CN117256563A

CN117256563A - 一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法

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Publication number: CN117256563A
Application number: CN202310418895.XA
Authority: CN
Inventors: 李宁; 刘顺龙; 丛琬芯; 巩遵双; 王彬
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2023-04-19
Filing date: 2023-04-19
Publication date: 2023-12-22

Abstract

本发明公开了一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，属于模型构建技术领域。本发明采用将动物肝脏的Eva1a基因特异敲除法建立非酒精性脂肪肝动物模型。本发明以Cre‑loxp技术作为示例建立非酒精性脂肪肝动物模型，构建得到的非酒精性脂肪肝动物模型，伴有脂肪肝、血脂异常等特征，与临床病理相似度高，且不区分雌性和雄性，都有显著脂肪肝表型。本发明所述非酒精性脂肪肝动物模型，无需高脂饲料喂养，成本低，效率高，可通过遗传的方式批量繁殖生产，鼠龄到10周即出现脂肪肝表型，能够有效缩短非酒精性脂肪肝动物模型的建立周期，极大节约NAFLD的医学研究的时间成本。

Description

一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法

技术领域

本发明属于模型构建技术领域，具体涉及一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法。

背景技术

非酒精性脂肪性肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种肝脏脂质稳态紊乱导致甘油三酯累积为特征的全球性疾病，影响世界约25％的人口，在大约10％的病例中，非酒精性脂肪性肝从相对良性的肝脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎，进而发展为肝硬化和肝细胞癌，随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD的发病率逐年上升，已成为全球慢性肝病和肝细胞癌的主要原因。因此，建立一种稳定可靠、方便快捷的可直接获取的遗传性非酒精性脂肪性肝动物模型，对研究NAFLD的发病机制及其治疗方法具有重要意义。

目前已知的构建非酒精性脂肪性肝动物模型的方法，不管是基因敲除如ApoE^-/-小鼠还是NR4A1^-/-小鼠，在基因敲除后依然需要高脂饮食进行诱导才能得到非酒精性脂肪肝动物模型，该模型构建周期长且不可遗传，无法反应非饮食因素造成的NAFLD的病理过程；另外采用不同动物构建的动物模型可靠性差，且不同动物出现的脂肪肝特征也不尽相同，参考价值有限。因此，亟需建立一种培育周期短、能够比较全面的体现NAFLD的病理特征、稳定遗传的可靠的模型，为研究NAFLD的发病机制及其治疗提供灵活便捷的工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，通过特异性敲除动物肝脏的Eva1a基因法建立非酒精性脂肪肝动物模型，操作简单，效果明显，且建模时间短，性状可遗传。

本发明提供了一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，包括以下步骤：特异性敲除动物肝脏的Eva1a基因，获得的Eva1a^-/-动物为所述非酒精性脂肪肝动物模型。

优选的，所述动物的种类包括哺乳动物。

本发明还提供了一种利用Cre-loxP方法构建非酒精性脂肪肝动物模型的方法，包括以下步骤：(1)以构建得到的Eva1a^flox/flox动物和携带Cre工具动物为亲本进行杂交，获得F₁代；所述工具动物中携带的Cre利用在肝脏特异性表达的启动子启动表达；

(2)筛选F₁代中基因型为Eva1a^flox+/-Cre⁺动物与所述Eva1a^flox/flox动物杂交，获得F₂代；

(3)筛选F₂代中基因型为Eva1a^flox+/+Cre⁺的动物，得所述非酒精性脂肪肝动物模型。

优选的，步骤(1)中在肝脏特异性表达的启动子包括Alb。

优选的，步骤(2)中所述筛选包括利用Cre基因的引物对进行PCR扩增，扩增出条带的基因型为Cre⁺。

优选的，步骤(3)中所述筛选包括通过gt3、gt5和Cre基因的引物对进行PCR法鉴定；

利用gt3的引物对进行PCR，出现单一条带；

利用gt5的引物对进行PCR，只有一条带鉴定为Eva1a^flox+/+纯合子；若出现两条带，为Eva1a^flox+/-杂合子；

利用Cre的引物对进行PCR，出现条带鉴定为Cre⁺。

优选的，针对gt3设计的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的gt3-F和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的gt3-R；

针对gt5设计的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的gt5-F和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的gt5-R；

针对Cre设计的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的Cre-F和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的Cre-R。

优选的，当所述动物为具长尾动物时，剪尾进行基因型测定；

当所述动物为具短尾动物时，采耳缘血测定基因型。

本发明还提供了一种非酒精性脂肪肝动物模型的繁殖方法，包括以下步骤：将利用上述方法构建得到的非酒精性脂肪肝动物模型与Eva1a^flox/flox动物杂交，筛选基因型为Eva1a^flox+/+Cre⁺的后代。

本发明还提供了利用上述构建方法得到的非酒精性脂肪肝动物模型或利用上述方法构建得到的非酒精性脂肪肝动物模型在筛选或研制治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，采用将动物肝脏的Eva1a基因特异敲除法建立。本发明以Cre-loxp技术作为示例建立非酒精性脂肪肝动物模型，选取了在肝脏实质细胞特异表达的Cre工具动物经过与loxp动物杂交繁殖后，随着Cre在肝脏中的表达，肝脏中的Eva1a基因被特异敲除，小鼠的进食、生存无明显改变，能够反映非饮食因素造成的NAFLD的病理过程。本发明构建得到的非酒精性脂肪肝动物模型，伴有脂肪肝、血脂异常等特征，与临床病理相似度高，且不区分雌性和雄性，都有显著脂肪肝表型。本发明所述非酒精性脂肪肝动物模型，无需高脂饲料喂养，成本低，效率高，可通过遗传的方式批量繁殖生产，鼠龄到10周即出现脂肪肝表型，能够有效缩短非酒精性脂肪肝动物模型的建立周期，极大节约NAFLD的医学研究的时间成本，为研究NAFLD的发病机制和治疗策略提供了一种良好的动物模型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为小鼠肝脏Eva1a基因敲除繁殖策略图；

图2为实施例1中F₁代小鼠尾Cre基因鉴定结果图；

图3为实施例1中F₂代小鼠尾gt3基因鉴定结果图；

图4为实施例1中F₂代小鼠尾gt5基因鉴定结果图

图5为实施例1中F₂代小鼠尾Cre基因鉴定结果图；

图6为实施例2中2组小鼠摄食量的结果图；

图7为实施例2中2组小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的结果图；

图8为实施例2中2组小鼠肝重/体重的结果图；

图9为实施例3中Eva1a^-/-小鼠各组织器官Eva1a基因琼脂糖凝胶电泳结果图；

图10为实施例3中Eva1a^-/-小鼠肝组织中Eva1a蛋白表达的westernblot结果图；

图11为实施例3中Eva1a^-/-小鼠肝组织中Eva1a蛋白表达的免疫组化结果图；

图12为实施例4中2组小鼠肝脏细胞油红O染色结果图(标尺为50微米)；

图13为实施例4中2组小鼠肝脏细胞H&E染色结果图(标尺为50微米)。

具体实施方式

本发明以动物肝脏中的Eva1a基因为靶标基因进行特异性基因敲除，且对特异性基因敲除的方法没有特殊限定，只要能够满足Eva1a基因只在肝脏缺失，且只在肝脏中不表达，Eva1a在其他脏器中仍正常存在即可。本发明所述动物的种类优选包括哺乳动物，更优选包括小鼠、大鼠、兔、犬、猪或猴等。

本发明以Cre-loxP方法为例进行特异性基因敲除构建非酒精性脂肪肝动物模型，包括以下步骤：(1)以构建得到的Eva1a^flox/flox动物和携带Cre工具动物为亲本进行杂交，获得F₁代；所述工具动物中携带的Cre利用在肝脏特异性表达的启动子启动表达；

本发明以构建得到的Eva1a^flox/flox动物和携带Cre工具动物为亲本进行杂交，获得F₁代；所述工具动物中携带的Cre利用在肝脏特异性表达的启动子启动表达。本发明对所述亲本的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行构建即可，如实施例中所利用的Eva1a^flox/flox小鼠已公开在Xin Lin等的文章(Liver-specific deletion of Eva1a/Tmem166 aggravates acute liver injury by impairing autophagy)中，并承诺自申请日起20年内向公众发放。本发明所述携带Cre工具动物中Cre由肝脏特异性表达的启动子启动表达，如实施例中选用的启动子Alb，即采用Alb-Cre工具鼠为亲本，Alb-Cre工具鼠可通过市售渠道获得，如购于上海南方模式生物科技发展有限公司。值得说明的是，本发明所述Eva1a^flox/flox小鼠以及Alb-Cre工具鼠均为SPF级C57BL/6遗传背景。

本发明优选将上述亲本进行适应性培养后，如小鼠培养到鼠龄达到6～8周，体重达到18～22g时即可进行杂交，F₁代小鼠中可产生两种基因型：Eva1a^flox+/-Cre⁺和Eva1a^flox ^+/-Cre^-。

得F₁代后，本发明筛选F₁代中基因型为Eva1a^flox+/-Cre⁺动物与所述Eva1a^flox/flox动物杂交，获得F₂代。

本发明优选通过PCR扩增的方法，筛选F₁代中存在Cre基因的个体作为下一代杂交的亲本。本发明优选利用Cre基因的引物对进行PCR扩增，扩增出条带的基因型为Cre⁺。本发明针对Cre设计的引物对优选包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的Cre-F(5'-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3')和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的Cre-R(5'-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3')。当所述动物为具长尾动物时，优选剪尾进行基因型测定，所述测定的PCR程序优选为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸7min。当所述动物为具短尾动物时，采耳缘血测定基因型，所述具短尾动物优选为大型动物如兔、猪等。

本发明从F₁代动物中选取Eva1a^flox+/-Cre⁺动物与Eva1a^flox/flox杂交产生F₂代，F₂代动物中有四种基因型：Eva1a^flox+/+Cre⁺、Eva1a^flox+/-Cre⁺、Eva1a^flox+/+Cre^-和Eva1a^flox+/-Cre^-。

得F₂代动物后，本发明筛选F₂代中基因型为Eva1a^flox+/+Cre⁺的动物，得所述非酒精性脂肪肝动物模型。本发明所述筛选优选包括通过gt3、gt5和Cre基因的引物对进行PCR法鉴定；利用gt3的引物对进行PCR，出现单一条带，一条带说明右侧flox位点存在，但不能说明是纯合子还是杂合子，不出现条带说明右侧flox位点丢失或者PCR反应失败；利用gt5的引物对进行PCR，只有一条带鉴定为Eva1a^flox+/+纯合子；若出现两条带，为Eva1a^flox+/-杂合子；利用Cre的引物对进行PCR，出现条带鉴定为Cre⁺。

本发明针对gt3设计的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的gt3-F(5'-TCTGAGGCGGAAAGAACCAG-3')和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的gt3-R(5'-CAGCCCAGGAAATAGGATGA-3')；针对gt5设计的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的gt5-F(5'-ATCTGTTAGGGACAAGGGTA-3')和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的gt5-R(5'-CAAAGGAGAATGGCAAATGG-3')。本发明所述PCR验证的方法和程序优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明所述F₂代动物中Eva1a^flox+/+Cre⁺基因型即为Eva1a基因的肝脏特异敲除动物，也就是本发明所述非酒精性脂肪肝动物模型。本发明对所述非酒精性脂肪肝动物模型进行正常饲养，鼠龄到10～15周，鉴定并检测脂肪肝指标。本发明所述脂肪肝的检测方法，优选包括：肝脏病理切片，油红O染色，测肝指数，检测小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST和ALT等指标，结果显示具备肝脏脂肪变性和血脂异常的特征，且所建立的非酒精性脂肪肝Eva1a^-/-模型不区分雌性和雄性。

本发明选择Eva1a^flox+/+Cre⁺与Eva1a^flox/flox杂交，后代产生两种基因型：Eva1a^flox ^+/+Cre⁺和Eva1a^flox+/+Cre^-，可利用上述相同的方法进行基因型鉴定，获得大量Eva1a^flox+/+Cre⁺基因型模型，鉴定Eva1a基因的肝脏特异敲除，检测脂肪肝指标。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

Eva1a肝脏特异性敲除小鼠的配种繁殖及鉴定策略

1)实验动物来源：SPF级C57BL/6遗传背景的Eva1a^flox/flox小鼠(Xin Lin等)；Alb-Cre工具鼠购于上海南方模式生物科技发展有限公司。

2)实验动物均饲养于温度22℃、湿度50％、光-暗周期为12h的SFP级动物房。将以上小鼠每笼6只进行普通饲料适应性饲喂，自由饮水。普通常规饲料购自江苏协同生物公司，产品符合GB14924.1《实验动物配合饲料通用质量标准》、GB14924.2《实验动物配合饲料卫生标准》、GB14924.3《实验动物配合饲料营养成分》和GB13078-2017《饲料卫生标准》要求。

3)如图1所示，鼠龄达到6～8周后选择Eva1a^flox+/+雌鼠与Alb-Cre雄鼠进行合笼配种。取F₁代基因型为Eva1a^flox+/-Cre⁺的小鼠与Eva1a^flox+/+小鼠继续杂交，选取F₂代基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺的小鼠为目标模型鼠，选取F₂代基因型为Eva1a^flox+/+Cre^-为对照组。且F₂代中的Eva1a ^flox+/+Cre⁺小鼠可与Eva1a^flox+/+继续杂交获得更多的基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺的小鼠。

4)小鼠出生后7天至14天时给小鼠耳朵编号，6周左右剪下鼠尾检测小鼠基因型。

5)于南京诺唯赞公司购买小鼠基因型快速鉴定试剂盒。将鼠尾浸泡在已经加入蛋白酶K的裂解液中，用55℃孵育20分钟后再95℃或者煮沸加热5分钟使得蛋白酶K失活。将裂解产物经涡旋充分混匀，再经12,000rpm离心5分钟后取上清，为提取的基因组DNA，取1μl直接进行PCR试验。

6)在Cre基因上设计引物Cre-R和Cre-R，鼠尾基因包含Cre时，该片段PCR的长度为481bp。

7)在Eva1a基因下游的包含loxp位点的一片段将其命名为gt3，设计上下游引物gt3-F和gt3-R，该片段PCR后的长度为502bp。

8)在Eva1a基因上游的一段包含loxp位点的片段将其命名为gt5，设计上下游引物gt5-F和gt3-R，当鼠尾基因不包含loxp位点时该片段PCR后的长度为332bp，当包含loxp位点时，该片段PCR后的长度为450bp。

9)PCR反应的体系(25μL)：2xTaq Plus MasterMix 12.5μL、基因组DNA 1μL、引物F(10μM)1μL、引物R(10μM)1μL，ddH₂O补足。

10)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸7min。

11)鉴定基因型。在1×TAE电泳液中，放入取上述PCR产物5μL，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳、拍照。

结果如图2～图5所示，在F₁代小鼠中检测Cre基因，Cre⁺小鼠的编号为2、3、4、5、6、9(图2)。在F₂代检测gt3，112号、113号、114号和115号小鼠都能检测到502bp的条带(图3)。在F₂代检测gt5，111号和115号小鼠能够扩增出450bp和332bp的两条带，为Eva1a ^flox+/-杂合子；112号、113号和114号小鼠只能扩增出450bp一条带，为Eva1a ^flox+/+纯合子(图4)。在F₂代检测Cre，112号、113号和114号小鼠中只有113号能扩增出Cre基因片段(图5)。

综合以上结果，113号小鼠的基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺，是目标模型鼠，112号、114号小鼠的基因型为Eva1a ^flox+/+Cre^-，同窝出生的该基因型小鼠作为对照鼠。

实施例2

正常小鼠和Eva1a肝脏基因敲除鼠摄食、肝指数、血清学指标测定

1)摄食量测定：Eva1a ^flox+/+Cre⁺基因型小鼠(目标模型鼠)和同窝的Eva1a^flox+/+Cre^-基因型小鼠(对照鼠)每笼4只进行同样的适应性饲养至鼠龄10～15周，每隔两天详细地记录各组小鼠的摄食量：用电子天平将饲料称重，等量投喂给正常小鼠和基因型为Eva1a^flox+/+Cre⁺的实验小鼠，每隔两天将剩余的饲料进行称重，前后重量之差为各组小鼠的这三天的摄食量。

2)血清学指标检测；将同期饲养的两组小鼠(10～15周鼠龄)，前一晚禁食，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，眼眶取血，全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等血清学指标。具体实施步骤如下：

①麻醉：用10％水合氯醛腹腔注射，麻醉两组小鼠。

②将小鼠抓起，置于采血台上，左手拇指和食指抓住小鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，静脉回流将被阻碍，以至于眼球充分外突，此时便可以判断眼眶后静脉丛充血。

③使用右手拿住采血管，使采血管尖端与小鼠面部成45°的夹角，沿内毗插入内眼入眼球后方，向眼底方向刺入，当感到有阻力时即旋转轻采血管以切开静脉丛，血液即流入采血管。

④缓慢改变采血管的角度使采血管的方向变为水平或向下倾斜一点，辅助者在采血管末端下方使用0.5ml EP管收集血液，并将耳标号标记在0.5ml EP管上。采血结束后，将采血管拔出，将左手放松，止血时，采用无菌纱布块轻轻压迫眼眶方法来进行止血。

⑤分离血清：收集血液的EP管于室温下静置1～2h使血液自然凝固。4℃，4000rpm/min，离心30min。用微量移液器吸取血清置于无菌EP管中保存于-80℃冰箱。

⑥集齐样本后一起上机检测TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST和ALT等指标。

3)肝指数测定：计算肝重/体重

①将同期饲养的两组小鼠分别称量各只的体重，完成眼眶取血后采用脱颈法处死小鼠。将小鼠进行仰卧固定，之后用蒸馏水湿润小鼠的胸部和腹部皮毛。

②用镊子钳夹小鼠的腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤一直至剑突下，再向尾端剪开皮肤，将皮下筋膜，肌肉等逐层暴露，打开腹腔，将各脏器充分暴露。

③找到并取出小鼠的肝脏，置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，称重，计算每只的肝脏重量和体重的比值。

结果如图6～图8所示：两组小鼠的摄食量无显著差异(图6)；与正常鼠相比，目标模型鼠的ALT、AST、TG均有显著上升(P<0.05)，TC、HDL-C和LDL-C无显著差异，说明目标模型鼠在10～15周鼠龄时，血液中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯已经明显上升，出现了高血脂症和肝功能下降(图7)；并且两组小鼠的肝指数无显著差异(图8)。

实施例3

Eva1a基因肝脏特异敲除效果鉴定

1)敲除器官特异性检测：取目标模型鼠(基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺)的肝、脾、心、肺、脑组织，用南京诺唯赞公司购买的基因组DNA提取试剂盒，提取各组织的DNA，采用Eva1a和内参基因ACTB的引物进行PCR，按照实施例1的PCR反应体系和程序进行扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶浓度为1.5％。PCR用到的引物序列：

Eva1a-F(SEQ ID No.7):CCTTGGCCGCCTTGGTGATGAG

Eva1a-R(SEQ ID No.8):TACCATCCTCGCTGTCGCTGCT

ACTB-F(SEQ ID No.9):CCCGGGCTGTATTCCCCTCCAT

ACTB-R(SEQ ID No.10):CCTCTCTTGCTCTGGGCCTCGT

2)敲除基因的蛋白表达生化检测：取目标模型鼠(基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺)的肝组织提取蛋白质，对Eva1a蛋白进行westernblot检测。

①用手术剪剪下约黄豆粒大小的肝脏组织放入匀浆器，冰上研磨，每mg组织加入100μL裂解液(含1％体积PMSF)裂解30min，离心收集上清至1.5mL EP管。

②取出部分蛋白样品用BCA试剂盒进行浓度测定，其余蛋白样品分装，加入5×Loading Buffer煮沸10min变性后上样。

③配置1.5％浓度的SDS-PAGE胶，每孔上样40μg，80V恒压约20min，改换120V恒压，当溴酚蓝移动至胶板底部时停止电泳。

④PVDF膜预先经甲醇浸泡5min活化，在黑色夹板上依次放置凝胶及PVDF膜，两面分别用滤纸和海绵垫覆盖；将组装好的电转夹置入电转槽，恒流300mA2 h电转。

⑤用5％BSA室温封闭2h，Eva1a一抗和内参β-actin一抗4℃冰箱孵育过夜，回温，TBST洗三次，加入稀释好的对应二抗室温摇床孵育1h，重复洗膜步骤。

⑥配制ECL化学发光工作液，覆盖整张膜，转移至暗室显影。

3)敲除基因的蛋白表达免疫组化检测：取目标模型鼠(基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺)新鲜剥离的肝组织用4％多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋，制备组织蜡块，5μm厚切片，将切片进行常规脱蜡，水化，双氧水消除内源性过氧化物酶后枸橼酸钠抗原修复，山羊血清封闭后滴加Eva1a一抗或IgG对照抗体，4℃过夜，第2天取出洗净后滴加二抗，PBS充分冲洗后DAB显色，苏木精复染，干燥，封片，观察拍照。

结果如图9～图11所示，目标模型鼠中心、脾、脑、肺的内参基因ACTB和目标敲除基因Eva1a都能检测到，而肝脏中只能检测到内参基因ACTB，目标基因Eva1a检测不到，说明肝脏内的Eva1a基因被特异敲除了(图9)；与正常小鼠相比，目标模型鼠的肝脏蛋白中Eva1a蛋白的表达明显下降，说明目标模型鼠中Eva1a基因水平含量明显减少(图10)；与正常小鼠相比，目标模型鼠的肝脏蛋白中Eva1a蛋白的表达明显下降，IgG阴性对照说明实验方法没有干扰(图11)。表明目标模型鼠中Eva1a基因的表达急剧下降。

综上可知，基因型为Eva1a ^flox+/+Cre⁺的目标模型鼠其肝脏Eva1a被特异敲除，敲除效果非常好。

实施例4

肝脏组织病理染色相关实验

1)肝脏组织油红O染色：将对照鼠(Eva1a^+/+)和模型鼠(Eva1a^-/-)新鲜分离的肝脏用4％多聚甲醛固定后，使用OCT包埋，Leica CM1520冰冻切片机进行切片。切片后进行染色，具体操作如下：蒸馏水漂洗→60％异丙醇2分钟→冰水清洗→油红O染色工作液避光染色10分钟→60％异丙醇数秒(去除背景色)→冰水清洗→苏木素5分钟→冰水清洗。染色完成后，擦干水分，甘油明胶封片，观察拍照。

结果如图12所示，对照鼠肝脏结构清晰，无脂滴沉积，Eva1a^-/-模型小鼠肝脏细胞内油红着色非常明显，说明脂滴大量沉积。

2)肝脏组织苏木精一伊红(H.E.)染色：将两组小鼠新鲜剥离的肝组织用4％多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋，制备组织蜡块，5μm厚切片；60℃烤片2小时，之后二甲苯1小时，后二甲苯30分钟脱蜡；然后100％乙醇→95％乙醇→95％乙醇→80％乙醇→70％乙醇依次处理5分钟，蒸馏水10分钟；苏木素5-8分钟，自来水冲洗2分钟，1％盐酸乙醇2秒，自来水冲洗，反蓝10分钟，伊红2-3分钟，自来水冲洗2分钟，70％乙醇20秒，80％乙醇30秒，90％乙醇1分钟，95％乙醇1分钟，100％乙醇Ⅰ1分钟，100％乙醇Ⅱ1分钟，二甲苯Ⅰ3分钟，二甲苯Ⅱ3分钟。染色完成，中性树胶封片，凝固后观察拍照。

结果如图13所示，与对照鼠相比，Eva1a^-/-小鼠肝脏细胞内出现密集的空泡，为脂滴的结构，两组小鼠的肝脏组织结构清晰度无明显差异，说明没有明显的炎症浸润。

综上可知，肝脏特异敲除Eva1a小鼠构建成功，与对照鼠相比，肝脏Eva1a^-/-敲除鼠出现了明显的肝脏脂肪变性，血脂明显升高，但尚未出现肝脏重量增加和进食量的显著改变，肝组织结构形态尚好，没有炎症浸润，是典型的非酒精性脂肪肝单纯病变模型，由于检测鼠龄为10～15周，鼠龄尚浅，可能随着鼠龄增涨会加剧NAFLD的病情。本模型没有经过高脂饲料诱导，是可遗传的非饮食引起的非酒精性脂肪肝动物模型，可为NAFLD发病机制的研究和治疗药物的开发提供快捷便利的动物模型。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：特异性敲除动物肝脏的Eva1a基因，获得的Eva1a^-/-动物为所述非酒精性脂肪肝动物模型。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述动物的种类包括哺乳动物。

3.一种利用Cre-loxP方法构建非酒精性脂肪肝动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以构建得到的Eva1a^flox/flox动物和携带Cre工具动物为亲本进行杂交，获得F₁代；所述工具动物中携带的Cre利用在肝脏特异性表达的启动子启动表达；

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)中在肝脏特异性表达的启动子包括Alb。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述筛选包括利用Cre基因的引物对进行PCR扩增，扩增出条带的基因型为Cre⁺。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(3)中所述筛选包括通过gt3、gt5和Cre基因的引物对进行PCR法鉴定；

利用gt3的引物对进行PCR，出现单一条带；

利用Cre的引物对进行PCR，出现条带鉴定为Cre⁺。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，针对gt3设计的引物对包括核苷酸序列如SEQID No.1所示的gt3-F和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的gt3-R；

8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，当所述动物为具长尾动物时，剪尾进行基因型测定；

当所述动物为具短尾动物时，采耳缘血测定基因型。

9.一种非酒精性脂肪肝动物模型的繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：将利用权利要求3～8任一项所述方法构建得到的非酒精性脂肪肝动物模型与Eva1a^flox/flox动物杂交，筛选基因型为Eva1a^flox+/+Cre⁺的后代。

10.利用权利要求1或2所述构建方法得到的非酒精性脂肪肝动物模型或利用权利要求3～8任一项所述方法构建得到的非酒精性脂肪肝动物模型在筛选或研制治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。