CN117269126A - 一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置。包括以下步骤：S1、宽场模块中光源产生激发光照射在样品上收集信号，实现快速宽场成像；S2、将得到的宽场图像通过针对事件类型专门设计的动态事件判别模块进行实时处理，该模块返回任何检测到的事件的一组坐标，如果检测到一个事件，则停止宽场成像，并在具有预先确定的采集参数的检测坐标周围开始FCS采集。本发明提供的基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置，与传统FCS技术相比，本发明可以快速、高靶向性地确定事件发生的感兴趣区域并进行FCS数据采集，极大程度地提高了FCS实验采集的靶向性和效率。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微领域，尤其涉及一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置。
背景技术
生物系统中的分子动力学是生命事件的基础，荧光相关光谱是一种通过分析生物分子在聚焦的观测体积中扩散时发出的强度波动来检测其分子动力学的强大工具，FCS可以精确地测量分子的局部浓度、流体力学半径、扩散系数以及不同生物分子的相互作用等，与其他面向动力学的方法相比，FCS具有更宽的可测量事件范围，从ns到s，以及更高的灵敏度，可以达到单分子水平，共焦显微镜提供了非常有限的观察体积(约0.5f l)，这显著提高了FCS的信噪比。
在研究活体生物系统的各种动态过程时，FCS不可避免地会受到许多因素的影响，如细胞的运动、荧光团的光漂白、亚衍射区的异常动态等，为了克服这些困难，在过去二十年中已经开展了许多工作，以扩展FCS的能力，例如，双色FCCS被提出用于测量不同分子的相互作用，空间复用技术允许FCS探测不同位置的动态过程，对于静态FCS，观测体积被固定在样品中的特定位置，因此不适用于生物膜中较慢的扩散动力学研究，在这种情况下，荧光团在焦点光斑中出现的频率较低，给采样带来了问题，为了得到足够的采集数据往往需要很长的采集时间，而焦点体积的长时间滞留增加了光破坏的可能性，扫描FCS通过快速扫描过样品，计算与一个或多个位置相关联的组合强度轨迹的自相关性，然后应用拟合模型获得动力学信息，平行扫描FCS在膜平面上沿一条线、两条线或一个圆扫描聚焦光，获取并组装具有时间和像素信息的光子，然后从扫描的线或圆中提取每个像素的强度并将其分箱成图像强度轨迹，图像强度轨迹的自相关可以提供目标生物分子的浓度和扩散系数等信息，同时，距离已知的两条扫描线或扫描圆的两个像素的强度也可以自相关和互相关，对得到的自相关和互相关关系进行全局拟合，可以得到被测生物分子的大小、浓度、扩散系数等信息，扫描FCS对一部分样品进行重复采样可确保减少荧光团的光漂白，并提高统计准确性，有助于检查活细胞应用中的动态行为和浓度。
无论是单点FCS还是扫描FCS对事件进行检测，都需要人为的选择感兴趣区域然后进行数据采集，对感兴趣区域的选择会很大程度的影响实验结果，不好的感兴趣区域会导致采集的数据少，甚至可能探测不到该事件的信号信息，感兴趣区域的选择的问题在大背景的活细胞内更为明显，而感兴趣区域的选择往往依靠实验人员的经验，这让实验的效率低下。
因此，有必要提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置解决上述技术问题。
发明内容
本发明提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置，解决了上述技术背景的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，包括以下步骤：
S1、宽场模块中光源产生激发光照射在样品上收集信号，实现快速宽场成像；
S2、将得到的宽场图像通过针对事件类型专门设计的动态事件判别模块进行实时处理，该模块返回任何检测到的事件的一组坐标，如果检测到一个事件，则停止宽场成像，并在具有预先确定的采集参数的检测坐标周围开始FCS采集；
S3、FCS模块进行FCS数据采集；
S4、获得FCS数据时，就可以保存有关事件的全面数据，包括导致检测到的事件的宽视场时间间隔、扫描的数据，以及总结事件检测和扫描的参数和计时的日志文件，在采集后的分析中，保存的辅助数据用于确认事件的有效性，以及对每个事件的FCS分析进行辅助；
S5、然后显微镜返回到先前的设置，另一个连续的宽视场记录立即开始，该方法可以无限运行，并且由焦点锁定模块保持整个实验过程中样品的稳定，防止轴向漂移。
进一步地，步骤S1中宽场模块内激光器输出第一束激光，经高数值孔径物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过高数值孔径物镜收集，通过滤波系统筛选出荧光信号，由CCD进行探测，获得宽场图像。
进一步地，在步骤S2中在显微镜控制软件实现的控制部件中进行实时事件分析、坐标变换和实时视觉反馈；
在宽场空间和扫描空间之间使用三阶多项式坐标变换来实现整个视场内的精确坐标变换；
该变换通过检测荧光珠在两种成像模式和多项式变换中的系数拟合进行校准，通过将所有被检测珠子的宽视场坐标变换到扫描空间，并与扫描图像中被检测珠子的宽视场坐标进行比较；
宽场和FCS间的转化发生在事件发生后的几十毫秒的时间窗口内以及实时对事件进行记录；
事件触发的模式转换通过八个主要步骤进行工作：
1、初始化事件触发方法；2、记录快速成像图像；3、运行动态事件判别模块；4、若检测到坐标：继续；若未检测到坐标：从步骤2开始重复；5、将检测坐标转化为扫描空间；6准备扫描并计算扫描曲线；7、运行扫描；8、保存数据和日志文件；
最后可以选择在无限循环中重复步骤2-8，以获得许多事件的全自动获取；
在步骤8中保存的最终数据不仅包括FCS记录数据，还包括导致事件的快速成像帧堆栈，以及包含例如触发事件坐标、转化坐标、事件判别模块参数和过程中不同步骤期间的时间戳的日志文件。
进一步地，在步骤S3中，激光器输出第二束激光，作为FCS模块的激发光，通过滤波模块后，经过高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤光片筛选出荧光信号，通过针孔，由雪崩光电二极管进行探测，获得焦点处的荧光强度信号，记录荧光时间轨迹
进一步地，在步骤S4中对事件有效性的确认需要基于FCS信号以及导致事件的N个宽场帧以及描述触发事件的日志文件；
这些帧用于采集后分析，以确定触发事件实际上是真实的目标事件还是由其他因素引起的；
为了对事件进行分类，可以研究事件前的N个宽视场帧，通过使用日志文件中保存的触发坐标可以提取触发坐标周围的信号轨迹，通常真实事件会在最后一帧表现出显著的增加，而由于帧中某些东西快速移动到检测像素而导致的假事件将显示出相对平坦的响应。
进一步地，对事件进行检测需要检测宽视场图像中的信号强度峰值，对峰值的检验的实现可以分为两个部分：使用当前帧、前一帧和感兴趣区域的掩码的预处理；以及峰值检测算法；
在启动该方法并运行模块之前，生成一个二进制掩码，表示视场中要考虑的区域，通常是单元格，其是通过对几个连续帧的平均图像强度进行强度阈值化和高斯平滑来创建的；
该掩模会被输入到检测通道，限制任何不相关的背景噪声，其中包括从帧到帧的大比例变化，避免影响结果；
在事件判别模块中，初始预处理将宽场图像转换为与前一图像相比的像素百分比强度变化图，它首先从当前帧中减去前一帧，并与前一帧相除，生成像素级强度百分比变化的比例图像；
然后将该图像乘以预先计算的掩模，只得到感兴趣区域内的变化并丢弃
背景
对图像进行高斯平滑处理以降低基于噪声的荧光强度变化波动的影响，随后的峰值检测中将预处理图像作为输入，并将其与自身的最大过滤版本进行比较，然后再两个图像相等的地方找到局部最大值；
将峰值放入布尔掩码中，然后将该掩码与预处理图像的两个阈值版本相乘：一个具有高阈值，一个具有低阈值；
提取布尔峰掩模中剩余峰的坐标，去除视场边缘附近的峰，提取每个峰周围小区域的强度，然后使用输入参数限制通道中其余部分使用的峰值数量；
峰值位置和强度被储存并形成一个额外的信息参数，通道从峰值位置连接轨迹，对这些轨迹进行分析，以确定某个轨迹何时首次出现，以及峰值的强度如何随着时间的推移而发展；
当在10帧内其强度保持在某个阈值比例以上呈比例增加时，认为事件发生，最后一帧的跟踪坐标认为是事件坐标。
一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱装置，包括宽场模块、FCS模块、焦点锁定模块和控制窗口；
所述宽场模块的发射部分沿光线传播方向依次包括有宽场成像光光源、高斯光扩束准直透镜组、第一二向色镜，所述宽场模块的探测部分沿光线传播方向依次包括第一二向色镜、第一透镜、第一可调反射镜、第二透镜、第一带宽滤波器、第一陷波器、宽场CCD相机；
所述激发模块沿光线传播方向依次包括第一激发光光源、声光可调谐波滤波器，高斯光扩束准直透镜组、第二可调反射镜、第二二向色镜、第三可调反射镜；
扫描模块沿光线传播方向包括第三透镜、Y轴方向扫描振镜、球面反射镜、X方向扫描振镜、扫描透镜、第三二向色镜；
探测模块沿光线传播方向依次包括第四透镜、针孔、第五透镜、第六透镜、第二带宽滤波器、第二陷波器、雪崩光电二极管；
所述焦点锁定模块沿光线传播方向依次包括第二激光光源、第四可调反射镜、扩束装置、第五可调反射镜、第七透镜、第六可调反射镜、第七可调反射镜、第三陷波器、焦点锁定CCD相机；
所述样品检测模块沿光线传播方向依次包括第四二向色镜、第八透镜、第八可调反射镜、高数值孔径物镜、载物台和压电移动平台。
与相关技术相比较，本发明提供的基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置具有如下有益效果：
本发明提供一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法及其装置，与传统FCS技术相比，本发明可以快速、高靶向性地确定事件发生的感兴趣区域并进行FCS数据采集，极大程度地提高了FCS对膜上事件探测实验的效率。
附图说明
图1为基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法的流程图；
图2为基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法的示意图；
图3为本发明装置的结构图；
图4为膜上缓慢事件的信号示意图。
图中标号：1、宽场成像光光源，2、高斯光扩束准直透镜组，3、第一二向色镜，4、第一透镜，5、第一可调反射镜，6、第二透镜，7、第一带宽滤波器，8、第一陷波器，9、宽场CCD相机，10、第一激发光光源，11、声光可调谐波滤波器，12、高斯光扩束准直透镜组，13、第二可调反射镜，14、第二二向色镜，15、第三可调反射镜，16、第三透镜，17、Y轴方向扫描振镜，18、球面反射镜，19、X方向扫描振镜，20、扫描透镜、21、第三二向色镜，22、第四透镜，23、针孔，24、第五透镜，25、第六透镜，26、第二带宽滤波器，27、第二陷波器，28、雪崩光电二极管，29、第二激光光源，30、第四可调反射镜，31、扩束装置，32、第五可调反射镜，33、第七透镜，34、第六可调反射镜，35、第七可调反射镜，36、第三陷波器，37、焦点锁定CCD相机，38、第四二向色镜，39、第八透镜，40、第八可调反射镜，41、高数值孔径物镜，42、压电移动平台。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。
请结合参阅图1-4所示，一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱装置，包括宽场模块、FCS模块、焦点锁定模块和控制窗口；
宽场模块的发射部分沿光线传播方向依次包括有宽场成像光光源1、高斯光扩束准直透镜组2、第一二向色镜3，宽场模块的探测部分沿光线传播方向依次包括第一二向色镜3、第一透镜4、第一可调反射镜5、第二透镜6、第一带宽滤波器7、第一陷波器8、宽场CCD相机9，荧光材料由宽场激光源激发的荧光信号由物镜收集返回，穿过二向色，3，通过第一可调反射镜5反射通过透镜6，之后再经过第一带宽滤波器7和第一陷波器8进行滤波筛选，最后由宽场CCD相机9收集获得宽场图像；
激发模块沿光线传播方向依次包括第一激发光光源10、声光可调谐波滤波器11，高斯光扩束准直透镜组12、第二可调反射镜13、第二二向色镜14、第三可调反射镜15，第一激发光光源10发射的光束为高斯光束，经过声光可调谐波滤波器11和扩束装置12后，经过第二反射镜13反射后，由第二二向色镜14反射，再经过第三可调反射镜15反射后进入扫描模块。；
扫描模块沿光线传播方向包括第三透镜16、Y轴方向扫描振镜17、球面反射镜18、X方向扫描振镜19、扫描透镜20、第三二向色镜21；
探测模块沿光线传播方向依次包括第四透镜22、针孔23、第五透镜24、第六透镜25、第二带宽滤波器26、第二陷波器27、雪崩光电二极管28；荧光信号经雪崩光电二极管28收集获得像素的荧光强度和时间信息，用于后续的FCS分析经过。
焦点锁定模块沿光线传播方向依次包括第二激光光源29、第四可调反射镜30、扩束装置31、第五可调反射镜32、第七透镜33、第六可调反射镜34、第七可调反射镜35、第三陷波器36、焦点锁定CCD相机37；
样品检测模块沿光线传播方向依次包括第四二向色镜38、第八透镜39、第八可调反射镜40、高数值孔径物镜41、载物台和压电移动平台42。
一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，包括以下步骤：
S1、在宽场模块中激光器输出第一束连续激光，经高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光。荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤波系统筛选出荧光信号，由CCD进行探测，获得宽场图像；
S2、将得到的宽场图像通过针对事件类型专门设计的动态事件判别模块进行实时处理，该模块返回任何检测到的事件的一组坐标，如果检测到一个事件，则停止宽场成像，并在具有预先确定的采集参数的检测坐标周围开始FCS采集；
S3、激光器输出第二束连续激光，作为FCS模块的激发光，通过滤波模块后，经过高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤光片筛选出荧光信号，通过针孔，由雪崩光电二极管28进行探测，获得焦点处的荧光强度信号，记录荧光时间轨迹；
S4、获得FCS数据时，就可以保存有关事件的全面数据，包括导致检测到的事件的宽视场时间间隔、扫描的数据，以及总结事件检测和扫描的参数和计时的日志文件，在采集后的分析中，保存的辅助数据用于确认事件的有效性，以及对每个事件的FCS分析进行辅助；
S5、然后显微镜返回到先前的设置，另一个连续的宽视场记录立即开始，该方法可以无限运行，并且由焦点锁定模块保持整个实验过程中样品的稳定，防止轴向漂移。
本发明步骤S1中宽场模块内激光器输出第一束激光，经高数值孔径物镜41聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过高数值孔径物镜41收集，通过滤波系统筛选出荧光信号，由CCD进行探测，获得宽场图像。
本发明在步骤S2中在显微镜控制软件实现的控制部件中进行实时事件分析、坐标变换和实时视觉反馈；
在宽场空间和扫描空间之间使用三阶多项式坐标变换来实现整个视场内的精确坐标变换；
该变换通过检测荧光珠在两种成像模式和多项式变换中的系数拟合进行校准，通过将所有被检测珠子的宽视场坐标变换到扫描空间，并与扫描图像中被检测珠子的宽视场坐标进行比较；
宽场和FCS间的转化发生在事件发生后的几十毫秒的时间窗口内以及实时对事件进行记录；
事件触发的模式转换通过八个主要步骤进行工作：
1、初始化事件触发方法；2、记录快速成像图像；3、运行动态事件判别模块；4、若检测到坐标：继续；若未检测到坐标：从步骤2开始重复；5、将检测坐标转化为扫描空间；6准备扫描并计算扫描曲线；7、运行扫描；8、保存数据和日志文件；
最后可以选择在无限循环中重复步骤2-8，以获得许多事件的全自动获取；
在步骤8中保存的最终数据不仅包括FCS记录数据，还包括导致事件的快速成像帧堆栈，以及包含例如触发事件坐标、转化坐标、事件判别模块参数和过程中不同步骤期间的时间戳的日志文件。
本发明在步骤S3中，激光器输出第二束激光，作为FCS模块的激发光，通过滤波模块后，经过高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤光片筛选出荧光信号，通过针孔，由雪崩光电二极管28进行探测，获得焦点处的荧光强度信号，记录荧光时间轨迹
本发明在步骤S4中对事件有效性的确认需要基于FCS信号以及导致事件的N个宽场帧以及描述触发事件坐标，计时等的日志文件；
这些帧用于采集后分析，以确定触发事件实际上是真实的目标事件还是由其他因素引起的；
为了对事件进行分类，可以研究事件前的N个宽视场帧，通过使用日志文件中保存的触发坐标可以提取触发坐标周围的信号轨迹，通常真实事件会在最后一帧表现出显著的增加，而由于帧中某些东西快速移动到检测像素而导致的假事件将显示出相对平坦的响应。
对事件进行检测需要检测宽视场图像中的信号强度峰值，对峰值的检验的实现可以分为两个部分：使用当前帧、前一帧和感兴趣区域的掩码的预处理；以及峰值检测算法；
在启动该方法并运行模块之前，生成一个二进制掩码，表示视场中要考虑的区域，通常是单元格，其是通过对几个连续帧比如10帧的平均图像强度进行强度阈值化和高斯平滑来创建的；
该掩模会被输入到检测通道，限制任何不相关的背景噪声，其中包括从帧到帧的大比例变化，避免影响结果；
在事件判别模块中，初始预处理将宽场图像转换为与前一图像相比的像素百分比强度变化图，它首先从当前帧中减去前一帧，并与前一帧相除，生成像素级强度百分比变化的比例图像；
然后将该图像乘以预先计算的掩模，只得到感兴趣区域内的变化并丢弃
背景
对图像进行高斯平滑处理以降低基于噪声的荧光强度变化波动的影响。随后的峰值检测中将预处理图像作为输入，并将其与自身的最大过滤版本进行比较,然后再两个图像相等的地方找到局部最大值；
将峰值放入布尔掩码中，然后将该掩码与预处理图像的两个阈值版本相乘：一个具有高阈值，一个具有低阈值；
提取布尔峰掩模中剩余峰的坐标，去除视场边缘附近的峰，提取每个峰周围小区域的强度，然后使用输入参数限制通道中其余部分使用的峰值数量；
峰值位置和强度被储存并形成一个额外的信息参数，通道从峰值位置连接轨迹，对这些轨迹进行分析，以确定某个轨迹何时首次出现，以及峰值的强度如何随着时间的推移而发展；
当在10帧内其强度保持在某个阈值比例以上呈比例增加时，认为事件发生，最后一帧的跟踪坐标认为是事件坐标。
实施例
使用连续型近红外激发光激发NaYF4:Yb/Tm稀土纳米颗粒，在本实例中选择波长为980nm，在一定功率的980nm近红外激光激发下，在宽场模块下快速成像，获得宽场图像，宽场图像在预处理后被输入动态事件判别模块进行实时分析,当事件发生后，动态事件判别模块快速做出响应，获得FCS模式下事件的具体坐标，并迅速完成模式转换，在事件坐标处进行FCS采集，并保存有关事件的全面数据，包括导致检测到的事件的宽视场时间间隔、扫描的数据，以及总结事件检测和扫描的参数和计时的日志文件；
在此轮FCS采集结束后迅速返回初始位置，回到宽场成像模式继续进行事件信号的探测，再后续检测到新的事件信号后切换到FCS模式到该事件坐标附近进行下一轮FCS采集，以此循环，从而实现数据的自动采集。获得到足够的数据后可以人为地结束循环；
外部计算机通过时间自相关函数对采集到的数据进行分析，得到多条FCS曲线，分别代表不同区域的事件的信息，结合这些FCS曲线和FCS采集时保存的数据可以对事件的有效性进行分析，排除干扰大的假阳性事件。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、宽场模块中光源产生激发光照射在样品上收集信号，实现快速宽场成像；
S2、将得到的宽场图像通过针对事件类型专门设计的动态事件判别模块进行实时处理，该模块返回任何检测到的事件的一组坐标，如果检测到一个事件，则停止宽场成像，并在具有预先确定的采集参数的检测坐标周围开始FCS采集；
S3、FCS模块进行FCS数据采集；
S4、获得FCS数据时，就可以保存有关事件的全面数据，包括导致检测到的事件的宽视场时间间隔、扫描的数据，以及总结事件检测和扫描的参数和计时的日志文件，在采集后的分析中，保存的辅助数据用于确认事件的有效性，以及对每个事件的FCS分析进行辅助；
S5、然后显微镜返回到先前的设置，另一个连续的宽视场记录立即开始，该方法可以无限运行，并且由焦点锁定模块保持整个实验过程中样品的稳定，防止轴向漂移。
2.根据权利要求书1所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，步骤S1中宽场模块内激光器输出第一束激光，经高数值孔径物镜(41)聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过高数值孔径物镜(41)收集，通过滤波系统筛选出荧光信号，由CCD进行探测，获得宽场图像。
3.根据权利要求书2所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，在步骤S2中在显微镜控制软件实现的控制部件中进行实时事件分析、坐标变换和实时视觉反馈；
在宽场空间和扫描空间之间使用三阶多项式坐标变换来实现整个视场内的精确坐标变换；
该变换通过检测荧光珠在两种成像模式和多项式变换中的系数拟合进行校准，通过将所有被检测珠子的宽视场坐标变换到扫描空间，并与扫描图像中被检测珠子的宽视场坐标进行比较；
宽场和FCS间的转化发生在事件发生后的几十毫秒的时间窗口内以及实时对事件进行记录；
事件触发的模式转换通过八个主要步骤进行工作：
1、初始化事件触发方法；2、记录快速成像图像；3、运行动态事件判别模块；4、若检测到坐标：继续；若未检测到坐标：从步骤2开始重复；5、将检测坐标转化为扫描空间；6准备扫描并计算扫描曲线；7、运行扫描；8、保存数据和日志文件；
最后可以选择在无限循环中重复步骤2-8，以获得许多事件的全自动获取；
在步骤8中保存的最终数据不仅包括FCS记录数据，还包括导致事件的快速成像帧堆栈，以及包含例如触发事件坐标、转化坐标、事件判别模块参数和过程中不同步骤期间的时间戳的日志文件。
4.根据权利要求书3所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，在步骤S3中，激光器输出第二束激光，作为FCS模块的激发光，通过滤波模块后，经过高数值孔径的物镜聚焦到荧光材料，通过电子自发辐射跃迁发射荧光，荧光材料发射的信号，经过物镜收集，通过滤光片筛选出荧光信号，通过针孔，由雪崩光电二极管(28)进行探测，获得焦点处的荧光强度信号，记录荧光时间轨迹。
5.根据权利要求书4所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，其特征在于，在步骤S4中对事件有效性的确认需要基于FCS信号以及导致事件的N个宽场帧以及描述触发事件(坐标，计时等)的日志文件；
这些帧用于采集后分析，以确定触发事件实际上是真实的目标事件还是由其他因素引起的；
为了对事件进行分类，可以研究事件前的N个宽视场帧，通过使用日志文件中保存的触发坐标可以提取触发坐标周围的信号轨迹，通常真实事件会在最后一帧表现出显著的增加，而由于帧中某些东西快速移动到检测像素而导致的假事件将显示出相对平坦的响应。
6.根据权利要求书5所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱方法，对事件进行检测需要检测宽视场图像中的信号强度峰值，对峰值的检验的实现可以分为两个部分：使用当前帧、前一帧和感兴趣区域的掩码的预处理；以及峰值检测算法；
在启动该方法并运行模块之前，生成一个二进制掩码，表示视场中要考虑的区域，通常是单元格，其是通过对几个连续帧(比如10帧)的平均图像强度进行强度阈值化和高斯平滑来创建的；
该掩模会被输入到检测通道，限制任何不相关的背景噪声，其中包括从帧到帧的大比例变化，避免影响结果；
在事件判别模块中，初始预处理将宽场图像转换为与前一图像相比的像素百分比强度变化图，它首先从当前帧中减去前一帧，并与前一帧相除，生成像素级强度百分比变化的比例图像；
然后将该图像乘以预先计算的掩模，只得到感兴趣区域内的变化并丢弃背景
对图像进行高斯平滑处理以降低基于噪声的荧光强度变化波动的影响，随后的峰值检测中将预处理图像作为输入，并将其与自身的最大过滤版本进行比较，然后再两个图像相等的地方找到局部最大值；
将峰值放入布尔掩码中，然后将该掩码与预处理图像的两个阈值版本相乘：一个具有高阈值，一个具有低阈值；
提取布尔峰掩模中剩余峰的坐标，去除视场边缘附近的峰，提取每个峰周围小区域的强度，然后使用输入参数限制通道中其余部分使用的峰值数量；
峰值位置和强度被储存并形成一个额外的信息参数，通道从峰值位置连接轨迹，对这些轨迹进行分析，以确定某个轨迹何时首次出现，以及峰值的强度如何随着时间的推移而发展；
当在10帧内其强度保持在某个阈值比例以上呈比例增加时，认为事件发生，最后一帧的跟踪坐标认为是事件坐标。
7.根据权利要求书6所述的一种基于事件引导的高靶向性荧光相关光谱装置，其特征在于，包括宽场模块、FCS模块、焦点锁定模块和控制窗口；。
所述宽场模块的发射部分沿光线传播方向依次包括有宽场成像光光源(1)、高斯光扩束准直透镜组(2)、第一二向色镜(3)，所述宽场模块的探测部分沿光线传播方向依次包括第一二向色镜(3)、第一透镜(4)、第一可调反射镜(5)、第二透镜(6)、第一带宽滤波器(7)、第一陷波器(8)、宽场CCD相机(9)；
所述激发模块沿光线传播方向依次包括第一激发光光源(10)、声光可调谐波滤波器(11)，高斯光扩束准直透镜组(12)、第二可调反射镜(13)、第二二向色镜(14)、第三可调反射镜(15)；
扫描模块沿光线传播方向包括第三透镜(16)、Y轴方向扫描振镜(17)、球面反射镜(18)、X方向扫描振镜(19)、扫描透镜(20)、第三二向色镜(21)；
探测模块沿光线传播方向依次包括第四透镜(22)、针孔(23)、第五透镜(24)、第六透镜(25)、第二带宽滤波器(26)、第二陷波器(27)、雪崩光电二极管(28)；
所述焦点锁定模块沿光线传播方向依次包括第二激光光源(29)、第四可调反射镜(30)、扩束装置(31)、第五可调反射镜(32)、第七透镜(33)、第六可调反射镜(34)、第七可调反射镜(35)、第三陷波器(36)、焦点锁定CCD相机(37)；
所述样品检测模块沿光线传播方向依次包括第四二向色镜(38)、第八透镜(39)、第八可调反射镜(40)、高数值孔径物镜(41)、载物台和压电移动平台(42)。
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