CN117247837A - 一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片 - Google Patents

一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片 Download PDF

Info

Publication number
CN117247837A
CN117247837A CN202311233209.8A CN202311233209A CN117247837A CN 117247837 A CN117247837 A CN 117247837A CN 202311233209 A CN202311233209 A CN 202311233209A CN 117247837 A CN117247837 A CN 117247837A
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
parts
cell screening
chip
super
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311233209.8A
Other languages
English (en)
Inventor
冯文骞
赵元轶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN202311233209.8A priority Critical patent/CN117247837A/zh
Publication of CN117247837A publication Critical patent/CN117247837A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/01—Drops
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于高通量药物递送技术领域，具体涉及一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片。本发明的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片包括超疏水多孔聚合物薄膜，所述超疏水多孔聚合物薄膜表面通过改性设置有微图案化的亲水区域和超疏水、高疏油氟化边框，所述亲水区域中聚合有光触发药物递送系统。本发明还进一步提供了包含该药物释放芯片的高通量细胞筛选装置。本发明在高通量细胞筛选中实现了无干扰、可编程的药物释放过程，具有很好的应用前景。

Description

一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的 药物释放芯片
技术领域
本发明属于高通量药物递送技术领域，具体涉及一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片。
背景技术
活细胞的高通量筛选对于有效的药物发现、了解细胞过程、推进个性化药物、加速研究和确保药物安全至关重要，因为它能够同时评估多种因素对细胞的表型的影响，如药物或生物活性化合物。液滴阵列(DropArray)作为用于基于细胞分析的创新微型化平台，实现了在不同时间点向数千个液滴同时给药不同药物的能力。
目前，大多数活细胞的高通量筛选是使用96孔和384孔微孔板进行的。然而，在微孔之间没有时间延迟的情况下，将多种生物化学试剂并行添加到单个细胞培养库中，需要移液步骤，这通常需要复杂的机械操作。在基于细胞的高通量筛选中，滑动芯片(SlipChip)、液滴阵列(DropArray)、液滴微流体(Droplet Microfludics)等基于细胞分析的微型化平台中，将细胞库小型化为微小的微滴以提高产量时，这一问题变得更加明显。此外，在这种小的贮存器中频繁的给药操作会破坏细胞行为，例如当培养液滴受到机械干扰时，导致细胞去粘附而自由漂浮。此外，目前的高通量筛选技术虽然实现了同时向多个细胞库给药，但多局限于单一药物的单一浓度，并不能灵活按需控制给药的种类和浓度，也不能解决给药操作时细胞培养环境失稳的问题。
光触发药物递送系统可以远程控制药物从固体表面释放到周围液体中，从而允许以前无法获得的药物以自由形式添加。具体而言，通过利用适当波长的光，可以在功能分子中诱导不可逆或可逆的结构变化，如共价键断裂，异构化，可切换的静电吸引，和分子重排等。这些转化是促进结合或笼中药物释放的关键。光敏主客体超分子复合物在各种光响应系统中引起了人们的极大兴趣。在这些复合体中，光起到非接触刺激的作用，触发释放开关，而不会引起任何机械干扰或产生不期望的副产物。偶氮苯衍生物已被广泛用作客体，与大环主体形成包合物，如环糊精或葫芦[7]脲，从而产生二元光化学超分子组装体。偶氮苯衍生物表现出的顺反式光异构化，加上超分子非共价相互作用的动力学性质，为精确调节含环糊精药物的缔合和解离以实现药物的受控释放提供了一种通用机制。
然而，目前光触发药物递送系统尚未满足上述在高通量细胞筛选过程中可编程药物释放的要求。这些限制源于，现有技术中缺乏一种恰当的实验装置，实现利用光触发药物递送系统进行准确控制药物装载量、调节特定药物种类、防止装载和释放过程中的交叉污染以及同时管理大量单个单元。克服这些限制对于推进该领域并以高通量筛选的形式执行复杂的药物测试至关重要。
发明内容
基于上述现有技术的问题，本发明提供一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片。
一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，它包括超疏水多孔聚合物薄膜，所述超疏水多孔聚合物薄膜表面通过改性设置有微图案化的亲水区域和超疏水、高疏油氟化边框，所述亲水区域中聚合有光触发药物递送系统；
所述超疏水多孔聚合物薄膜是在甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃板上聚合聚合单体A和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物后得到的；所述聚合单体A选自含有2-溴异丁基和(甲基)丙烯酸酯基的化合物；
所述超疏水、高疏油边框区域是在超疏水多孔聚合物薄膜表面聚合聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯聚合物后得到的；
所述亲水区域中的光触发药物递送系统是在超疏水、高疏油边框内部进行偶氮苯衍生物聚合后，进一步和负载有药物的大环化合物组装得到的；所述偶氮苯衍生物选自含有偶氮苯基团和(甲基)丙烯酰胺基团的分子。
优选的，所述聚合单体A和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物是采用如下重量份的原料在光照作用下聚合后得到的：
聚合单体A 10～40份、
乙二醇二甲基丙烯酸酯40～10份、
1-癸醇10～40份、
环己醇40～10份、
光引发剂0.5～4份；
所述聚合单体A和乙二醇二甲基丙烯酸酯总用量为20～80份；所述1-癸醇和环己醇的总用量为80～20份；所述聚合单体A、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1-癸醇和环己醇总用量为100份；
其中，
所述聚合单体A选自甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯、丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯或甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)丙酯中的至少一种；
和/或，所述光引发剂选自2，2-二甲氧基-2-苯基丙酮或光引发剂819中的至少一种；
和/或，所述光照的条件为：254～405nm 30～80W光照40～80秒；
和/或，所述共聚物的厚度为6～200μm。
优选的，所述聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯是采用如下重量份的原料在光照作用下聚合后得到的：
原子转移自由基聚合反应光催化剂1～3份、
抗坏血酸1～4份、
2-(全氟辛基)甲基丙烯酸乙酯300～1000份；
所述原子转移自由基聚合反应光催化剂选自三(2-苯基吡啶)铱或二苯基二氢吩嗪中的至少一种；
和/或，所述光照的条件为：405～460nm30～80W光照40～80秒；
和/或，所述聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯的聚合在N-甲基吡咯烷酮和N,N-二甲基甲酰胺共溶剂中实现。
优选的，所述光触发药物递送系统由偶氮苯衍生物与负载有药物的大环化合物构成，所述大环化合物选自环糊精或葫芦[7]脲。
优选的，所述光触发药物递送系统按照如下方法聚合至所述亲水区域中：
步骤a，将偶氮苯衍生物聚合至所述亲水区域中，为稳定的反式偶氮苯状态；对于图案外接圆直径小于3mm的亲水区域，聚合所述偶氮苯衍生物后，进一步在亲水区域中聚合甲基丙烯酸-2-羟乙酯单体；
步骤b，将负载有药物的大环化合物滴入所述亲水区域，使所述偶氮苯衍生物与大环化合物组装。
优选的，步骤a中，所述偶氮苯衍生物的聚合采用如下重量份的原料实现：
偶氮苯衍生物40～200份、
抗坏血酸20～80份、
2,2'-联吡啶10～50份、
CuBr 5～20份。
或，采用如下重量份的原料在光照作用下实现：
ATRP反应光催化剂1～3份、
抗坏血酸1～4份、
偶氮苯衍生物200～1000份；
所述ATRP反应光催化剂选自三(2-苯基吡啶)铱或二苯基二氢吩嗪中的至少一种；
和/或，所述偶氮苯衍生物选自4-(甲基丙烯酰氨基)偶氮苯或4-(丙烯酰氨基)偶氮苯中的至少一种。
优选的，步骤a中，所述偶氮苯衍生物的聚合在N-甲基吡咯烷酮和N,N-二甲基甲酰胺共溶剂中实现。
本发明还提供上述高通量细胞筛选的药物释放芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，取甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃板，在其表面聚合聚合单体A和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物，得到超疏水多孔聚合物薄膜；
步骤2，在所述超疏水多孔聚合物薄膜表面按照设计的图案聚合聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯，得到微图案化的超疏水、高疏油边框；
步骤3，在所述超疏水、高疏油边框内部聚合偶氮苯衍生物聚合物，得到微图案化的亲水区域。
步骤4，在所述亲水区域中制备光触发药物递送系统。
本发明还提供一种高通量细胞筛选装置，包括从上至下依次设置的数字光处理投影设备、上述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片和细胞培养装置；
所述数字光处理投影设备用于对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的每一个亲水区域提供程序化的光照；
所述细胞培养装置上设置有至少一个区域细胞培养库，所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片和细胞培养装置通过对准装置对准后，每一个区域细胞培养库通过液滴与用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的至少一个亲水区域连通。
本发明还提供一种应用上述高通量细胞筛选装置进行细胞筛选实验的方法，其特征在于，包括如下步骤：在细胞培养过程中，采用数字光处理投影设备对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片进行曝光，对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的每一个亲水区域分别提供程序化的光照；通过曝光区域、曝光强度和曝光时间的控制，实现对每一个亲水区域药物释放量和释放流程的控制。
本发明提出一种通过数字光处理(DLP)技术实现在细胞高通量筛选中无扰动给药的技术。其原理如图1所示，具体的，提供了一种经微图案化亲疏水改性的聚合物薄膜制成的高通量筛选的芯片，在其亲水区域精准聚合浓度可调的偶氮苯客体分子以绑定相应浓度的不同种类的环糊精药物。基于计算机的设计系统与DLP紫外线投影仪的集成提供了对紫外线曝光区域、曝光强度和曝光时间的精确控制，实现了可根据实验设计要求进行每个细胞库中精确定制的具有可调节药物剂量和集成药物种类的复杂药物递送程序。DLP紫外线投影仪的宽投影范围允许在多孔聚合物芯片数千个单独的细胞培养液滴中并行添加药物，同时确保每个液滴都有自己独立的曝光程序。它能够在高通量筛选中实现对大量液滴的程序化、同时化和无扰动的药物添加，所有这些都由计算机程序控制。这种方法将促进对包括药物和细胞在内的广泛样本进行高效和精确的检测，从而提高筛选过程的可扩展性和可靠性。
采用本发明的技术方案，可以实现如下有益的技术效果：
1、可以灵活定制聚合物膜上任意形状和大小的亲疏水区域，为芯片的高通量筛选建立基础，解决了装载和释放过程中的交叉污染以及同时管理大量单个单元的问题。
2、利用制备过程中聚合反应的可反应性，可以灵活定制每一个亲水区域内偶氮苯客体分子的聚合度，从而绑定不同浓度的药物分子，解决了高通量筛选中准确控制药物装载量、调节特定药物种类的问题。
3、利用本发明技术的光诱导药物释放实现远程非接触式的药物添加，保证细胞培养环境的无扰动。
4、利用本发明技术实现了根据实验设计要求进行每个细胞库中精确定制的具有可调节药物剂量和集成药物种类的复杂药物递送程序。DLP投影仪的宽投影范围允许在多孔聚合物芯片数千个单独的细胞培养液滴中并行添加药物，同时确保每个液滴都有自己独立的曝光程序。
因此，本发明在活细胞的高通量筛选实验中具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为用于将多种药物光诱导、可编程和并行添加到阵列细胞培养液滴中的微图案化BrMA-Azo药物释放芯片示意图；
图2为每行亲水圆形区域中具有Azo-MA的梯度聚合度BrMA-Azo芯片的制备示意图及实物图，比例尺：2mm。
图3为光诱导药物释放的不同策略和实际结果，其中，a为通过检测在不同照射时间下收集的含水液滴的吸光度来量化光诱导的药物表面释放的示意图，搭载药物的亲水区域SEM照片，以及实际测得的液滴吸光度和对应的浓度-时间动力学曲线，b为每个亲水区域均匀聚合10分钟的样品照片、强度分析；通过荧光标记药物进行区域曝光前后，表面的荧光照片及荧光强度分析，c为每个亲水区域均匀聚合50分钟的样品照片、强度分析；通过荧光标记药物进行梯度曝光前后，表面的荧光照片及荧光强度分析，d为每列亲水区域进行0-45分钟梯度聚合的样品照片、强度分析；通过荧光标记药物进行均匀曝光前后，表面的荧光照片及荧光强度分析。
图4为在夹层的细胞培养液滴中可编程光诱导添加药物的示例，其中，a为在含有细胞的液滴中通过光诱导添加多种药物的过程的示意图。b为二元药物装载芯片的光学照片。比例尺：2mm。c为以不同程序的方式将两种药物光诱导释放到液滴中后，细胞的荧光显微镜图像。比例尺：50μm。d为十元可编程药物释放示意图。e为以十元形式显示每个位点的独立药物负载和液滴合并的光学照片。比例尺：1mm.f为条件化紫外光投影装置的光学照片。g为显示了使用紫外光投影装置进行十元的药物装载和可编程药物释放的光学照片和荧光照片。比例尺：1毫米。
具体实施方式
以下实施例中所用的试剂和原料，无具体说明的均为市售品。
实施例1实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片
本实施例提供一种用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其包括超疏水多孔聚合物(BrMA)薄膜，所述超疏水多孔聚合物薄膜表面通过改性设置有微图案化的亲水区域，所述亲水区域中聚合有光触发药物递送系统。
所述超疏水多孔聚合物薄膜是在甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃板上聚合聚甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物后得到的。具体制备方法如下：
在用甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃板(25×75×1mm，宽×长×厚，江苏世泰实验器材有限公司)的边缘放置两条15μm薄的聚酰亚胺膜。将含有甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯BrMA(30wt％)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，20wt％)、1-癸醇(10wt％)和环己醇(40wt％)，此外还添加2，2-二甲氧基-2-苯基丙酮(DMPAP)作为光引发剂(相对于甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的总重量为2wt％)的聚合混合物涂布于改性玻璃(75μL)。然后将氟化载玻片置于顶部并暴露于365nm、45W UV光55秒。用手术刀小心地打开氟化载玻片，用乙醇彻底清洗板并用气枪干燥，得到BrMA聚合物薄膜。
所述超疏水、高疏油氟化边框区域是采用聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯对超疏水多孔聚合物薄膜表面进行改性后得到的。具体制备方法如下：
将三(2-苯基吡啶)铱(光敏催化剂，Ir(ppy)3，1mg溶于200μL N-甲基吡咯烷酮(NMP))、抗坏血酸(Asc，1.2mg溶于40μL NMP)和2-(全氟辛基)甲基丙烯酸乙酯(PFOEMA，500mg溶于1mL DMF)溶解并混合均匀，取100μL混合溶液快速滴到配备有光源(405nm，72W)的DLP系统的屏幕上。随后，将BrMA聚合物薄膜倒置在屏幕上。在黑暗的实验室条件下排出气泡后，BrMA聚合物薄膜暴露于预先设计的框架图案70秒，曝光区域被氟化。改性后，将边界氟化的BrMA聚合物薄膜(此氟化边框可以根据计算机设计任意形状)小心地从屏幕上分离并浸入新鲜DMF中，然后晃动以除去任何未反应的组分。
所述亲水区域内的光触发药物递送系统由偶氮苯衍生物与负载有药物的大环化合物构成，所述大环化合物选自环糊精或葫芦[7]脲。本实施例以负载有药物的环糊精(CD)为例，具体制备所述光触发药物递送系统的方法如下：
单体混合物由Ir(ppy)3(1mg溶于200μL NMP)、Asc(1.2mg溶于40μL NMP)和4-(甲基丙烯酰氨基)偶氮苯(Azo-MA，200mg溶于1mL DMF)组成。在氩气气氛中，BrMA聚合物薄膜的未氟化区域，将适当体积的单体混合物滴入亲水区域，在460nm、35W蓝光照射下引发聚合。该聚合过程属于ATRP聚合，其特点之一是在一定时间内，聚合度与聚合时间成线性关系，由于Ir(ppy)3催化剂蓝光敏感性，通过调节每个亲水区域的照射时间来实现每个亲水区域的不同聚合度，得到BrMA-Azo膜。聚合一定时间后，分离BrMA-Azo膜，将其浸入新鲜DMF中，并振荡以除去未反应的组分。为了增强用于CD缔合的Azo-MA接枝位点的亲水性，在面积较小的微图案(外接圆直径小于3mm)的BrMA膜上进行Azo-MA聚合之后，为了改进其亲水性，将三(2-苯基吡啶)铱(光敏催化剂，Ir(ppy)3，1mg溶于200μL N-甲基吡咯烷酮(NMP))、抗坏血酸(Asc，1.2mg溶于40μL NMP)和甲基丙烯酸-2羟乙酯(HEMA，500mg溶于1mL DMF)溶解并混合均匀，取适量该混合溶液滴入Azo-MA接枝区域，在氩气气氛中聚合30分钟。图案外接圆直径大于3mm的图案无需此步骤。聚合后的每个亲水区域中的样品经历交替的紫外光(365nm、45W)和可见光(460nm、35W)照射四个循环，以转变为稳定的反式偶氮苯状态。图2展示了一种5×10的直径为3mm的圆形载药阵列BrMA-Azo芯片，每行载药量梯度变化。
用乙醇润湿BrMA-Azo膜，然后将溶剂交换到去离子水中。对于与Azo-MA分子聚合并进一步与HEMA分子聚合的膜，由于其优异的亲水性，直接用去离子水润湿。随后，将适当体积的含有CD的PBS水溶液(0.2mg mL-1)滴入亲水区域以启动组装过程。在4小时的组装期后，分离得到BrMA-AzoCD膜(即用于高通量细胞筛选的药物释放芯片)，并用去离子水清洗48小时以去除任何未缔合的CD分子。
实施例2实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片
本实施例提供的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片与实施例1基本相同，区别在于聚合Azo-MA的方法不同，具体的：
采用CuBr催化的单体混合物，其由溶解在10mL DMF中的Azo-MA(80mg)、Asc(43.7mg)、2,2'-联吡啶(bpy，16.4mg)和CuBr(8.4mg)组成。对于BrMA聚合物薄膜的未氟化区域，将适当体积的单体混合物滴入亲水区域以引发聚合。聚合一定时间后，分离BrMA-Azo膜，将其浸入新鲜DMF中，并振荡以除去未反应的组分。
实施例3高通量细胞筛选装置及高通量细胞筛选过程中无干扰和可编程的药物添加方法
如图1所示，本实施例的高通量细胞筛选装置包括从上至下依次设置的数字光处理投影设备(DLP紫外线投影仪)、用于高通量细胞筛选的药物释放芯片(BrMA-AzoCD膜)和细胞培养装置。所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片通过实施例1的方法制备。所述DLP紫外线投影仪用于对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的每一个亲水区域提供程序化的光照。所述细胞培养装置上设置有多个区域细胞培养库构成的整列，每一个区域细胞培养库通过液滴与用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的至少一个亲水区域连通。
利用上述高通量细胞筛选装置进行细胞筛选实验时，药物添加的方法为：
在细胞培养过程中，采用数字光处理投影设备对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片进行曝光，对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的每一个亲水区域分别提供程序化的光照；通过曝光区域、曝光强度和曝光时间的控制，实现对每一个亲水区域药物释放量和释放流程的控制。
下面提供利用上述装置和方法进行药物添加的示例。
在BrMA-AzoCD膜用水性溶液润湿，并暴露于穿过BrMA-Azo/>CD膜的玻璃基板的特定UV光即可在短时间内完成从芯片向液滴的药物释放。对于LED光源(365nm，45W，1.2mWcm-2)，2分钟的曝光足以完全释放CD药物分子。对于Alvéole Primo系统光源(375nm UV，90mJ cm-2，1.28mW cm-2)，70s曝光即可完全释放CD药物分子。对于MiiCraft H50 DLP 3D打印机(385nm UV，30W，0.8mW cm-2)，3分钟的曝光即可完全释放CD药物分子。图3a展示了光诱导的载药区域药物由固体表面释放至液滴的示意图及动力学性质。可以看到，在一定时间内，药物的释放量与光照的时间呈正相关。
由于Azo-MA分子的聚合度决定CD药物分子的搭载量，本实施例提供了两种控制药物释放浓度的策略。
对于均匀搭载药物的芯片，通过操纵曝光条件实现每个载药区域的释放浓度，测试了区域曝光(只曝光芯片的特定位点)和梯度曝光(沿着芯片每一列的顺序逐渐增加曝光剂量)的方式。以α-CD-RhoB(罗丹明B磺酰氯，一种罗丹明通道下发光的荧光染料)为药物模型，区域曝光后，芯片的荧光图像显示出剩余相关药物的独特“W”形(图3b)，该形状与曝光的程序一致，这证实了药物释放与暴露程序一致。梯度药物释放也通过荧光强度分析进行了验证，如图3c所示。对于非均匀搭载药物的芯片(以梯度为例，实际应用中可任意设计)，通过均匀的光照实现了每个载药区域的不同释放浓度，如图3d所示。
在本实施例中，针对细胞的悬浮和贴壁培养模式设计了不同的给药方式。使用到的药物分别为：α-CD-CHB(氯氨布希，一种抗癌药物，可以显著影响细胞活性)；α-CD-CFDA(5(6)-羧基荧光素二乙酸酯，一种标记细胞的药物，能产生绿色荧光)和α-CD-6-Hex(6-六氯荧光素，一种标记细胞的药物，能产生红色荧光)。
将上述药物用于对悬浮细胞以及贴壁细胞的培养。为了进一步提高药物释放芯片的可编程性，在设计药物释放芯片的图案形状时，可以设计亲水区域的边界将偶氮苯接枝的圆形区域划分为独立的扇区，每个扇区装载特定的药物。通过将与圆形区域直径大小相同的圆形液滴与药物释放芯片夹在中间，使圆形液滴同时渗透到所有载药区，形成与所有药物分子相连的区域细胞培养库。这种设置能够通过DLP光投影设备调节紫外线照射，从暴露的部分以单个液滴的形式靶向释放特定药物。图4展示了二元载药区域和十元载药区域的程序化药物释放。用于药物释放的芯片是通过将多种携带环糊精的药物分配到微图案化并具有超疏水(SH)边界的BrMA-Azo膜上的单独药物位点(即亲水区域)来制备的。当与含有细胞的液滴接触时，不同的载药区域(即亲水区域)同时被同一液滴润湿，从而允许多种药物被包括在同一细胞培养库中。在有条件的紫外线照射后，仅有被紫外线照射的载药区域会释放药物，多次曝光的组合使药物能够按程序释放到液滴中。
通过本实施例可以看到，本发明高通量细胞筛选装置及方法能够实现对单种药物控制释放浓度和释放时间的程序化释放过程，以及对多种药物的程序化释放过程。
通过上述实施例可以看到，本发明设计了一种用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，并利用该芯片构件了高通量细胞筛选装置和方法。利用本发明的装置和方法进行高通量细胞筛选实验，能够实现无干扰、可编程的药物释放过程。这大大优化了高通量细胞筛选实验的实验方法，优化了其结果的准确性，拓展了其适用的范围，具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于，它包括超疏水多孔聚合物薄膜，所述超疏水多孔聚合物薄膜表面通过改性设置有微图案化的亲水区域和超疏水、高疏油氟化边框，所述亲水区域中聚合有光触发药物递送系统；
所述超疏水多孔聚合物薄膜是在甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃板上聚合聚合单体A和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物后得到的；所述聚合单体A选自含有2-溴异丁基和(甲基)丙烯酸酯基的化合物；
所述超疏水、高疏油边框区域是在超疏水多孔聚合物薄膜表面聚合聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯聚合物后得到的；
所述亲水区域中的光触发药物递送系统是在超疏水、高疏油边框内部进行偶氮苯衍生物聚合后，进一步和负载有药物的大环化合物组装得到的；所述偶氮苯衍生物选自含有偶氮苯基团和(甲基)丙烯酰胺基团的分子。
2.按照权利要求1所述的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于：所述聚合单体A和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物是采用如下重量份的原料在光照作用下聚合后得到的：
聚合单体A 10～40份、
乙二醇二甲基丙烯酸酯40～10份、
1-癸醇10～40份、
环己醇40～10份、
光引发剂0.5～4份；
所述聚合单体A和乙二醇二甲基丙烯酸酯总用量为20～80份；所述1-癸醇和环己醇的总用量为80～20份；所述聚合单体A、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1-癸醇和环己醇总用量为100份；
其中，
所述聚合单体A选自甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯、丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)乙酯或甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基)丙酯中的至少一种；
和/或，所述光引发剂选自2，2-二甲氧基-2-苯基丙酮或光引发剂819中的至少一种；
和/或，所述光照的条件为：254～405nm 30～80W光照40～80秒；
和/或，所述共聚物的厚度为6～200μm。
3.按照权利要求1所述的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于：所述聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯是采用如下重量份的原料在光照作用下聚合后得到的：
原子转移自由基聚合反应光催化剂1～3份、
抗坏血酸1～4份、
2-(全氟辛基)甲基丙烯酸乙酯300～1000份；
所述原子转移自由基聚合反应光催化剂选自三(2-苯基吡啶)铱或二苯基二氢吩嗪中的至少一种；
和/或，所述光照的条件为：405～460nm30～80W光照40～80秒；
和/或，所述聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯的聚合在N-甲基吡咯烷酮和N,N-二甲基甲酰胺共溶剂中实现。
4.按照权利要求1所述的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于：所述光触发药物递送系统由偶氮苯衍生物与负载有药物的大环化合物构成，所述大环化合物选自环糊精或葫芦[7]脲。
5.按照权利要求4所述的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于：所述光触发药物递送系统按照如下方法聚合至所述亲水区域中：
步骤a，将偶氮苯衍生物聚合至所述亲水区域中，为稳定的反式偶氮苯状态；对于图案外接圆直径小于3mm的亲水区域，聚合所述偶氮苯衍生物后，进一步在亲水区域中聚合甲基丙烯酸-2-羟乙酯单体；
步骤b，将负载有药物的大环化合物滴入所述亲水区域，使所述偶氮苯衍生物与大环化合物组装。
6.按照权利要求5所述的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于：步骤a中，所述偶氮苯衍生物的聚合采用如下重量份的原料实现：
偶氮苯衍生物40～200份、
抗坏血酸20～80份、
2,2'-联吡啶10～50份、
CuBr 5～20份。
或，采用如下重量份的原料在光照作用下实现：
ATRP反应光催化剂1～3份、
抗坏血酸1～4份、
偶氮苯衍生物200～1000份；
所述ATRP反应光催化剂选自三(2-苯基吡啶)铱或二苯基二氢吩嗪中的至少一种；
和/或，所述偶氮苯衍生物选自4-(甲基丙烯酰氨基)偶氮苯或4-(丙烯酰氨基)偶氮苯中的至少一种。
7.按照权利要求6所述的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片，其特征在于：步骤a中，所述偶氮苯衍生物的聚合在N-甲基吡咯烷酮和N,N-二甲基甲酰胺共溶剂中实现。
8.权利要求1-7任一项所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，取甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃板，在其表面聚合聚合单体A和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物，得到超疏水多孔聚合物薄膜；
步骤2，在所述超疏水多孔聚合物薄膜表面按照设计的图案聚合聚2-全氟辛基乙基甲基丙烯酸酯，得到微图案化的超疏水、高疏油边框；
步骤3，在所述超疏水、高疏油边框内部聚合偶氮苯衍生物聚合物，得到微图案化的亲水区域。
步骤4，在所述亲水区域中制备光触发药物递送系统。
9.一种高通量细胞筛选装置，其特征在于：包括从上至下依次设置的数字光处理投影设备、用于高通量细胞筛选的药物释放芯片和细胞培养装置；
所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片如权利要求1-7任一项所述；
所述数字光处理投影设备用于对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的每一个亲水区域提供程序化的光照；
所述细胞培养装置上设置有至少一个区域细胞培养库，所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片和细胞培养装置通过对准装置对准后，每一个区域细胞培养库通过液滴与用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的至少一个亲水区域连通。
10.一种应用权利要求9所述高通量细胞筛选装置进行细胞筛选实验的方法，其特征在于，包括如下步骤：在细胞培养过程中，采用数字光处理投影设备对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片进行曝光，对所述用于高通量细胞筛选的药物释放芯片中的每一个亲水区域分别提供程序化的光照；通过曝光区域、曝光强度和曝光时间的控制，实现对每一个亲水区域药物释放量和释放流程的控制。
CN202311233209.8A 2023-09-22 2023-09-22 一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片 Pending CN117247837A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311233209.8A CN117247837A (zh) 2023-09-22 2023-09-22 一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311233209.8A CN117247837A (zh) 2023-09-22 2023-09-22 一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117247837A true CN117247837A (zh) 2023-12-19

Family

ID=89136365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311233209.8A Pending CN117247837A (zh) 2023-09-22 2023-09-22 一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117247837A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4755368B2 (ja) 高密度細胞アレイ用基板、製造法、及びその利用方法
US9956542B2 (en) Method for preparing molecularly imprinted polymers (MIP) through radical polymerisation
EP2684601B1 (en) Formation of droplet or hydrogel arrays using hydrophilic-hydrophobic patterned surfaces for high-throughput screening applications
CN1653189B (zh) 制备聚合物涂层的方法
US8664003B2 (en) Chip provided with film having hole pattern with the use of thermoresponsive polymer and method of producing the same
Song et al. One‐Step Generation of a Drug‐Releasing Hydrogel Microarray‐On‐A‐Chip for Large‐Scale Sequential Drug Combination Screening
US20200292944A1 (en) Method of making a patterned hydrogel and kit to make it
US20140335610A1 (en) Cell culture substrate, and method for manufacturing same
EP1600498B1 (en) Substrates for high-density cell arrays and preparation processes and uses thereof
Moon et al. Elimination of unreacted acrylate double bonds in the polymer networks of microparticles synthesized via flow lithography
JP2006322709A (ja) 物質固定化基板
EP3243862B1 (en) Surface modification method
US9487745B2 (en) Micro-patterned plate composed of an array of releasable elements surrounded with solid or gel walls
CN117247837A (zh) 一种实现无干扰和可编程药物添加的用于高通量细胞筛选的药物释放芯片
EP3235899B1 (en) Method of producing 3d cell structures in hanging droplets and hanging droplet device comprising 3d cell structures
KR20130098321A (ko) 소분자 어레이 및 이의 제조 및 사용 방법
Zhao et al. Compact Micropatterned Chip Empowers Undisturbed and Programmable Drug Addition in High‐Throughput Cell Screening
Simms et al. Using living radical polymerization to enable facile incorporation of materials in microfluidic cell culture devices
JPH06100725A (ja) 多孔質体の製造方法およびセンサーの製造方法
JP2006316010A (ja) 物質固定化剤、物質固定化方法および物質固定化基体
KR102145883B1 (ko) 단일 입자 분석을 위한 다공성 막
KR102198489B1 (ko) 단일 입자 분석을 위한 다공성 막
Starly et al. UV-Photolithography fabrication of poly-ethylene glycol hydrogels encapsulated with hepatocytes
JP2004277652A (ja) 低タンパク質吸着性成形物、その製造方法、及び細胞培養器
JPH11322997A (ja) 多孔質ビーズの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination