CN117247872A - 一株产谷氏菌素的诺尔斯链霉菌nk27及其在植物病害防治中的应用 - Google Patents

一株产谷氏菌素的诺尔斯链霉菌nk27及其在植物病害防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产谷氏菌素的诺尔斯链霉菌NK27及其在植物病害防治中的应用，属于植物病害防治技术领域，所述诺尔斯链霉菌NK27的保藏编号为CGMCC No.28268；本发明还公开了一种广谱抗菌剂，所述广谱抗菌剂包含所述诺尔斯链霉菌NK27的菌株、发酵液或代谢产物。本发明经实验筛选制备出对灰霉病菌、烟草黑胫病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、杨树溃疡病菌、小麦纹枯病菌、辣椒疫病病菌和玉米大斑病菌均具有明显抑菌效果的微生物制品，有效防治多种植物病害，本发明为多种植物病害防治提供了安全可靠的新途径。

Description

一株产谷氏菌素的诺尔斯链霉菌NK27及其在植物病害防治中 的应用
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，特别是涉及一株产谷氏菌素的诺尔斯链霉菌NK27及其在植物病害防治中的应用。
背景技术
植物病害威胁农业生产，给农业经济造成了巨大的损失，如每年因灰霉病造成葡萄产后损失高达50.0％以上；每年因烟草黑胫病这种土传性卵菌病害造成的产值损失超过上亿元。而施用化学农药一直是人们防治植物病害的主要措施，具有杀菌谱广、见效快、成本低等优点。然而，长期大量施用化学农药导致农药残留及环境污染，危害人类健康并破坏生态平衡，病原菌抗药性不断增强，甚至出现用药量与病害发生程度相互递增的恶性循环。利用细菌、放线菌、真菌等有益微生物及其代谢产物对植物病害进行防治，因其对环境无污染、对人类和其他动物安全、产品无残留、对病原菌特异性强等优点得到世界各国的广泛重视并发挥越来越重要的作用。植物病害生物防治不仅满足了人们对绿色食品的需求，而目为农业的可持续发展提供了可靠保障。已成功应用于植物病害生物防治中，在有害生物综合治理中发挥了重要作用，具有广阔的发展前景。
目前，越来越多的生防菌种类在植物病害防治中得到广泛应用，国内外已对生防菌株展开了大量的研究，包括生防菌的筛选和鉴定、抑菌物质分析检测、防治效果以及产品开发应用等诸多方面。在生防菌中，链霉菌作为放线菌中的最大种群在代谢过程中能产生多种抗生素等次生代谢物，这些代谢物具有高效低毒的特点。因此，挖掘筛选出高效、具有潜在开发性的生防菌株，不仅为开发植物病害生物防治制剂的研制和应用提供优质菌种，也丰富了生防菌资源库。
发明内容
本发明的目的是提供一株产谷氏菌素的诺尔斯链霉菌NK27及其在植物病害防治中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该诺尔斯链霉菌NK27对多种植物病害菌有明显抑菌效果，有效防治多种植物病害，本发明为多种植物病害防治提供了安全可靠的新途径。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)NK27，其在2023年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28268，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明还提供一种广谱抗菌剂，所述广谱抗菌剂包含所述诺尔斯链霉菌NK27的菌株、发酵液或代谢产物。
进一步地，所述发酵液通过以下方式获得：
将所述诺尔斯链霉菌NK27接于发酵培养基中培养；所述发酵培养基的组成为：豆饼粉2-3g、(NH4)2SO40.4-0.5g、葡萄糖1-2g、玉米粉3-5g和CaCO30.3-0.5g，加水至1000mL。
进一步地，所述代谢产物包含谷氏菌素、茴香霉素、纳他霉素或制霉菌素。
本发明还提供一种所述诺尔斯链霉菌NK27在制备广谱抗菌剂中的应用。
进一步地，所述广谱抗菌剂包括灰霉病菌、烟草黑胫病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、杨树溃疡病菌、小麦纹枯病菌、辣椒疫病病菌和玉米大斑病菌抗菌剂。
本发明还提供一种防治植物病害的方法，包括在植物上喷施所述诺尔斯链霉菌NK27的步骤。
进一步地，所述植物病害包括灰霉病、烟草黑胫病、苹果腐烂病、苹果轮纹病、番茄菌核病、棉花枯萎病、烟草赤星病、杨树溃疡病、小麦纹枯病、辣椒疫病和玉米大斑病。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从土壤中分离获得一株诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)NK27，并经实验筛选制备出对灰霉病菌、烟草黑胫病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、杨树溃疡病菌、小麦纹枯病菌、辣椒疫病病菌和玉米大斑病菌均具有明显抑菌效果的微生物制品，有效防治多种植物病害。可见，本发明为多种植物病害防治提供了安全可靠的新途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为通过邻接法构建的基于NK27菌株和相关链霉菌的16S rDNA序列的系统发育树；
图2为NK27菌株的全基因组图谱；
图3-图6为诺尔斯链霉菌发酵液LC-MS/MS分析结果；图3：谷氏菌素标准品与诺尔斯链霉菌NK27发酵液的对比图；图4：茴香霉素标准品与诺尔斯链霉菌NK27发酵液的对比图；
图5：纳他霉素标准品与诺尔斯链霉菌NK27发酵液的对比图；图6：制霉菌素标准品与诺尔斯链霉菌NK27发酵液的对比图；
图7为诺尔斯链霉菌NK27不同浓度发酵液对灰霉病菌、烟草黑胫病菌的抑制测定效果；上图为灰霉病菌，下图为烟草黑胫病菌；
图8为诺尔斯链霉菌NK27对灰霉病菌菌丝生长影响；
图9为诺尔斯链霉菌NK27不同浓度发酵液对灰霉病菌菌孢子萌发的影响；
图10为诺尔斯链霉菌NK27不同浓度发酵液对葡萄叶片灰霉病防治效果；
图11为诺尔斯链霉菌NK27不同浓度发酵液对葡萄果实灰霉病防治效果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1诺尔斯链霉菌NK27的采集、分离和鉴定
(一)诺尔斯链霉菌NK27采集分离：
诺尔斯链霉菌NK27从土壤里分离，土样采自于小麦田病害发生区域中，取健康植株的根际土，土样采集方法：用取样小铲铲掉表层，取20-100mm深处的100g左右装入无菌牛皮纸袋中，编号并记录采集地、采集时间，带回实验室风干后用于菌株的分离。
采用传统的稀释分离法进行。用灭菌药匙取0.1g样，倒入已灭菌并装有0.9ml的LB液体培养基的1.5mL的离心管中，30℃、100rmp条件下培养30min，静置20min。用10倍梯度稀释法稀释成10-3梯度，吸取200μL该梯度的稀释液，涂布于加有萘啶酮酸的高氏I号固体培养基上，于30℃培养14d，根据链霉菌菌落特征选取链霉菌单菌落，高氏I号固体培养基划线培养，直至确认为纯种，用25％甘油于-80℃冰箱冻存。
(二)诺尔斯链霉菌NK27的鉴定：
采用16S rDNA对鉴定技术对菌株NK27进行种属鉴定。菌株DNA的提取使用链霉菌全基因组DNA提取试剂盒。16S rDNA通用引物(27F，1492R)由华大基因合成，引物序列见表1。PCR反应体系及条件如下。
表1引物序列
PCR反应体系：
2×Taq PCR Master mix 25μL，27F 2μL，1492R 2μL，模板DNA 1μL，ddH2O 20μL。
PCR反应条件：
95℃预变性5min；95℃变性30s，45℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min。
PCR扩增结束后，将PCR产物利用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测；将PCR得到的基因产物送至擎科生物技术有限公司测序，测序结果提交至NCBI中进行序列比对，选择与菌株同源性较高的菌株，应用MEGA7.0软件进行多序列比对并建立系统发育树(图1)。
委托奥维森科技有限公司对菌株NK27进行第二代+第三代(即Illumina Hiseq+PacBio)测序以及相关组装工作，使用SMRTportal软件对reads进行组装和比对，统计map到最长序列的测序深度分布情况。将得到的初步组装结果进行比对分析，筛分染色体与质粒序列，并将染色体序列组装成为一个线性基因组序列，即最终获0gap完成图序列，获得菌株NK27全基因组图谱(图2)。
通过PCR扩增获得了菌株NK27的16S rRNA基因片段，其序列长度为1465bp。将该序列提交至NCBI数据库进行BLAST分析比对，结果显示菌株NK27与Streptomyces noursei的相似性达到97％，因此，将菌株NK27鉴定为诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)。
基因组分析测序组装结果显示，全基因组总长度为9628020bp。GC含量72.24％，结合NR、KEGG、COG和GO数据库对全基因组进行基因功能注释，结果显示全基因组共预测到8,456个开放阅读框，占整个基因组长度的84.87％，对编码基因、重复序列、非编码RNA进行预测，获取测序基因组的组成情况，基因组共编码69个TRNA，总长度5239bp，7个5S sRNA总长度812bp，7个16S sRNA总长度10603bp，7个28S rRNA总长度21790bp。
将诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)NK27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.28268，保藏时间为2023年8月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2诺尔斯链霉菌NK27平板拮抗试验
(一)供试菌株：
供试病原真菌：灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果轮纹病菌(Physalosporapiricola)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternate)、杨树溃疡病菌(Botryosphaeriadothidea)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、辣椒疫病病菌(Phytophthora capsici)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)均由中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素组保存，保存于中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素实验室-80℃超低温冰箱。诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)NK27从土壤样品中分离、纯化获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号：CGMCCNo.28268。
(二)供试培养基及发酵液：
发酵培养基成分对链霉菌次级代谢产物的产量有着重要的影响，为筛选更适合菌株的发酵培养基，选择2种发酵培养基分别标注为A、B，所用培养基配方如下：
MS培养基配方：葡萄糖10g，麦芽提取物3g，酵母粉3g，胰蛋白胨5g，蔗糖340g，加蒸馏水至1000mL；发酵液培养基A配方：豆饼粉2g，(NH4)2SO40.4g，葡萄糖2g，玉米粉3g，CaCO30.3g，加蒸馏水至1000mL；发酵液培养基B配方：黄豆粉15g，可溶性淀粉20g，酵母粉5g，蛋白胨2g，氯化钠4g，碳酸钙4g，蒸馏水1000mL；均需121℃高温灭菌30min。采用牛津杯琼脂扩散法比对发酵液的抑菌活性。
发酵液的制备：菌株NK27划线种在MS培养基平板上，均放置28℃培养箱中培养7d，将培养好的菌株切成1.0cm2大小后接入种子培养基中，置于28℃，220rpm震荡培养24h，用紫外分光光度计测定其OD600，以1％的接种量接于发酵培养基A、发酵培养基B中，发酵培养基在28℃，220rpm条件下震荡培养72h，将发酵液用滤纸过滤后再在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，将无菌发酵液于4℃保存备用。
(三)诺尔斯链霉菌NK27发酵液抑菌活性测定
将培养好的病原真菌用打孔器打取直径为5mm的菌块，培养皿中倒入PDA培养基，在培养皿中心放置打取好的病原真菌菌块，距离中心30mm设置两点分别放置1个牛津杯，牛津杯中分别接菌株NK27发酵液A、发酵液B，发酵液的量为200μL，每种发酵液重复3次。上述各种处理后，在28℃恒温箱中黑暗培养5-7d，测量抑菌带的大小，由此确定对病原菌的抑菌活性。
表2诺尔斯链霉菌NK27发酵液抑菌活性测定
试验结果：根据表2所示，诺尔斯链霉菌NK27在发酵培养基A产生的次级代谢产物对病原真菌的抑菌活性均比培养基B好，更有利于代谢产物的产生。对灰霉病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、杨树溃疡病菌、烟草赤星病菌等抑制效果强，抑菌带直径分别为：20.0mm、18.7mm、15.3mm、18.0mm和15.0mm，可见诺尔斯链霉菌NK27对多种植物病原菌均有较好的抑制作用，抑菌谱较广。
实施例3诺尔斯链霉菌NK27次级代谢基因簇预测及活性成分检测
(一)供试菌株：
诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)NK27。
(二)诺尔斯链霉菌NK27次级代谢基因簇分析
委托奥维森科技有限公司对菌株NK27进行第二代+第三代(即Illumina Hiseq+PacBio)测序以及相关组装工作，使用SMRT portal软件对reads进行组装和比对，统计map到最长序列的测序深度分布情况。将得到的初步组装结果进行比对分析，筛分染色体与质粒序列，并将染色体序列组装成为一个线性基因组序列，即最终获0gap完成图序列，获得菌株基因组完成图。并利用AntiSMASH 7.0.0(https://antismash.secondarymetabolites.org)在线工具对菌株NK27中的次级代谢产物合成基因簇进行预测。
表3诺尔斯链霉菌NK27全基因组次级代谢生物合成基因簇预测
试验结果统计分析：测序组装结果显示，全基因组总长度为9628020bp。GC含量72.24％，结合NR、KEGG、COG和GO数据库对全基因组进行基因功能注释，结果显示全基因组共预测到8,456个开放阅读框，占整个基因组长度的84.87％，对编码基因、重复序列、非编码RNA进行预测，获取测序基因组的组成情况，基因组共编码69个TRNA，总长度5239bp，7个5S sRNA总长度812bp，7个16S sRNA总长度10603bp，7个28s rRNA总长度21790bp。利用Anti-SMASH，根据表3可知，分析得到全基因组共有40个次级代谢基因簇，基因簇种类包括：核苷类、聚酮类、非核糖体肽类、丁内酯类、乳酸菌肽类、细菌素类、嗜铁素类、四氢嘧啶类、萜烯类等，其中核苷类基因簇有2个，聚酮(PKS)和非核糖体肽(NRPS)基因簇有14个，丁内脂类有4个。
(三)诺尔斯链霉菌NK27抑菌活性物质检测
将发酵得到的诺尔斯链霉菌NK27发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液；准确称取谷氏菌素、制霉菌素、纳他霉素以及制霉菌素标准品2mg溶于2mL溶液中，充分混匀后即得到1000μg/mL标准溶液，稀释至1μg/mL即为标准品溶液。取1.5mL标准品溶液及无菌发酵液分别经0.22μm的无菌滤膜过滤后置于液相进样瓶中待检测；采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)定性检测发酵液中活性成分。LC-MS/MS分析条件如下：仪器型号：SCIEX Triple Quad 5500；分析色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18色谱柱(1.7μm,2.1×100mm)，检测中液相色谱条件：柱温35℃，进样量2μL，流速0.3mL/min，流动相A为甲醇，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：
谷氏菌素的梯度程序为：在0min时浓度为10％B，在4min内线性增加到90％，保持90％浓度2min，在0.01min后降低初始条件，平衡时间为1.4min，总运行时间为10min；纳他霉素、制霉菌素、茴香霉素梯度程序为：在0min时浓度为20％B，在1分钟内线性增加到60％B，在1分钟内线性增加到80％B，然后在0.01min内降低初始条件，平衡时间为2.4min，总运行时间为5min。自动进样器和柱箱温度分别设置为15℃和35℃。
质谱系统在正模式下使用电喷雾电离(ESI)，质谱条件：扫描方式多反应监测(MRM，表4)，离子源温度150℃，去溶剂雾化流量800L/h，雾化锥体流量150L/h，雾化器压力7.0bar，去溶剂温度350℃，毛细管喷涂电压3kV。
将标准品溶液和样品溶液在同一条件下进行检测，采用Analyst 1.6软件处理数据，通过分析比较标准品与样品色谱图出峰保留时间，具有相同保留时间则代表样品溶液中有此物质。
表4MRM参数
试验结果：LC-MS/MS定性检测分析由图3-图6表明，谷氏菌素、茴香霉素、纳他霉素、制霉菌素标准品出峰保留时间分别为7.36、3.74、3.55和3.92min，比对诺尔斯链霉菌NK27发酵液在相同检测条件下具有相同保留时间的峰。因此证实诺尔斯链霉菌NK27次级代谢产物中含有谷氏菌素、茴香霉素、纳他霉素、制霉菌素多种活性物质。
实施例4诺尔斯链霉菌NK27对灰霉病的生防效果评价
(一)将发酵得到的诺尔斯链霉菌NK27发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液；灰霉菌株B05.10来自中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素组。
(二)不同浓度发酵液对灰霉病菌、烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制效果测定
将无菌发酵液添加至100mL的PDA培养基中混合成不同浓度(体积比V发酵液/V水，1％、2％、4％、8％、10％)，打取直径5mm灰霉病菌、烟草黑胫病菌的菌块置于不同浓度的PDA培养基中央，以未添加发酵液的PDA作为对照，每个浓度3个重复，置于25℃培养箱中培养3d后采用十字交叉法测量并通过公式计算抑菌率。
抑制生长率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径]×100。结果如表5、表6和图7所示。
表5诺尔斯链霉菌NK27不同浓度发酵液对灰霉病菌的抑制测定
表6诺尔斯链霉菌NK27不同浓度发酵液对烟草黑胫病菌的抑制测定
结果表明：不同浓度的发酵液对灰霉病菌、烟草黑胫病菌生长影响差异显著，1％的发酵液对灰霉病菌的抑制率为23.2％，随着发酵液浓度从2％提高到4％，其对灰霉病菌的抑制率从54.2％上升至76.8％，8％的发酵液对灰霉病菌生长抑制可达96.3％。10％的发酵液完全抑制了灰霉病菌生长。1％、2％的发酵液浓度对烟草黑胫病菌的抑制率仅为6.3％、6.9％，随着浓度提高为4％、8％抑制率上升至22.5％、59.2％，浓度为10％的发酵液对烟草黑胫病菌的抑制率达100％。
(三)发酵液对灰霉病菌菌丝形态及孢子萌发的影响
将无菌发酵液添加至100mL的PDA中，制成含1％浓度(体积比V发酵液/V水)发酵液的PDA，冷却后在PDA培养基上平铺己灭菌玻璃纸，打取直径5mm灰霉病菌的菌块置于PDA培养基中央，以未加发酵液的PDA作为对照，置于25℃恒温培养箱中培养3d后，用光学显微镜观察对照组以及处理组菌丝生长情况；将无菌发酵液添加至100mL的PDA中，制成含不同浓度(体积比V发酵液/V水，0.25％、0.5％、1％)发酵液的PDA，冷却后在PDA培养基上平铺己灭菌玻璃纸，取200μL灰霉病菌孢子悬浮液(106孢子/mL)均匀涂布于玻璃纸上，以未添加发酵液的PDA作为对照，置于22℃恒温培养箱中培养12h后，用光学显微镜观察孢子萌发的情况。
孢子萌发抑制率(％)＝(对照组孢子萌发率-处理组孢子萌发率)/对照组孢子萌发率×100。
试验结果：根据图8、图9可知，对照组菌丝纤细直长，粗细均匀一致，线条流畅，分枝正常，而经发酵液处理组菌丝生长杂乱，分枝增多，分枝间距变短。对照组中培养12小时后孢子萌发率为99.1％，当使用发酵液浓度0.25％的PDA培养孢子时培养基上孢子的萌发率为94.1％，随着发酵液的浓度从0.25％提高到0.5％，孢子的萌发率从94.1％降为11.5％，而当发酵液浓度为1％时，孢子不萌发。
(四)发酵液对葡萄灰霉病离体叶片的防治效果测定
葡萄叶片处理：选取大小一致的葡萄叶片，用无菌水冲洗干净，放在铺有滤纸的培养皿中，将下层滤纸打湿并在叶柄处覆盖棉花保湿。
先喷施不同浓度(体积比V发酵液/V水，5％、10％、20％、40％)的发酵液，将葡萄叶片置于25℃培养箱中保湿培养24h后，用无菌注射器针头在葡萄离体叶片上制造伤口并在伤口上接直径为5mm灰霉病菌的菌块，以喷湿等量无菌水作为空白对照，每处理重复3次，置于25℃培养箱保湿培养5d左右，采用十字交叉法测量病斑直径，计算防治效果。
防治效果＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％。
表7诺尔斯链霉菌NK27对葡萄叶片灰霉病防治效果测定
试验结果：根据表7、图10所示，与对照组相比，随着发酵液浓度的提高，诺尔斯链霉菌NK27对葡萄叶片灰霉病有较好的防治效果，当发酵液浓度为20％，防治效果为72.5％，当发酵液浓度过高为40％时，可能会有轻微药害，因此最佳试用浓度为20％。
(五)发酵液对葡萄灰霉病离体果实的防治效果测定
葡萄果实处理：葡萄果实选择“藤稔葡萄”品种进行试验。挑选大小一致、外形良好且无任何伤口和病斑的葡萄果实，经2％次氯酸钠浸泡5min后，无菌水漂洗3次；
将不同浓度(体积比V发酵液/V水，5％、10％、20％、40％、80％)发酵液分别均匀涂抹于葡萄果实表面，以无菌水处理作为空白对照。待发酵液挥发干后，将葡萄果实置于25℃培养箱中保湿培养24h后，用无菌注射器针头在葡萄果实底部均匀扎三个伤口，伤口深度3mm左右，并在伤口处接入10μL灰霉病菌孢子悬浮液(106孢子/mL)。之后继续将其放入培养箱培养7d后查看葡萄发病情况，根据病情分级标准统计病情指数，计算防治效果。
病情指数＝Σ(各级发病果实数×对应级数)/最高发病级数×调查总数×100；
防治效果(％)＝对照组病情指数-处理组病情指数/对照组病情指数×100。
表8诺尔斯链霉菌NK27对葡萄果实灰霉病防治效果测定
试验结果(表8、图11)：接种7d后，通过观察对照组葡萄果实表面布满深褐色菌丝，果实松软能闻到明显的发酵气味，而经发酵液处理的果实病状减缓，且随着发酵液浓度的提高，对离体果实上灰霉病的防治效果逐渐增加，发酵液的浓度从5％提高到20％，防治效果从45.4％提高到70.5％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)NK27，其特征在于，其在2023年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28268，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种广谱抗菌剂，其特征在于，所述广谱抗菌剂包含权利要求1所述诺尔斯链霉菌NK27的菌株、发酵液或代谢产物。
3.根据权利要求2所述的广谱抗菌剂，其特征在于，所述发酵液通过以下方式获得：
将所述诺尔斯链霉菌NK27接于发酵培养基中培养；所述发酵培养基的组成为：豆饼粉2-3g、(NH4)2SO40.4-0.5g、葡萄糖1-2g、玉米粉3-5g和CaCO30.3-0.5g，加水至1000mL。
4.根据权利要求2所述的广谱抗菌剂，其特征在于，所述代谢产物包含谷氏菌素、茴香霉素、纳他霉素或制霉菌素。
5.一种如权利要求1所述诺尔斯链霉菌NK27在制备广谱抗菌剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述广谱抗菌剂包括灰霉病菌、烟草黑胫病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、杨树溃疡病菌、小麦纹枯病菌、辣椒疫病病菌和玉米大斑病菌抗菌剂。
7.一种防治植物病害的方法，其特征在于，包括在植物上喷施权利要求1所述诺尔斯链霉菌NK27的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物病害包括灰霉病、烟草黑胫病、苹果腐烂病、苹果轮纹病、番茄菌核病、棉花枯萎病、烟草赤星病、杨树溃疡病、小麦纹枯病、辣椒疫病和玉米大斑病。
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