CN117269486A - 广谱新冠病毒蛋白液相芯片、试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了广谱新冠病毒蛋白液相芯片、试剂盒、检测方法和应用。所述广谱新冠病毒蛋白液相芯片包括至少两种来自不同新冠病毒毒株的新冠病毒蛋白和至少两种作为载体的荧光编码微球，其中每种所述新冠病毒蛋白分别各自与一种荧光编码微球偶联，并且不与其他的荧光编码微球偶联，其中所述新冠病毒毒株包括奥密克戎BA.4毒株。基于本发明的液相芯片进行中和抗体的检测，可实现灵敏度高、特异性强、重复性好、高通量的检测，并且灵活性强、可比性高、可实现检测自动化，还可大量节省试剂样本与实验成本，用常规实验室即可操作。

Description

广谱新冠病毒蛋白液相芯片、试剂盒、检测方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体而言，涉及广谱新冠病毒蛋白液相芯片、试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
新冠病毒为单股正链RNA病毒，其基因组在复制的过程中极易发生突变。随着新冠病毒在全球范围的不断传播，其病毒基因组序列发生改变产生了多种新冠病毒变异毒株，其中D614G、Alpha(阿尔法)、Beta(贝塔)、Gamma(伽玛)、Delta(德尔塔)、Kappa(卡帕)和Omicron(奥密克戎)变异株等表现出更高的传播性，而且对疫苗和中和抗体药物的抵抗力更高，给新冠病毒感染的预防和治疗带来巨大挑战。在缺乏有效治疗药物的情况下，安全且有效的新型冠状病毒肺炎疫苗是控制新冠疫情最有效的方法。新冠病毒中和抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法。中和抗体是免疫系统产生的一种保护性抗体，能够识别并阻止病原体结合到宿主细胞上，发挥保护效应，是评估疫苗效果，监测感染率、群体免疫和保护性免疫的标准。因此，快速、准确、高灵敏度和易操作的中和抗体检测方法，无论是对新冠肺炎治疗，还是对疫苗有效性的评估，都是十分重要的。
目前评估新冠中和抗体的检测主要有病毒侵染法(包括真病毒和假病毒中和试验)和免疫阻断法(包括酶联免疫法、化学发光法和POCT试纸条)。真病毒中和试验是检测中和抗体的金标准，需要使用活病毒蚀斑减少中和试验(PRNT)，在高安全性实验室S3中进行；假病毒中和实验也需要细胞，并在一定安全级别的P2实验室完成，无法在大规模人群中应用。基于免疫阻断法的中和性抗体检测技术简单快速，在常规实验室就可操作，但仍存在以下问题：1)每次只能检测一种变异毒株，而检测多种毒株需要成倍的时间、样本和试剂用量，检测成本大大提高。2)每种突变体的中和性抗体反应相对独立，容易受到操作者、环境和试剂的影响，导致分析误差增加，影响结果的可比性。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了广谱新冠病毒蛋白液相芯片、试剂盒、检测新冠病毒中和抗体的方法和应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种广谱新冠病毒蛋白液相芯片，包括至少两种来自不同新冠病毒毒株的新冠病毒蛋白和至少两种作为载体的荧光编码微球，其中每种所述新冠病毒蛋白分别各自与一种荧光编码微球偶联，并且不与其他的荧光编码微球偶联，其中所述新冠病毒毒株包括奥密克戎BA.4毒株。
(2)根据(1)所述的液相芯片，其中所述新冠病毒蛋白选自新冠病毒毒株的S三聚体蛋白、S单体蛋白和RBD蛋白。
(3)根据(1)所述的液相芯片，其中所述新冠病毒毒株还包括D614G、阿尔法、贝塔、伽玛、德尔塔、卡帕和奥密克戎BA.1、BA.2、BA.3和BA.5毒株。
(4)根据(1)所述的液相芯片，其中偶联在每种所述荧光编码微球上的每种所述新冠病毒蛋白的量为1-10μg/106个微球。
(5)根据(1)所述的液相芯片，其中所述荧光编码微球上包被有荧光染料和/或量子点，不同的荧光编码微球的荧光染料和/或量子点的颜色不同，和/或浓度不同，使得不同的荧光编码微球的光谱信号不同；优选地，所述荧光编码微球具有磁性。
(6)根据(1)-(5)中任一项所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片在检测新冠病毒中和抗体中的应用。
(7)一种检测新冠病毒中和抗体的方法，包括以下步骤：
1)提供根据(1)-(5)中任一项所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片；
2)将所述液相芯片与待测样品混合；
3)将ACE2蛋白与步骤2)所得的混合物混合以使其与新冠病毒蛋白结合，其中所述ACE2蛋白标记有标签以用于引入可检测物质从而进行新冠病毒蛋白检测；其中当所述可检测物质包含荧光分子时，该荧光分子的光谱信号与所述荧光编码微球的光谱信号不同；
4)从步骤3)所得的体系中去除游离的所述可检测物质；
5)用流式细胞仪分选步骤4)所得的液相芯片并进行所述新冠病毒蛋白检测，其中基于所述荧光编码微球的不同的光谱信号进行所述分选。
(8)根据(7)所述的方法，其中所述待测样品为接种过新冠疫苗的生物体的血清样本；优选地，所述血清样本的稀释倍数为1-100倍；优选地，步骤2)所述的混合在室温下避光进行1-3小时。
(9)根据(7)所述的方法，其中在步骤3)中，所述ACE2蛋白与所述新冠病毒蛋白的重量比为1000:1至1:1；优选地，步骤3)所述混合在室温下避光进行0.5-2小时。
(10)根据(7)所述的方法，其中所述ACE2蛋白所标记的标签包括含有或不含有荧光分子的以下物质：生物素、亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、组氨酸抗体、含Ni亲和分子、荧光素酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶；其中优选含有或不含有荧光分子的生物素。
(11)根据(7)所述的方法，其中所述可检测物质能够与所述ACE2蛋白的所述标签特异性结合；优选地，所述可检测物质与所述ACE2蛋白的重量比为8:1至1:1；优选地，所述可检测物质为荧光分子标记的链霉亲和素。
(12)一种液相芯片试剂盒，包括根据(1)-(5)中任一项所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片和ACE2蛋白，其中所述ACE2蛋白标记有标签以用于引入可检测物质从而进行新冠病毒蛋白的检测；优选地，所述ACE2蛋白标记有生物素，并且所述试剂盒还包括荧光分子标记的链霉亲和素。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明提出用液相芯片技术制备包括新冠变异毒株奥密克戎BA.4蛋白在内的多种新冠蛋白的蛋白芯片，利用荧光编码微球的多种不同发射光以及荧光标记ACE2(血管紧张素转化酶2，新冠病毒入侵细胞的受体蛋白)蛋白与中和抗体之间的竞争结合，巧妙地实现了待测样品中针对多种新冠病毒蛋白的中和抗体的高通量检测，并且可同时针对多种变异株进行检测，包括D614G、阿尔法、贝塔、伽玛、德尔塔、卡帕和奥密克戎BA.1-BA.5。
本发明的中和抗体检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可进行高通量检测，并且灵活性强、可比性高、可实现检测自动化，还可大量节省试剂样本与实验成本，用常规实验室即可操作，不依赖P2或P3实验室。与传统中和抗体检测技术相比具有极大的优势和临床价值。
基于上述发明构思，本发明首次制备了包括新冠变异毒株奥密克戎BA.4蛋白在内的多种新冠蛋白的液相芯片，为新冠病毒的研究及疫苗和药物的开发提供了新的有效平台。
附图说明
图1为本发明原理的示意图。
图2示出本申请实施例2的实验结果。
图3示出本申请实施例3的实验结果；其中图3A为D614G毒株结果；图3B为贝塔毒株结果；图3C为阿尔法毒株结果；图3D为卡帕毒株结果；图3E为伽玛毒株结果；图3F为德尔塔毒株结果；
图3G为奥密克戎BA.1毒株结果；图3H为奥密克戎BA.2毒株结果；
图3I为奥密克戎BA.3毒株结果；图3J为奥密克戎BA.4毒株结果；
图3K为奥密克戎BA.5毒株结果。
图4示出本申请实施例6中将用本发明方法检测中和抗体的结果与用假病毒实验检测中和抗体滴度的结果进行相关性分析的结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本文所述“新冠病毒”或“新型冠状病毒”是指世界卫生组织于2020年1月命名的2019-nCoV病毒。国际病毒分类委员会于2020年2月11日还将其命名SARS-CoV-2病毒。
本文所述“液相芯片”和“荧光编码微球”具有本领域已知且公认的含义。
本发明一个方面提供了一种广谱新冠病毒蛋白液相芯片，包括至少两种来自不同新冠病毒毒株的新冠病毒蛋白和至少两种作为载体的荧光编码微球，其中每种所述新冠病毒蛋白分别各自与一种荧光编码微球偶联，并且不与其他的荧光编码微球偶联，其中所述新冠病毒毒株包括奥密克戎BA.4毒株。
在一些实施方案中，所述新冠病毒毒株还包括D614G、阿尔法、贝塔、伽玛、德尔塔、卡帕和奥密克戎BA.1、BA.2、BA.3和BA.5毒株。
在上述情况中，每种新冠毒株的病毒蛋白分别与不同的荧光编码微球偶联。例如，新冠病毒毒株包括D614G、阿尔法、贝塔、伽玛、德尔塔、卡帕和奥密克戎BA.1-BA.5毒株，它们分别与12种不同的荧光编码微球偶联。
优选地，所述新冠病毒蛋白选自新冠病毒毒株的S三聚体蛋白、S单体蛋白和RBD蛋白。
在本发明中，不同的荧光编码微球是指，微球上所包被的荧光染料和/或量子点的颜色不同，和/或浓度不同，使得不同的荧光编码微球的光谱信号不同。通常，荧光编码微球技术是通过在微球中掺入一种或多种不同浓度(例如两种不同比例)的荧光染料或量子点，使微球带有不同的荧光强度和/或颜色，从而形成具有编码功能的微球阵列。这些微球可以包被不同特异性的抗体或核酸，能够同时对生物样本中的多个指标进行高通量定量检测。
荧光编码微球可以通过本领域已知的商业途径购得，其材质可为已知的那些。例如，荧光编码微球的材质可选自二氧化硅、聚苯乙烯、磁性微球和生物大分子聚合物。优选地，本发明荧光编码微球的材质为聚苯乙烯。
在优选的实施方案中，所述荧光编码微球具有磁性，这样有利于利用磁性(例如磁力分离架)将微球分离。
优选地，偶联在每种荧光编码微球上的每种新冠病毒蛋白的量为1-10μg/106个微球。如果偶联的量低于1μg/106个微球，则实验中检测到的荧光强度过低，影响实验结果的判读；如果偶联的量高于10μg/106个微球，则会导致实验中蛋白量的浪费，因为蛋白偶联量达到一定数值后，检测到的荧光强度不会随着蛋白偶联量的增加而增加。
在本发明优选的实施方案中，将蛋白偶联在荧光编码微球上可通过以下步骤进行：
1)微球活化；例如，将微球与NaH2PO4、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(EDC)混合，室温孵育20-60分钟，进一步优选20-40分钟，更优选30分钟；
2)微球偶联；例如，分别将不同的新冠病毒蛋白与不同光谱信号的活化的微球混合，偶联的量为3μg/106个微球，室温孵育2-4小时，优选2.5小时；
3)封闭；例如，用1％BSA室温封闭0.5-6小时，进一步优选0.5-3小时，更优选1小时；
4)保存；例如，将偶联好的微球重悬于储存液中，2-8℃，优选4℃避光保存。
在活化微球之前，上述方法还优选包括微球的预处理；例如，将微球涡旋振荡、水浴超声，充分混匀。
本发明的液相芯片能够利用多种荧光编码微球的不同发射光，同时凭借荧光标记ACE2蛋白与中和抗体之间与蛋白的竞争结合，从而巧妙地实现针对多种新冠病毒蛋白的中和抗体的高通量检测。
因此，本发明还提供了本发明所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片在检测新冠病毒中和抗体中的应用。
本发明还提供了检测新冠病毒中和抗体的方法，包括以下步骤：
1)提供本发明所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片；
2)将所述液相芯片与待测样品混合；
3)将ACE2蛋白与步骤2)所得的混合物混合以使其与新冠病毒蛋白结合，其中所述ACE2蛋白标记有标签以用于引入可检测物质从而进行新冠病毒蛋白检测；其中当所述可检测物质包含荧光分子时，该荧光分子的光谱信号与所述荧光编码微球的光谱信号不同；
4)从步骤3)所得的体系中去除游离的所述可检测物质；
5)用流式细胞仪分选步骤4)所得的液相芯片并进行所述新冠病毒蛋白检测，其中基于所述荧光编码微球的不同的光谱信号进行所述分选。
在一些实施方案中，所述待测样品为接种过新冠疫苗的生物体的血清样本。所述生物体包括人等哺乳动物。
优选地，在检测时，将所述血清样本稀释1-100倍，进一步优选10-40倍，更优选20倍。
优选地，步骤2)所述的混合在室温下避光进行1-3小时，进一步优选1.5-2.5小时，最优选2小时。
优选地，在步骤3)中，所述ACE2蛋白与所述新冠病毒蛋白的重量比为1000:1至1:1，更优选10:3。
优选地，步骤3)所述混合在室温下避光进行0.5-2小时，进一步优选0.5-1.5小时，最优选1小时。
所述ACE2蛋白带有标签的目的是引入可检测物质，从而进行新冠病毒蛋白的检测。所标记的标签包括含有或不含有荧光分子的以下物质：生物素、亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、组氨酸抗体、含Ni亲和分子、荧光素酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶；其中优选含有或不含有荧光分子的生物素。
在本发明的方法中，检测可检测物质可通过荧光法检测、显色法检测、电化学检测、力学检测等。优选采用荧光法检测。更优选地，在532nm和635nm波长下进行荧光检测。
在一些实施方案中，ACE2蛋白的标签直接标记有所述可检测物质，例如荧光标记。当ACE2与蛋白结合后，可直接进行检测。
在另一些实施方案中，ACE2蛋白的标签不直接标记有可检测物质，可检测物质是额外添加的。在这种情况中，所述可检测物质能够特异性识别并结合ACE2蛋白的标签，从而实现检测。
优选地，所述ACE2蛋白标记有生物素(即带有生物素标签)，并且所述可检测物质为荧光分子标记的链霉亲和素(SA-PE)。
优选地，可检测物质与ACE2蛋白的重量比为8:1-1:1。
在本发明的方法中，所检测到的荧光值越大，证明血清中所含中和抗体的量越少。可以通过公式计算中和抗体对新冠病毒蛋白的抑制率(抑制率＝(1-样本MFI/空白孔MFI)×100％)，通过抑制率来表示中和抗体的量，抑制率越大，所含中和抗体的量越多。
在本发明优选的具体实施方案中，所述检测新冠病毒中和抗体的方法包括以下步骤：
1)在同一体系中，将不同的偶联有新冠病毒蛋白的荧光编码微球与待测样品混合，孵育2小时；
2)加入生物素标记的ACE2，孵育1小时；
3)加入SA-PE，孵育30分钟；
4)在流式细胞仪上进行检测。
在本发明更具体的实施方案中，所述检测新冠病毒中和抗体的方法包括以下步骤：
(1)将偶联好的微球混合加入96孔板，每种微球的浓度设置为2500个微球/孔，50μL/孔；
(2)加入检测样品，振荡孵育2小时；
(3)加入生物素标记的ACE2，浓度为0.5μg/mL，50μl/孔，振荡孵育1小时；
(4)加入荧光检测探针SA-PE溶液，浓度为2μg/ml，50μl/孔，振荡孵育30min；
(5)在流式细胞仪上进行上机检测。
本发明还提供了一种液相芯片试剂盒，包括本发明所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片和ACE2蛋白，其中所述ACE2蛋白标记有标签以用于引入可检测物质从而进行新冠病毒蛋白的检测。
优选地，所述ACE2蛋白标记有生物素，并且所述试剂盒还包括荧光分子标记的链霉亲和素。
以下结合本发明的实施例对本发明作进一步详细说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不应以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法和条件实施，或者按照制造厂商所建议的条件实施。
实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂：
活化缓冲液：NaH2PO4(0.1M，pH 6.2)，用0.22μm滤器过滤，4℃存放；
Sulfo-NHS：50mg/mL(用ddH2O稀释)，现配现用；
EDC：50mg/mL(用ddH2O稀释)，现配现用；
PBS-T：PBS，0.05％ Tween-20，pH 7.4，用0.22μm滤器过滤，4℃存放；
偶联缓冲液：MES(50mM，pH 5.0)，用0.22μm滤器过滤，4℃存放；
封闭液：50mM Tris(pH 8.1)与PBS-TBN(PBS-T、1％ BSA、0.05％NaN3)各1/2制成，0.22μm滤器过滤后使用；
储存液：PBS-TBN(PBS-T、1％ BSA、0.05％NaN3)，用0.22μm滤器过滤后使用；
分析缓冲液：PBS-TB(PBS-T、0.1％ BSA)，用0.22μm滤器过滤后使用。
实施例1：广谱新冠变异毒株蛋白芯片的制备
(1)将12种未偶联的不同荧光编码微球进行预处理：涡旋振荡1min、水浴超声30s，超声仪的功率为100w，充分混匀；
所述荧光编码微球购自唯公科技公司，每种荧光编码微球上具有APC(别藻蓝蛋白)和APC-Cy7两种荧光染料，不同的荧光编码微球的两种染料比例不同，导致每种微球的光谱信号不同。不同的荧光编码微球具有不同的编号，分别如下表所示；其与待偶联的新冠变异株蛋白的对应关系也如下表所示。
(2)分别取125μL(浓度为8000个/μL)微球到EP管内，将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液；
(3)移走磁力分离架，并用100μL去离子水震荡重悬微球，将EP管放置在磁力板上2min，将微球与溶液分开，去上清液；
(4)移走磁力分离架，并用80μL NaH2PO4(0.1M，pH 6.2)振荡重悬微球，加入10μL的50mg/ml的Sulfo-NHS溶液(溶于水中)，轻柔振荡混匀，加入10μL的50mg/ml的EDC溶液中(溶于水中)，轻柔振荡混匀，在室温孵育20分钟，每隔10分钟轻柔振荡混匀一次；
(5)将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液。
(6)移走磁力分离架并用200μL的MES缓冲液(50mM，pH 5.0)，振荡重悬微球，将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液，重复两次；
(7)移走磁力分离架并用MES缓冲液(50mM，pH 5.0)振荡重悬活化并清洗后的微球，分别加入3μg的D614G、Alpha(阿尔法)、Beta(贝塔)、Gamma(伽玛)、Delta(德尔塔)、Kappa(卡帕)和Omicron(奥密克戎)BA.1-BA.5变异株的S三聚体蛋白以及阴性对照N蛋白(来源如下表所示)到重悬的微球溶液中，用MES缓冲液(50mM，pH 5.0)将总体积增至200μL，振荡混匀进行偶联反应，在室温下振荡孵育2.5个小时；
(8)将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液。
(9)移走磁力分离架并用200μL的封闭液振荡重悬偶联后的微球，将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液，重复两次；
(10)移走磁力分离架并用200μL的封闭液振荡重悬清洗好的偶联后的微球，在室温下振荡孵育1个小时；
(11)将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液。
(12)移走磁力分离架并用200μL的储存液振荡重悬偶联后的微球，将EP管放置在磁力分离架上2min，将微球与溶液分开，去上清液，重复两次；
(13)移走磁力分离架并用200μL的储存液振荡重悬封闭并清洗后的偶联好的微球，4℃避光保存；
(14)使用时，将12种偶联好的微球混合，用PBS-TB溶液进行稀释，每种微球的浓度设置为50个微球/μL，即可制成广谱新冠变异株蛋白芯片。
实施例2：广谱新冠变异株蛋白-宿主受体结合能力的测定
(1)将实施例1中制成的广谱新冠变异株蛋白芯片，涡旋振荡1min、水浴超声30s，超声仪的功率为100w，充分混匀；
(2)将生物素标记的ACE2用PBS-TB溶液进行1:3倍比稀释，浓度(μg/mL)设置如下表所示；
10 3.333 1.111 0.370 0.123 0.0412 0.014 0
(3)取96孔板，将稀释好的生物素标记的ACE2(购自义翘神州公司(SinoBiological Inc.)，货号Cat:10108-H08H-B)溶液以50μL/孔加入到96孔板中，设置重复组；
(4)将制成的广谱新冠变异株蛋白芯片以50μL/孔加入相应孔中(若加样时间长，期间须涡旋混匀)，在平板振荡器(1000rpm)上室温避光孵育1h；
(5)将96孔板进行4000r，离心1min；
(6)将96孔板放置在磁性分离板上，静置2min，之后快速有力地翻转，把孔中的溶液倒入生物垃圾桶；
(7)从磁性分离板上取下96孔板，加入100μL PBS-TB溶液，用移液器轻轻吹打数次，洗涤每个孔，在平板振荡器(1000rpm)上振荡2min，按照步骤(6)除去洗涤液，重复两次；
(8)将SA-PE(购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，货号：S866，链霉亲和素、R-藻红蛋白标记，EX:578nm)溶液加入相应孔中，2μg/mL，50μL/孔；在平板振荡器(1000rpm)上室温避光孵育30min；
(9)重复洗涤步骤(5)～(7)；
(10)从磁性分离板上取下96孔板，将微球重悬于100μL PBS-TB溶液中，在平板振荡器(1000rpm)振荡5min，补加100μL PBS-TB溶液，用移液器充分吹打混匀，转至流式管；
(11)在流式分析仪上检测，计数200珠子/区域；
(12)实验结果如附图2所示。
图2示出了各新冠变异株与生物素标记ACE2的亲和力实验结果。通过图2A的标准曲线，用GraphPad Prism 9.0.0软件进行标准曲线分析，可以计算得出EC50(图2B)，通过EC50的大小可以判断各新冠变异株与ACE2的亲和力大小，EC50越大表明与ACE2的亲和力越小。
实施例3：应用于新冠中和纯化抗体的检测
(1)将实施例1制成的广谱新冠变异株蛋白芯片，涡旋振荡1min、水浴超声30s，超声仪的功率为100w，充分混匀；
(2)将RBD(抗新冠病毒受体结合域)中和抗体(购自义翘神州公司，货号：Cat:40592-T62)用PBS-TB溶液进行1:3倍比稀释，浓度(μg/mL)设置如下表所示；
10 3.333 1.111 0.370 0.123 0.0412 0.014 0
(3)取96孔板，将稀释好的RBD中和抗体以50μL/孔加入到96孔板中；
(4)将制成的广谱新冠变异株蛋白芯片以50μL/孔加入相应孔中(若加样时间长，期间须涡旋混匀)，在平板振荡器(1000rpm)上室温避光孵育2h；
(5)将96孔板进行4000r，离心1min；
(6)将96孔板放置在磁性分离板上，静置2min，之后快速有力地翻转，把孔中的溶液倒入生物垃圾桶；
(7)从磁性分离板上取下96孔板，加入100μL PBS-TB溶液，用移液器轻轻吹打数次，洗涤每个孔，在平板振荡器(1000rpm)上振荡2min，按照步骤(6)除去洗涤液，重复两次；
(8)将生物素标记的ACE2溶液加入相应孔中，0.5μg/mL，50μL/孔；在平板振荡器(1000rpm)上室温避光孵育1h；
(9)重复洗涤步骤(5)～(7)；
(10)将SA-PE溶液加入相应孔中，2μg/mL，50μL/孔；在平板振荡器(1000rpm)上室温避光孵育30min；
(11)重复洗涤步骤(5)～(7)；
(12)从磁性分离板上取下96孔板，将微球重悬于100μL PBS-TB溶液中，在平板振荡器(1000rpm)振荡5min，补加100μL PBS-TB溶液，用移液器充分吹打混匀，转至流式管；
(13)在流式分析仪上检测，计数200beads/region；
(14)实验结果如附图3所示，计算RBD中和抗体的抑制率(抑制率＝(1-样本MFI/空白孔MFI)×100％)，做成标准曲线。
注：空白孔：在加入RBD中和抗体这一步，空白孔未加入，只加入PBS-TB溶液。
实施例4：广谱新冠变异株蛋白芯片检测中和抗体的重复性
根据实施例3，使用广谱新冠变异株蛋白芯片，加入浓度为1μg/mL的RBD中和抗体，重复实验5次，计算RBD中和抗体的抑制率(抑制率＝(1-样本MFI/空白孔MFI)×100％)，结果统计见下表所示；
结果解读：CV均控制在15％以内，证明重复性好。
注：空白孔：在加入RBD中和抗体这一步，空白孔未加入，只加入PBS-TB溶液。
实施例5：应用于血清样本中和抗体检测
步骤如实施例3，只是将加入的RBD中和抗体改为血清样本，血清样本用PBS-TB溶液进行1:20稀释，其余步骤均如实施例3的步骤；
血清样本有80例阴性血清样本(未接种过新冠疫苗的健康人血清样本)和106例阳性样本(接种过第三针新冠疫苗后30-60天的健康人血清样本)；
MFI检测结果如下文的表格所示。通过以下公式计算抑制率：抑制率＝(1-样本MFI/空白孔MFI)×100％(空白孔：在加入血清样本这一步，空白孔未加入，只加入PBS-TB溶液。)；MFI：平均荧光强度。
其中，奥密克戎系列毒株抑制率＜15％判断为阴性，15％判断为阳性；非奥密克戎系列毒株抑制率＜30％判断为阴性，＞30％判断为阳性。
186例血清样本的检测结果汇总如下：
灵敏度计算：103/(3+103)×100％＝97.17％
特异性计算：78/(78+2)×100％＝97.50％
总符合率：(78+103)/(78+2+3+103)×100％＝97.31％。
实施例6：与假病毒实验检测的中和抗体滴度结果进行比对
本实施例中采用的实验血清样本为接种第一针新冠疫苗14天后和接种第二针新冠疫苗28天后健康人血清样本。
本发明实验方法的实验步骤如实施例5所述，检测结果用抑制率(抑制率＝(1-样本MFI/空白孔MFI)×100％)表示，结果如下表所示。
假病毒实验是将慢病毒载体中的包膜糖蛋白用新冠病毒S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒。假病毒通过表面S蛋白感染靶细胞并表达报告荧光素酶基因。中和剂如抗体可以阻断S蛋白和ACE2的结合，从而阻止假病毒对宿主细胞的感染。通过检测报告基因荧光素酶的表达量，能推断出病毒被阻断的程度，从而进行中和抗体滴度的检测，检测结果用中和抗体滴度表示。本实施例的假病毒实验同样采用上述同一批血清样本，由中科国邦(北京)检验检测有限公司完成实验，假病毒实验所用的材料、试剂、步骤和条件均采用本领域已知的常规方法进行，故不赘述。检测结果如下表所示。
本实施例只呈现新冠变异株D614G检测结果的相关性分析(如图4所示)。通过用R语言计算皮尔逊(Pearson)相关系数，将本实验方法检测的抑制率与假病毒实验检测的中和抗体滴度进行相关性分析。
由图4可见，在相关性分析中p＜2.2e-16，R＝0.57，表明两个结果存在相关性，相关性为0.57。可见假病毒实验结果与本实验检测的结果相关性显著。用假病毒实验结果来验证本发明检测方法具有可行性。

Claims (12)

1.一种广谱新冠病毒蛋白液相芯片，包括至少两种来自不同新冠病毒毒株的新冠病毒蛋白和至少两种作为载体的荧光编码微球，其中每种所述新冠病毒蛋白分别各自与一种荧光编码微球偶联，并且不与其他的荧光编码微球偶联，其中所述新冠病毒毒株包括奥密克戎BA.4毒株。
2.根据权利要求1所述的液相芯片，其中所述新冠病毒蛋白选自新冠病毒毒株的S三聚体蛋白、S单体蛋白和RBD蛋白。
3.根据权利要求1所述的液相芯片，其中所述新冠病毒毒株还包括D614G、阿尔法、贝塔、伽玛、德尔塔、卡帕和奥密克戎BA.1、BA.2、BA.3和BA.5毒株。
4.根据权利要求1所述的液相芯片，其中偶联在每种所述荧光编码微球上的每种所述新冠病毒蛋白的量为1-10μg/106个微球。
5.根据权利要求1所述的液相芯片，其中所述荧光编码微球上包被有荧光染料和/或量子点，不同的荧光编码微球的荧光染料和/或量子点的颜色不同，和/或浓度不同，使得不同的荧光编码微球的光谱信号不同；优选地，所述荧光编码微球具有磁性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片在检测新冠病毒中和抗体中的应用。
7.一种检测新冠病毒中和抗体的方法，包括以下步骤：
1)提供根据权利要求1-5中任一项所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片；
2)将所述液相芯片与待测样品混合；
3)将ACE2蛋白与步骤2)所得的混合物混合以使其与新冠病毒蛋白结合，其中所述ACE2蛋白标记有标签以用于引入可检测物质从而进行新冠病毒蛋白检测；其中当所述可检测物质包含荧光分子时，该荧光分子的光谱信号与所述荧光编码微球的光谱信号不同；
4)从步骤3)所得的体系中去除游离的所述可检测物质；
5)用流式细胞仪分选步骤4)所得的液相芯片并进行所述新冠病毒蛋白检测，其中基于所述荧光编码微球的不同的光谱信号进行所述分选。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述待测样品为接种过新冠疫苗的生物体的血清样本；优选地，所述血清样本的稀释倍数为1-100倍；优选地，步骤2)所述的混合在室温下避光进行1-3小时。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤3)中，所述ACE2蛋白与所述新冠病毒蛋白的重量比为1000:1至1:1；优选地，步骤3)所述混合在室温下避光进行0.5-2小时。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述ACE2蛋白所标记的标签包括含有或不含有荧光分子的以下物质：生物素、亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、组氨酸抗体、含Ni亲和分子、荧光素酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶；其中优选含有或不含有荧光分子的生物素。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述可检测物质能够与所述ACE2蛋白的所述标签特异性结合；优选地，所述可检测物质与所述ACE2蛋白的重量比为8:1至1:1；优选地，所述可检测物质为荧光分子标记的链霉亲和素。
12.一种液相芯片试剂盒，包括根据权利要求1-5中任一项所述的广谱新冠病毒蛋白液相芯片和ACE2蛋白，其中所述ACE2蛋白标记有标签以用于引入可检测物质从而进行新冠病毒蛋白的检测；优选地，所述ACE2蛋白标记有生物素，并且所述试剂盒还包括荧光分子标记的链霉亲和素。
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