP)进行基因转移,这是一种高度侵入性的方法,需要复杂的程序。因此,静脉注射等全身给药在患者耐受性和便利性方面极为有利。此外,根据上述非专利文献1,除非严格控制载体浓度、体积、注射速率和时间,否则逆行胰管注射与重症胰腺炎的风险相关。在这方面,全身给药也具有更高的安全性。
在上述非专利文献1中,作为使用基因治疗代替注射HB-EGF蛋白来治疗糖尿病的HB-EGF的原因,作者解释了HB-EGF蛋白质的生物活性的持久性低,并且假设大部分被胰液中的蛋白酶灭活。他们认为,通过胰腺导管细胞中表达的膜结合proHB-EGF的自分泌或旁分泌作用,使β细胞从胰腺导管细胞分化或新生是最重要的,此外,胰腺导管细胞分泌的可溶性HB-EGF具有旁分泌效应,可保护和/或再生胰岛中剩余的β细胞。因此,可以合理地得出结论,本领域技术人员在学习了非专利文献1的教导后,无法预测从诸如肝脏的远程器官表达和分泌的可溶性HB-EGF将通过血流输送到胰腺,并通过内分泌作用引起β细胞的保护和/或再生作用。因此,通过将基因转移到胰腺以外的器官作为主要靶器官,通过器官细胞表达和分泌的可溶性HB-EGF的作用保护和再生β细胞,并抑制血糖升高来治疗糖尿病的策略是新颖和独创的。
在本发明中使用的病毒载体的剂量范围中,当使用相对高的剂量时,为了避免肝损伤(这作为由病毒载体引起的不良事件特别重要),希望避免将高剂量的病毒载体递送到肝脏的给药途径,如肝动脉给药,和施用本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(I),例如从静脉,特别是外周静脉等。
本发明的β细胞保护和/或再生剂(I)的给药频率没有特别限制。如以下实施例所示,即使使用Ad载体,单次给药也能在至少70天的长时间内提供一定程度的高血糖抑制作用。此外,胰腺β细胞的葡萄糖反应性胰岛素分泌能力可以维持(改善葡萄糖耐受性)至少60天。实施例的小鼠正在进行进度观察,完全可以预期上述效果将持续更长的时间。当AAV载体(其转基因原则上不整合到染色体中)被引入分裂细胞时,情况可能也是如此。
此外,当AAV载体用于靶向非分裂细胞时,HB-EGF的表达可以维持更长的时间。因此,认为高血糖抑制作用和葡萄糖耐量改善作用可以持续更长的时间(例如,6个月或更长,优选一年或更长,更优选几年或更长)。
因此,本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(I)可以以例如至少60天或更长、优选75天或更长,更优选90天或更长和进一步优选120天或更长的间隔给药,即使当Ad载体和AAV载体,其是非染色体整合的并且通常被认为比逆转录病毒和慢病毒载体更安全并且使用更频繁。此外,根据要使用的病毒载体的类型,它也可以每隔三个月至几年给药一次,在另一个实施方案中,单次给药也是可能的。
2.本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)
本发明还提供了一种用于保护和/或再生患有糖尿病的哺乳动物中的胰腺β细胞的制剂,其包含编码HB-EGF的核酸和编码HGF的核酸的组合,其特征在于至少编码HB-EGF的核酸是全身给药的(下文也称为“本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)”)。
作为本发明中使用的“编码HGF的核酸”,包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列(对应于在GenBank中以登录号NM_000601注册的人HGF mRNA序列的77至2263位的核苷酸序列)的核酸,或在严格条件下与其互补链序列杂交并编码具有与HGF相当的活性(例如胰腺β细胞保护和/或再生活性)的蛋白质的核苷酸序列。
在严格条件下与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的互补链序列杂交的核酸的实例包括含有显示出约60%或更高、优选约70%或更高、更优选约80%或更高、特别优选约90%或更高同一性的核苷酸序列的核酸,最优选约95%或更高,具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,等等。如本文所用,“严格条件”如对上述编码HB-EGF的核酸所定义。核酸编码与SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列显示出约90%或更高、优选约95%或更高、进一步优选约97%或更高、特别优选约98%或更高同一性的氨基酸序列,使得含有氨基酸序列的蛋白质具有与含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白基本相同的活性(例如胰腺β细胞保护和/或再生活性)。
编码HGF的核酸在非人哺乳动物中可以是由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成的核酸的同源物。例如,希望使用编码源自哺乳动物的HGF的核酸作为给药对象。给予本发明的保护和/或再生β细胞的药剂的哺乳动物没有特别限制,只要它患有糖尿病,并且包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴子等,优选人。因此,在优选的实施方案中,编码HGF的核酸是编码人HGF(即,由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质)的核酸。
编码HGF的核酸可以以与上述编码HB-EGF的核酸相同的方式克隆,并且可以插入各种病毒载体或类似于上述的非病毒载体的启动子下游。编码HGF的核酸可以与编码HB-EGF的核酸一起插入到单个表达载体中,或者每个可以插入到单独的表达载体中。当编码HB-EGF的核酸和编码HGF的核酸插入单个表达载体中时,它们可以置于单个启动子的控制下,或者可以置于单独的相同或不同启动子的管理下。在前一种情况下,编码HB-EGF的核酸或编码HGF的核酸可以位于上游(更靠近启动子),但能够在哺乳动物细胞中进行双向表达的序列(例如IRES序列、源自口蹄疫病毒的2A序列)插入在这两种核酸之间。此外,当将编码HB-EGF的核酸和编码HGF的核酸插入单独的表达载体中时,表达载体的类型可以相同或不同。此外,两种核酸都可以置于相同或不同启动子的控制下。
通过与编码HB-EGF的核酸组合使用,编码HGF的核酸可以在长时间内抑制高血糖,同时保持正常的胰岛素分泌。因此,它可用于治疗T1D和其他糖尿病(如T2D,其中胰岛素抵抗进展,β细胞因代偿性胰岛素分泌过多而耗尽,导致胰岛素分泌受损并最终导致β细胞死亡),由于胰腺β细胞的破坏而需要胰岛素给药,以及用于抑制进展为并发症。
在本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)中,本发明的HB-EGF表达载体和本发明的HGF表达载体可以原样使用,或者在必要时可以与药理学上可接受的载体混合,并配制成各种形式的制剂,如注射液等,并用作药物制剂。当将编码HB-EGF的核酸和编码HGF的核酸插入单独的表达载体中时,本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)可以配制为含有这两种表达载体的单一药物组合物,或者每个表达载体可以单独配制并组合使用。当每种表达载体被单独配制时,含有含有编码HB-EGF的核酸的表达载体的制剂可以以与上述本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(I)相同的方式配制,并通过相同的给药途径给药。此外,当将编码HB-EGF的核酸和编码HGF的核酸插入单个表达载体中时,可以以与上述本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(I)相同的方式配制含有表达载体的制剂,并以相同的给药途径、剂量和给药频率给药。
在本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)中,当单独配制每种表达载体时,通过将常规用作药物制备材料的各种有机或无机载体物质作为溶剂、增溶剂、悬浮剂、,液体制剂中的等渗剂、缓冲剂、舒缓剂等。此外,根据需要,可以使用药物制剂添加剂,例如防腐剂、抗氧化剂、着色剂等。作为溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、舒缓剂、防腐剂、抗氧化剂和着色剂,本发明的上述保护和/或再生β细胞的制剂(I)中分别例举的那些可以优选以相同的方式使用。
作为上述药物组合物的剂型的实例,可以提及胃肠外制剂,例如注射(例如,皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射等)、滴注等。
含有含有编码HGF的核酸的表达载体的制剂可以通过制剂技术领域中常规使用的方法,例如日本药典中描述的方法来生产。作为制剂中的活性成分的病毒载体的含量根据活性成分的剂型、剂量等而变化,例如为约0.1至100wt%。病毒滴度可以适当调整为例如1010-1011pfu/ml(因为物理滴度比生物滴度高出几到100倍或更多,就病毒颗粒而言,为2×1010-2×1013vp/ml),但不限于此范围。
适用于肠外给药(例如,静脉注射、皮下注射、肌肉注射、局部注射、腹膜内给药等)的制剂的实例包括水性和非水性等渗无菌注射液体,其中可含有抗氧化剂、缓冲剂、抗菌剂、等渗剂等。实例还包括水性和非水性无菌悬浮液,其任选地包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。含有含有编码HGF的核酸的表达载体的制剂的最优选剂型是注射液。
当本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)以每种表达载体单独配制的形式提供时,两种制剂可以在使用时混合并作为单一药物组合物给药,或者可以作为单独的制剂通过相同或不同的给药途径同时或以交错的方式给药。
本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)的剂量根据载体的种类、启动子活性、给药途径、疾病的严重程度、给药对象的动物种类、给药主体的药物耐受性、体重、年龄等而变化,其中每种表达载体是单独配制的。例如,当使用Ad载体作为HB-EGF表达载体和HGF表达载体时,例如,两种表达载体的总量为每次约5×109-约5×1012vp/kg体重,优选约1×1010-约2×1012vp/kg体重。此外,当AAV载体用作HB-EGF表达载体和HGF表达载体时,例如,两种表达载体的总量为每次约5×109-约5×1013vp/kg体重,优选约1×1010-约1×1013VP/kg体重。
另一方面,当使用包封在脂质体中的非病毒载体作为HB-EGF表达载体和HGF表达载体时,例如,对于成年人,两种表达载体的总量为每次约2至约10mg,优选约5mg至约8mg。
两种表达载体在本发明的保护和/或再生β细胞的制剂(II)中的定量比率,其中每种表达载体是单独配制的,只要它提供所需的β细胞保护和/或再生作用(抑制禁食和餐后高血糖,维持葡萄糖反应性胰岛素分泌能力),就没有特别的限制。例如,HB-EGF表达载体与HGF表达载体的比例可以在10:1至1:10的范围内适当选择,优选为5:1至1:5,更优选为2:1至1:2。
下面通过举例说明本发明。它们仅仅是示例,并且不以任何方式限制本发明的范围。
[实施例]
试验方法
1.重组腺病毒载体(Ad)的生产
在巨细胞病毒即时早期增强子的杂交启动子和修饰的鸡β-肌动蛋白启动子(CA启动子)或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子(在本说明书中分别称为“Ad.CA-HB-EGF”、“Ad.RSV-HB-EGF”)的转录控制下,在CA启动子的转录控制下表达非增殖性Ad的人HGF(在本说明书中分别称为“Ad.CA-HGF”),和在CA启动子转录控制下的非增殖Ad表达的LacZ基因(在本说明书中分别称为“Ad.CA-LacZ”)通过在《人类基因治疗》10:2013-2017(1999)中描述的方法制备。对由此产生的重组Ads进行增殖和纯化,并通过常规方法如Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:2577-2581(1995)。
2.动物实验
雄性8周龄c57/BL/6N小鼠(Kyudo Co.,有限公司,Tosu),体重18g-20g,可自由获取食品和水。如先前报道的(Diabetes 2010;59:1261-1265),将溶于0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)中的链脲佐菌素(STZ;Sigma-Aldrich Japan,Tokyo)以50mg/kg的剂量腹膜内给予40只小鼠,每天一次,连续5天(第-7至-3天)。注射STZ的小鼠在3天后(第0天)随机分为4组(每组10只),且静脉注射一次以下中的任一个:
(1)2×1011vp Ad.CA-LacZ
(2)1×1011vp Ad.CA-HB-EGF+1×1011vp Ad.CA-LacZ
(3)1×1011vp Ad.RSV-HB-EGF+1×1011vp Ad.CA-LacZ
(4)1×1011vp Ad.CA-HB-EGF+1×1011vp Ad.CA-HGF
既没有接受STZ注射也没有接受腺病毒基因治疗的小鼠(n=4)被用作正常对照(完整)。从包括正常组小鼠在内的所有小鼠身上采集血液。从第-7天到第7天每天采集血样,从第14天到第70天每周采集一次血样。在图1所示的时间点测试血糖水平。在Ad载体给药后16天和60天进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。小鼠禁食14小时后,腹膜内给予2g/kg体重的葡萄糖(相当于人类口服葡萄糖耐量试验(OGTT)75g),并在给药前、给药后30、60和120分钟立即采集血样。在每个时间点测量血糖水平和血浆胰岛素水平。使用超灵敏的小鼠胰岛素测量ELISA试剂盒(森永生物科学研究所)测量胰岛素。
所有动物实验都是根据美国国立卫生研究院的指导方针进行的,并得到鹿儿岛大学动物实验伦理委员会的批准。
3.生化分析
使用Medisafefit Pro II(Terumo,Tokyo)测量血糖水平,并通过ELISA测定(Morinaga Co.有限公司,Yokohama)测量血浆胰岛素水平。
通过SPOTCHEM SP-4430临床自动仪(Arkray)测量各组病毒给药后3、5、7和14天的血浆天冬氨酸转氨酶(AST)和血浆丙氨酸转氨酶(ALT)水平。
4.统计分析
数据以平均值±标准误差(s.e.)表示。通过单向配置分散分析(单向ANOVA)测试多重比较,并通过Student t检验确定用Ad.CA-LacZ治疗的小鼠和用Ad.CA-HB-EGF+Ad.CA-HGF治疗的小鼠之间是否存在统计学显著差异。P<0.05被定义为具有统计学意义。
5.组织学分析
使用病毒给药后的小鼠肝脏,以与Int J Mol Med.38(6):1673-1682(2016)中所述相同的方式进行科学分析,方法是在病毒给药3、5、7和14天后使用每组的样品。
实验结果
1.HB-EGF(和HGF)基因治疗对T1D模型小鼠急性期高血糖的抑制作用
在未治疗组(Ad.CA-LacZ给药组)中,在载体给药后第7天(第一次注射STZ后14天),血糖浓度迅速升高至约400mg/dl(图1A),此后逐渐升高,然后保持在不低于400mg/dl的高水平(图1B)。单次静脉注射1×1011vp Ad.CA-HB-EGF或Ad.RSV-HB-EGF抑制了第7天血糖水平的升高(图第1A段)。在此后约10周的进展观察中,与未治疗组相比,血糖水平显示出抑制的趋势,并且认识到了长期效果(图1B)。在联合使用HB-EGF基因和HGF基因的组中,与单独使用HB-EGF-基因的情况相比,高血糖被更强地抑制,并且在长时间内表现出显著的效果。
2.通过用Ad载体的HB-EGF(和HGF)基因治疗抑制T1D模型小鼠的餐后高血糖和葡萄糖反应性胰岛素分泌能力
在给予治疗基因后16天和60天进行IPGTT,并确认餐后高血糖的抑制和葡萄糖反应性胰岛素分泌能力。在HB-EGF基因给药组给药后第16天,观察到葡萄糖给药后血糖升高的抑制(图2A),并证实胰岛素分泌量增加是对葡萄糖刺激的反应(图2B)。这些作用通过将HB-EGF基因与HGF基因结合而协同增加,类似于血糖水平。给药60天后观察到类似的结果(图3A、3B)。从以上内容可以看出,基因治疗可以长期改善葡萄糖耐量。
3.本实施例的Ad载体的静脉给药不会引起肝功能障碍
临床前和临床研究已经报道,体内高剂量Ad载体的静脉给药导致基因转移主要进入肝脏,这可能导致严重的肝病(Mol Genet Metab 2003;80:148-158.;Hum gene Ther2020;31:695-696)。因此,为了评价由于静脉给予本实施例的Ad载体而引起的肝病,在第3、5、7和14天测量与上述1中相同的五组小鼠的血浆AST和ALT水平。(图4)。没有任何生化测试(AST和ALT)显示异常值超过200IU/L(图4)。Ad.CA-LacZ组的组织学分析显示,肝损伤程度为轻度至中度(图5,图6),证实该剂量不存在安全问题。此外,与LacZ组相比,HB-EGF组抑制了AST和ALT值的增加(图4),HB-EGF/HGF组表现出强烈的抑制作用(图1-3)。由此证实,HB-EGF,进一步的HB-EGF/HGF,不仅在糖尿病中保护和/或再生β细胞,而且可以抑制由病毒给药引起的肝功能障碍并发症。
[工业适用性]
HB-EGF基因治疗通过全身给药对胰腺β细胞表现出保护和/或再生作用,并在保持正常胰岛素分泌能力的同时表现出高血糖抑制作用。此外,通过将HB-EGF基因与HGF基因结合,葡萄糖反应性胰岛素分泌能力显著提高,并且不仅可以显著抑制随机血糖和空腹血糖的升高,还可以显著抑制餐后高血糖。到目前为止,通过逆行胰管注射HB-EGF治疗糖尿病的基因治疗已经报道,这是一种高度侵入性的并且需要复杂的技术。然而,β细胞的分化和增殖仅在正常小鼠中得到证实,而高血糖的抑制作用尚未得到充分证实。根据本发明,全身给药,如静脉注射,甚至以相当于胰腺局部给药的低剂量给药,表现出优异的β细胞保护和/或再生作用以及高血糖抑制作用。此外,即使使用传统上被认为相对安全的染色体非整合病毒载体,这种效果也能维持很长一段时间,远远超过预期的基因表达期。因此,本发明的保护和/或再生β细胞的制剂可以是一种安全有效的糖尿病基因治疗剂,可在临床上应用。糖尿病患者的数量在全球范围内持续增加,并已成为一个社会问题,本发明的意义重大。特别是,T1D在很小的时候就发展起来,现有的胰岛移植疗法的使用受到限制。因此,本发明的保护和/或再生β细胞的制剂作为包括T1D在内的糖尿病的再生医学的替代和通用手段是非常有用的。
本申请基于在日本提交的第2021-033714号专利申请(申请日期:2021年3月3日)和在日本提交(申请日期为2021年9月7日)的第2021-145796号专利申请,其内容全部并入本文。
序列表
<110> 国立大学法人鹿儿岛大学
<120> 用于糖尿病的HB-EGF基因治疗
<130> 093229
<150> JP 2021-033714
<151> 2021-03-03
<150> JP 2021-145796
<151> 2021-09-07
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(627)
<400> 1
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Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly
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<210> 3
<211> 2187
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2187)
<400> 3
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tca gat ctg gtt tta atg aag ctt gcc agg cct gct gtc ctg gat gat 1776
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
ttt gtt agt acg att gat tta cct aat tat gga tgc aca att cct gaa 1824
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
aag acc agt tgc agt gtt tat ggc tgg ggc tac act gga ttg atc aac 1872
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
tat gat ggc cta tta cga gtg gca cat ctc tat ata atg gga aat gag 1920
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
aaa tgc agc cag cat cat cga ggg aag gtg act ctg aat gag tct gaa 1968
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
ata tgt gct ggg gct gaa aag att gga tca gga cca tgt gag ggg gat 2016
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
tat ggt ggc cca ctt gtt tgt gag caa cat aaa atg aga atg gtt ctt 2064
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
ggt gtc att gtt cct ggt cgt gga tgt gcc att cca aat cgt cct ggt 2112
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
att ttt gtc cga gta gca tat tat gca aaa tgg ata cac aaa att att 2160
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
tta aca tat aag gta cca cag tca tag 2187
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 4
<211> 728
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
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Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
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275 280 285
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Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
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485 490 495
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Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
Claims (12)
1.一种用于在患有糖尿病的哺乳动物中保护和/或再生胰腺β细胞的制剂,包括编码肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的核酸,其中所述制剂是全身给药的。
2.根据权利要求1所述的制剂,与编码肝细胞生长因子(HGF)的核酸结合。
3.根据权利要求1或2所述的制剂,其中胰腺β细胞保留葡萄糖反应性胰岛素分泌能力。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制剂,其中所述全身给药是静脉给药。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制剂,其中所述核酸被携带在病毒载体上。
6.根据权利要求5所述的制剂,其中所述病毒载体是腺病毒(Ad)载体或腺相关病毒(AAV)载体。
7.根据权利要求6所述的制剂,其中所述制剂以单剂量给药或以至少60天间隔的多剂量给药。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的制剂,其中所述病毒载体以1×1010至2×1012个病毒颗粒(vp)/kg体重的剂量给药。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制剂,其中所述糖尿病为1型糖尿病。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制剂,其中所述哺乳动物是人。
11.一种在患有糖尿病的哺乳动物中保护和/或再生胰腺β细胞的方法,包括向哺乳动物全身给予有效量的编码HB-EGF的核酸。
12.根据权利要求11所述的方法,还包括向哺乳动物施用有效量的编码HGF的核酸。
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