CN117241838A - 经修饰的多肽和其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。具体地，本文提供了：与野生型细胞周期蛋白F多肽相比具有增加的细胞质靶向性的经修饰的细胞周期蛋白F多肽；和功能性的截短的经修饰的细胞周期蛋白F多肽；以及编码所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。本文还提供了所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码核酸分子用于增强运动神经元存活、抑制运动神经元变性和治疗神经退行性病状，具体地与神经元TDP‑43蛋白病相关的神经退行性病状的用途。

Description

经修饰的多肽和其用途

技术领域

本公开总体上涉及经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。在一些方面，本公开涉及与野生型细胞周期蛋白F多肽相比具有增加的细胞质靶向性的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。本公开还涉及经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码核酸分子用于增强运动神经元存活、抑制运动神经元变性和治疗神经退行性病状的用途。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是最常见的运动神经元疾病(MND)，并且分别是指大脑和脊髓的上下运动神经元的选择性变性。ALS和额颞叶痴呆(FTD)属于一系列疾病，15％的ALS患者也表现出FTD症状，这是早发性痴呆的第二常见形式。ALS和FTD的病因尚不清楚，但大多数ALS患者和超过一半的FTD患者都有共同的组织病理学特征。ALS患者大脑和脊髓组织的尸检分析经常显示存在tau阴性、泛素阳性的聚集体，这些聚集体表现为圆形或骨架状内含物，最常见于受影响神经元和神经胶质的细胞质中。这些内含物上点缀着泛素、sqstm1、泛醌蛋白1和泛醌蛋白2——这些蛋白质都参与泛素介导的蛋白质转换，这表明蛋白酶体清除缺陷是ALS/FTD发病机制的促成因素。2006年，这些包涵体的主要组分被鉴定为43kDa的反式激活应答DNA结合蛋白(TDP-43)，这是一种在ALS/FTD病例中被发现从细胞核转移到细胞质的主要核蛋白。对来自患者脑裂解物的肌氨酰不溶性级分的表征揭示了TDP-43的生物化学特征的惊人变化。在患者裂解物中，TDP-43是多泛素化的、超磷酸化的，并在C末端被切割。TDP-43蛋白病现已在超过98％的ALS病例和超过50％的FTD病例中被发现，无论其家族性或散发性起源如何，这使得TDP-43阳性聚集体或包涵体成为该疾病的标志性特征。

与其不溶性、聚集性病理形式相反，可溶性TDP-43(sTDP-43)是正常细胞功能所必需的。在这方面，其参与mRNA代谢的若干种机制，如前mRNA剪接、mRNA稳定性、mRNA转运和miRNA加工，并且是神经元活力所必需的。在正常条件下，sTDP-43的亚细胞定位主要是核定位，但蛋白质N末端的核定位序列(NLS)和核输出序列的存在允许sTDP-43在细胞核和细胞质之间穿梭。已知sTDP-43还调节参与神经元和胚胎发育的mRNA，并在CNS发育到成年期间表达。因此，可以理解sTDP-43是一种必需的RNA结合蛋白，并且其执行细胞作用的能力的改变对神经元细胞是有毒的。

家族性ALS(fALS)突变占所有ALS病例的5-10％，而其余病例没有明确的病因(散发性ALS；sALS)。虽然家族性基因突变在ALS病例中占少数，但其为疾病的潜在机制提供了宝贵的见解。因此，已经在包含SOD1、VCP、TARDBP、FUS、OPTN、SQSTM1、UBQLN2、MATR3和TBK1在内的多个基因中鉴定了突变。有趣的是，编码TDP-43的TARDBP基因的突变仅在约4％的fALS患者和约1％的sALS病例中发现。

有强有力的证据表明，TDP-43在运动神经元内的亚细胞位置是神经变性表型的核心。例如，TDP-43的异常细胞质积聚(不溶性聚集体)是ALS(98％的病例)和FTD(＞50％)的病理标志。2015年，产生了一种转基因小鼠，该小鼠具有人TDP-43变体的诱导型过表达，该变体特异性地错误定位于细胞质(变体被称为dNLS-TDP-43)。当过表达时，dNLS-TDP-43小鼠产生快速的ALS样表型，导致运动麻痹和死亡。这种dNLS-TDP-43小鼠表示散发性ALS/FTD的实验模型，因为其特异性地导致让人想起散发性疾病的细胞质错误定位的TDP-43。

已在CCNF中鉴定了ALS/FTD相关突变，其发生频率与在TARDBP中发现的频率类似。CCNF细胞周期蛋白F，其是多蛋白Skp1-Cul1-F框(SCF^{细胞周期蛋白F})E3连接酶的配体结合组分。在这种SCF复合物中，细胞周期蛋白F(F框蛋白)负责募集和定位多泛素化的底物，随后进行蛋白酶体降解。迄今为止，细胞周期蛋白F活性与细胞周期进展和DNA损伤密切相关，因为它介导核糖核苷二磷酸还原酶亚基M2(RRM2)、核仁和纺锤体相关蛋白1(NuSAP)、110kDa的中心体卷曲螺旋蛋白(CP110)、细胞分裂控制蛋白6同源物(CDC6)、组蛋白RNA发夹结合蛋白(SLBP)核酸外切酶1(exo1)和fizzy相关蛋白(fizzy-related protein)同源物(Fzr1)的泛素化。细胞周期蛋白F也已知结合并改变myb相关蛋白B(B-myb)的有丝分裂转录程序。重要的是，所有这些研究都报告了细胞周期蛋白F的核定位，这与其作为细胞周期调节蛋白的功能一致。

在诸位发明人的先前工作中，发现：(1)TDP-43是SCF^{细胞周期蛋白F}复合物的相互作用伴侣和底物；(2)细胞周期蛋白F的缺乏导致运动神经元中TDP-43的积聚；(3)患有神经退行性病状的患者的子集的运动神经元中的细胞周期蛋白F水平或活性异常低，并且增加该患者的子集的运动神经元中的细胞周期蛋白F的水平可以降低蛋白质的异常积聚，由此提高运动神经元的存活；以及(4)通过向神经元补充另外的细胞周期蛋白F，可以提高神经元的存活，包含运动神经元，这些神经元具有正常水平的内源性细胞周期蛋白F(参见例如WO2018/081878和PCT/AU2020/051133)。

诸位发明人还在患有ALS/FTD的多代澳大利亚家族中鉴定了细胞周期蛋白F的位置621(S621G)处的丝氨酸-甘氨酸取代，其导致TDP-43和其它底物的过度活跃的泛素化(Lee等人,2017)。总之，这指示：(i)细胞周期蛋白F活性受到严格调节，以维持泛素化依赖性蛋白质降解途径的适当活性，并且导致细胞周期蛋白F水平低或活性过度的失调会损害这些途径，并引发神经退行性疾病，如ALS和FTD；和(ii)细胞周期蛋白F可以用作增强神经元存活(包含运动神经元存活)的治疗剂，而与神经元中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性无关，和/或其中神经元相对于对照不具有降低的内源性细胞周期蛋白F水平或活性，用于治疗神经退行性疾病，包含与TDP-43蛋白病适当相关的家族性和散发性神经退行性疾病。因此，需要针对治疗用途进行优化的细胞周期蛋白F多肽。

发明内容

本公开源于确定细胞周期蛋白F多肽可以靶向细胞的细胞质，并且可以有效地结合和清除细胞质TDP-43(TDP-43的致病形式)，同时使核形式的TDP-43基本上不受影响(这是正常细胞功能所需的)。因此，提供了靶向细胞质的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。还提供了功能性的截短的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。因此，本公开还提供了用于增强神经元存活、抑制神经元变性、抑制神经元中异常蛋白质积聚和/或治疗神经退行性病状(例如，ALS、FTD、AD等)的方法，这些疾病适合与神经元TDP-43蛋白病相关的病状，其包括使神经元与经修饰的细胞周期蛋白F多肽或多核苷酸接触。

因此，在一方面，本公开涉及一种核酸分子，其包括经修饰的细胞周期蛋白F多肽的编码序列，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括异源核输出信号(NES)。在一些实例中，所述NES包括选自以下的氨基酸序列：LPPLERLTL(SEQ ID NO:8)、LQLPPLERLTLD(SEQID NO:9)、LALKLAGLDL(SEQ ID NO:10)、PLQLPPLERLTL(SEQ ID NO:11)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:12)、LSSHFQELSI(SEQ ID NO13)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:14)、DHAEKVAEKLEALSV(SEQ ID NO:15)、QLVEELLKIICAFQL(SEQ ID NO:16)和TNLEALQKKLEELEL(SEQ ID NO:17)。在一个实施例中，所述NES位于所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的C末端或N末端。

在一些实施例中，所述核酸分子编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其还包括一种或两种内源性NLS中的核定位信号(NLS)失活修饰。在一些实例中，所述NLS失活修饰包括相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽，内源性NLS的全部或一部分的缺失。因此，在一些实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置20-28处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。在另外的实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置568-574处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。在特定实施例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或与其具有至少或约95％序列同一性的序列。在另外的实施例中，NLS失活修饰包括包含内源性NLS的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代(例如对K20、R21、R22、R24、R25、R26和R28中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F，例如用非碱性氨基酸；或对R568、R569、K571、R572、K574和R574中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F，例如用非碱性氨基酸)。

在另外的实施例中，所述核酸分子编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其进一步包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，PEST结构域的全部或一部分的缺失。因此，在一些实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述PEST结构域的在氨基酸位置582-766处的至少或约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或180个氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

在另一方面，提供了一种核酸分子，其编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，PEST结构域的全部或一部分的缺失。因此，在一些实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述PEST结构域的在氨基酸位置582-766处的至少或约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或180个氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。在特定实施例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列或与其具有至少或约95％序列同一性的序列。

在一些实施例中，由所述核酸分子编码的所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽进一步包括异源核输出信号(NES)，例如，包括选自以下的氨基酸序列的NES：LPPLERLTL(SEQ IDNO:8)、LQLPPLERLTLD(SEQ ID NO:9)、LALKLAGLDL(SEQ ID NO:10)、PLQLPPLERLTL(SEQ IDNO:11)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:12)、LSSHFQELSI(SEQ ID NO13)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:14)、DHAEKVAEKLEALSV(SEQ ID NO:15)、QLVEELLKIICAFQL(SEQ ID NO:16)和TNLEALQKKLEELEL(SEQ ID NO:17)。所述NES可以例如，位于所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的C末端或N末端。在另外的实施例中，所述核酸分子编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其还包括一种或两种内源性NLS中的核定位信号(NLS)失活修饰。在一些实例中，所述NLS失活修饰包括相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽，内源性NLS的全部或一部分的缺失。因此，在一些实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ IDNO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置20-28处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。在另外的实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置568-574处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。在另外的实施例中，NLS失活修饰包括包含内源性NLS的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代(例如对K20、R21、R22、R24、R25、R26和R28中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F，例如用非碱性氨基酸；或对R568、R569、K571、R572、K574和R574中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F，例如用非碱性氨基酸)。

在一个实施例中，由本公开的所述核酸分子编码的经修饰的细胞周期蛋白F多肽与TDF-43结合。在一些实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽保留SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽的TDF-43结合能力的至少或约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

在特定实施例中，由本公开的所述核酸分子编码的所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括在SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽的位置292-405处的细胞周期蛋白结构域的至少或约20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或110个氨基酸残基。在另外的实例中，所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽形成Skp1-Cul1-F框(SCF)E3泛素-蛋白质连接酶复合物(例如所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽保留SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽形成Skp1-Cul1-F框(SCF)E3泛素-蛋白质连接酶复合物的能力的至少或约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。在另外的实施例中，由本公开的所述核酸分子编码的所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括在SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽的位置29-76处的F框的至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个或45个氨基酸残基。

在其它实施例中，由本公开的所述核酸分子编码的所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽在神经元中表达或递送到神经元时，在神经元的细胞质中积聚、定位、定向和/或靶向神经元的细胞质。

在特定实施例中，所述核酸分子包括表达构建体，所述表达构建体包括可操作地连接到所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的所述编码序列的启动子。

在另一个方面，提供了由上文和本文所述的核酸分子编码的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。

还提供了递送媒剂，所述递送媒剂包括上文和本文所述的核酸分子或经修饰的细胞周期蛋白F多肽。在一个实施例中，所述递送媒剂是包括本公开的核酸分子的病毒载体(例如腺相关病毒载体(AAV)(例如rAAV2/1、rAAV2/8或rAAV2/9)、慢病毒载体、腺病毒载体或单纯疱疹病毒载体)。在一个实例中，所述病毒载体是嗜神经病毒载体。在另外的实施例中，所述递送媒剂是非病毒载体(例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒或基于脂质的系统，如水包油乳液、胶束、混合胶束或脂质体)，并且包括本公开的核酸分子或经修饰的细胞周期蛋白F多肽。

在另外的方面，提供了一种用于增强神经元的存活、抑制神经元的变性、抑制神经元中的异常蛋白质积聚、抑制神经元中的聚集或不溶性TDP-43积聚的方法，所述方法包括以下、由或基本上由以下组成：将所述神经元暴露于上文和本文所述的核酸分子、经修饰的细胞周期蛋白F多肽或递送媒剂。在一些实例中，所述神经元是运动神经元。

在另一个方面，提供了一种用于治疗患有神经退行性病状或处于罹患神经退行性病状的风险中的受试者的方法，所述方法包括以下、由或基本上由以下组成：向受试者施用上文和本文所述的核酸分子、经修饰的细胞周期蛋白F多肽或递送媒剂。在一个实施例中，所述神经退行性病状与神经元TDP-43蛋白病相关。在一些实例中，所述受试者患有家族性神经退行性病状(例如家族性ALS、家族性FTD或家族性AD)。在其它实例中，所述受试者患有散发性神经退行性病状(例如散发性ALS、散发性FTD或散发性AD)。

还提供了上文和本文所述的核酸分子、经修饰的细胞周期蛋白F多肽或递送媒剂在制备用于治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状的发展的药物中的用途。

在另一个方面，通过了一种试剂盒，所述试剂盒包括上文和本文所述的核酸分子、经修饰的细胞周期蛋白F多肽或递送媒剂在用于治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状的发展的方法。在一些实例中，所述试剂盒包括用于执行所述方法的说明材料。

附图说明

图1是为实验研究产生的细胞周期蛋白F多肽的示意表示，包含野生型细胞周期蛋白F、细胞周期蛋白F(CT)和细胞周期蛋白F(ΔPEST；本文也称为dPEST)。示出了核定位信号(NLS)、F框、细胞周期蛋白框(或结构域)、PEST结构域和核输出信号(NES)的位置，其编号相对于野生型细胞周期蛋白F的SEQ ID NO:2、细胞周期蛋白F(CT)的SEQ ID NO:4和细胞周期蛋白F(ΔPEST)的SEQ ID NO:6中所示的多肽的相应氨基酸序列。

图2呈现了野生型细胞周期蛋白F核苷酸和氨基酸序列，注释示出了NLS、F框、细胞周期蛋白结构域和PEST结构域。

图3呈现了细胞周期蛋白F(CT)核苷酸和氨基酸序列，注释示出了F框、细胞周期蛋白结构域、PEST结构域和NES。

图4呈现了细胞周期蛋白F(ΔPEST)核苷酸和氨基酸序列，注释示出了NLS、F框和细胞周期蛋白结构域。

图5是细胞周期蛋白多肽的产生和评估的示意和照片表示。A)野生型细胞周期蛋白F和经修饰的细胞质细胞周期蛋白F(CT细胞周期蛋白F，也称为细胞周期蛋白F(CT))的产生。B)mCherry细胞周期蛋白F(WT)在HEK293细胞中的表达。C)mCherry-CT-细胞周期蛋白F在HEK293细胞中的表达。

图6是在培养的HEK细胞中通过CT-细胞周期蛋白F进行的dNLS-TDP-43的清除的图形表示。用dNLS TDP-43和编码(CT)细胞周期蛋白F(CT-CCNF)的DNA构建体共转染细胞，或仅用dNLS TDP-43转染细胞。然后在转染后24小时评估尿素可溶性dNLS TDP-43。采用事后邓尼特(Dunnets)多重比较n＝3进行单向ANOVA统计检验。

图7是在转基因斑马鱼中通过CT-细胞周期蛋白F进行的dNLS-TDP-43的清除的图形表示，用全细胞TDP-43荧光强度表示。将编码人CT-细胞周期蛋白F的mRNA转染到在斑马鱼的脊髓运动神经元中过表达人dNLS-TDP-43-GFP的稳定转基因斑马鱼中。48小时后，在每个治疗组的至少3只动物中测量每个脊髓图像随机选择的3个运动神经元(每只动物3张图像)中GFP的荧光强度。CT-细胞周期蛋白F引起脊髓运动神经元中dNLS-TDP-43水平的显著降低。

图8是mCherry野生型细胞周期蛋白F、mCherry细胞质细胞周期蛋白F(CT-细胞周期蛋白)和mCherry细胞周期蛋白F(ΔPEST)在HEK293细胞中的细胞定位的照片表示。

图9是在培养的HEK细胞中通过细胞周期蛋白F(ΔPEST)进行的dNLS-TDP-43的清除的图形表示。用dNLS TDP-43和编码细胞周期蛋白F(ΔPEST)的DNA构建体共转染细胞或仅用dNLS TDP-43转染细胞。然后在转染后24小时评估尿素可溶性dNLS TDP-43。采用事后邓尼特多重比较n＝3进行单向ANOVA统计检验。

图10是在转基因斑马鱼中通过CT-细胞周期蛋白F和ΔPEST-细胞周期蛋白F进行的野生型TDP-43的清除的图形表示，用全细胞TDP-43荧光强度表示。将编码人CT-细胞周期蛋白F或人ΔPEST-细胞周期蛋白F的mRNA转染到在斑马鱼的脊髓运动神经元中过表达人野生型TDP-43-GFP的稳定转基因斑马鱼中。48小时后，在每个治疗组的至少3只动物中测量每个脊髓图像随机选择的3个运动神经元(每只动物3张图像)中GFP的荧光强度。CT-细胞周期蛋白F和ΔPEST-细胞周期蛋白F对脊髓运动神经元中野生型TDP-43水平均无任何影响。

图11是在转基因斑马鱼中通过LP/AA-细胞周期蛋白F进行的野生型TDP-43的清除的图形表示，用全细胞TDP-43荧光强度表示。将编码人野生型细胞周期蛋白F或人LP/AA细胞周期蛋白F的mRNA转染到在斑马鱼的脊髓运动神经元中过表达人野生型TDP-43-GFP的稳定转基因斑马鱼中。48小时后，在每个治疗组的至少3只动物中测量每个脊髓图像随机选择的3个运动神经元(每只动物3张图像)中GFP的荧光强度。WT细胞周期蛋白F引起脊髓运动神经元中WT-TDP-43水平的显著降低，然而不活跃的LP/AA变体(IA)对WT-TDP-43的清除没有影响。

图12是在转基因斑马鱼中通过细胞周期蛋白F变体进行的野生型TDP-43(A)和dNLS-TDP-43(B)的清除的图形表示，用全细胞TDP-43荧光强度表示。将编码ΔPEST-细胞周期蛋白F、CT-细胞周期蛋白F、人野生型细胞周期蛋白F(WT)或人LP/AA细胞周期蛋白F(IA)的mRNA转染到在斑马鱼的脊髓运动神经元中过表达人野生型TDP-43-GFP(A)或dNLS-TDP-43-GFP(B)的稳定转基因斑马鱼中。48小时后，在每个治疗组的至少3只动物中测量每个脊髓图像随机选择的3个运动神经元(每只动物3张图像)中GFP的荧光强度。结果证实了图7、10和11中所述的结果。

表A

序列简要说明

具体实施方式

1.定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本公开的所述实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但是描述了优选方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”是指所述冠词的语法对象的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象，除非上下文清楚地另外指明。

如本文所用，“和/或(and/or)”是指并且涵盖关联的所列项中的一个或多个所列项的任何和所有可能组合以及在以替代性方案(“或”)解释时组合的缺少。

进一步地，当提及如量、剂量、时间、温度、活性、水平、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、位置、长度等测量值时，如本文所使用的术语“约(about)”和“大约(approximate)”意指涵盖所指定量、剂量、时间、温度、活性、水平、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、位置、长度等的±15％,、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。

如本文所使用的，术语“活性(activity)”应理解为对转录产物或翻译产物产生生物效应的能力的测量，或对生物活性分子水平的测量。由此，在细胞周期蛋白F的上下文中，术语“活性”是指以下活性中的任一个或多个：(1)与其它亚基缔合以形成Skp1-Cul1-F框(SCF)E3泛素-蛋白质连接酶复合物(SCF^{细胞周期蛋白F})；(2)抑制B-Myb活性以促进细胞周期检查点控制；(3)与底物(例如，CDC6、RRM2、CP110和SLBP以及TDP-43)相互作用以促进底物的泛素化和降解；以及(4)如本文所公开的，直接与TDP-43结合。

如本文所使用的，术语“施用(administered)”是指通过某种方法或途径将本文所描述的药剂置于受试者体内，所述方法或途径导致化合物在期望的位点至少部分定位。本文所述的药剂可以通过任何适当的途径施用，所述适当的途径在所述受试者中产生有效的治疗，即，施用导致递送到受试者的期望位置，在所述期望位置递送所述组合物的至少一部分。示例性施用模式包含但不限于注射、输注、滴注或摄取。“注射”包含但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。

术语“同时施用(administration concurrently)”或“同时施用(administeringconcurrently)”或“共施用(co-administering)”等是指施用含有两种或更多种活性物质的单一组合物，或将每种活性物质作为单独的组合物施用和/或在足够短的时间内同时期或同时或顺序地通过单独的途径递送，使得有效结果等于当所有这些活性物质作为单一组合物施用时获得的结果。“同时”意指活性剂基本上在同一时间施用，并且期望在同一调配物中一起施用。“同时期”意指活性剂在时间上密切施用，例如，一种药剂在另一种药剂前后约一分钟至约一天内施用。任何同时期时间都是有用的。然而，通常情况下，当不同时期施用时，药剂将在约一分钟至约八小时内，并且适当地在小于约一至约四小时内施用。当同时期施用时，在受试者的相同部位适当施用。术语“相同部位”包含确切位置，但可以在约0.5至约15厘米范围内，优选地在约0.5至约5厘米范围内。如本文所使用的，术语“单独地”意指以一定间隔施用，例如以约一天至若干周或月的间隔施用。活性剂可以按任意顺序施用。如本文所使用的，术语“顺序地”意指按顺序施用，例如以分钟、小时、天或周的间隔施用。如果合适的话，活性剂可以在有规律的重复周期中施用。

术语“药剂”包含诱导期望药理和/或生理效应的化合物。所述术语还涵盖本文具体提及的这些化合物的药学上可接受的和药理学上活性的成分，包含但不限于盐、酯、酰胺、前药剂、活性代谢物、类似物等。当使用上述术语时，应理解的是，这包含活性剂本身以及药学上可接受的药理学上活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“药剂”不应狭义解释，而是延伸到小分子、蛋白质分子如肽、多肽和蛋白质以及包括它们的组合物、遗传分子如RNA、DNA和模拟物及其化学类似物以及细胞试剂。术语“试剂”包含能够产生和分泌本文所述多肽的细胞，以及包括编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“药剂”延伸为核酸构建体，包含载体如病毒或非病毒载体、表达载体和用于在一系列细胞中表达和分泌的质粒。示例性药剂包含经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸。

术语“顺式作用元件”、“顺式反应序列”或“顺式调控区”在本文中可互换地用于意指调节可操作地连接的启动子的转录活性和/或可操作地连接的核苷酸序列的表达的任何核苷酸序列。本领域技术人员将意识到，顺式序列可以能够以激活、沉默、增强、抑制或以其它方式改变任何核苷酸序列(包含编码序列和非编码序列)的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。

“编码序列”是指任何有助于基因的多肽产物的编码或基因的最终mRNA产物(例如剪接后的基因的mRNA产物)的核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不有助于基因的多肽产物的编码或基因的最终mRNA产物的任何核酸序列。

在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包含所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。因此，术语“包括”等的使用表明所列出的要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并可以存在或不存在。“由……组成(consisting of)”意指包含并且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列元件是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元件。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后所列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列元素指定的活动或行为的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元件是必需的或强制性的，但是其它元件是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否影响所列元件的活动或作用。

如本文所使用的，术语“病状”包含解剖和生理偏离正常，其构成活体动物或其部分之一的正常状态的损害，其中断或改变身体功能的表现。

术语“条件表达(conditional expression)”、“条件表达(conditionallyexpressed)”、“条件表达(conditionally expressing)”等是指通过存在或不存在刺激或其它信号(例如，化学、光、激素、应激或病原体)来激活或抑制所关注的基因的表达的能力。在具体实施例中，所关注的核酸序列的条件表达取决于诱导物的存在或抑制剂的不存在。

“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义，其通常可以细分如下：

表1：

氨基酸子分类

保守氨基酸取代还包含基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸，用谷氨酸替代天冬氨酸，用丝氨酸替代苏氨酸，或者用结构相关的氨基酸类似地替代氨基酸，将不会对所得变体多肽的性质产生主要影响。氨基酸改变是否产生功能性多肽可以通过测定其活性来容易地确定。保守性取代示出于表2中的标题示例性和优选取代下。落入本公开范围内的氨基酸取代通常是通过选择其在维持以下的效果上没有显著差异的取代来实现的：(a)取代区域中肽主链的结构；(b)靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。引入取代后，对变体的生物活性进行筛选。

表2：

示例性和优选氨基酸取代

如本文所使用的，结合与运动神经元或运动神经元替代细胞接触使用的术语“接触(contacting)”或“接触(contact)”包含将运动神经元或替代细胞置于包括所述化合物和/或药剂的适当培养基中。在运动神经元或替代细胞在体内的情况下，“接触(contacting)”或“接触(contact)”包含通过适当的施用途径将药物组合物中的化合物和/或药剂施用于受试者，以使所述化合物和/或药剂在体内与运动神经元或替代细胞接触。在具体实施例中，对所接触的运动神经元或替代细胞进行细胞存活率测定。细胞存活率的测量可以基于细胞与化合物或药剂接触一段时间后活细胞的数量。例如，活细胞的数量可以在约至少5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间后进行计数，并与未处理的对照中的活细胞数量相比较。

术语“构建体”是指包含来自不同来源的一个或多个分离的核酸序列的重组遗传分子。因此，构建体是嵌合分子，其中两种或更多种不同来源的核酸序列被组装成单个核酸分子，并且包含任何含有(1)核酸序列的构建体，包含在自然界中不一起发现的调节和编码序列(即，至少一个核苷酸序列相对于其至少一个其它核苷酸序列是异源的)；或(2)编码非天然邻接的功能性RNA分子或蛋白质的部分的序列；或(3)非天然邻接的启动子的部分。代表性构建体包含来源于任何来源能够进行基因组整合或自主复制的任何重组核酸分子，如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，包括核酸分子，其中一个或多个核酸分子已经可操作地连接。本公开的构建体通常将包含直接表达也包含在构建体中的所关注的核酸序列的必要元件，例如靶核酸序列或调节剂核酸序列。此类元件可以包含控制元件，如与所关注的核酸序列可操作地连接(以便直接转录)的启动子，并且通常还包含聚腺苷酸化序列。在本公开的某些实施例中，构建体可以包含在载体内。除了构建体的组分之外，载体可以包含例如一种或多种可选择标志物、一种或多种复制起源(如原核和真核起源)、至少一个多重克隆位点和/或促进构建体稳定整合到宿主细胞的基因组中的元件。两个或更多个构建体可以包含在单个核酸分子(如单个载体)内，或者可以包含在两个或更多个分离的核酸分子(如两个或更多个分离的载体)内。“表达构建体”通常包含至少一个与所关注的核苷酸序列可操作地连接的对照序列。以这种方式，例如，在用于在包含宿主细胞的生物体或其部分中表达的表达构建体中提供了与待表达的核苷酸序列可操作连接的启动子。对于本公开的方法的实践，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员众所周知的，参见例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版第1、2和3卷.J.F.Sambrook,D.W.Russell和N.Irwin,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)2000。

如本文所使用的，术语“对照神经元”意指来自一个或多个健康受试者或未患有神经退行性病状和/或未患有TDP-43蛋白病的受试者(例如，对照受试者)的神经元(例如，运动神经元)。

“与…相对应(corresponds to)”或“与…相对应(corresponding to)”意指与参考氨基酸序列显示出实质性序列相似性或同一性的氨基酸序列。通常，氨基酸序列将显示与参考氨基酸序列的至少一部分至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、97％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至至多100％的序列相似性或同一性。

术语“减少(decrease)”、“降低(reduce)”或“抑制(inhibit)”及其语法等效物在本文中通常全部用于意指统计学显著显着量的减少。然而，为了避免疑问，术语“减少(decrease)”、“降低(reduce)”或“抑制(inhibit)”及其语法等效物意指与参考水平相比减少了至少10％，例如，与参考水平相比减少了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的减少，其中所述减少小于100％。在一个实施例中，所述减少包含100％减少(例如与参考样品相比不存在的水平)或与参考水平相比介于10％至100％之间的任何减少。

如本文所使用的，术语“剂量单位”是指适于作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的药剂，所述预定量被计算为产生与所需的药物载剂相关联的所期望的治疗效果。

如本文所使用的，术语“有效量”意指有效促进运动神经元细胞的存活或抑制或减缓此类细胞的死亡的化合物和/或药剂的量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，有效量可能会随受试者的病史、年龄、病情、性别以及受试者体内医学病状的严重性和类型以及在神经退行性病状中抑制病理过程的其它药物的施用而变化。

如本文所使用的，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可以被转录和/或翻译以产生多肽，或者如果其可以被加工成可以被转录或翻译以生产多肽的形式，则称其为“编码”多肽。此类核酸序列可以包含编码序列或编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等包含由DNA分子的转录产生的RNA产物、由RNA分子的翻译产生的蛋白质、由DNA分子的转录形成RNA产物并随后翻译RNA产物产生的蛋白质、或由DNA分子的转录以提供RNA产物产生的蛋白质、对RNA产物进行处理以提供处理的RNA产物(例如，mRNA)以及随后对处理的RNA产物进行翻译。

如本文所使用的，短语“增强运动神经元存活率”是指与对照相比运动神经元细胞存活率的增加。在一些实施例中，运动神经元与本文所述的药剂的接触导致运动神经元存活率相对于未处理的对照至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多的增加。运动神经元存活率可以例如通过以下来评估：(i)增加运动神经元在培养中的存活时间；(ii)在培养或体内增加神经元相关分子的产生，例如，胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶和细胞周期蛋白F；(iii)降低培养或体内包含TDP-43在内的蛋白质的异常积聚；或(iv)减少体内运动神经元功能障碍的症状。可以通过本领域已知的任何方法测量此类效应。在一个非限制性实例中，运动神经元的增加的存活率可以通过由Arakawa等人(1990,《神经科学研究杂志(J.Neurosci.)》10:3507-3515)描述的方法进行测量；神经元相关分子的增加的产生可以通过生物测定、酶测定、抗体结合、Northern印迹测定等来测量，这取决于待测量的分子；蛋白质的降低的异常积聚可以通过检测聚集体和包涵体中聚集的蛋白质来测定，如例如由Shen等人(2011,《细胞生物化学与生物物理(Cell Biochem Biophys)》60:173-185)所描述，并且运动神经元功能障碍可以通过评估运动神经元病症的物理表现来测量。在一个实施例中，运动神经元存活率的增加可以通过测量细胞周期蛋白F水平的增加来评估。细胞存活率还可以通过摄取钙黄绿素AM(活性染料荧光素二乙酸酯的类似物)来测量。钙黄绿素被活细胞吸收，并在细胞内裂解为荧光盐，所述荧光盐由活细胞的完整膜保留。活神经元的显微镜计数与用荧光活力测定法获得的相对荧光值直接相关。因此，该方法提供了给定培养的总细胞群中细胞存活率的可靠和定量测量结果(Bozyczko-Coyne等人,《神经科学方法杂志(J.Neur.Meth.)》50:205-216,1993)。评估细胞存活率的其它方法描述于美国专利第5,972,639号；第6,077,684号和第6417,160号中，所述文献的内容通过引用并入本文。体内运动神经元存活可以通过受试者运动神经元、神经运动或神经肌肉功能的增加来评估。在一个非限制性实例中，受试者体内的运动神经元存活可以通过逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与受试者的运动神经元功能障碍或死亡相关的病状例如，ALS或FTD的进展、加重或严重程度来评估。

术语“内源性”是指在宿主生物体或其细胞内存在和/或自然表达的分子(例如，核酸、碳水化合物、脂质或多肽)，或在基因、核酸或蛋白质内自然存在的结构域或区域。例如，“内源性细胞周期蛋白F”是指在细胞(例如，运动神经元)中自然表达的细胞周期蛋白F多肽，并且“内源性核定位信号”是指天然存在于蛋白质如细胞周期蛋白F中的核定位信号。

如本文所使用的，术语“外源性”是指引入宿主细胞的分子(例如，核酸、碳水化合物、脂质或多肽)。在具体实施例中，外源性多肽是指由对其被引入的细胞是外来的多核苷酸表达的多肽，或与其被引入细胞中的序列同源但在宿主细胞核酸内通常未发现多核苷酸的位置的多核苷酸。

关于基因序列的术语“表达”是指基因的转录以产生RNA转录物(例如，mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)，并且在适当的情况下，将产生的mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，从上下文中可以清楚地看出，编码序列的表达是由编码序列的转录和翻译产生的。相反，非编码序列的表达是由非编码序列的转录产生的。

如本文所使用的，术语“基因”是指能够被用来产生mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等并且在一些实施例中产生多肽的核酸分子。基因可能能够或者可能不能够被用来产生功能性蛋白质。基因可以包含编码区和非编码区两者(例如，内含子、调节元件，包含启动子、增强子、终止序列以及5'和3'非翻译区)。在某些实施例中，术语“基因”在其范围内包含编码涉及表达的调控的特定多肽、内含子和相邻的5'和3'非编码核苷酸序列的开放阅读框。在这方面，基因可以进一步包括与给定基因天然相关的控制序列，如启动子、增强子、终止和/或聚腺苷酸化信号，或异源控制序列。基因序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。可以将基因引入到适当的载体中用于染色体外维持或用于引入到宿主中。

出于本公开的目的，术语“异源”是指在宿主生物体或其细胞内不自然存在和/或自然表达的分子(例如，核酸或多肽)，或在基因、核酸或蛋白质内不天然存在的结构域或区域。例如，“异源NES”是指存在于经修饰的多肽(例如，经修饰的细胞周期蛋白F多肽)中，但不存在(或不存在于该位置)于对应的野生型多肽(例如野生型细胞周期蛋白F多肽)中的NES。

术语“增加”、“增强”或“激活”及其语法等效物在本文中通常全部用来指统计显著量的增加；为了避免任何疑问，术语“增加”、“增强”或“激活”及其语法等效物意指与参考水平相比增加了至少10％，例如与参考水平相比增加了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包含100％的增加或介于10-100％的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加或介于2倍与10倍或更大之间的任何增加。

如本文所使用的，短语“抑制运动神经元变性”是指降低运动神经元活力的损失、降低运动神经元功能的损失和/或降低运动神经元的数量的损失。在一些实施例中，运动神经元与本文所述的药剂的接触导致运动神经元变性相对于未处理的对照至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多的减少。运动神经元变性可以通过例如测定氧化应激或内质网应激或细胞凋亡或神经元死亡来评估。

如本文所使用的，术语“调节”意指引起或促进所关注的分子、过程、途径或现象的定性或定量变化、改变或修饰。无限制地，此类变化可以是过程、途径或现象的不同组分或分支的结合特性的增加、减少、变化或相对强度或活性的变化。

如本文所使用的，短语“运动神经元变性”或“运动神经元的变性”是指运动神经元的变性的情况，其中所述神经元死亡或改变为功能较低或较不活跃的形式。

术语“神经退行性病状”是包容性术语，涵盖中枢或外周神经系统的急性和慢性病状、病症或疾病，并且通常由神经系统的细胞或组织的退化引起或与之相关。神经退行性病状可以是年龄相关的，也可以由损伤或创伤引起，或可以与特定的疾病或病状相关。急性神经退行性病状包含但不限于与神经元细胞死亡或损害相关的病状，包含脑血管功能不全、局灶性或弥漫性脑创伤、弥漫性脑损伤、脊髓损伤或外周神经创伤，例如，由物理或化学烧伤、深切或肢体分离引起的。急性神经退行性病症的实例为以下：脑缺血或梗死，包含栓塞性闭塞和血栓性闭塞、急性缺血后再灌注、围产期缺氧缺血性损伤、心脏停搏以及任何类型(如硬膜外、硬膜下、蛛网膜下和脑内)的颅内出血，以及颅内和脑内损伤(如挫伤、穿透、剪切、压迫和撕裂)，以及颈部扭伤和摇晃婴儿综合征。慢性神经退行性病状包含但不限于：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、弥漫性路易体病(diffuse Lewy body disease)、进行性核上性麻痹(斯蒂尔-理查森综合征(Steel-Richardson syndrome))、多系统退化(Shy-Drager综合征(Shy-Drager syndrome))、与神经变性有关的慢性癫痫病状、运动神经元疾病，包含肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、退行性共济失调、皮质基底变性、关岛ALS-帕金森痴呆复合征(ALS-Parkinson's-Dementia complex of Guam)、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、突触核蛋白病(包含多系统萎缩)、原发性进行性失语症、纹状体黑质变性、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)/脊髓小脑性共济失调3型和橄榄体脑桥小脑变性、抽动秽语综合征(Gilles De La Tourette's disease)、延髓和假性延髓麻痹、脊髓和脊髓延髓肌萎缩(肯尼迪病(Kennedy's disease))、原发性侧索硬化症、家族性痉挛性截瘫、韦德尼格-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)、库格尔伯格-韦兰德病(Kugelberg-Welanderdisease)、泰萨二氏病(Tay-Sach's disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、家族性痉挛病、沃伊法特-库格尔伯格-韦兰德病(Wohlfart-Kugelberg-Welander disease)、痉挛性下肢轻瘫、进行性多灶性白质脑病、家族性自主神经异常(赖利-戴综合征(Riley-Daysyndrome))和朊病毒病(包含但不限于：克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、库鲁病(Kuru)和致命性家族性失眠症)、脱髓鞘疾病和病症，包含多发性硬化症和遗传性疾病如脑白质营养不良。在具体实施例中，神经退行性病状选自ALS和FTD。

如本文所使用的，术语“神经元”包含神经元及其一部分或多部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。如本文所使用的，术语“神经元”表示神经系统细胞，其包含中心细胞体或胞体以及两种类型的延伸或突起：树突，其通常将大部分神经元信号传递到细胞体；以及轴突，其通常将大部分神经信号从细胞体传递到效应细胞，如靶神经元或肌肉。神经元可以将组织和器官的信息传递到中枢神经系统(传入或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传出或运动神经元)。其它神经元(被称为中间神经元)连接中枢神经系统(大脑和脊柱)内的神经元。神经元可以是任何神经元，包含但不限于感觉、交感、副交感或肠，例如，背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元，例如，来自脊髓的神经元。可以接受根据本公开的治疗或方法的神经元类型的某些具体实例包含小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮层神经元。在一些实施例中，所述神经元是感觉神经元。在一些实施例中，所述神经元是运动神经元。

术语“神经元变性”和“神经变性”在本文中可互换地用于指代神经元细胞中的任何病理变化，包含但不限于神经元细胞的死亡或损失、细胞死亡之前的任何变化以及神经元细胞的活性或功能的任何降低或损失。病理变化可以是自发的或者可以由任何事件诱导，并且包含例如与细胞凋亡相关的病理变化。神经元可以是任何神经元，包含但不限于感觉、交感、副交感或肠，例如，背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元，例如，来自脊髓的神经元。神经元变性或细胞损失是各种神经疾病或病症，例如神经退行性疾病或病症的特征。在一些实施例中，所述神经元是感觉神经元。在一些实施例中，所述神经元是运动神经元。

术语“嗜神经病毒载体”是指选择性地感染神经元细胞(包含运动神经元)的病毒载体。

“获得”意指拥有。如此获得的样品包含，例如，从特定来源分离或衍生的核酸提取物或多肽提取物。例如，提取物可以直接从受试者的生物流体或组织中分离。

如本文所使用的，术语“可操作地连接(operably connected)”或“可操作地连接(operably linked)”是指并置，其中如此描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。例如，与所关注的核苷酸序列(例如，编码和/或非编码序列)“可操作地连接”的调控序列(例如，启动子)是指对照序列相对于所关注的核酸序列的定位和/或取向，以允许该序列在与所述对照序列兼容的条件下表达。控制序列不必与所关注的核苷酸序列相邻，只要其起到指导其表达的作用。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在插入的非编码序列(例如，未翻译但已转录的序列)，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。

本文中可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何受试者，具体地脊椎动物受试者，并且甚至更具体地哺乳动物受试者。落入本公开范围内的合适脊椎动物包含但不限于：脊索动物亚门的任何成员，包含灵长类动物(例如，人、猴和猿，并且包含猕猴属的猴(例如，食蟹猴如长尾猕猴和/或恒河猴(恒河猴))和狒狒(豚尾狒狒)以及狨猴(狨属的物种)、松鼠猴(松鼠猴属的物种)和绢毛猴(怪柳猴属的物种)，以及如黑猩猩等猿的物种(黑猩猩))、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类动物(例如，兔子、野兔)、牛科动物(例如，牛)、绵羊(例如，绵羊)、山羊(例如，山羊)、猪(例如，猪)、马(例如，马)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要提高细胞周期蛋白F的水平或活性和/或治疗神经退行性病状的人。然而，应当理解，上述术语并不意味着存在症状。

如此处所使用的，术语“药学上可接受的是指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的与合理的益处/风险比相称的那些化合物、药剂、材料、组合物和/或剂型。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题药剂从身体的一个器官或部分携带或运送到身体的另一个器官或部分)。在与调配物的其它成分相容并且对患者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。

术语“多核苷酸”在本文中可与“核酸”互换使用以表示核苷的聚合物。通常，本公开的多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的DNA或RNA中天然存在的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。然而，所述术语涵盖包括核苷或核苷类似物的分子，其含有化学或生物修饰的碱基、修饰的主链等，无论是否在天然存在的核酸中发现，并且此类分子对于某些申请可能是优选的。在本申请涉及多核苷酸的情况下，应理解为提供了DNA、RNA，以及在每种情况下提供单链和双链形式(以及每个单链分子的补体)两者。如本文所使用的“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或在生物化学上表征特定核酸的序列信息(例如，用作碱基的缩写的字母序列)。除非另有说明，否则本文所呈现的多核苷酸序列的呈现方向为5'至3'。

如本文所使用的，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是一种相对较短的多肽，长度通常在约2个与60个氨基酸之间。本文所用的多肽通常含有氨基酸，如在蛋白质中最常见的20个L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。可以例如通过添加如以下等化学实体来修饰多肽中的一或多个氨基酸：碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团、用于共轭、功能化等的接头。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽仍然被认为是“多肽”。示例性修饰包含糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生，通过化学手段如常规固相肽合成等合成。如本文所使用的，术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料本身和/或在生物化学上表征多肽的序列信息(例如，用作氨基酸名称的缩写的字母序列或三个字母代码)。除非另有说明，否则本文所呈现的多肽序列的呈现方向为N末端至C末端。

术语“启动子”是指核苷酸序列，通常位于可转录序列的上游(5')，通过识别RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子来控制可转录序列的表达。“启动子”包含最小启动子，所述最小启动子是由TATA盒和其它用于指定转录起始的位点的序列组成的短核酸序列，其中添加了控制元件(例如，顺式作用元件)以控制表达。“启动子”还指包含最小启动子和能够控制编码序列或功能性RNA的表达的控制元件(例如，顺式作用元件)的核苷酸序列。该类型的启动子序列可以由近侧和更远侧的上游元件组成，后一种元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核酸序列并且可以是启动子的先天元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。其能够在两个取向(正常或翻转)上运行，并且即使在启动子的上游或下游移动时也能够发挥作用。增强子和其它上游启动子元件都与介导其作用的序列特异性核酸结合蛋白结合。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至由合成核酸片段组成。启动子还可以含有参与蛋白质因子的结合的核酸序列，所述蛋白质因子控制响应生理或发育条件的转录起始的有效性。启动子元件，特别是TATA元件，在没有上游激活的情况下是无活性的或启动子活性大大降低的，被称为“最小或核心启动子”。在存在合适的转录因子的情况下，最小启动子起允许转录的作用。因此，“最小或核心启动子”仅由转录启动所需的所有基础元件，例如，TATA盒和/或启动子组成。术语“经调节的启动子”是指以时间和/或空间调节的方式而不是组成性地指导基因表达的启动子，并且包含组织特异性和诱导型启动子两者。其包含天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。不同的启动子可以引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件的表达。在宿主细胞中有用的各种类型的新启动子不断被发现。由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全限定，因此不同长度的核酸片段可以具有相同的启动子活性。说明性经调控的启动子包含但不限于安全剂诱导型启动子、衍生自四环素诱导型系统的启动子、衍生自水杨酸盐诱导型系统的启动子、衍生自酒精诱导型系统的启动子、衍生自糖皮质激素诱导型系统的启动子、衍生自病原体诱导型系统的启动子、衍生自碳水化合物诱导型系统的启动子、衍生自激素诱导型系统的启动子、衍生自抗生素诱导型系统的启动子、衍生自金属诱导型系统的启动子、衍生自热休克诱导型系统的启动子和衍生自蜕皮激素诱导型系统的启动子。

“调节序列”、“调节元件”等是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其直接地或间接地影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调节元件包含增强子、启动子、翻译前导序列、内含子、Rep识别元件、基因间区域和聚腺苷酸化信号序列。其包含天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。

如本文所使用的，术语“重组多核苷酸”是指通过将核酸操纵成自然界中通常没有的形式在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通常，此类表达载体包含与核苷酸序列可操作地连接的转录和翻译调节核酸。

“重组多肽”意指使用重组技术，即，通过重组多核苷酸的表达制备的多肽。

如本文所使用的，术语“样品”包含可以从受试者身上提取、未处理、处理、稀释或浓缩的任何生物样本。样品可以包含但不限于：生物流体，如全血、血清、红细胞、白细胞、血浆、唾液、尿液、粪便(即，粪便)、泪液、汗液、皮脂、乳头抽吸物、导管灌洗物、肿瘤渗出物、滑液、腹水、腹膜液、羊水、脑脊液、淋巴液、细针抽吸物、羊水、任何其它体液、细胞裂解液、细胞分泌产物、炎性反应液、精液和阴道分泌物。样品可以包含组织样品和活检、组织匀浆等。在某些实施例中，样品含有组织，并且在这种类型的代表性实例中，样品来自切除术、活检或芯针活检。此外，还可以使用细针抽吸物样品。样品可以包含石蜡包埋和冷冻的组织。在具体实施例中，样品包括神经元组织，所述神经元组织包含运动神经元。在其它实施例中，样品包括作为运动神经元的替代物的细胞，其非限制性实例包含成纤维细胞，如例如由Yang等人(2015,《神经毒性研究(Neurotox Res)》28:138-146)所公开的，以及血细胞，如例如在www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140408121918.htm中所公开的。术语“样品”还包含未处理或预处理(或预处理)的样品。在一些实施例中，所述样品为未处理的生物样品。样品可以通过从受试者中取出细胞样品来获得，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，在先前时间点分离并由同一人或另一人分离)来实现。

如本文所使用的，术语“序列同一性”是指序列在比较窗口内在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过以下方式计算：在比较窗内比较两个最佳地比对的序列，测定的一致核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或一致氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)在两个序列中出现的位置的数目以得到相配位置的数目，用相配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。本公开考虑了全长细胞周期蛋白F多肽及其生物活性片段在本文公开的方法中的用途。通常，全长细胞周期蛋白F多肽的生物活性片段可以参与相互作用，例如，分子内或分子间相互作用。

“相似性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的百分比，如上表1和2中所定义的。可以使用如GAP等序列比较程序来确定相似性(Deveraux等人1984,《核酸研究》12:387-395)。以此方式，可以通过在比对中插入空位来比较与本文引用的序列长度类似或显著不同的序列，此类空位例如通过由GAP使用的比较算法来确定。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包含“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“实质性同一性”。“参考序列”(例如野生型细胞周期蛋白F)的长度是至少12个，但常常是15个至18个且通常是至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基在内。因为两个多核苷酸或多肽可以各自包括(1)在两个多核苷酸或多肽之间类似的序列(即，仅完整多核苷酸或多肽序列的一部分)；和(2)在两个多核苷酸或多肽之间相异的序列，两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗口”内比较两个多核苷酸或多肽的序列以鉴别并比较序列局部区域的相似性来进行。“比较窗口”是指具有至少6个连续位置的概念性区段，通常为约50个到约100个，更通常为约100个到约150个，其中序列与具有相同数目的连续位置的参考序列在这两个序列进行最佳比对后进行比较。比较窗口可以包括与参考序列(所述参考序列不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以用于这两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施例(美国威斯康星州麦迪逊的科学大道575号的遗传学计算机集团(Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)的威斯康星遗传学软件包7.0版本(Wisconsin Genetics Software Package Release7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过检查和由所选择的各种方法中的任何一种方法生成的最佳比对(即，产生了比较窗口内的最高同源性百分比)来进行。还可以参考BLAST系列程序，如例如通过Altschul等人,1997,《核酸研究》25:3389所公开的。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人,“当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)”,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),1994-1998,第15章,第19.3单元。在一个实例中，在经修饰的细胞周期蛋白F多肽的序列与野生型细胞周期蛋白F多肽比对的情况下，比较窗口包括经修饰的细胞周期蛋白F多肽的全长。如将理解的，在经修饰的细胞周期蛋白F多肽被截短的情况下，将其与野生型细胞周期蛋白F多肽进行比较，比较窗口将小于野生型细胞周期蛋白F多肽的全长(例如野生型细胞周期蛋白F多肽的长度的40％、50％、60％、70％、80％或90％)。

术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学上的显著性，并且通常是指低于标志物的正常或更低浓度的两个标准偏差(2SD)。该术语是指存在差异的统计证据。该术语被定义为当零假设实际上为真时，决定拒绝该零假设的可能性。通常使用p值进行决定。

术语“TDP-43蛋白病”在本文中用于描述与TDP-43的沉积相关的神经退行性病状，包含但不限于肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、嗜银颗粒病、额颞叶痴呆(如FTD-TDP-43和FTD-tau)、关岛ALS帕金森氏症痴呆复合物、皮质基底节变性、路易体痴呆、亨廷顿氏病(HD)、路易体病、运动神经元病、额颞叶变性(FTLD)、额颞叶痴呆、额颞叶变性伴泛素阳性包涵体、海马硬化症、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病(PD)、帕金森病痴呆、Kii半岛帕金森痴呆综合征(Parkinson-dementia complex in Kii peninsula)、皮克氏病(Pick's disease)、马查多-约瑟夫病等。TDP-43蛋白病的另外的细节描述于Gendron等人,2010,《神经病理学和应用神经生物学(Neuropathol.Appl.Neurobiol.)》36:97-112和Lagier-Tourenne等人,2010,《人类分子遗传学》19(1):R46-R64；所述文献的公开内容通过引用并入本文。在具体实施例中，TDP-43蛋白病与神经元中的TDP-43沉积有关，其在本文中称为“神经元TDP-43蛋白病”。

如本文所使用的，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得所需药理学和/或生理学效果。所述作用就完全或部分地预防疾病或其症状来说可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈病状和/或由病状引起的不良影响来说可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类的病状的任何治疗，并且包含：(a)抑制受试者的病状的发展，所述受试者可能易患所述病状，但尚未被诊断为患有所述病状；(b)抑制病状，即，抑制其发展；以及(c)减轻病状，即，引起病状的消退。因此，“神经退行性病状的治疗”在其范围内包含延迟或预防此类病状的发作(例如运动神经元的死亡)，逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止此类病状的进展、加重或恶化此类病状的进展或严重性。在一个实施例中，神经退行性病状的症状减轻至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在一个实施例中，神经退行性病状的症状减轻了超过50％。在一个实施例中，神经退行性病状的症状减轻了80％、90％或更多。治疗还包含改善神经肌肉功能。在一些实施例中，神经肌肉功能改善至少约10％、20％、30％、40％、50％或更多。

“载体”意指多核苷酸分子，合适地衍生自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，多核苷酸可以插入或克隆到其中。载体可以含有一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在包含靶细胞或组织或其祖细胞或组织的限定宿主细胞中自主复制，或者整合到限定宿主的基因组中，使得克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可以含有任何确保自我复制的方式。可替代地，载体可以是这样一种载体，当引入到宿主细胞中时，所述载体被整合到基因组中，并与整合到其中的染色体一起复制。载体系统可以包括单个载体或质粒或一起含有要引入到宿主细胞的基因组或转座子中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。载体的选择通常将取决于载体与要引入载体的宿主细胞的相容性。在当前情况下，载体优选地是病毒或病毒衍生的载体，其在动物细胞和优选地哺乳动物细胞中可操作地起作用。可用于本公开实践的非限制性病毒载体包含腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。载体还可以包含选择标记，如可用于选择合适转化体的抗生素抗性基因。此类抗性基因的实例是本领域技术人员已知的并且包含对抗生素卡那霉素(kanamycin)和G418产生抗性的nptII基因和对抗生素潮霉素B(hygromycin B)产生抗性的hph基因。

术语“野生型”、“天然”和“天然存在的”在本文中可互换使用，指的是从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型、天然或天然存在的基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中最常见的，并且因此被任意地设计为基因或基因产物的“正常”或“野生型”形式。

如本文所使用的，基因名称的下划线或斜体应指示该基因，与之相反，其蛋白质产物在没有任何下划线或斜体的情况下由基因名称指示。例如，“细胞周期蛋白F”应意指细胞周期蛋白F基因，而“细胞周期蛋白F”应指示“细胞周期蛋白F”基因的转录、翻译和/或选择性剪接产生的一种或多种蛋白质产物。

除非另有明确说明，否则本文描述的每个实施例将在必要的修改后应用于每个实施例。

2.缩写

贯穿本申请使用以下缩写：

MND＝运动神经元病

ALS＝肌萎缩侧索硬化症

FTD＝额颞叶痴呆

AD＝阿尔茨海默氏病

HD＝亨廷顿氏病

PD＝帕金森氏病

3.经修饰的细胞周期蛋白F多肽

提供了经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码核酸分子。本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽含有相对于野生型细胞周期蛋白F多肽，如SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的一种或多种修饰(例如氨基酸取代、缺失和/或插入)。示例性修饰包含一种或多种异源核输出信号(NES)的包含或添加、使内源性核定位信号失活的修饰(即NLS失活修饰)，以及细胞周期蛋白F的治疗活性不需要的一个或多个氨基酸残基或结构域(例如PEST结构域的全部或一部分)的缺失。在一些实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括至少一种异源NES和至少一种NLS失活修饰(例如NLS的全部或一部分的缺失，和/或NLS中降低NLS将多肽引导至细胞核的能力的一个或多个氨基酸取代)。在另外的实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括至少一种NES、至少一种NLS失活修饰和PEST结构域的缺失。

可以对任何细胞周期蛋白F多肽进行修饰，即任何细胞周期蛋白F多肽都可以表示“未经修饰的细胞周期蛋白F多肽”，对其进行修饰从而产生经修饰的细胞周期蛋白F多肽。在一些实例中，未经修饰的细胞周期蛋白F多肽是SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F或与其具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、95％或99％序列同一性的细胞周期蛋白F多肽。因此，本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽可以包括如本文所述的一种或多种修饰，其中多肽的剩余部分(即不包括修饰的多肽的部分)与SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、95％或99％序列同一性。在一些实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽与SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、95％或99％序列同一性。

通常，与野生型细胞周期蛋白F相比，经修饰的细胞周期蛋白F多肽对细胞质的靶向性增加，即与用野生型细胞周期蛋白F观察到的靶向细胞质或在细胞质中积聚相比，经修饰的细胞周期蛋白F多肽对细胞质靶向性或在经修饰的细胞周期蛋白F多肽在细胞质中的积聚增加了至少或约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％或400％。

本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽保留细胞周期蛋白F活性(例如与TDP-43结合的能力和形成SKP1-CUL1-F框蛋白(SCF)泛素连接酶复合物的能力，如下文进一步详细描述的)，并且因此当如本文所述递送至神经元时具有治疗效用。更具体地，当递送到神经元并引导到细胞质时，经修饰的细胞周期蛋白F多肽优先地且主要地结合并清除细胞质定位的病理性TDP-43，而不显著干扰核定位的TDP-43。

3.1核输出信号

在一些实例中，本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括异源核输出信号(NES)。NES天然存在于许多从细胞核输出到细胞质的蛋白质中。蛋白质的核输出主要通过输出蛋白/CRM1途径进行调节，该途径涉及通过CRM1对蛋白质中的NES的特异性识别。NES通常为8-15个氨基酸长，并且含有四个或五个疏水性残基，这些残基特征性地间隔成不同的模式，形成NES类的11类(1a-d类、2类、3类、4类和1a-d反向)(Kosugi等人,2008,《Traffic杂志(Traffic)》9 2053-2062；Fung等人,2015,《e生命(eLife)》4,e10034.)。NES通常确认Φ1-X_2,3-Φ2-X_2,3-Φ3-XΦ4的一致序列(其中Φn表示Leu、Val、Ile、Phe或Met，并且X可以是任何氨基酸)(Xu等人,2012,《分子细胞生物学(Mol Biol Cell)》.23:3677-3693)。如本文所述，细胞周期蛋白F可以被修饰以包含异源NES，从而产生主要靶向细胞质的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。

经修饰的细胞周期蛋白F多肽可以包含1个、2个、3个或更多个NES。此外，任何将多肽引导到细胞质的NES都可以用于本公开的经修饰的多肽，并且此类NES是本领域技术人员众所周知的。NES的非限制性实例包含包括以下的那些：LPPLERLTL(SEQ ID NO:8)、LQLPPLERLTLD(SEQ ID NO:9)、LALKLAGLDL(SEQ ID NO:10)、PLQLPPLERLTL(SEQ ID NO:11)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:12)、LSSHFQELSI(SEQ ID NO13)、ERFEMFRELNEALEL(SEQID NO:14)、DHAEKVAEKLEALSV(SEQ ID NO:15)、QLVEELLKIICAFQL(SEQ ID NO:16)或TNLEALQKKLEELEL(SEQ ID NO:17)。本领域描述的其它NES序列，包含由Xu等人(2012,《分子细胞生物学》23:3677-3693)描述的那些，可以用于本公开的上下文中。

一种或多种NES可以包含在细胞周期蛋白F多肽的任何位置，条件是其不会显著不利地影响细胞周期蛋白F多肽的活性(例如TDF结合活性或SCF(Skp1-Cul1-F框蛋白)泛素连接酶复合物形成活性)，并且条件是其可与CRM1结合(例如不埋在经修饰的细胞周期蛋白F多肽的三维结构内)。例如，NES可以存在于经修饰的细胞周期蛋白F多肽的N或C末端(例如与未经修饰的细胞周期蛋白F多肽的N或C末端融合)，或者可以存在于经修饰的细胞周期蛋白F多肽内。在特定实例中，NES存在于C末端。

3.2核定位信号修饰

本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽还包含具有核定位信号(NLS)失活修饰的那些，其导致内源性NLS的失活，并且因此与野生型细胞周期蛋白F相比，经修饰的细胞周期蛋白F多肽在细胞核中的定位减少。

野生型细胞周期蛋白F多肽具有两个内源性NLS。第一NLS(NLS1)在N末端附近，在位置20-28或20-29处不同地报告，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F，而第二NLS(NLS2)在SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F的位置568-574处。通过NLS失活修饰的存在对NLS的失活可以是部分或完全的。因此，NLS失活修饰包含当存在经修饰的细胞周期蛋白F多肽时，导致经修饰的细胞周期蛋白F多肽与野生型细胞周期蛋白F相比，在靶向或定位于细胞核方面显示出至少或约15％、20％、30％、35％、40％、45％或50％的减少。如所理解的，当经修饰的细胞周期蛋白F多肽在两个内源性NLS中包括NLS失活修饰时，与野生型细胞周期蛋白F相比，经修饰的细胞周期蛋白F多肽对细胞核的靶向或定位可以降低至少或约30％、35％、40％、45％或50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。因此，在一些情况下，在一个或两个NLS中具有NLS失活修饰的经修饰的细胞周期蛋白F多肽在细胞质中的定位与野生型细胞周期蛋白F相比增加了至少或约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％。

在一些实例中，NLS失活修饰包括内源性NLS的全部或一部分的缺失。因此，在一些实施例中，经修饰的多肽包括NLS1的全部或一部分的缺失，例如相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F，位置20-29处的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸残基的缺失。在一些实例中，存在位置20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、22-29、22-28、22-27、22-26、22-29，23-28、23-27、24-29或24-28处的氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F。在另外的实施例中，经修饰的多肽包括NLS2的全部或一部分的缺失，例如相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F，正电子568-574处的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基的缺失。因此在一些实施例中，存在位置568-574、568-573、568-572、568-571、569-574、569-573、569-572、569-571、570-574、570-573、570-572、571-574、571-573或570-572处的氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F。如将理解的，在仅NLS1和/或NLS2的一部分缺失的情况下，NLS中足够数量的氨基酸(即NLS的足够部分)缺失，使得与野生型细胞周期蛋白F相比，经修饰的细胞周期蛋白F多肽在细胞核中的定位降低。

在一个实施例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括NLS1和NLS2二者的缺失，并且进一步包括异源NES。在特定实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括SEQ ID NO:4中所示的序列，或与其具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、95％或99％序列同一性的序列(前提是所述多肽包括NLS1和NLS2两者的缺失，并且进一步包括异源NES)。

在其它实例中，NLS失活修饰包括包含NLS1(即位置20-28或20-29，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F)或NLS2(即SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F的位置568-574)的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，使得与以氨基酸20-28或20-29所示的野生型NLS相比，NLS将多肽引导到细胞核的能力降低(即与野生型细胞周期蛋白F相比，包括一个或多个氨基酸取代的经修饰的细胞周期蛋白F多肽靶向或定位于细胞核的能力减少，如减少至少或约15％、20％、30％、35％、40％、45％或50％)。

NLS基序在长度和特征方面有很大差异，然而，几乎所有基序共享一个简单的特征，即主要是碱性氨基酸的短链，如赖氨酸(K)和精氨酸(R)。因此，在一些实例中，NLS失活修饰包括用不同氨基酸残基对K20、R21、R22、R24、R25、R26和R28中的一个或多个进行氨基酸取代(其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F)。在一些实例中，取代是用非碱性氨基酸残基(例如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或缬氨酸(V)))。在一个实例中，K20、R21、R22、R24、R25、R26和R28中的一个或多个被丙氨酸取代。在其它实例中，NLS失活修饰包括用不同氨基酸残基对R568、R569、K571、R572、K574和R574中的一个或多个进行氨基酸取代(其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F)。在一些实例中，取代是用非碱性氨基酸残基(例如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或缬氨酸(V)))。在一个实例中，R568、R569、K571、R572、K574和R574中的一个或多个被丙氨酸取代。

在特定实例中，NLS失活修饰包括NLS1的一部分的缺失和NLS1中一个或多个氨基酸残基的氨基酸取代。在其它实例中，NLS失活修饰包括NLS2的一部分的缺失和NLS2中一个或多个氨基酸残基的氨基酸取代。

3.3其它缺失

本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽可以具有一个或多个另外的氨基酸缺失，由此产生相对于野生型细胞周期蛋白F的截短的细胞周期蛋白F多肽。与野生型多肽和多核苷酸相比，截短的细胞周期蛋白F多肽和编码多核苷酸可以具有优势，如在多肽或多核苷酸的生产中，其中短多肽或多核苷酸通常比长的多肽或多核苷酸更容易以高产量和高质量生产；以及在多肽或多核苷酸的递送中，其中较短的多肽或多核苷酸通常比较长的多肽或多核苷酸更容易递送到细胞如神经元。病毒载体递送多核苷酸的情况尤其如此，其中病毒载体对其基因组中可携带的核酸的长度有上限。

如将理解的，经修饰的细胞周期蛋白F多肽保留必要的结构域和序列，以促进TDP-43结合和SCF(Skp1-Cul1-F框蛋白)泛素连接酶复合物SCF^{细胞周期蛋白F的形成}。因此，提供了经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其至少包括TDP-43结合结构域和SCF^{细胞周期蛋白F}形成结构域。SCF^{细胞周期蛋白F}形成结构域和TDP结合结构域可以通过一个或多个内源性细胞周期蛋白F氨基酸或区或通过其它氨基酸或肽接头连接，使得所产生的经修饰的细胞周期蛋白F多肽具有与TDP-43结合和形成SCF^{细胞周期蛋白F}复合物所需的构象。氨基酸和肽接头在本领域中是众所周知的。合适的接头仅以举例的方式包含，氨基酸如氨基己酸、甘氨酸和丝氨酸，以及两个或更多个氨基酸如甘氨酸和丝氨酸的延伸。接头可以是任何长度，但是通常长度为至少20个氨基酸。因此，在一实施例中，接头的长度将是至少20个、30个、40个或50个氨基酸。

TDP-43结合结构域是促进细胞周期蛋白F与TDP-43的结合所需的最小氨基酸区域。出于本公开的目的，包括TDP-43结合结构域的经修饰的细胞周期蛋白F多肽与TDP-43的结合意味着对SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F观察到的结合的至少50％。评估包括TDP-43结合结构域的多肽与TDP-43的结合的方法在本领域中是众所周知的，并且包含例如下拉测定法、微量热泳法(MST)、表面等离子体共振法(SPR)、生物层干涉法(BLI)和等温滴定量热法(ITC)。在一个实例中，免疫沉淀测定法(例如使用抗体或GFP/RFP-trap)用于对细胞周期蛋白F多肽和TDP-43进行共沉淀。所得洗脱液通过例如免疫印迹法或质谱法进行分析。在另一个实例中，使用基于免疫荧光显微镜和或邻近连接的方法。如诸位发明人先前所确定的，TDP-43结合结构域在细胞周期蛋白F的细胞周期蛋白框内(即在SEQ ID NO:2中所示的横跨野生型细胞周期蛋白F的氨基酸位置292-405的区域内)。因此，在一些实施例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽在SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的位置292-405处包括至少或约20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或110个细胞周期蛋白结构域的氨基酸残基，如至少在SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的位置292-405、300-400、310-390、320-370、330-360、300-390、300-380、300-370、300-360、300-350、300-340、310-380、310-370、310-360、310-350、320-380或320-260处的氨基酸。

经修饰的细胞周期蛋白F多肽还保留必要的结构域和序列，以促进SCF(Skp1-Cul1-F框蛋白)泛素连接酶复合物SCF^{细胞周期蛋白F的形成}。因此，经修饰的细胞周期蛋白F多肽至少包括SCF^{细胞周期蛋白F}形成结构域。评估多肽形成SCF^{细胞周期蛋白F}复合物的能力的方法在本领域是众所周知的，并且包含例如免疫沉淀方法和泛素化测定。在一个实例中，细胞周期蛋白F多肽与Skp1、Rbx1和Cul1结合的能力通过从细胞中对细胞周期蛋白F多肽进行免疫沉淀来评估(例如使用标记的多肽和识别标签e的抗体)，然后通过免疫印迹或质谱法评估Skp1、Rbx1和Cul1的洗脱液。在确认Skp1-Cul1-Rbx1 E3连接酶是完整的之后，可以利用体外泛素化测定来测量免疫沉淀的SCF^{细胞周期蛋白F}复合物的活性。在该测定中，将泛素化所需的所有组分(例如ATP、泛素、底物(重组TDP-43)、E1、E2和免疫沉淀的SCF^{细胞周期蛋白F}复合物)混合，并评估泛素化并将其与背景泛素化进行比较(例如，使用酶失活的细胞周期蛋白F变体，如细胞周期蛋白F(LP/AA)变体进行评估)。在一些实施例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括存在于SEQ IDNO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的位置29-76处的F框的全部或一部分，如F框的至少或约至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个或45个氨基酸残基。在一些实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括或至少包括SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的位置29-76、29-70、29-65、29-60、29-55、29-50、35-76、35-70、35-65、35-60、35-55、40-79、40-70、40-65、40-60、45-76、45-70或45-65。

在一些实例中，本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括内源性PEST结构域(SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F的氨基酸582-766)的全部或一部分的缺失。如本文首次证明的，内源性PEST结构域的全部或一部分的缺失令人惊讶地产生经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其指向并定位于细胞质。在一些实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括在氨基酸位置582-766处从PEST结构域的至少或约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或180个氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽。因此，在一些实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括或至少包括SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的位置582-766、582-760、582-750、582-740、582-730、582-720、582-710、582-700、590-766、590-760、590-750、590-740、590-730、590-720、590-710、590-700、600-766、600-760、600-750、600-740、600-730、600-720、600-710、600-700、610-766、610-760、610-750、610-740、610-730、610-720、610-710或610-700。在一个实例中，经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括SEQ ID NO:6中所示的序列，或与其具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、95％或99％序列同一性的序列(前提是所述多肽包括PEST结构域的全部或一部分的缺失)。

3.4核酸构建体

还提供了编码本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子，即包括本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽的编码序列。因此，核酸分子包括经修饰的CCNF多核苷酸，其包括相对于野生型CCNF多核苷酸(如SEQ ID NO:1中所示的多核苷酸)或相对于编码野生型细胞周期蛋白F的多核苷酸的一种或多种修饰(例如核苷酸缺失、插入或取代)。在特定实施例中，核酸分子包括经修饰的细胞周期蛋白F多肽的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到启动子。因此，本公开的CCNF多核苷酸的非限制性实例包含编码SEQ ID NO:4或6中所示的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或与SEQ ID NO:4或6具有至少或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的经修饰的细胞周期蛋白F多肽的那些。在一些实施例中，核酸分子包括SEQ ID NO:3或5中所示的序列，所述序列与SEQ ID NO:3或5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性，如通过例如本文所述的使用默认参数的序列比对程序所确定的。

本公开还考虑了在下述严格条件下与SEQ ID NO:3或5中所示的CCNF核苷酸序列或与其补体杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语“在中等严格、高严格或非常高严格条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以在Ausubel等人,(1998,同上),章节6.3.1-6.3.6中找到。在该参考文献中描述了水性和非水性方法，并且可以使用任何一种方法。本文提及的中等严格条件包含并涵盖至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和用于在42℃下杂交的至少约0.5M至至少约0.9M盐，以及用于在55℃下洗涤的至少约0.1M至至少约0.2M盐。中等严格条件还可以包含1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5MNaHPO₄(pH 7.2)、用于在65℃下杂交的7％SDS，和(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、用于在60-65℃下洗涤的5％SDS。中等严格条件的一个实施例包含在6×SSC中在约45℃下杂交，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在60℃下洗涤一次或多次。高严格条件包含并涵盖至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和用于在42℃下杂交的约0.01M至约0.15M盐，以及用于在55℃下洗涤的约0.01M至约0.02M盐。高严格条件还可以包含1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、用于在65℃下杂交的7％SDS，和(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、用于在超过65℃的温度下洗涤的1％SDS。高严格条件的一个实施例包含在6×SSC中在约45℃下杂交，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤一次或多次。

在某些实施例中，细胞周期蛋白F多肽由在非常高严格条件下与所公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。非常高严格条件的一个实施例包含在约65℃下杂交0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在0.2×SSC、1％SDS下在65℃下洗涤一次或多次。

其它严格条件在本领域是众所周知的，并且技术人员将认识到可以操纵各种因素来优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性的优化可以用于确保高度杂交。更多详细实例参见Ausubel等人,(1998,同上)第2.10.1至2.10.16页以及Sambrook等人,(1989,同上)章节1.101至1.104。

虽然严格洗涤通常在约42℃至68℃的温度下进行，但本领域技术人员将理解，其它温度可以适用于严格条件。最大杂交速率通常发生在低于DNA-DNA杂交体的形成的Tm的约20℃至25℃。在本领域中众所周知，Tm是熔融温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。用于评估Tm的方法是本领域众所周知的(参见Ausubel等人,(1994,同上)第2.10.8页)。通常，DNA的完全匹配的双链体的Tm可以通过以下公式预测为近似值：

Tm＝81.5+16.6(log10 M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)

其中：M是Na+的浓度，优选地在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％G+C是鸟苷和胞嘧啶碱基的总和占碱基总数的百分比，范围在30％-75％G+C之间；％甲酰胺是甲酰胺浓度的体积百分比；长度是DNA双链体中碱基对的数量。随机错配碱基对的数量每增加1％，双链DNA的Tm就会减少大约1℃。洗涤通常在Tm-15℃下进行以实现高严格，或Tm-30℃下进行以实现中等严格。

在杂交程序的一个实例中，含有固定化DNA的膜(例如，硝化纤维膜或尼龙膜)在42℃下在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×邓哈特溶液(Denhardt’s solution)(0.1％ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL变性鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后，对膜进行两次连续中等严格洗涤(即，2×SSC、0.1％SDS在45℃下洗涤15分钟，随后是2×SSC、0.1％SDS在50℃下洗涤15分钟)，随后是两次连续较高严格洗涤(即，0.2×SSC、0.1％SDS在55℃下洗涤12分钟，随后是0.2×SSC和0.1％SDS溶液在65-68℃下洗涤12分钟)。

4.递送媒剂

本公开还考虑了用于将本公开的CCNF多核苷酸(即编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子)或本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽递送至神经元(例如，运动神经元)的递送媒剂。核酸分子和/或多肽的合适的递送媒剂在本领域是众所周知的，并且可以用于将CCNF多核苷酸或经修饰的细胞周期蛋白F多肽递送到神经元的方法中。例如，病毒载体可以用于递送本公开的CCNF多核苷酸，而非病毒载体(例如脂质体、外泌体、聚合物、纳米颗粒等)可以用于递送本公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。因此，还提供了递送媒剂，如下文所述的任何递送媒剂，其包括本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。

4.1病毒载体

用于递送编码本文所公开的经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子的合适的病毒载体包含但不限于腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体，并且在特定实施例中是嗜神经病毒载体。

4.1.1腺相关病毒

CCNF多核苷酸可以通过使用腺相关病毒载体(AAV载体)递送到中枢神经系统的细胞中，包含神经元(例如，运动神经元)。AAV载体将基因递送到脑中的用途在本领域中众所周知(参见例如，美国专利第8,198,257号和第7,534,613号、美国专利申请序列号13/881,956，所述参考文献中的每一个通过引用并入)。

用于将CCNF多核苷酸递送到运动神经元的AAV载体是本领域已知的(参见美国专利第7,335,636号，所述美国专利通过引用并入)。AAV载体可以使用已知技术构建，以至少提供控制元件的可操作地连接的组分，包含转录起始区(例如，启动子)、转录终止区和任选地至少一个转录后调节序列。控制元件被选择为在目标细胞中起作用。所得到的含有可操作地连接的组分的构建体通常侧接在具有功能性AAV反向末端重复序列(ITR)的5'和3'区域。

AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。AAV-2ITR序列例如由Kotin等人《人类基因疗法(Human gene therapy)》,5:793-01(1994)；Fields和Knipe,《基础病毒学(FundamentalVirology)》,“细小病毒科及其复制(Parvoviridae and their Replication)”(第2版1986)描述。本领域技术人员将理解AAV ITR可以使用标准分子生物学技术进行修饰(例如，Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册》,(第4版,2012))。因此，在本公开的载体中使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列，并且可以通过例如，核苷酸的插入、缺失或取代而改变。另外地，AAV ITR可以衍生自若干种AAV血清型中的任何一种，包含但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9等。此外，AAV表达载体中所选核苷酸序列侧接的5'和3'ITR不必相同或来自同一AAV血清型或分离株，只要ITR功能符合预期，即，当细胞中存在AAV rep基因产物时，允许所关注的界定的核苷酸序列的切除和复制。

本领域技术人员可以理解，调节序列通常可以由衍生自病毒的常用启动子提供，所述病毒如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。使用病毒调节元件来直接表达蛋白质可以允许蛋白质在各种宿主细胞中的高水平组成型表达。还可以使用的普遍表达的启动子包含，例如，早期巨细胞病毒启动子(Boshart等人,《细胞(Cell)》,41:521-30(1985))、疱疹病毒胸苷激酶启动子(McKnight等人《细胞》,37:253-62(1984))、β肌动蛋白启动子(例如，人β肌动蛋白启动子，Ng等人,《分子细胞生物学(Molecular CellBiology)》,5:2720-32(1985))和集落刺激因子1启动子(Ladner等人,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》,6:2693-98(1987))。

可替代地，AAV载体的调节序列可以优先指导基因在特定细胞类型中的表达，即，可以使用组织特异性调节元件。可以使用的组织特异性启动子的非限制性实例包含中枢神经系统(CNS)特异性启动子如神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:5473-77(1989))和胶质细胞特异性启动子(Morii等人,《生物化学和生物物理研究通讯(Biochemical&BiophysicalResearch Communications)》,175:185-91(1991))。在具体实施例中，启动子是组织特异性的，并且在中枢神经系统外基本上没有活性，或者启动子在中枢神经系中的活性高于在其它系统中的活性。例如，可以选择对脊髓、脑干(髓质、脑桥和中脑)、小脑、间脑(丘脑、下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮层或皮层内、枕叶、颞叶、顶叶或额叶)或其组合特异性的启动子。启动子可以对特定细胞类型具有特异性，如CNS中的神经元或神经胶质细胞。如果所述启动子在胶质细胞中具有活性，其可能对星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、施旺细胞或小神经胶质细胞具有特异性。如果所述启动子在神经元中具有活性，其可以对特定类型的神经元具有特异性，例如，运动神经元、感觉神经元或中间神经元。另外地，所述启动子可以对具有特定表型的神经元具有特异性，例如，产生多巴胺的神经元、产生血清素的神经元等。在某些实施例中，启动子对大脑的特定区域的细胞，例如皮层、纹状体、黑质和海马体具有特异性。

合适的神经元特异性启动子包含但不限于突触蛋白启动子、神经元特异性烯醇酶(NSE)(Olivia等人,《基因组学(Genomics)》,10:157-65(1991).基因库登录号：X51956)以及人神经丝轻链启动子(NEFL)(Rogaev等人,《人类分子遗传学(Human MolecularGenetics)》,1:781(1992),基因库登录号：L04147)。神经胶质特异性启动子包含但不限于神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Morii等人,《生物化学和生物物理研究通讯》,175:185-91(1991),基因库登录号：M65210)、S100启动子(Morii等人,《生物化学和生物物理研究通讯》,175:185-91(1991),基因库登录号：M65210)和谷氨酰胺合成酶启动子(Vanden等人,《生物化学与生物物理学报(Biochimica Biophysica Acta)》,2:249-51(1991),基因库登录号：X59834)。在优选实施例中，基因的上游(即,5')侧接神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子。在另一个优选实施例中，所关注的基因的上游(即,5')侧接延伸因子1α(EF)启动子。合适的表型特异性启动子包含但不限于酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺β羟化酶、乙酰胆碱酯酶启动子、胆碱乙酰转移酶启动子、多巴胺受体I和II启动子、多巴胺转运蛋白启动子、囊泡单胺转运蛋白启动子、神经视蛋白启动子和囊泡乙酰胆碱转运蛋白启动子。

携带可表达CCNF多核苷酸的核酸构建体和侧接AAV ITR的转录后调节序列(PRE)的AAV载体可以通过将所关注的核苷酸序列和PRE直接插入AAV基因组中来构建，所述AAV基因组已经切除了主要的AAV开放阅读框(“ORF”)。只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能，AAV基因组的其它部分也可以是缺失的。可以使用本领域众所周知的技术来设计这些构建体。(参见，例如，Lebkowski等人,《分子与细胞生物学(Molecular&CellularBiology)》,8:3988-96(1988)；Vincent等人,《疫苗(Vaccines)》90(冷泉港实验室出版社,1990)；Carter,《生物技术当前述评(Current Opinion Biotechnology)》,3:533-39(1992)；Muzyczka,《当前微生物学和免疫学的话题(Current Topics Microbiology&Immunology)》,158:97-29(1992)；Kotin,《人类基因疗法》,5:793-01(1994)；Shelling等人,《基因疗法(Gene Therapy)》,1:165-69(1994)；和Zhou等人,《实验医学杂志(JExperimental Medicine)》,179:1867-75(1994))。可替代地，可以使用标准连接技术，如Green和Sambrook(Green&Sambrook,《分子克隆：实验室手册》,(第4版,2012))中所述的那些技术从病毒基因组或含有存在于另一个载体中的所选核酸构建体的相同和融合的5'和3'的AAV载体中切除AAV ITR。若干种AAV载体可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)以登录号为53222、53223、53224、53225和53226获得。

为了产生重组AAV颗粒，使用已知技术如通过转染可以将AAV载体引入到合适的宿主细胞中。许多转染技术在本领域中通常是已知的(参见，例如，Graham等人,《病毒学(Virology)》,52:456(1973)；Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册》,(第4版,2012)；Davis等人,《分子生物学的基本方法(Basic Methods Molecular Biology)》,(爱思唯尔(Elsevier),1986)；和Chu等人,《基因(Gene)》,13:197(1981))。特别合适的转染方法包含磷酸钙共沉淀(Graham等人,《病毒学》,52:456-67(1973))、直接显微注射到培养细胞中(Capecchi,《细胞》,22:479-88(1980))、电穿孔(Shigekawa等人,《生物技术(BioTechniques)》,6:742-51(1988))、脂质体介导的基因转移(Mannino等人,《生物技术》,6:682-90(1988))、脂质介导的转导(Feigner等人,《美国国家科学院院刊》,84:7413-17(1987))和使用高速微探针的核酸递送(Klein等人,《自然(Nature)》327:70-73(1987))。

用于产生重组AAV颗粒的合适的宿主细胞包含但不限于可以或已经用作外源性核酸分子的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常指已经用外源性核酸分子转染的细胞。宿主细胞包含任何真核细胞或细胞系，只要该细胞或细胞株与待表达的蛋白质、所选择的选择系统或所采用的发酵系统不相容即可。非限制性实例包含DHFR缺失性CHO细胞(Urlaub和Chasin《美国国家科学院院刊》,77:4216-420(1980))、293细胞(Graham等人,《普通病毒学杂志(J.General Virology)》36:59-72(1977))或骨髓瘤细胞像SP2或NSO(Galfre和Milstein,《酶学方法(MethodsEnzymology)》,73:3-46(1981))。

在一些实施例中，宿主细胞来自稳定的人细胞系293(通过例如，ATCC以登录号：ATCC CRL 1573很容易地获得)，其是用5型腺病毒DNA片段转化的人胚胎肾细胞系(Graham等人,《普通病毒学杂志》,36:59-72(1977))并表达腺病毒E1a和E1 b基因(Aiello等人,《病毒学》,94:460-69(1979))。293细胞系易于转染，并提供了产生AAV病毒体的特别方便的平台。

必须使含有上述AAV载体的宿主细胞能够提供AAV辅助功能，以便复制和包封AAVITR侧接的表达盒以产生重组AAV颗粒。AAV辅助功能通常是AAV衍生的编码序列，其可以被表达以提供AAV基因产物，所述AAV基因产物进而以反式用于生产性AAV复制。AAV辅助功能在本文中用于补充AAV载体中缺失的必要AAV功能。因此。AAV辅助功能包含一个或两个主要的AAV开放阅读框(ORF)，即rep和cap编码区，或其功能同源物。

AAV基因组的AAV rep编码区编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40。已示出这些Rep表达产物具有许多功能，包含：DNA复制的AAV起源的识别、结合和切口；DNA解旋酶活性；和来自AAV(或其它外源性)启动子的转录的调节。Rep表达产物是复制AAV基因组所必需的。AAV基因组的AAV cap编码区编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，或其功能同源物。AAV辅助功能可以通过在转染包括表达盒的AAV载体之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞而引入宿主细胞，因此，AAV辅助构建体用于提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充生产性AAV感染所必需的缺失的AAV功能。AAV辅助构建体缺乏AAV ITR并且既不能复制也不能自我包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，如编码Rep和Cap表达产物两者的常用质粒pAAV/Ad和plM29+45(参见，例如，Samulski等人,《病毒学杂志(J.Virology)》,63:3822-28(1989)；McCarty等人,《病毒学杂志》,65:2936-45(1991))。已经描述了编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体(参见例如，美国专利第5,139,941号，所述美国专利通过引用并入)。

作为用辅助病毒的宿主细胞的感染的结果，产生AAV Rep和/或Cap蛋白。Rep蛋白还用于复制AAV基因组。表达的Cap蛋白组装成衣壳，并且将AAV基因组包装到衣壳中。这导致AAV被包装到包括表达盒的重组AAV颗粒中。在重组AAV复制之后，可以使用各种常规纯化方法(如CsCl梯度)从宿主细胞中纯化重组AAV颗粒。然后将所得的重组AAV颗粒准备用于向各种细胞类型的基因递送。

在一些实施例中，施用于受试者的病毒载体和/或病毒颗粒的数量可以在10³至10¹⁵颗粒/mL的范围内，或其间的任何值，例如约10⁷颗粒/mL、10⁸颗粒/mL、10⁹颗粒/mL、10¹⁰颗粒/mL、10¹¹颗粒/mL、10¹²颗粒/mL、10¹³颗粒/mL、10¹⁴颗粒/mL或10¹⁵颗粒/mL。在一些实施例中，施用高于10¹³颗粒/mL的载体和/或病毒粒子。可以施用1μL和10mL之间的体积，以使受试者接受10²与10¹⁶之间的总载体和/或病毒颗粒。因此，在一些实施例中，施用约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁴或10¹⁶载体和/或病毒颗粒。

在本公开的方法的实践中，可以使用任何血清型的AAV。本发明的某些实施例中使用的病毒载体的血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8(参见，例如，Gao等人,2002,《美国国家科学院院刊》99:11854-11859；和《用于基因疗法的病毒载体：方法和方案(Viral Vectors for Gene Therapy:Methods andProtocols)》,Machida编辑,胡马纳出版社(Humana Press),2003)。除了本文列出的血清型之外，还可以使用其它血清型。此外，假型化AAV载体也可用于本文所述的方法中。假型化AAV载体是在第二种AAV血清型的衣壳中含有一种AAV血清型的基因组的那些；例如，含有AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV载体或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV病毒载体(Auricchio等人,2001.《人类分子遗传学》10(26):3075-81)。AAV载体衍生自对哺乳动物无致病性的单链(ss)DNA细小病毒(综述于Muzyscka,1992.《微生物学和免疫学的最新课题(Curr.Top.Microb.Immunol.)》158:97-129)。简言之，基于重组AAV的载体去除了占病毒基因组96％的rep和cap病毒基因，留下两个用于启动病毒DNA复制、包装和整合的侧接145碱基对(bp)反向末端重复(ITR)。在没有辅助病毒的情况下，野生型AAV以染色体19q 13.3的优先位点特异性整合到人类宿主细胞基因组中，或者其可以游离地维持。单个AAV颗粒可以容纳高达5kb的ssDNA，因此为转基因和调节元件留下约4.5kb，这通常是足够的。然而，反式剪接系统，如例如在美国专利第6,544,785号中描述的，可以是该限值的近两倍。

在某些实例中，AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、rh.39、rh.43和CSp3。

靶向CNS细胞的基于AAV的基因疗法载体已经描述于例如美国专利第6,180,613号和第6,503,888号中。另外的示例性AAV载体是编码人蛋白的重组AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9血清型载体。在具体实施例中，AAV是选自rAAV2/1、rAAV2/8和rAAV2/9的嗜神经性AAV，例如在Ayers等人(2015,《分子疗法(Mol Ther.)》23(1):53-62)中所描述的。

可替代地，本公开的载体可以是腺相关病毒以外的病毒或其部分，其允许引入病毒核酸中的CCNF核酸分子的表达。例如，可以使用复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒。产生重组逆转录病毒和用此类病毒在体外或体内感染细胞的方案可以在Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南》§§9.10-9.14(格林出版协会(GreenePublishing Associates),1989)和其它标准实验室手册中找到。合适的逆转录病毒的实例包含本领域技术人员已知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒系的实例包含Crip、Cre、2和Am。腺病毒的基因组可以被操纵，使其编码和表达所关注的蛋白质，但就其在正常裂解病毒生命周期中复制的能力而言是失活的(参见例如，Berkner等人,《生物技术》,6:616-29(1988)；Rosenfeld等人,《科学(Science)》,252:431-34(1991)；Rosenfeld等人,《细胞》68:143-55(1992))。衍生自腺病毒毒株Ad 5型d1324或其它腺病毒毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体对本领域技术人员来说是众所周知的。

4.1.2慢病毒

慢病毒载体可以用于在包含神经元(例如，运动神经元)的神经系统的细胞中表达CCNF多核苷酸，并且合适的慢病毒载体的产生在本领域中是众所周知的(参见，例如，美国专利申请序列号13/893,920，所述美国专利通过引用并入)。根据本公开的慢病毒载体可以衍生自或可以衍生自任何合适的慢病毒。重组慢病毒颗粒能够用所关注的核苷酸转导靶细胞。一旦RNA基因组进入细胞，载体颗粒被逆转录成DNA并整合到靶细胞的基因组中。

慢病毒载体是更大的逆转录病毒载体群的一部分。慢病毒的详细列表可以在Coffin等人,《逆转录病毒(Retroviruses)》758-763(冷泉港实验室出版社,1997)中找到。简言之，慢病毒可分为灵长类和非灵长类组。灵长类慢病毒的实例包含但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SrV)。非灵长类慢病毒群包含原型“慢病毒”维斯那梅迪病毒(visnaimaedi virus，VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)。

慢病毒与逆转录病毒家族的其它成员的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞两者的能力(Lewis等人,《欧洲分子生物学学会杂志》,11:3053-58(1992)；Lewis和Emerman,《病毒学杂志》,68:510-16(1994))。相比之下，其它逆转录病毒，如MLV，无法感染非分裂或缓慢分裂的细胞，如构成例如肌肉、大脑、肺和肝组织的那些细胞。

如本文所使用的，慢病毒载体是包括可从慢病毒衍生的至少一种组分的载体。该组分部分可以参与载体感染细胞、表达基因或复制的生物学机制。逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构共享许多共同的特征，如5'LTR和3'LTR，其间或其内部定位有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使其能够整合到宿主细胞基因组中的整合位点，以及编码包装组分的gag、pol和env基因，其是病毒颗粒的组装所需的多肽。慢病毒具有另外的特征，如rev和rev反应元件(RRE)序列，这使得整合的前病毒的RNA转录物能够有效地从细胞核输出到感染的靶细胞的细胞质中。在原病毒中，病毒基因的两端侧接称为长末端重复(LTR)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。LTR还充当增强子-启动子序列并且可以控制病毒基因的表达。LTR本身是一致的序列，其可以分成三种元件，称为“U3”、“R”和“U5”。U3来源于RNA的3'端独有的序列，R来源于RNA两端重复的序列并且U5来源于RNA的5'端独有的序列。三种元件的大小在不同病毒之间可以显著不同。

在缺陷型慢病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或无功能。RNA的两端的R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5'和3'端处的独有序列。

在本公开的典型慢病毒载体中，可以从病毒中去除复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分，这使得病毒载体复制有缺陷。病毒基因组的部分也可以用核酸代替，以产生包括核酸的载体，所述核酸能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。在一个实施例中，慢病毒载体是如美国专利申请序列号12/138,993中描述的非整合载体(所述美国专利通过引用并入本文)。

在另外的实施例中，载体具有递送缺失或缺乏病毒RNA的序列的能力。位于待递送的RNA上的异源结合结构域(对于gag来说是异源的)，并且位于gag或pol上的同源结合结构域可以用于确保待递送的核糖核酸的包装。这些载体中的两者描述于美国专利申请序列号12/139,035中(所述美国专利通过引用并入本文)。慢病毒载体可能是“非灵长类”载体，即，衍生自不主要地感染灵长类动物，尤其是人类的病毒。

非灵长类慢病毒的实例可以是不自然地感染灵长类的慢病毒科的任何成员，并且可以包含猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、梅迪-维斯纳(Maedi-Visna)病毒(MW)或马传染性贫血病毒(EIAV)。

在一些实施例中，病毒载体衍生自EIAV。EIAV具有慢病毒中最简单的基因组结构。除了gag、pol和env基因外，EIAV还编码其它三个基因：tat、rev和S2。tat充当病毒LTR的转录活化因子(Derse和Newbold,《病毒学》,194:530-36(1993)；Maury等人,《病毒学》200:632-42(1994))。Rev通过rev应答元件(RRE)来调节并协调病毒基因的表达(Martarano等人,《病毒学杂志》,68:3102-11(1994))。这两种蛋白质的作用机理被认为广泛类似于灵长类动物病毒的类似机理(Martarano等人,《病毒学杂志》,68:3102-11(1994))。S2的功能未知。另外，已鉴别出由tat的第一外显子编码的EIAV蛋白Ttm，所述第一外显子与位于跨膜蛋白起点的env编码序列剪接。

可以操纵病毒载体以去除非必需元件并保留必需元件，以提供所需的功能来感染、转导所关注的核苷酸序列并将其递送至靶宿主细胞(参见，例如，美国专利第6,669,936号，所述美国专利通过引用并入)。在一些实施例中，基因组被限制为足够的慢病毒遗传信息，以允许在包装组分存在的情况下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可以包含逆转录以及整合到靶细胞基因组中。慢病毒载体携有通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。在一些实施例中，载体不能独立复制以在最终靶细胞内产生感染性慢病毒颗粒。重组慢病毒载体通常缺乏功能gag-pol和/或env基因和/或复制所需的其它基因。本公开的载体可以被配置为分裂内含子载体(参见，例如，美国专利第7,303,910号，所述美国专利通过引用并入)。

载体可以是自我灭活载体。可以通过删除转录增强子或3'LTR的U3区的增强子和启动子来构建自我灭活逆转录病毒载体。在一轮载体逆转录和整合后，这些变化被复制到5'和3'LTR两者中，产生转录无活性的前病毒(Yu等人,《美国国家科学院院刊》,83:3194-98(1986)；Dougherty和Temin等人,《美国国家科学院院刊》,84:1197-01(1987):Hawley,《美国国家科学院院刊》,84:2406-10(1987)；Yee等人,《美国国家科学院院刊》,91:9564-68(1994))。然而，此类载体中的LTR内部的(多个)任何启动子仍将具有转录活性。该策略已被用于消除病毒LTR中的增强子和启动子对内部放置的基因的转录的影响。此类影响包含增加转录(Jolly等人,《核酸研究》,11:1855-72(1983))或抑制转录(Emerman和Temin,《细胞》,39:449-67(1984))。该策略还可以用于消除3'LTR到基因组DNA的下游转录(Herman和Coffin,《科学》,236:845-48(1987))。这在人类基因疗法中尤其值得关注，其中预防内源性致癌基因的意外激活至关重要。

用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体还将包含转录调节控制所述转录调节控制序列与慢病毒基因组可操作地连接以引导所述基因组在宿主细胞/包装细胞中的转录。这些调节序列可以是与已转录的慢病毒序列有关的天然序列，即5'U3区域，或其可以是异源启动子，如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组需要另外的序列以用于病毒高效产生。例如，在HIV的实例中，优选地包含rev和RRE序列；然而，对rev和RRE的要求可以通过密码子优化来降低或消除(参见美国专利申请序列号12/587,236，所述美国专利申请通过引用并入)。与rev/RRE系统执行相同功能的替代序列也是已知的。举例来说，在梅森辉瑞(Mason Pfizer)猴病毒中发现了revIRRE系统的功能类似物。这称为组成型转运元件(CTE)并且在基因组中包括RRE型序列，所述RRE型序列被认为与被感染的细胞中的因子相互作用。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可以用作reviRRE系统的替代物。已知的或变得可用的任何其它功能等价物可以与本公开的方法相关。例如，HTLV-1的Rex蛋白可以在功能上替换HIV-1的Rev蛋白。已知Rev和Rex具有与IRE-BP类似的效应。

在某些实施例中，慢病毒载体是衍生自马传染性贫血病毒(EIAV)的自我灭活最小慢病毒载体，CCNF多核苷酸可从其表达。载体可以通过用三种质粒对细胞(例如HEK293T细胞)进行瞬时转染来产生，所述三种质粒编码：(1)重组EIAV PROSAVIN(英国牛津的牛津生物医药公开有限公司(Oxford BioMedica plc,Oxford UK))载体基因组(Farley等人,《基因医学杂志(J.Gen.Med.)》,9:345-56(2007)；美国专利第7,259,015号，所述美国专利通过引用并入)；(2)合成的EIAV gag/pol表达载体(pESGPK，美国专利申请序列号13/893,920和12/587,236，所述美国专利申请通过引用并入)；以及(3)VSV-G包膜表达载体(pHGK)。

4.1.3单纯疱疹病毒

单纯疱疹病毒(HSV)载体还可以用于在包含神经元(例如，运动神经元)的神经系统细胞中递送和表达CCNF多核苷酸。1型(HSV-1)的基因组是约150kb的线性双链DNA，具有约70个基因。许多病毒基因可以被删除，而病毒不会失去其繁殖能力。“立即早期”(IE)基因首先被转录。它们编码调节其它病毒基因表达的反式作用因子。“早期”(E)基因产物参与病毒DNA的复制。晚期基因编码病毒粒子的结构组分，以及启动IE和E基因转录或破坏宿主细胞蛋白质翻译的蛋白质。

HSV载体可以是基于质粒的系统，由此产生质粒载体(称为扩增子)，其含有编码基因的核苷酸序列和两个顺式作用HSV识别信号。识别信号是不编码HSV基因产物的DNA复制的起源和切割包装信号。因此，辅助病毒需要复制扩增子并将其包装成HSV外壳。因此，载体在接受者细胞内不表达病毒基因产物，并且由于缺陷行型HSV载体基因组内存在的HSV DNA序列的最小量，载体与潜在病毒的重组或再激活受到限制。

HSV介导的基因疗法的实例在本领域中是众所周知的(Breakefield和DeLuca.《新生物学家(New Biologist)》,3:203-18(1991)；Ho和Mocarski,《病毒学》,167:279-93(1988)；Palella等人,《分子与细胞生物学》,8:457-60(1988)；Palella等人,《基因》,80:137-44(1988)；Andersen等人,《人类基因疗法》,3:487-99(1992)；Kaplitt等人,《神经分泌学的当前话题(Current Topics Neuroendocrinology)》,11:169-91(1993)；Spade和Frenkel,《细胞》,30:295-04(1982)；Kaplitt等人,《分子和细胞神经科学(Molecular&Cellular Neuroscience)》,2:320-30(1991)；Federoff等人,《美国国家科学院院刊》,89:1636-40(1992))。

4.1.4腺病毒

腺病毒载体可以用于在包含神经元(例如，运动神经元)的神经系统细胞中递送和表达CCNF多核苷酸。腺病毒基因组由约36kb的双链DNA组成。腺病毒靶向气道上皮细胞，但也能够感染神经元。重组腺病毒载体已被用作非分裂细胞的基因转移媒剂。这些载体类似于重组HSV载体，因为腺病毒E1a直接早期基因被去除，但大多数病毒基因被保留。由于Ela基因很小(约1.5kb)，并且腺病毒基因组大约为HSV基因组的大小的三分之一，因此去除其它非必需的腺病毒基因，以便在腺病毒基因组中插入外源基因。

腺病毒介导的基因疗法的实例在本领域中是众所周知的(Akli等人,《自然遗传学(Nature Genetics)》,3:224-28(1993)；La Salle等人,《科学》,259:988-90(1993)、LaSalle,《自然遗传学》,3:1-2(1993)；Neve,《生物化学科学趋势(Trends BiochemicalSci.)》,16:251-53(1993))。

4.2非病毒递送系统

经修饰的细胞周期蛋白F多肽和编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子可以使用非病毒递送系统递送。本领域已知的用于递送核酸分子和/或蛋白质的任何递送方法或系统可以用于递送经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。这包含在胶体分散系统中将经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子递送到期望组织，所述胶体分散系统包含例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，所述基于脂质的系统包含水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。其它递送系统包含外泌体、病毒体、纳米颗粒(包含金或二氧化硅纳米颗粒)、聚合物(例如树枝状聚合物、聚合物纳米凝胶等)用于杰斯按摩的合适的递送试剂包含但不限于例如Mirus Transit TKO亲脂性试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、去端肽胶原、纳米复合物和脂质体。在以下文献中描述了去端肽胶原作为核酸分子的递送媒剂的用途：Minakuchi等人《核酸研究》,32:e109(2004)；Hanai等人《纽约科学院年鉴(Annals N.Y.Acad.Sci.)》,1082:9-17(2006)；Kawata等人《分子癌症治疗学(Molecular Cancer Therapeutics)》,7:2904-12(2008)。

在一个实例中，脂质体被用作递送媒剂。脂质体是可以在体外和体内用作递送媒剂的人工膜囊泡。为了使脂质体成为有效的转移媒剂，应具有以下特征：(1)高效封装遗传物质或蛋白质，同时不损害生物活性；(2)与非靶细胞相比，与靶细胞的优先和实质性结合；(3)将囊泡的含水内容物高效递送至靶细胞质；以及在相关情况下(4)准确且有效表达遗传信息(Mannino等人,《生物技术》,6:682-90(1988))。

适用于递送本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子的脂质体可以由标准的囊泡形成脂质形成，其通常包含中性或带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑如期望脂质体大小和血流中的脂质体的半衰期等因素来引导。合适的脂质脂质体生产的实例包含磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。脂质的另外的实例包含但不限于聚赖氨酸、鱼精蛋白、硫酸盐和3β-[N--(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇。已知用于制备脂质体的多种方法，例如，如在Szoka等人,生物物理和生物工程年度综述(Annual Rev.Biophysics&Bioengineering),9:467-08(1980)；和美国专利第4,235,871号；第4,501,728号；第4,837,028号；和第5,019,369号，所述美国专利通过引用并入本文。

脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成并且自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm至4m。MLV的超声处理导致形成直径在200埃至500埃的范围内的小单层囊泡(SUV)，从而在核心包含水溶液。

与经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子一起使用的脂质体也可以被修饰，以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面上具有调理作用-抑制部分或掺入脂质体结构中。

用于制备本文所述脂质体的调理作用-抑制部分通常是结合到脂质体膜的大亲水性聚合物。如本文所使用的，当调理作用抑制部分以化学或物理方式附着在脂质体膜上时，例如，通过将脂溶性锚插入膜本身，或通过直接结合到膜脂质的活性基团，所述调理作用抑制部分“结合”到脂质体膜。这些调理作用-抑制的亲水性聚合物形成保护性表面层，其显著减少MMS和RES对脂质体的摄取；例如，如美国专利第4,920,016号所描述的，所述美国专利通过引用并入本文。

在一些实施例中，适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分是数均分子量为约500道尔顿至约40,000道尔顿或约2,000道尔顿至约20,000道尔顿的水溶性聚合物。此类聚合物包含聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG和PEG或PPG硬脂酸盐；合成聚合物，如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性、支链或树枝状聚合物聚酰胺胺；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基基团化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物或其衍生物也是合适的。此外，调理作用抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制聚合物还可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如，半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶；胺化多糖或低聚糖(直链或支链)；或羧化多糖或低聚糖，例如，与碳酸衍生物反应，产生羧基基团连接。在一些实施例中，调理作用-抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时被称为“PEG化脂质体”。

5.经修饰的细胞周期蛋白F多肽和多核苷酸的递送

神经元(例如，运动神经元)可以在细胞培养(例如，体外或离体)中与经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码核酸接触，或施用于受试者(例如，体内)。在一些实施例中，本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码核酸(任选地在递送媒剂内，如本文所述)可施用于受试者，以治疗或抑制神经退行性病状的发展，包含与神经元TDP-43蛋白病相关的那些，如ALS、FTD和AD。

对于体外方法，神经元可以从不同的来源获得。例如，神经元可以从受试者获得。在一些实施例中，神经元是全细胞。在一些实施例中，受试者患有神经退行性病状(例如，与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状)。在一些实施例中，受试者处于罹患神经退行性病状(例如，与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状)的风险中。在一些实施例中，受试者疑似患有神经退行性病状(例如，与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状)。在一些实施例中，受试者处于罹患由神经元细胞死亡表征的病状的风险中。在一些实施例中，受试者疑似患有由神经元细胞死亡表征的病状。在一些实施例中，受试者患有神经元细胞死亡。在一些实施例中，受试者患有ALS。在一些实施例中，受试者患有FTD。在一些实施例中，受试者患有AD。在一些实施例中，受试者是携带者例如，无症状携带者。在一些实施例中，运动神经元细胞衍生自受试者的胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是小鼠。在一些实施例中，小鼠是转基因小鼠。从胚胎干细胞诱导运动神经元分化的方法是本领域已知的，例如，如以下文献中所描述的：Di Giorgio等人,《自然神经科学(Nature Neuroscience)》(2007),于2007年4月15日在线公开；doi:10.1038/nn1885和Wichterle等人,《细胞》(2002)110:385-397。在一些实例中，诱导多能干细胞可以从受试者身上产生，并且然后分化为运动神经元。从受试者获得运动神经元的一种示例性方法描述于Dimos,J.T.等人《科学》(2008)321,1218-122(电子版2008年7月31日)。

对于体内方法，可以向受试者施用有效量的本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码核酸。向受试者施用药剂的方法是本领域已知的，并且本领域技术人员容易获得。

本领域技术人员还将认识到，本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码核酸可以用于抑制神经元变性或增强神经元存活，这可以导致由神经元(例如，运动神经元)变性表征的多种病状的治疗、发展的抑制或改善。

在具体实施例中，神经元变性包括运动神经元变性。运动神经元疾病(MND)是一组选择性地影响运动神经元的神经退行性病状，运动神经元是控制自主肌肉活动(包含说话、行走、呼吸、吞咽和身体的一般运动)的神经细胞。骨骼肌由位于脊髓腹角的一组神经元(下运动神经元)支配，这些神经元从腹根投射到肌肉细胞。这些神经细胞本身由皮质脊髓束或从大脑运动皮质投射的上部运动神经元支配。在宏观病理学上，存在脊髓腹角的变性以及腹根的萎缩。在大脑中，萎缩可能出现在额叶和颞叶。在显微镜检查中，神经元可以表现为海绵状血管病，存在活化的星形胶质细胞和小胶质细胞，以及许多内含物，包含特征性的“骨骼样”包涵体、小体和空泡化。运动神经元疾病的影响多种多样，并且具有破坏性。它们通常在其起源和因果关系上有明显的差异，但对患者来说，结果相似：严重肌无力。肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、假性延髓麻痹、进行性延髓麻痹、脊髓性肌萎缩(SMA)和脊髓灰质炎后综合征都是MND的实例。运动神经元变性的主要部位将神经退行性病状分类。

同时影响上和下运动神经元两者的ALS是MND最常见的形式。进行性延髓麻痹影响脑干下运动神经元，导致口齿不清以及咀嚼和吞咽困难。患有这些病状的个体的手臂和腿部几乎总是有异常体征。原发性侧索硬化症是一种上运动神经元疾病，而进行性肌萎缩只影响脊髓中的下运动神经元。用于诊断MND的手段是本领域技术人员众所周知的。下文描述了症状的非限制性实例。

5.1肌萎缩侧索硬化症(ALS)

肌萎缩侧索硬化症(ALS)，也称为葛雷克氏病(Lou Gehrig's disease)或经典运动神经元病，是一种最终会破坏所有自主肌肉的信号的进行性最终致命的病症。在美国，医生将术语运动神经元疾病和ALS互换使用。上和下运动神经元两者受到影响。大约75％的典型ALS患者也会出现延髓肌肉(控制言语、吞咽和咀嚼的肌肉)无力和萎缩。症状通常首先在手臂和手、腿或吞咽肌肉上发现。肌肉无力和萎缩在身体两侧不成比例地出现。受影响的个体会失去力量和移动手臂、腿和身体的能力。其它症状包含痉挛、反射过度、肌肉痉挛、肌束震颤以及吞咽和形成单词的问题增加。说话可能变得口齿不清或带鼻音。当横膈膜和胸壁的肌肉不能正常工作时，个体就失去了在没有机械支撑的情况下呼吸的能力。尽管疾病通常不会损害一个人的心智或个性，但最近的若干项研究表明，一些患有ALS的人可能会出现认知功能的改变，如决策和记忆问题。ALS最常见于40岁与60岁之间的人群，但年轻人和老年人也可能患上这种疾病。男性比女性更容易受到影响。大多数ALS病例都是偶发性的，并且这些个体的家庭成员并不被认为有罹患所述疾病的增加的风险。然而，成人ALS有一种家族形式，通常是由负责RNA代谢(例如，TDP-43和FUS)和蛋白质降解(例如，UBQLN2、TBK1和CCNF)的基因的突变引起的。此外，ALS的罕见的青少年发病形式是遗传性的。大多数患有ALS的个体死于呼吸衰竭，通常在症状出现后3年至5年内死亡。然而，约10％的受影响个体能够存活10年或更多年。

5.2额颞叶痴呆(FTD)

额颞叶痴呆(FTD)是额颞叶变性的临床表现，其特征是进行性神经元损失，主要涉及额叶和/或颞叶，以及70％以上的的纺锤体神经元典型损失，而其它神经元类型保持完整。在FTD中，额叶和颞叶的部分萎缩或萎缩。大脑的额叶和颞叶通常与个性、行为和语言有关。常见的体征和症状各不相同，这取决于大脑的受影响的部分。一些患有FTD的人的性格发生了巨大变化，并且变得不适合社交、冲动或情绪冷漠，而另一些人则失去了使用语言的能力。体征和症状包含社交和个人行为的显著变化、冷漠、情绪迟钝以及表达和接受语言的缺陷。目前，FTD尚无治愈方法，但有一些治疗可以帮助缓解症状。

5.3脊髓性肌萎缩(SMA)

脊髓性肌萎缩(SMA)是指许多不同的病症，所有这些病症都有共同的遗传原因和由于脊髓和脑干运动神经元损失而导致的无力的表现。骨骼肌的无力和萎缩是由脊髓前角细胞的进行性变性引起的。这种无力通常在腿部比在手臂更严重。SMA有多种形式，有不同的发病年龄、遗传模式、症状的严重程度和进展。下文描述一些更常见的SMA。

SMN基因产物的缺陷被认为是SMA的主要原因，并且SMN蛋白水平与患有SMA的受试者的生存相关。SMA最常见的形式是由SMN基因的突变引起的。染色体5上含有SMN(存活运动神经元)基因的区域有很大的重复。含有若干个基因的大序列在相邻的片段中出现两次。因此存在基因的两个拷贝，SMN1和SMN2。SMN2基因有使其制造蛋白质的效率降低的另外的突变，尽管其制造效率很低。SMA是由两条染色体的SMN1基因的损失引起的。SMA的严重程度的范围为SMA 1至SMA3，部分地与剩余的SMN 2基因能在多大程度上弥补SMN 1的损失有关。

SMA I型，也称为韦德尼格-霍夫曼病，在儿童6个月大时表现明显。症状可以包含张力减退(肌肉张力严重降低)、肢体运动减弱、肌腱反射不足、肌束震颤、震颤、吞咽和进食困难以及呼吸受损。一些儿童还会出现脊柱侧弯(脊柱弯曲)或其它骨骼异常。受影响的儿童从不坐或站，并且大多数通常在2岁之前死于呼吸衰竭。

SMA II型的症状通常在儿童6个月大后开始。其特征可以包含无法站立或行走、呼吸系统问题、张力减退、肌腱反射减少或缺失以及肌束震颤。这些儿童可能会学会坐，但不会站。预期寿命各不相同，并且有些个体活到青少年期或更晚。

SMA III型(库格尔伯格-韦兰德病)的症状出现在2岁与17岁之间，并且包含步态异常；跑步、爬台阶或从椅子上站起来有困难；以及手指轻微颤抖。下肢最常受到影响。并发症包含脊柱侧弯和关节挛缩，这是由异常的肌肉张力和无力引起的关节周围肌肉或肌腱的慢性缩短，阻碍了关节的自由运动。

SMA的其它形式包含例如，遗传性延髓-脊髓SMA肯尼迪病(X连锁的雄激素受体)、SMA伴呼吸窘迫(SMARD 1)(染色体11，IGHMBP2基因)、远端SMA伴上肢优势(染色体7，甘氨酰基tRNA合成)和X连锁的婴儿SMA(基因UBE1)。

目前SMA的治疗由慢性运动单元损失的副作用的预防和管理组成。一些正在经历临床研究的SMA的治疗的药物包含丁酸盐、丙戊酸、羟基脲和利鲁唑(Riluzole)。

法齐奥-隆德病(Fazio-Londe disease)的症状出现在1岁与12岁之间，并且可能包含面部无力、吞咽困难(吞咽困难)、喘鸣音(经常与喉部急性阻塞有关的高音呼吸音)、说话困难(构音障碍)和眼肌麻痹。大多数患有SMA III型的个体死于呼吸并发症。

肯尼迪病，也称为进行性脊髓延髓肌萎缩，是X连锁隐性疾病。患有肯尼迪病的个体的女儿是携带者，并且有50％的几率生下患有该疾病的儿子。发作通常发生在15岁与60岁之间。症状包含面部和舌头肌肉无力、手抖、肌肉痉挛、吞咽困难、构音障碍以及男性乳房和乳腺过度发育。无力通常从骨盆开始，然后蔓延到四肢。一些个体发展成非胰岛素依赖型糖尿病。

病症的病程各不相同，但通常进展缓慢。个人倾向于保持走动，直到疾病晚期。患有肯尼迪病的个体的预期寿命通常是正常的。

先天性SMA伴关节弯曲(肢体固定异常姿势的关节持续挛缩)是罕见病症。表现包含严重挛缩、脊柱侧弯、胸部畸形、呼吸系统问题、异常小的下颌和上眼睑下垂。

进行性延髓麻痹，也称为进行性延髓萎缩，涉及球形脑干，该区域控制吞咽、说话、咀嚼和其它功能所需的下运动神经元。症状包含咽肌肉无力(与吞咽有关)、下颌和面部肌肉无力、进行性言语丧失和舌头肌肉萎缩。四肢无力伴有上和下运动神经元体征两者几乎总是很明显，但不那么突出。受影响的人会爆发大笑或哭泣(称为情绪不稳定)。个体最终变得无法进食或说话，并且处于窒息和吸入性肺炎的风险增加，这是由液体和食物通过声带并进入下呼吸道和肺部引起的。中风和重症肌无力每一个都有类似于进行性延髓麻痹的某些症状，并且在诊断这种病症之前必须排除这些症状。在约25％的ALS病例中，早期症状开始于延髓累及。患有典型ALS的约75％的个体最终表现出一些延髓累及。许多临床医生认为，在没有手臂或腿部异常证据的情况下，进行性延髓麻痹本身是极为罕见的。

假性延髓麻痹与进行性延髓麻痹共享许多症状，其特征是上运动神经元变性和说话、咀嚼和吞咽能力的进行性丧失。面部肌肉的进行性无力导致面部无表情。个体可能会发出沙哑的声音以及增加的咽反射。舌头可能会变得不动，并且无法从嘴里伸出。个体也可能经历情绪不稳定。

原发性侧索硬化症(PLS)仅影响上运动神经元，并且男性的发病率通常几乎是女性的两倍。发作一般发生在50岁以后。PLS的病因未知。当大脑皮质中控制自主运动的特定神经细胞(覆盖大脑的薄层细胞，负责大多数高级心理功能)逐渐退化，导致其控制下的肌肉无力时，就会发生这种情况。科学家们认为，这种综合征很少是遗传性的，它会在几年或几十年内逐渐发展，导致受影响的肌肉僵硬和笨拙。这种病症通常首先影响腿部，其次是躯干、手臂和手，并且最后是延髓肌肉。症状可能包含平衡困难、腿部无力和僵硬、笨拙、导致动作缓慢和僵硬的腿部痉挛、双脚拖拉(导致无法行走)以及导致构音障碍(言语表达不良)的面部累及。ALS和PLS(被认为是ALS的一种变体)之间的主要区别是涉及的运动神经元和疾病进展的速率。PLS可能被误认为是痉挛性截瘫，导致腿部痉挛的上运动神经元遗传性疾病，并且通常开始于青少年期。大多数神经科医师在诊断为PLS之前，会跟踪个体的临床病程至少3年。这种病症并不致命，但可能会影响生活质量。PLS常发展为ALS。

进行性肌萎缩(PMA)的特点是仅下运动神经元缓慢但进行性变性。其主要影响男性，发病时间比其它MND更早。无力通常首先出现在手上，并且然后蔓延到下半身，在那里可能会很严重。其它症状可能包含肌肉萎缩、手部动作笨拙、肌束震颤和肌肉痉挛。躯干肌肉和呼吸可能会受到影响。暴露在寒冷中会使症状恶化。这种疾病在许多情况下发展为ALS。

脊髓灰质炎后综合征(PPS)是可能在脊髓灰质炎幸存者从脊髓灰质炎中康复几十年后袭击他们的病状。PPS被认为是在损伤、疾病(如退行性关节病)、体重增加或衰老过程损害或杀死脊髓运动神经元时发生的，这些神经元在最初的脊髓灰质炎发作后仍保持功能。许多科学家认为PPS是先前受脊髓灰质炎影响的肌肉的潜在弱点，而不是一种新的MND。症状包含疲劳、缓慢进行性肌肉无力、肌肉萎缩、肌束震颤、寒冷不耐受以及肌肉和关节疼痛。这些症状最常出现在受初始疾病影响的肌肉群中。其它症状包含骨骼畸形，如脊柱侧弯和呼吸、吞咽或睡眠困难。症状在老年人和那些受早期疾病影响最严重的个体中更为常见。一些个体仅出现轻微症状，而另一些则发展为SMA，而且很少是ALS的形式。PPS通常不会危及生命。医生估计，PPS的发病率约为麻痹性脊髓灰质炎幸存者的25％至50％。

本文所考虑的神经元TDP-43蛋白病还可能与ALS以外的疾病有关，如额颞叶痴呆(FTD)、AD、佩里综合征(Perry syndrome)、慢性创伤性脑病、关岛ALS/帕金森氏症痴呆复合体、海马硬化症和多系统蛋白病。相关TDP-43蛋白疾病的非排他性列表包含阿尔茨海默氏病(AD)、额颞叶变性、皮质基底部变性、进行性核上性麻痹、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克、伴有脑铁积聚的神经变性、球状神经胶质蛋白病、原发性年龄相关蛋白病、年龄相关性tau星形胶质细胞病变、脑炎后帕金森氏综合征、亚急性硬化性全脑炎、泛酸激酶相关神经变性、慢性创伤性脑病变、唐氏综合征(Down syndrome)、早发性AD、强直性肌营养不良、脂褐质沉积症、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、C型、亚历山大病(Alexander disease)、佩里综合征、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、神经节神经胶质瘤/神经节细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、铅性脑病，创伤性脑损伤(急性)与包涵体肌炎如例如在Chornenkyy等人(《实验室调查(Laboratory Investigation)》99:993-1007(2019))中所呈现的。

5.4阿尔茨海默氏病

AD的主要标记是以下：(1)β淀粉样蛋白(在所谓的神经炎斑块中的Aβ肽)在神经元外的逐渐积聚，干扰突触处的神经元间通信，并可能导致细胞死亡；(2)Aβ肽也以所谓的血管淀粉样蛋白的形式在大脑的血管周围积聚，由此干扰血液中必需营养物质进入大脑的吸收；(3)神经元内蛋白质tau(神经原纤维缠结)的异常沉积，阻断了神经元内货物的运输。这是神经元功能障碍和细胞死亡的主要驱动因素。最终，淀粉样蛋白沉积和缠结两者对大脑造成不可逆转的损伤，导致大脑的萎缩和认知功能的损失。AD最常见的早期症状是难以记住最近发生的事件，并且随着疾病的进展，症状可以包含语言问题、迷失方向(包含容易迷路)、情绪波动、失去动力、无法管理自我护理和行为问题。随着一个人的病状恶化，他们往往会退出家庭和社会。逐渐地，身体机能丧失，最终导致死亡。尽管进展速度可能各不相同，但诊断后的典型预期寿命为三年至九年。

在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括选择被诊断为神经退行性病状的受试者，该受试者适合地与神经元TDP-43蛋白病相关。可以基于所呈现的症状来选择患有神经退行性病状的受试者。例如，患有ALS的受试者可能表现出肌束震颤、痉挛、肌肉紧绷和僵硬(痉挛)、手臂、肩膀或舌头抽搐、影响手、手臂或腿的肌肉无力、口齿不清和说话带鼻音或咀嚼或吞咽困难的症状。

在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括选择处于罹患神经退行性病状的风险中的受试者，该受试者适合地与神经元TDP-43蛋白病相关。可以基于遗传诊断测试(例如，针对与神经退行性病状相关的基因的突变或基于所呈现的症状)来选择处于罹患神经退行性病状的风险的受试者。

6.治疗方法

本公开的某些方面涉及用于治疗神经退行性病状的方法，具体地与神经元TDP-43蛋白病和/或以神经元变性为特征的病状相关的方法。因此，本公开的一个方面涉及治疗或抑制与有需要的受试者中的神经元TDP-43蛋白病适当地相关的神经退行性病状的发展的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。在另一个方面，本公开涉及治疗或抑制与有需要的受试者中以神经元变性和TDP-43蛋白病为特征的病状的发展的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子。

适当地，经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子(称为“药剂”)增强或增加细胞周期蛋白F的水平或活性，并增强受试者的神经元存活(例如，运动神经元存活)和/或抑制神经元变性(例如，运动神经元变性)。在一些实施例中，所述药剂改善与受试者的神经退行性病状相关的至少一种症状。在一些实施例中，所述药剂治疗受试者的神经退行性病状。在一些实施例中，所述药剂防止受试者罹患神经退行性病状。在一些实施例中，所述药剂防止受试者的神经退行性病状进展。

在一些实施例中，所述药剂减少细胞质TDP-43的量并增强受试者中的神经元存活(例如，运动神经元存活)和/或抑制神经元变性(例如，运动神经元变性)。在一些实施例中，所述药剂减少细胞质TDP-43的量并改善与受试者的神经退行性病状相关的至少一种症状。在一些实施例中，所述药剂减少细胞质TDP-43的量并治疗受试者的神经退行性病状。在一些实施例中，所述药剂减少细胞质TDP-43的量并防止受试者罹患神经退行性病状。在一些实施例中，所述药剂减少细胞质TDP-43的量并防止受试者的神经退行性病状进展。

在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，选择用于治疗的受试者患有神经退行性病状，或以运动神经元变性为特征的病状。在一些实施例中，受试者处于罹患发展神经退行性病状，具体地与神经元TDP-43蛋白病相关的病状，或以运动神经元变性为特征的病状的风险中。在一些实施例中，受试者疑似患有发展神经退行性病状，具体地与神经元TDP-43蛋白病相关的病状，或以运动神经元变性为特征的病状。在一些实施例中，受试者患有神经退行性病状，具体地与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状。神经退行性病状可以是本文所述的任何神经退行性病状。在一些实施例中，神经退行性病状以运动神经元变性为标志。在一些实施例中，神经退行性病状是运动神经元疾病。在一些实施例中，神经退行性病状是ALS。在一些实施例中，神经退行性病状是FTD。在一些实施例中，神经退行性病状包含运动神经元变性以外的神经元变性。一些实施例，神经退行性病状是AD。

在一些实施例中，还向受试者施用另一种治疗剂。此类另一种治疗剂或“辅助”剂通常与经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子同时施用。例如，治疗剂可以以相同的调配物或以单独的调配物例如，丁酸、丙戊酸、羟基脲或利鲁唑施用。在一些实施例中，本文所述的药剂与适用于治疗ALS的一种或多种症状的另一种治疗剂组合使用，包含但不限于以下中的一种或多种：(i)氢化吡啶并[4,3-b]吲哚或其药学上可接受的盐；以及(ii)促进或增加对肌肉细胞的能量供应的药剂、COX-2抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)抑制剂、3OS核糖体蛋白抑制剂、NMDA拮抗剂、NMDA受体拮抗剂、钠通道阻滞剂、谷氨酸盐释放抑制剂、K(V)4.3通道阻滞剂、抗炎剂、5-HT1A受体激动剂、神经营养因子增强子、促进运动神经元表型存活和/或神经炎发生的药剂、保护血脑屏障不受破坏的药剂、一种或多种促炎细胞因子的产生或活性的抑制剂、免疫调节剂、神经保护剂、星形胶质细胞的功能的调节剂、抗氧化剂(如小分子催化抗氧化剂)、自由基清除剂、减少一种或多种反应性氧物质的药剂、抑制非蛋白质硫醇含量的减少的药剂、正常细胞蛋白质修复途径的刺激因子(如激活分子伴侣的药剂)、神经营养剂、神经细胞死亡抑制剂、神经炎生长刺激因子、防止神经细胞死亡和/或促进受损脑组织再生的药剂、细胞因子调节剂、降低小神经胶质细胞活化水平的药剂、大麻素CB1受体配体、非甾类抗炎药、大麻素CB2受体配体、肌酸、肌酸衍生物、多巴胺受体激动剂如盐酸普拉克索的立体异构体、睫状神经营养因子、编码睫状神经营养因子的药剂、神经胶质源性神经营养因子、编码神经胶质源性神经营养因子的药剂、神经营养蛋白3、编码神经营养蛋白3的药剂或其组合。

在一些实施例中，本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子与适用于治疗ALS或FTD的一种或多种症状的另一种治疗剂组合使用，包含但不限于以下中的一种或多种：抗生素(例如，氨基糖甙类(Aminoglycosides)、头孢菌素(Cephalosporins)、氯霉素(Chloramphenicol)、克林霉素(Clindamycin)、红霉素(Erythromycins)、氟喹诺酮(Fluoroquinolones)、大环内酯类(Macrolides)、环酰胺(Azolides)、甲硝唑(Metronidazole)、青霉素(Penicillins)、四环素(Tetracyclines)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-sulfamethoxazole)、万古霉素(Vancomycin))、类固醇(例如，雄激素(Andranes)(例如，睾酮(Testosterone))、胆甾烷类(Cholestanes)(例如，胆固醇)、胆汁酸(Cholic acids)(例如，胆汁酸)、皮质类固醇(Corticosteroids)(例如，地塞米松(Dexamethasone))、雌激素(Estraenes)(例如，雌二醇(Estradiol))、孕烷类(Pregnanes)(例如，孕酮(Progesterone))、麻醉性和非麻醉性止痛剂(例如，吗啡(Morphine)、可待因(Codeine)、海洛因(Heroin)、氢化吗啡酮(Hydromorphone)、羟甲左吗喃(Levorphanol)、哌替啶(Meperidine)、美沙酮(Methadone)、氧化酮(Oxydone)、丙氧芬(Propoxyphene)、芬太尼(Fentanyl)、美沙酮、纳洛酮(Naloxone)、丁丙诺啡(Buprenorphine)、布托啡诺(Butorphanol)、纳布啡(Nalbuphine)、潘他唑新(Pentazocine))、抗炎剂(例如，阿氯芬酸(Alclofenac)、二丙酸阿氯米松(AlclometasoneDipropionate)、丙缩阿尔孕酮(Algestone Acetonide)、α淀粉酶(alpha Amylase)、安西法尔(Amcinafal)、安西非特(Amcinafide)、氨芬酸钠(Amfenac Sodium)、氨普立糖(Amiprilose Hydrochloride)、阿那白滞素(Anakinra)、阿尼罗酸(Anirolac)、阿尼扎芬(Anitrazafen)、阿扎丙宗(Apazone)、巴柳氮二钠(Balsalazide Disodium)、苄达酸(Bendazac)、苯恶洛芬(Benoxaprofen)、苯海拉明盐酸盐(Benzydamine Hydrochloride)、菠萝蛋白酶(Bromelains)、溴哌莫(Broperamole)、布地奈德(Budesonide)、卡洛芬(Carprofen)、环洛芬(Cicloprofen)、辛喷他宗(Cintazone)、克利洛芬(Cliprofen)、丙酸氯倍他索(Clobetasol Propionate)、丁酸氯倍他松(Clobetasone Butyrate)、氯吡酸(Clopirac)、氯硫卡松丙酸盐(Cloticasone Propionate)、醋酸三氟米松(CormethasoneAcetate)、可托多松(Cortodoxone)、癸酸盐(Decanoate)、地夫可特(Deflazacort)、庚酸睾酮(Delatestryl)、环戊丙酸睾酮(Depo-Testosterone)、地奈德(Desonide)、去羟米松(Desoximetasone)、双丙酸地塞米松(Dexamethasone Dipropionate)、双氯芬酸钾(Diclofenac Potassium)、双氯芬酸钠(Diclofenac Sodium)、双醋酸双氟拉松(Diflorasone Diacetate)、二氟米酮钠(Diflumidone Sodium)、二氟尼柳(Diflunisal)、二氟泼尼酯(Difluprednate)、地氟他酮(Diftalone)、二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide)、羟西奈德(Drocinonide)、恩甲羟松(Endrysone)、恩莫单抗(Enlimomab)、烯醇化钠(Enolicam Sodium)、依匹唑(Epirizole)、依托度酸(Etodolac)、依托芬那酯(Etofenamate)、联苯乙酸(Felbinac)、非那莫(Fenamole)、芬布芬(Fenbufen)、芬氯酸(Fenclofenac)、苯克洛酸(Fenclorac)、芬吲柳酸(Fendosal)、奋匹帕隆(Fenpipalone)、芬替酸(Fentiazac)、氟苯哌酮(Flazalone)、氟扎可松(Fluazacort)、氟灭酸(FlufenamicAcid)、氟鲁咪唑(Flumizole)、醋酸氟尼缩松(Flunisolide Acetate)、氟尼辛(Flunixin)、氟胺烟酸葡胺(Flunixin Meglumine)、氟可丁丁酯(Fluocortin Butyl)、氟米龙醋酸酯(Fluorometholone Acetate)、氟喹宗(Fluquazone)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、氟瑞托芬(Fluretofen)、丙酸氟替卡松(Fluticasone Propionate)、呋喃洛芬(Furaprofen)、呋罗布芬(Furobufen)、哈西奈德(Halcinonide)、卤倍他索丙酸酯(Halobetasol Propionate)、醋酸溴氟龙(Halopredone Acetate)、异丁芬酸(Ibufenac)、布洛芬(Ibuprofen)、布洛芬铝(Ibuprofen Aluminum)、皮考布洛芬(Ibuprofen Piconol)、伊洛达普(Ilonidap)、茚甲新(Indomethacin)、吲哚美辛钠(Indomethacin Sodium)、吲哚洛芬(Indoprofen)、吲哚克索(Indoxole)、吲四唑(Intrazole)、醋酸异氟泼尼松(Isoflupredone Acetate)、伊索克酸(Isoxepac)、伊索昔康(Isoxicam)、酪洛芬(Ketoprofen)、盐酸洛非咪唑(LofemizoleHydrochloride)、氯诺昔康(Lomoxicam)、氟替泼诺(Loteprednol Etabonate)、甲氯芬那酸钠(Meclofenamate Sodium)、甲氯灭酸(Meclofenamic Acid)、甲氯松二丁酯(MeclorisoneDibutyrate)、甲芬那酸(Mefenamic Acid)、氨水杨酸(Mesalamine)、美西拉宗(Meseclazone)、美睾酮(Mesterolone)、美雄酮(Methandrostenolone)、美替诺龙(Methenolone)、美替诺龙醋酸酯(Methenolone Acetate)、磺庚甲泼尼龙(Methylprednisolone Suleptanate)、莫尼氟酯(Morniflumate)、萘丁美酮(Nabumetone)、诺龙(Nandrolone)、萘普生(Naproxen)、萘普生钠(Naproxen Sodium)、萘普索(Naproxol)、尼马宗(Nimazone)、奥沙拉嗪钠(Olsalazine Sodium)、肝蛋白(Orgotein)、奥帕诺辛(Orpanoxin)、氧甲氢龙(Oxandrolane)、奥沙普秦(Oxaprozin)、羟基保泰松(Oxyphenbutazone)、康复龙(Oxymetholone)、盐酸瑞尼托林(ParanylineHydrochloride)、木聚硫钠(Pentosan Polysulfate Sodium)、甘油保泰松钠(Phenbutazone Sodium Glycerate)、吡非尼酮(Pirfenidone)、吡罗昔康(Piroxicam)、吡罗昔康肉桂酸盐(Piroxicam Cinnamate)、吡罗昔康乙醇胺(Piroxicam Olamine)、吡洛芬(Pirprofen)、泼那扎特(Prednazate)、普立非酮(Prifelone)、普罗度酸(Prodolie Acid)、普罗喹宗(Proquazone)、普罗沙唑(Proxazole)、柠檬酸普罗沙唑(Proxazole Citrate)、利美索龙(Rimexolone)、氯马扎利(Romazarit)、柳胆来司(Salcolex)、沙那西定(Salnacedin)、水杨酰水杨酸(Salsalate)、血根氯铵(Sanguinarium Chloride)、司克拉宗(Seclazone)、丝美辛(Sermetacin)、康力龙(Stanozolol)、舒多昔康(Sudoxicam)、舒林酸(Sulindac)、舒洛芬(Suprofen)、他美辛(Talmetacin)、他尼氟酯(Talniflumate)、他洛沙酯(Talosalate)、特丁非隆(Tebufelone)、替尼达普(Tenidap)、替尼达普钠(TenidapSodium)、替诺昔康(Tenoxicam)、替昔康(Tesicam)、替昔米德(Tesimide)、睾酮、睾酮共混物、四氢甲吲胺(Tetrydamine)、硫平酸(Tiopinac)、新戊酸替可的松(TixocortolPivalate)、托美丁(Tolmetin)、托美丁钠(Tolmetin Sodium)、三氯奈德(Triclonide)、三氟米酯(Triflumidate)、齐多美辛(Zidometacin)、佐美酸钠(Zomepirac Sodium))或抗组胺剂(例如，乙醇胺(像苯海拉明、卡比拉明(carbinoxamine))、乙二胺(像扑敏宁(tripelennamine)、新安特甘(pyrilamine))、烷基胺(像扑尔敏(chlorpheniramine)、右扑尔敏(dexchlorpheniramine)、溴苯那敏(brompheniramine)、曲普利啶(triprolidine))、其它抗组胺药像阿司咪唑(astemizole)、氯雷他定(loratadine)、非索非那定(fexofenadine)、溴苯那敏(Bropheniramine)、克立马丁(Clemastine)、对乙酰氨基酚(Acetaminophen)、伪麻黄碱(Pseudoephedrine)、曲普利啶(Triprolidine))。

在一些实施例中，将本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子与适合用于治疗AD的一种或多种症状的另一种治疗剂组合使用，包含但不限于认知增强剂，如但不限于多奈哌齐(donepezil)、卡巴拉汀(rivastigmine)、美金刚(memantine)和加兰他敏(galantamine)。

7.调配物和施用

为了施用于受试者，本文所述的药剂可以口服、肠道外施用，例如皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、通过鼻内滴注或通过应用于粘膜，如鼻、喉咙和支气管的粘膜。靶向神经系统(如脊髓神经胶质)的一种方法是通过鞘内递送。靶向药剂被释放到周围的CSF和/或组织中，并且所释放的化合物可以在急性鞘内注射后渗透到脊髓实质中。对包含CNS递送的药物递送策略进行全面综述，参见Ho等人,《分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.)》(1999),1:336-3443；Groothuis等人,《神经病毒学杂志(J.Neuro Virol.)》(1997),3:387-400；和Jan,《药物递送系统：技术与商业机会、决策资源(Drug Delivery Systmes:Technologiesand Commercial Opportunities,Decision Resources)》,1998，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

其可以单独施用或与合适的药物载剂一起施用，并且可以呈固体或液体形式，如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液或乳剂。

所述药剂可以调配成药学上可接受的组合物，所述组合物包括有效量的所述药剂，与一种或多种药学可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂一起调配。所述药剂可以被专门调配成用于以固体或液体形式施用，包含被调整为用于以下的药物组合物：(1)口服施用，例如，浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、含片、糖衣丸、胶囊、丸剂、片剂(例如，用于颊、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于向舌施用的糊剂；(2)肠胃外施用，例如，通过以无菌溶液或悬浮液或缓释调配物的形式皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射或硬膜外注射；(3)例如以应用于皮肤的霜剂、软膏或控释贴剂或喷雾剂形式局部应用；(4)阴道内或子宫内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)经眼；(7)透皮；(8)经黏膜；或者(9)经鼻。另外地，可以将组合物和/或药剂植入到患者中或使用药物递送系统注射。参见例如，Urquhart等人(1984.《药理学和毒理学年度评论(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)》24:199-236)；Lewis编辑“农药和药物的受控制的释放(Controlled Release of Pesticides andPharmaceuticals)”(纽约普莱南出版社(Plenum Press,New York),1981)；美国专利第3,773,919号；以及美国专利第353,270,960号。

可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C₂-C₁₂醇，如乙醇；以及(23)药物调配物中所用的其它无毒可相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于调配物中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。

药学上可接受的抗氧化剂包含但不限于：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

PEG包含在其范围内的任何乙二醇聚合物，其含有约20个至约2000000个连锁单体，通常为约50-1000个连锁单体，一般为约100-300个。聚乙二醇包含含有各种数量的连锁单体的PEG，例如，PEG20、PEG30、PEG40、PEG60、PEG80、PEG100、PEG115、PEG200、PEG 300、PEG400、PEG500、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG4600、PEG5000、PEG6000、PEG8000、PEG11000、PEG12000、PEG2000000及其任何混合物。

药剂可以在使用前调配成明胶胶囊、片剂形式、糖衣丸、糖浆、悬浮液、局部乳膏、栓剂、可注射溶液或用于制备糖浆、悬浮剂、局部乳膏、栓剂或可注射溶液的试剂盒。此外，化合物和/或试剂可以包含在复合物中，这有助于其缓慢释放到血流中，例如，硅盘、聚合物珠粒。

所述调配物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药领域众所周知的任何方法来制备。通常可以在以下文献中找到技术、赋形剂和调配物：例如，《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(MackPublishing Co.,Easton,Pa.)1985,第17版；Nema等人,PDA《药物科学与技术杂志(J.Pharm.Sci.Tech.)》199751:166-171。制备本发明调配物的方法包含使活性剂与一种或多种赋形剂或载剂结合或接触的步骤。通常，通过将一种或多种药剂与液体赋形剂或细碎固体赋形剂或两者均匀且紧密地缔合并且然后如果合适使产品成型来制备调配物。

制备过程可以包含对药物制剂进行灭菌。药剂可以与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、用于影响渗透压的盐等混合，这些助剂不会与所述药剂发生有害反应。

可注射形式的实例包含溶液、悬浮液和乳剂。可注射形式还包含用于即时制备可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末。本发明的药剂可以与以下药物载剂联合注射：如生理盐水(normal saline)、生理盐水(physiological saline)、抑菌水、Cremophor.TM.EL(新泽西州帕西帕尼的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、右旋糖溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物，以及本领域已知的其它水性载剂。还可以使用合适的非水性载剂，并且实例包含固定油和油酸乙酯。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应具有达到易于注射的程度的流动性。其必须在制备和储存的条件下稳定，并且必须保存以抵抗如细菌和真菌等微生物的污染作用。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选的是，组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。合适的载剂是5％右旋糖于生理盐水中。通常，期望在载剂中包含添加剂，如缓冲剂和防腐剂或其它物质以增强等渗性和化学稳定性。

在一些实施例中，本文所述的药剂可以包封在脂质体内施用。此类脂质体的制备和分子插入此类脂质体是本领域众所周知的，例如如美国专利第4,522,811号中所描述的。脂质体悬浮液(包含靶向特定细胞的脂质体，例如，垂体细胞)也可以用作药学上可接受的载剂。

在一个实施例中，药剂与保护化合物和/或药剂免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控制释放调配物，包含植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。材料还可以从Alza公司(AlzaCorporation)和Nova制药公司(Nova Pharmaceuticals,Inc)商业获得。

在口服施用的情况下，可以用于口服施用的固体调配物的赋形剂是本领域中通常使用的那些，并且有用的实例是赋形剂如乳糖、蔗糖、氯化钠、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、甲基纤维素、甘油、海藻酸钠、阿拉伯树胶等；粘合剂如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、阿拉伯树胶、虫胶、蔗糖、水、乙醇、丙醇、羧甲基纤维素、磷酸钾等；润滑剂如硬脂酸镁、滑石等；并且进一步包含添加剂如通常已知的着色剂、崩解剂如海藻酸和PRIMOGEL^TM等。

药剂可以例如与惰性稀释剂或用可同化的可食用载体一起口服施用，或所述活性化合物可以包封在硬或软壳胶囊中，或所述活性化合物可以压缩成片剂，或所述活性化合物可以与饮食的食物直接掺入。对于口服治疗施用，这些化合物和/或药剂可以与赋形剂结合并且以片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆等形式使用。此类组合物和制剂应含有至少0.1％的化合物和/或药剂。当然，这些组合物中的药剂的百分比可以变化，并且可以方便地介于单位重量的约2％到约60％之间。此类治疗有用的组合物中的化合物和/或药剂的量使得将获得合适的剂量。制备根据本发明的优选组合物，使得口服剂量单位含有介于约100与2000mg之间的化合物和/或药剂。

可以用于栓剂的调配物的基质的实例是油性基质，如可可脂、聚乙二醇、羊毛脂、脂肪酸甘油三酯、witepsol(商标，诺贝尔火药公司(Dynamite NobelCo.Ltd.))等。液体调配物可以是水性或油性悬浮液、溶液、糖浆、酏剂等形式，其可以通过使用添加剂的常规方式制备。

组合物可以单次给药，以在给药后的最长时间内使循环水平最大化。连续输注还可以在推注剂量之后使用。

药剂还可以以气雾剂的形式直接施用于气道。对于通过吸入施用，溶液或悬浮液中的药剂以气溶胶喷雾形式从含有适合推进剂(例如气体，如二氧化碳或烃推进剂像丙烷、丁烷、异丁烷)的加压容器或分配器或喷雾器递送。药剂还可以以非加压形式，如在雾化器或喷雾器中施用。

药剂还可以肠胃外施用。可以在合适地与表面活性剂，如羟丙基纤维素混合的水中制备这些药剂的溶液或悬浮液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散体。说明性油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、葡聚糖水溶液和相关的糖溶液以及如丙二醇或聚乙二醇等二元醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液而言。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

为了易于施用以及剂量的均一性，以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物可以是有利的。

施用还可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在调配物中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。所述渗透剂是所属领域中一般已知的，并且例如对于经粘膜施用，包含清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂实现。如所属领域中通常已知，对于经皮施用来说，将药剂调配成软膏、药膏、凝胶或乳膏。

药剂可以与其它药物活性剂组合施用于受试者。示例性药物活性化合物和/或药剂包含但不限于以下文献中发现的那些：《哈里森内科医学原理(Harrison's Principlesof Internal Medicine)》,补充第13版,编辑T.R.Harrison等人纽约州纽约市的麦克劳-希尔出版公司(McGraw-Hill N.Y.,NY)；《内科医师案头参考(Physician's DeskReference)》,补充第50版,1997,新泽西州奥拉德尔的医学经济学公司(Oradell NewJersey,Medical EconomicsCo.)；《治疗学的药理学基础(Pharmacological Basis ofTherapeutics)》,补充第8版,Goodman and Gilman,1990；美国药典国家处方集(UnitedStates Pharmacopeia,The National Formulary),USP XII NF XVII,1990，所述参考文献的完整内容通过引入并入本文。在一些实施例中，药物活性剂选自由以下组成的组：丁酸盐、丙戊酸、羟基脲和利鲁唑。

可以以相同的药物组合物或不同的药物组合物(在同一时间或在不同时间)将药剂和其它药物活性剂施用于受试者。例如，极光激酶抑制剂和用于治疗神经退行性病状的另外的药剂可以以相同的药物组合物或不同的药物组合物(在同一时间或不同时间)施用于受试者。

可以与载体材料组合以产生单个剂型的药剂的量通常将是产生治疗效果的药剂的量。通常，在百分之百中，此量的范围将是化合物的约0.1％至99％，优选地约5％至约70％，最优选地10％至约30％。

片剂、胶囊剂等还可以含有粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料之外，还可以含有液体载体，如脂肪油。

各种其它材料可以包衣形式存在或用来调节剂量单元的物理形式。例如，可以用虫胶、糖或两者来包被药片。除活性成分以外，糖浆还可含有蔗糖作为甜味剂，甲基和丙基对羟基苯甲酸酯作为防腐剂、染料和调味剂(如樱桃或橙子调味剂)。

药物组合物可以连同施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

可以从ALS或FTD的动物模型中获得关于将递送有效量的化合物和/或药剂来治疗ALS或FTD的疗效和剂量的指导，参见例如，Hsieh-Li等人(2000.《自然遗传学》24:66-70)以及其中引用的参考文献中描述的那些。

毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序测定，例如，用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体有效的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且所述治疗指数可以被表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物是优选的。

可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来调配一系列用于在人类中使用的剂量。此类化合物和/或药剂的剂量优选地处于包含ED50在内的具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的施用途径在此范围内变化。

最初可以依据细胞培养测定估计有效剂量。在动物模型中可以将剂量调配为实现包含如在细胞培养中确定的IC50(即，治疗剂的实现症状的半数最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。任何特定剂量的效果都可以通过合适的生物测定来监测。合适的生物测定的实例包含DNA复制测定、基于转录的测定、GDF-8结合测定和免疫学测定。

剂量可以由医生确定并根据需要进行调整，以适应观察到的治疗效果。通常，施用组合物使得化合物和/或药剂以如下剂量给药：1μg/kg至100mg/kg、1μg/kg至50mg/kg、1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、100μg/kg至100mg/kg、100μg/kg至50mg/kg、100μg/kg至20mg/kg、100μg/kg至10mg/kg、100μg/kg至1mg/kg,、1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至10mg/kg,、10mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至50mg/kg或10mg/kg至20mg/kg。对于抗体化合物和/或药剂，一种优选的剂量是0.1mg/kg体重(通常为10mg/kg至20mg/kg)。如果抗体要在大脑中发挥作用，则50mg/kg至100mg/kg的剂量通常是合适的。

关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者，以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否增加或减少剂量、增加或减少施用频率、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其它改变。给药计划可以从每周一次到每天一次不等，这取决于许多临床因素，如受试者对多肽的敏感性。期望剂量可以一次性施用或分为子剂量，例如，2-4个子剂量，并在一段时间内施用例如，在一天中以适当的间隔施用或其它适当的时间表施用。此类子剂量可以作为单位剂型施用。给药方案的实例是每周一次、每周两次、每周三次、每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或更多次施用。

8.试剂盒

本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子(即“药剂”)可以在试剂盒中提供。试剂盒包含(a)药剂，例如，包含经修饰的细胞周期蛋白F多肽或编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽的核酸分子的组合物；以及(b)信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、营销性的或是与本文所描述的方法和/或用于本文所描述的方法的药剂的用途相关的其它材料。例如，信息材料描述了施用药剂以增强运动神经元存活、治疗或抑制神经退行性病状的发展的方法，具体地与神经元TDP-43蛋白病(例如，ALS、FTD、AD等)或神经退行性病状的至少一种症状相关的病状，或与神经元(例如，运动神经元)功能失调或减少相关的病状。

在一个实施例中，信息材料可以包含以合适的方式施用药剂的指令，例如，以合适的剂量、剂型或施用模式(例如，本文所述的剂量、剂量形式或施用模式)施用药剂。在另一个实施例中，信息材料可以包含用于识别合适的受试者，例如，人，例如，成年人的指令。试剂盒的信息材料的形式不限。在许多实例中，信息材料，例如，说明书，以印刷形式提供，例如，印刷文本、图纸和/或照片，例如，标签或印刷纸张。然而，信息材料还可以以其它格式，如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录提供。在另一个实施例中，试剂盒的信息材料是链接或联系信息，例如，物理地址、电子邮件地址、超链接、网站或电话号码，其中试剂盒的用户可以获得关于调节剂和/或其在本文描述的方法中的使用的实质性信息。当然，信息材料还可以以任何格式的组合来提供。

除了药剂之外，试剂盒的组合物还可以包含其它成分，如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂，和/或用于治疗本文所述的病状或病症的第二药剂。可替代地，其它成分可以包含在试剂盒中，但在与药剂不同的组合物或容器中。在此类实施例中，试剂盒可以包含用于将药剂和其它成分混合，或者用于将药剂与其它成分一起使用的说明书。

药剂可以以任何形式提供，例如，液体、干燥或冻干形式。药剂试剂基本上是纯的和/或无菌的是优选的。当药剂以液体溶液提供时，液体溶液优选地为水溶液，其中优选无菌水溶液。当以干燥形式提供化合物和/或药剂时，通常通过添加合适的溶剂来进行重构。任选地可以在试剂盒中提供溶剂，例如，无菌水或缓冲液。

试剂盒可以包含用于含有化合物和/或药剂的组合物的一个或多个容器。在一些实施例中，试剂盒含有用于药剂(例如，在组合物中)和信息材料的单独容器、分隔物或隔室。例如，药剂(例如，在组合物中)可以包含在瓶子、小瓶或注射器中，并且信息材料可以包含在塑料套管或包装中。在其它实施例中，试剂盒的单独元件包含在单个未分隔的容器内。例如，药剂(例如，在组合物中)包含在其上贴有标签形式的信息材料的瓶子、小瓶或注射器中。在一些实施例中，试剂盒包含各自含有一种或多种单位剂型(例如，本文所描述的剂型)的药剂(例如，在组合物中)的多个(例如，一包)单独的容器。例如，试剂盒包含每个都含有单个单位剂量的药剂的多个注射器、安瓿、箔包或泡罩包装。试剂盒的容器可以是气密的和/或防水的。

药剂(例如，在组合物中)可以施用于受试者，例如，成年受试者(例如，需要增强神经元(例如，运动神经元)的存活或活力的受试者)，和/或抑制神经元(例如，运动神经元)的存活或活力的受试者)，和/或抑制神经元(例如，运动神经元)中的异常蛋白质积聚的受试者。方法可以包含评估受试者，例如，评估受试者中神经元TDP-43蛋白病的存在，由此鉴定受试者可能对本文所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或多核苷酸的治疗敏感。

为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将通过以下非限制性实例来描述特定的优选实施例。

实验

诸位发明人先前的工作证明，野生型TDP-43是野生型细胞周期蛋白F的直接泛素化底物，并且因此靶向通过泛素-蛋白酶体系统降解。还表明，过表达野生型CCNF(编码细胞周期蛋白F蛋白的基因)，如通过使用基于AAV的基因疗法方法，可以从神经元中去除TDP-43。因此，细胞周期蛋白F被提议作为治疗MND的疗法。

因此，进行了另外的研究来开发细胞周期蛋白F变体，这些变体已被进一步优化用于治疗用途。

细胞质介导的细胞周期蛋白F变体

细胞周期蛋白F通常被认为是核蛋白，通过泛素化和蛋白酶体系统降解来调节各种细胞周期蛋白的核内水平。从治疗的角度来看，由于若干个原因，这在靶向MND/ALS中的致病性TDP-43方面不是最佳的。首先，致病性TDP-43通常被认为是从细胞核错误定位到细胞质的形式。因此，野生型细胞周期蛋白F(位于细胞核中)治疗性清除细胞质TDP-43的能力可能受到限制。其次，健康TDP-43位于细胞核内，在细胞核内其执行一系列基本功能，并且细胞核TDP-43的缺失可能影响细胞活力。因此，在长期基因疗法中使用野生型细胞周期蛋白F可能对健康TDP-43产生有害影响。

为了克服这一点，产生了一种针对细胞质的经修饰的细胞周期蛋白F变体。该变体具有融合到细胞周期蛋白F多肽的C末端的细胞质靶向肽(核输出信号(NES):LPPLERLTL(SEQ ID NO:8))。细胞周期蛋白F多肽还具有两个两个核定位信号(NLS)的缺失，这两个信号存在于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽的氨基酸位置20-28和568-574处。这种新的细胞质导向的细胞周期蛋白F变体被称为CT-细胞周期蛋白F，并且具有SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:3中所示的核酸序列编码。如图3所示，CT-细胞周期蛋白F在氨基酸位置20-66(由SEQ ID NO:3中的核苷酸58-198编码)处保留F框，在氨基酸位置282-395(由SEQ ID NO:3中的核苷酸844-1185编码)处保留细胞周期蛋白结构域，并且在氨基酸位置565-749(由SEQ ID NO:3中的核苷酸1693-2247编码)处保持PEST结构域，并且在氨基酸位置769-778(由SEQ ID NO:3中的核苷酸2305-2334编码)处具有NES。如图5所示，CT-细胞周期蛋白F在细胞中显示出主要的细胞质定位。

为了证明CT-细胞周期蛋白F清除细胞质(病理性)TDP-43的能力，在HEK293细胞中过表达了具有非活性NLS(dNLS-TDP-43)的TDP-43变体，导致其错误定位到细胞质中。dNLS-TDP-43在该领域被接受为用于潜在TDP-43清除治疗的临床前测试的合适的TDP-43变体。值得注意的是，过表达dNLS-TDP-43的转基因小鼠会出现MND样症状，并被认为是MND/ALS的金标准临床前动物模型(Walker等人,2015；《神经病理学学报(Acta Neuropathol)》130(5):643-60)。如图6所示，CT-细胞周期蛋白F显著降低了这些细胞中dNLS-TDP-43的水平。

为了研究CT-细胞周期蛋白F在体内清除细胞质TDP-43的能力，dNLS-TDP-43在斑马鱼的脊髓运动神经元中特异性过表达。CT-细胞周期蛋白F在这些斑马鱼中的过表达导致dNLS-TDP-43水平显著降低(参见图7)。

总之，具有异源NES和两个内源性NLS的缺失的经修饰的细胞周期蛋白F多肽靶向细胞质。此外，这种经修饰的CT-细胞周期蛋白在体外和体内显著降低了细胞质TDP-43的水平，证明了细胞质靶向细胞周期蛋白F的临床实用性。

截短的细胞周期蛋白F变体

细胞周期蛋白F是一种相对较大的多肽：786个氨基酸，由2.4kb的多核苷酸编码。细胞周期蛋白F的主动截短在临床上(如在基于病毒载体的基因疗法的上下文下，其中遗传构建体/载体基因组的大小可能存在限制)和生产中(其中通常倾向于较小的多核苷酸或多肽)可能具有优势。为了帮助确定细胞周期蛋白F的酶促功能所需的最小功能组分，并且因此鉴定可能具有治疗活性的截短变体，设计了保持TDP-43清除特性的截短变体。具体而言，横跨SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F的位置582-766处的氨基酸残基的PEST结构域缺失(参见图1)。该PEST区不是细胞周期蛋白F的泛素化活性所必需的。相反，PEST结构域充当蛋白质降解的信号，并且因此该序列可能参与细胞周期蛋白F的降解。

这种新的细胞周期蛋白F变体被称为ΔPEST细胞周期蛋白F(本文中也称为dPEST-细胞周期蛋白F)，并且具有SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:5中所示的核酸序列编码。如图4所示，ΔPEST-细胞周期蛋白F在位置20-28和568-574(分别由SEQ IDNO:5中的核苷酸58-84和1702-1722编码)处保留NLS，在氨基酸位置29-76(由SEQ ID NO:5中的核苷酸85-228编码)处保留F框，并且在氨基酸位置292-405(由SEQ ID NO:5中的核苷酸874-1215编码)处保留细胞周期蛋白结构域。

令人惊讶的是，观察到细胞周期蛋白F中PEST区的缺失改变了其细胞内定位，导致ΔPEST-细胞周期蛋白F的细胞质定位(参见图8)。此外，ΔPEST-细胞周期蛋白F促进HEK细胞中dNLS-TDP-43的显著清除(图9)。

细胞周期蛋白F变体对细胞核TDF-43水平的影响

如上所述，CT-细胞周期蛋白F和ΔPEST-细胞周期蛋白F变体两者清除细胞质(致病性)TDP-43。为了确定这种降低是否对细胞质TDP-43而不是核TDP-43具有特异性，测定了CT-细胞周期蛋白F或ΔPEST-细胞周期蛋白对斑马鱼脊髓运动神经元中表达的野生型(核)TDP-43的影响。如图10所示，两种变体均未对野生型TDP-43清除产生任何影响。这是用于临床的变体的一个重要特性，因为只有(或主要)致病性细胞质TDP-43被靶向和清除，而不是细胞核TDP-43，这对神经元的正常功能至关重要。

无酶活性的细胞周期蛋白F变体

细胞周期蛋白F(作为SCF E3连接酶复合物的一部分)直接与TDP-43结合，促进其通过SCF复合物的泛素化，并且泛素标签随后将TDP-43引导到蛋白酶体进行清除。将包括SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F的位置35处的亮氨酸和位置36处的脯氨酸被两个丙氨酸取代的LP/AA变体工程化为细胞周期蛋白F。这种修饰存在于细胞周期蛋白F的F框中。虽然修饰不阻止经修饰的多肽与TDP-43结合，但其确实阻止其对TDP-43泛素化。这是细胞周期蛋白F的无酶活性变体。在脊髓运动神经元中过表达WT-TDP-43的转基因斑马鱼中，证实无活性LP/AA变体完全阻止了TDP-43清除(参见图11)。

细胞周期蛋白F变体对WT TDF-43和dNLS TDP-43水平的影响

重复图7、10和11所述的实验进行实验。结果示出于图12中。证实了图11中的数据，野生型细胞周期蛋白F降低了野生型TDP-43水平，但失活的(LP/AA)细胞周期蛋白F不降低(图12A)。ΔPEST-细胞周期蛋白F或CT-细胞周期蛋白F两者对野生型TDP-43没有任何影响(证实了图10中的数据)(图12A)。野生型细胞周期蛋白F降低dNLS-TDP-43的水平，但失活的(LP/AA)细胞周期蛋白F不降低(图12B)。ΔPEST-细胞周期蛋白F和CT-细胞周期蛋白F两者降低了dNLS-TDP-43的水平(图12B)。

材料和方法

质粒

所有质粒均由金斯瑞公司(Genscript)合成并存档。质粒包含编码野生型细胞周期蛋白F(具有SEQ ID NO:1中所示的核酸序列，编码SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列)、CT-细胞周期蛋白F(具有SEQ ID NO:3中所示的核酸序列，编码SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列)和ΔPEST-细胞周期蛋白F(具有SEQ ID NO:1中所示的核酸序列，编码SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列)(图1-4)。还包含码LP/AA细胞周期蛋白F变体(编码SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列)的质粒。简言之，将编码mCherry-flag-细胞周期蛋白F的DNA寡核苷酸亚克隆到pCS2+质粒中。

用于成像的转染

将HEK293细胞铺板到24孔板内的盖玻片上。第二天，细胞约80％融合，并根据制造商说明，使用lipofectamine 2000，使用mCherry-细胞周期蛋白F(WT)、mCherry-细胞周期蛋白F(细胞质)或mCHerry-细胞周期蛋白F(ΔPEST)质粒(如上所述)转染。

转染后24小时，从细胞中吸出培养基，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。将洗涤过的细胞在4％PFA于PBS中固定10分钟。然后用PBS洗涤细胞三次，然后使用DAPI对经固定细胞的细胞核进行染色。然后将经染色的细胞安装在载玻片上，并使用蔡司AxioImager成像。

可溶性/不溶性研究的转染

将HEK293细胞接种在T75烧瓶中。第二天，用mCherry-细胞周期蛋白F(WT)、mCHerry-细胞周期蛋白F(ΔPEST)或mCHerrry-细胞周期蛋白F(CT)质粒(如上所述)以及TDP-43-GFP(ΔNLS)共转染细胞。作为对照，用mCherry空载体和GFP空载体共转染细胞。转染后48小时，将细胞刮入冰冷的PBS中，以2000×g离心5分钟，并在-80℃下储存，直至进一步使用。

培养细胞的可溶性/不可溶性蛋白质分级

通过使用Sonic Ruptor 250在50％功率和设置为30％的脉冲发生器设置下超声处理10x，将细胞重新悬浮并裂解在含有完整蛋白酶抑制剂混合物和phosSTOP(罗氏公司(Roche))的RIPA缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，1％NP-40替代物，5mM EDTA，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠)中。将所得裂解物在4℃下以100,000xg离心30分钟。将产生的上清液用作洗涤剂可溶性级分。所得沉淀在RIPA缓冲液中洗涤两次(将探针在RIPA缓冲剂中超声处理，并每次以100,000xg离心)。最终洗涤后，将蛋白质重新悬浮于RIPA缓冲液中，并在4℃下再次以100,000xg离心30分钟。在将所得沉淀重新悬浮于尿素缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、30mM Tris)中并使用Sonic Ruptor 250在50％功率和设定为30％的脉冲发生器设置下超声处理10次之前，去除上清液。这被认为是不溶性级分。

TDP-43转基因斑马鱼中mRNA介导的CCNF过表达

使用在运动神经元中表达GFP标记的人TDP-43的转基因斑马鱼来评估细胞周期蛋白F介导的TDP-43清除。将WT-、CT-或ΔPEST-细胞周期蛋白F RNA(即CCNF RNA)注射(约2nl)到斑马鱼胚胎的单细胞期中。使用荧光报告基因验证成功注射的幼虫，并在28.5℃下饲养至受精后3-5天。在第3-5天，对所有治疗组使用相同的采集设置捕获GFP阳性脊髓神经元的共聚焦显微镜图像。最大强度投影用于计算脊髓运动神经元的TDP-43荧光强度。将CCNF注射组的TDP-43水平的平均比率(细胞核比全细胞强度)与未注射的对照组进行比较。

本文所引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。

本文中引用的任何参考文献不应被解释为承认该参考文献是作为本申请的“现有技术”可获得的。

在整个说明书中，目的是描述本公开的优选实施例，而不将本公开限于任何一个实施例或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解的是，鉴于本公开，在不脱离本公开的范围的情况下，可以对例示的具体实施例进行多种修改和改变。所有这种修改和改变旨在包含在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 麦考瑞大学（Macquarie University）

<120> 经修饰的多肽和其用途

<130> 35575862

<160> 17

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 2361

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

atggggagcg gcggcgtggt ccactgtagg tgtgccaagt gtttctgtta tcctacaaag 60

cgaagaataa ggaggaggcc ccgaaacctg accatcttga gtctccccga agatgtgctc 120

tttcacatcc tgaaatggct ttctgtagag gacatcctgg ccgtccgagc tgtacactcc 180

cagctgaagg acctggtgga caaccacgcc agtgtgtggg catgtgccag cttccaggag 240

ctgtggccgt ctccagggaa cctgaagctc tttgaaaggg ctgctgaaaa ggggaatttc 300

gaagctgctg tgaagctggg catagcctac ctctacaatg aaggcctgtc tgtgtctgat 360

gaggcccgcg cagaagtgaa tggcctgaag gcctctcgct tcttcagtct cgctgagcgg 420

ctgaatgtgg gtgccgcacc tttcatctgg ctcttcatcc gccctccgtg gtcggtgagc 480

ggaagctgct gcaaggccgt ggttcacgag agcctcaggg cagagtgcca gctgcagagg 540

actcacaaag catccatatt gcactgcttg ggcagagtgc tgagtctgtt cgaggatgag 600

gagaagcagc agcaggccca tgacctgttt gaggaggctg ctcatcaggg atgtctgacc 660

agctcctacc tcctctggga aagcgacagg aggacagatg tgtcagatcc tgggcgatgc 720

ctccacagct tccgaaaact cagggactac gctgccaaag gctgctggga agcgcagctg 780

tctttagcca aagcctgtgc aaatgcaaac cagcttggac tggaggtgag agcttccagt 840

gagatcgtct gccagctatt tcaggcttcc caggctgtca gtaaacaaca agtcttctcc 900

gtgcagaagg gactcaatga cacaatgagg tacattctga tcgactggct ggtggaagtt 960

gccaccatga aggacttcac aagcctgtgc ctgcacctga ccgtggagtg tgtggaccgg 1020

tacctgcgga ggaggctggt gccgcggtac aggctccagc tgctgggcat cgcctgcatg 1080

gtcatctgca cccggtttat cagtaaagag atcctgacca tccgggaggc cgtatggctc 1140

acggacaaca cttacaagta cgaggacctg gtgagaatga tgggcgagat cgtctccgcc 1200

ttggaaggga agattcgagt ccccactgtg gtggattaca aggaggtcct gctgacgcta 1260

gtccctgtgg agctgagaac ccagcacctg tgcagcttcc tctgcgagct ctccctgctg 1320

cacaccagcc tgtccgccta cgccccagcc cgcctggctg ccgcagccct gctcctggcc 1380

agactgacgc acgggcagac acagccctgg accactcagc tgtgggacct caccggattc 1440

tcctatgaag acctcattcc ctgcgtcttg agcctccata agaagtgctt ccatgatgac 1500

gcccccaagg actacaggca agtctctctg accgccgtga agcagcggtt tgaggacaag 1560

cgctatggag aaatcagcca ggaagaggtg ctgagctaca gccagttgtg tgctgcatta 1620

ggagtgacac aagacagccc cgaccccccg actttcctca gcacagggga gatccacgcc 1680

ttcctcagct ctccctcggg gcggagaacc aaacggaagc gggagaacag cctccaggaa 1740

gacagaggca gcttcgttac cacccccact gcggagctgt ccagccagga ggagacgctg 1800

ctgggcagct tcctcgactg gagcctggac tgctgctctg gctatgaagg cgaccaggag 1860

agtgagggcg agaaggaggg cgacgtgaca gctcccagcg gcatcctcga tgtcaccgtg 1920

gtctacctga acccagaaca gcattgctgc caggaatcca gtgatgagga ggcttgtcca 1980

gaggacaagg gaccccagga cccacaggca ctggcgctgg acacccagat ccctgcaacc 2040

cctggaccca aacccctggt ccgcaccagc cgggagccag ggaaggacgt cacgacctca 2100

gggtactcct ccgtcagcac cgcaagtccc acaagctccg tggacggtgg cttgggggcc 2160

ctgccccaac ctacctcagt gctgtccctg gacagtgact cgcacacaca gccctgccac 2220

catcaggcca ggaagtcatg tttacagtgt cgtcccccaa gtcccccgga gagcagtgtt 2280

ccccagcaac aggtgaagcg gataaaccta tgcatacaca gtgaggagga ggacatgaac 2340

ctgggccttg tgaggctgta a 2361

<210> 2

<211> 786

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gly Ser Gly Gly Val Val His Cys Arg Cys Ala Lys Cys Phe Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Lys Arg Arg Ile Arg Arg Arg Pro Arg Asn Leu Thr Ile

20 25 30

Leu Ser Leu Pro Glu Asp Val Leu Phe His Ile Leu Lys Trp Leu Ser

35 40 45

Val Glu Asp Ile Leu Ala Val Arg Ala Val His Ser Gln Leu Lys Asp

50 55 60

Leu Val Asp Asn His Ala Ser Val Trp Ala Cys Ala Ser Phe Gln Glu

65 70 75 80

Leu Trp Pro Ser Pro Gly Asn Leu Lys Leu Phe Glu Arg Ala Ala Glu

85 90 95

Lys Gly Asn Phe Glu Ala Ala Val Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Leu Tyr

100 105 110

Asn Glu Gly Leu Ser Val Ser Asp Glu Ala Arg Ala Glu Val Asn Gly

115 120 125

Leu Lys Ala Ser Arg Phe Phe Ser Leu Ala Glu Arg Leu Asn Val Gly

130 135 140

Ala Ala Pro Phe Ile Trp Leu Phe Ile Arg Pro Pro Trp Ser Val Ser

145 150 155 160

Gly Ser Cys Cys Lys Ala Val Val His Glu Ser Leu Arg Ala Glu Cys

165 170 175

Gln Leu Gln Arg Thr His Lys Ala Ser Ile Leu His Cys Leu Gly Arg

180 185 190

Val Leu Ser Leu Phe Glu Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Ala His Asp

195 200 205

Leu Phe Glu Glu Ala Ala His Gln Gly Cys Leu Thr Ser Ser Tyr Leu

210 215 220

Leu Trp Glu Ser Asp Arg Arg Thr Asp Val Ser Asp Pro Gly Arg Cys

225 230 235 240

Leu His Ser Phe Arg Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Ala Lys Gly Cys Trp

245 250 255

Glu Ala Gln Leu Ser Leu Ala Lys Ala Cys Ala Asn Ala Asn Gln Leu

260 265 270

Gly Leu Glu Val Arg Ala Ser Ser Glu Ile Val Cys Gln Leu Phe Gln

275 280 285

Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Gln Val Phe Ser Val Gln Lys Gly

290 295 300

Leu Asn Asp Thr Met Arg Tyr Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val

305 310 315 320

Ala Thr Met Lys Asp Phe Thr Ser Leu Cys Leu His Leu Thr Val Glu

325 330 335

Cys Val Asp Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Leu Val Pro Arg Tyr Arg Leu

340 345 350

Gln Leu Leu Gly Ile Ala Cys Met Val Ile Cys Thr Arg Phe Ile Ser

355 360 365

Lys Glu Ile Leu Thr Ile Arg Glu Ala Val Trp Leu Thr Asp Asn Thr

370 375 380

Tyr Lys Tyr Glu Asp Leu Val Arg Met Met Gly Glu Ile Val Ser Ala

385 390 395 400

Leu Glu Gly Lys Ile Arg Val Pro Thr Val Val Asp Tyr Lys Glu Val

405 410 415

Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Glu Leu Arg Thr Gln His Leu Cys Ser

420 425 430

Phe Leu Cys Glu Leu Ser Leu Leu His Thr Ser Leu Ser Ala Tyr Ala

435 440 445

Pro Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr His

450 455 460

Gly Gln Thr Gln Pro Trp Thr Thr Gln Leu Trp Asp Leu Thr Gly Phe

465 470 475 480

Ser Tyr Glu Asp Leu Ile Pro Cys Val Leu Ser Leu His Lys Lys Cys

485 490 495

Phe His Asp Asp Ala Pro Lys Asp Tyr Arg Gln Val Ser Leu Thr Ala

500 505 510

Val Lys Gln Arg Phe Glu Asp Lys Arg Tyr Gly Glu Ile Ser Gln Glu

515 520 525

Glu Val Leu Ser Tyr Ser Gln Leu Cys Ala Ala Leu Gly Val Thr Gln

530 535 540

Asp Ser Pro Asp Pro Pro Thr Phe Leu Ser Thr Gly Glu Ile His Ala

545 550 555 560

Phe Leu Ser Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Lys Arg Lys Arg Glu Asn

565 570 575

Ser Leu Gln Glu Asp Arg Gly Ser Phe Val Thr Thr Pro Thr Ala Glu

580 585 590

Leu Ser Ser Gln Glu Glu Thr Leu Leu Gly Ser Phe Leu Asp Trp Ser

595 600 605

Leu Asp Cys Cys Ser Gly Tyr Glu Gly Asp Gln Glu Ser Glu Gly Glu

610 615 620

Lys Glu Gly Asp Val Thr Ala Pro Ser Gly Ile Leu Asp Val Thr Val

625 630 635 640

Val Tyr Leu Asn Pro Glu Gln His Cys Cys Gln Glu Ser Ser Asp Glu

645 650 655

Glu Ala Cys Pro Glu Asp Lys Gly Pro Gln Asp Pro Gln Ala Leu Ala

660 665 670

Leu Asp Thr Gln Ile Pro Ala Thr Pro Gly Pro Lys Pro Leu Val Arg

675 680 685

Thr Ser Arg Glu Pro Gly Lys Asp Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Ser

690 695 700

Val Ser Thr Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Asp Gly Gly Leu Gly Ala

705 710 715 720

Leu Pro Gln Pro Thr Ser Val Leu Ser Leu Asp Ser Asp Ser His Thr

725 730 735

Gln Pro Cys His His Gln Ala Arg Lys Ser Cys Leu Gln Cys Arg Pro

740 745 750

Pro Ser Pro Pro Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Gln Val Lys Arg Ile

755 760 765

Asn Leu Cys Ile His Ser Glu Glu Glu Asp Met Asn Leu Gly Leu Val

770 775 780

Arg Leu

785

<210> 3

<211> 2337

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

atggggagcg gcggcgtggt ccactgtagg tgtgccaagt gtttctgtta tcctacactg 60

accatcttga gtctccccga agatgtgctc tttcacatcc tgaaatggct ttctgtagag 120

gacatcctgg ccgtccgagc tgtacactcc cagctgaagg acctggtgga caaccacgcc 180

agtgtgtggg catgtgccag cttccaggag ctgtggccgt ctccagggaa cctgaagctc 240

tttgaaaggg ctgctgaaaa ggggaatttc gaagctgctg tgaagctggg catagcctac 300

ctctacaatg aaggcctgtc tgtgtctgat gaggcccgcg cagaagtgaa tggcctgaag 360

gcctctcgct tcttcagtct cgctgagcgg ctgaatgtgg gtgccgcacc tttcatctgg 420

ctcttcatcc gccctccgtg gtcggtgagc ggaagctgct gcaaggccgt ggttcacgag 480

agcctcaggg cagagtgcca gctgcagagg actcacaaag catccatatt gcactgcttg 540

ggcagagtgc tgagtctgtt cgaggatgag gagaagcagc agcaggccca tgacctgttt 600

gaggaggctg ctcatcaggg atgtctgacc agctcctacc tcctctggga aagcgacagg 660

aggacagatg tgtcagatcc tgggcgatgc ctccacagct tccgaaaact cagggactac 720

gctgccaaag gctgctggga agcgcagctg tctttagcca aagcctgtgc aaatgcaaac 780

cagcttggac tggaggtgag agcttccagt gagatcgtct gccagctatt tcaggcttcc 840

caggctgtca gtaaacaaca agtcttctcc gtgcagaagg gactcaatga cacaatgagg 900

tacattctga tcgactggct ggtggaagtt gccaccatga aggacttcac aagcctgtgc 960

ctgcacctga ccgtggagtg tgtggaccgg tacctgcgga ggaggctggt gccgcggtac 1020

aggctccagc tgctgggcat cgcctgcatg gtcatctgca cccggtttat cagtaaagag 1080

atcctgacca tccgggaggc cgtatggctc acggacaaca cttacaagta cgaggacctg 1140

gtgagaatga tgggcgagat cgtctccgcc ttggaaggga agattcgagt ccccactgtg 1200

gtggattaca aggaggtcct gctgacgcta gtccctgtgg agctgagaac ccagcacctg 1260

tgcagcttcc tctgcgagct ctccctgctg cacaccagcc tgtccgccta cgccccagcc 1320

cgcctggctg ccgcagccct gctcctggcc agactgacgc acgggcagac acagccctgg 1380

accactcagc tgtgggacct caccggattc tcctatgaag acctcattcc ctgcgtcttg 1440

agcctccata agaagtgctt ccatgatgac gcccccaagg actacaggca agtctctctg 1500

accgccgtga agcagcggtt tgaggacaag cgctatggag aaatcagcca ggaagaggtg 1560

ctgagctaca gccagttgtg tgctgcatta ggagtgacac aagacagccc cgaccccccg 1620

actttcctca gcacagggga gatccacgcc ttcctcagct ctccctcggg ggagaacagc 1680

ctccaggaag acagaggcag cttcgttacc acccccactg cggagctgtc cagccaggag 1740

gagacgctgc tgggcagctt cctcgactgg agcctggact gctgctctgg ctatgaaggc 1800

gaccaggaga gtgagggcga gaaggagggc gacgtgacag ctcccagcgg catcctcgat 1860

gtcaccgtgg tctacctgaa cccagaacag cattgctgcc aggaatccag tgatgaggag 1920

gcttgtccag aggacaaggg accccaggac ccacaggcac tggcgctgga cacccagatc 1980

cctgcaaccc ctggacccaa acccctggtc cgcaccagcc gggagccagg gaaggacgtc 2040

acgacctcag ggtactcctc cgtcagcacc gcaagtccca caagctccgt ggacggtggc 2100

ttgggggccc tgccccaacc tacctcagtg ctgtccctgg acagtgactc gcacacacag 2160

ccctgccacc atcaggccag gaagtcatgt ttacagtgtc gtcccccaag tcccccggag 2220

agcagtgttc cccagcaaca ggtgaagcgg ataaacctat gcatacacag tgaggaggag 2280

gacatgaacc tgggccttgt gaggctgcta ccaccgcttg agagacttac tctttaa 2337

<210> 4

<211> 778

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Gly Ser Gly Gly Val Val His Cys Arg Cys Ala Lys Cys Phe Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Leu Thr Ile Leu Ser Leu Pro Glu Asp Val Leu Phe His

20 25 30

Ile Leu Lys Trp Leu Ser Val Glu Asp Ile Leu Ala Val Arg Ala Val

35 40 45

His Ser Gln Leu Lys Asp Leu Val Asp Asn His Ala Ser Val Trp Ala

50 55 60

Cys Ala Ser Phe Gln Glu Leu Trp Pro Ser Pro Gly Asn Leu Lys Leu

65 70 75 80

Phe Glu Arg Ala Ala Glu Lys Gly Asn Phe Glu Ala Ala Val Lys Leu

85 90 95

Gly Ile Ala Tyr Leu Tyr Asn Glu Gly Leu Ser Val Ser Asp Glu Ala

100 105 110

Arg Ala Glu Val Asn Gly Leu Lys Ala Ser Arg Phe Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Glu Arg Leu Asn Val Gly Ala Ala Pro Phe Ile Trp Leu Phe Ile Arg

130 135 140

Pro Pro Trp Ser Val Ser Gly Ser Cys Cys Lys Ala Val Val His Glu

145 150 155 160

Ser Leu Arg Ala Glu Cys Gln Leu Gln Arg Thr His Lys Ala Ser Ile

165 170 175

Leu His Cys Leu Gly Arg Val Leu Ser Leu Phe Glu Asp Glu Glu Lys

180 185 190

Gln Gln Gln Ala His Asp Leu Phe Glu Glu Ala Ala His Gln Gly Cys

195 200 205

Leu Thr Ser Ser Tyr Leu Leu Trp Glu Ser Asp Arg Arg Thr Asp Val

210 215 220

Ser Asp Pro Gly Arg Cys Leu His Ser Phe Arg Lys Leu Arg Asp Tyr

225 230 235 240

Ala Ala Lys Gly Cys Trp Glu Ala Gln Leu Ser Leu Ala Lys Ala Cys

245 250 255

Ala Asn Ala Asn Gln Leu Gly Leu Glu Val Arg Ala Ser Ser Glu Ile

260 265 270

Val Cys Gln Leu Phe Gln Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Gln Val

275 280 285

Phe Ser Val Gln Lys Gly Leu Asn Asp Thr Met Arg Tyr Ile Leu Ile

290 295 300

Asp Trp Leu Val Glu Val Ala Thr Met Lys Asp Phe Thr Ser Leu Cys

305 310 315 320

Leu His Leu Thr Val Glu Cys Val Asp Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Leu

325 330 335

Val Pro Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ile Ala Cys Met Val Ile

340 345 350

Cys Thr Arg Phe Ile Ser Lys Glu Ile Leu Thr Ile Arg Glu Ala Val

355 360 365

Trp Leu Thr Asp Asn Thr Tyr Lys Tyr Glu Asp Leu Val Arg Met Met

370 375 380

Gly Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Gly Lys Ile Arg Val Pro Thr Val

385 390 395 400

Val Asp Tyr Lys Glu Val Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Glu Leu Arg

405 410 415

Thr Gln His Leu Cys Ser Phe Leu Cys Glu Leu Ser Leu Leu His Thr

420 425 430

Ser Leu Ser Ala Tyr Ala Pro Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Leu Leu

435 440 445

Leu Ala Arg Leu Thr His Gly Gln Thr Gln Pro Trp Thr Thr Gln Leu

450 455 460

Trp Asp Leu Thr Gly Phe Ser Tyr Glu Asp Leu Ile Pro Cys Val Leu

465 470 475 480

Ser Leu His Lys Lys Cys Phe His Asp Asp Ala Pro Lys Asp Tyr Arg

485 490 495

Gln Val Ser Leu Thr Ala Val Lys Gln Arg Phe Glu Asp Lys Arg Tyr

500 505 510

Gly Glu Ile Ser Gln Glu Glu Val Leu Ser Tyr Ser Gln Leu Cys Ala

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Ala Leu Gly Val Thr Gln Asp Ser Pro Asp Pro Pro Thr Phe Leu Ser

530 535 540

Thr Gly Glu Ile His Ala Phe Leu Ser Ser Pro Ser Gly Glu Asn Ser

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Leu Gln Glu Asp Arg Gly Ser Phe Val Thr Thr Pro Thr Ala Glu Leu

565 570 575

Ser Ser Gln Glu Glu Thr Leu Leu Gly Ser Phe Leu Asp Trp Ser Leu

580 585 590

Asp Cys Cys Ser Gly Tyr Glu Gly Asp Gln Glu Ser Glu Gly Glu Lys

595 600 605

Glu Gly Asp Val Thr Ala Pro Ser Gly Ile Leu Asp Val Thr Val Val

610 615 620

Tyr Leu Asn Pro Glu Gln His Cys Cys Gln Glu Ser Ser Asp Glu Glu

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Ala Cys Pro Glu Asp Lys Gly Pro Gln Asp Pro Gln Ala Leu Ala Leu

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Asp Thr Gln Ile Pro Ala Thr Pro Gly Pro Lys Pro Leu Val Arg Thr

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Ser Arg Glu Pro Gly Lys Asp Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Ser Val

675 680 685

Ser Thr Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Asp Gly Gly Leu Gly Ala Leu

690 695 700

Pro Gln Pro Thr Ser Val Leu Ser Leu Asp Ser Asp Ser His Thr Gln

705 710 715 720

Pro Cys His His Gln Ala Arg Lys Ser Cys Leu Gln Cys Arg Pro Pro

725 730 735

Ser Pro Pro Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Gln Val Lys Arg Ile Asn

740 745 750

Leu Cys Ile His Ser Glu Glu Glu Asp Met Asn Leu Gly Leu Val Arg

755 760 765

Leu Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu

770 775

<210> 5

<211> 1803

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

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cgaagaataa ggaggaggcc ccgaaacctg accatcttga gtctccccga agatgtgctc 120

tttcacatcc tgaaatggct ttctgtagag gacatcctgg ccgtccgagc tgtacactcc 180

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ctccacagct tccgaaaact cagggactac gctgccaaag gctgctggga agcgcagctg 780

tctttagcca aagcctgtgc aaatgcaaac cagcttggac tggaggtgag agcttccagt 840

gagatcgtct gccagctatt tcaggcttcc caggctgtca gtaaacaaca agtcttctcc 900

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acggacaaca cttacaagta cgaggacctg gtgagaatga tgggcgagat cgtctccgcc 1200

ttggaaggga agattcgagt ccccactgtg gtggattaca aggaggtcct gctgacgcta 1260

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agactgacgc acgggcagac acagccctgg accactcagc tgtgggacct caccggattc 1440

tcctatgaag acctcattcc ctgcgtcttg agcctccata agaagtgctt ccatgatgac 1500

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cgctatggag aaatcagcca ggaagaggtg ctgagctaca gccagttgtg tgctgcatta 1620

ggagtgacac aagacagccc cgaccccccg actttcctca gcacagggga gatccacgcc 1680

ttcctcagct ctccctcggg gcggagaacc aaacggaagc gggagaacag cctccaggaa 1740

cggataaacc tatgcataca cagtgaggag gaggacatga acctgggcct tgtgaggctg 1800

taa 1803

<210> 6

<211> 600

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Met Gly Ser Gly Gly Val Val His Cys Arg Cys Ala Lys Cys Phe Cys

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Tyr Pro Thr Lys Arg Arg Ile Arg Arg Arg Pro Arg Asn Leu Thr Ile

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Leu Ser Leu Pro Glu Asp Val Leu Phe His Ile Leu Lys Trp Leu Ser

35 40 45

Val Glu Asp Ile Leu Ala Val Arg Ala Val His Ser Gln Leu Lys Asp

50 55 60

Leu Val Asp Asn His Ala Ser Val Trp Ala Cys Ala Ser Phe Gln Glu

65 70 75 80

Leu Trp Pro Ser Pro Gly Asn Leu Lys Leu Phe Glu Arg Ala Ala Glu

85 90 95

Lys Gly Asn Phe Glu Ala Ala Val Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Leu Tyr

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Asn Glu Gly Leu Ser Val Ser Asp Glu Ala Arg Ala Glu Val Asn Gly

115 120 125

Leu Lys Ala Ser Arg Phe Phe Ser Leu Ala Glu Arg Leu Asn Val Gly

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Ala Ala Pro Phe Ile Trp Leu Phe Ile Arg Pro Pro Trp Ser Val Ser

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Gln Leu Gln Arg Thr His Lys Ala Ser Ile Leu His Cys Leu Gly Arg

180 185 190

Val Leu Ser Leu Phe Glu Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Ala His Asp

195 200 205

Leu Phe Glu Glu Ala Ala His Gln Gly Cys Leu Thr Ser Ser Tyr Leu

210 215 220

Leu Trp Glu Ser Asp Arg Arg Thr Asp Val Ser Asp Pro Gly Arg Cys

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Leu His Ser Phe Arg Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Ala Lys Gly Cys Trp

245 250 255

Glu Ala Gln Leu Ser Leu Ala Lys Ala Cys Ala Asn Ala Asn Gln Leu

260 265 270

Gly Leu Glu Val Arg Ala Ser Ser Glu Ile Val Cys Gln Leu Phe Gln

275 280 285

Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Gln Val Phe Ser Val Gln Lys Gly

290 295 300

Leu Asn Asp Thr Met Arg Tyr Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val

305 310 315 320

Ala Thr Met Lys Asp Phe Thr Ser Leu Cys Leu His Leu Thr Val Glu

325 330 335

Cys Val Asp Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Leu Val Pro Arg Tyr Arg Leu

340 345 350

Gln Leu Leu Gly Ile Ala Cys Met Val Ile Cys Thr Arg Phe Ile Ser

355 360 365

Lys Glu Ile Leu Thr Ile Arg Glu Ala Val Trp Leu Thr Asp Asn Thr

370 375 380

Tyr Lys Tyr Glu Asp Leu Val Arg Met Met Gly Glu Ile Val Ser Ala

385 390 395 400

Leu Glu Gly Lys Ile Arg Val Pro Thr Val Val Asp Tyr Lys Glu Val

405 410 415

Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Glu Leu Arg Thr Gln His Leu Cys Ser

420 425 430

Phe Leu Cys Glu Leu Ser Leu Leu His Thr Ser Leu Ser Ala Tyr Ala

435 440 445

Pro Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr His

450 455 460

Gly Gln Thr Gln Pro Trp Thr Thr Gln Leu Trp Asp Leu Thr Gly Phe

465 470 475 480

Ser Tyr Glu Asp Leu Ile Pro Cys Val Leu Ser Leu His Lys Lys Cys

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Phe His Asp Asp Ala Pro Lys Asp Tyr Arg Gln Val Ser Leu Thr Ala

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Val Lys Gln Arg Phe Glu Asp Lys Arg Tyr Gly Glu Ile Ser Gln Glu

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Glu Val Leu Ser Tyr Ser Gln Leu Cys Ala Ala Leu Gly Val Thr Gln

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Ser Leu Gln Glu Arg Ile Asn Leu Cys Ile His Ser Glu Glu Glu Asp

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Met Gly Ser Gly Gly Val Val His Cys Arg Cys Ala Lys Cys Phe Cys

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Tyr Pro Thr Lys Arg Arg Ile Arg Arg Arg Pro Arg Asn Leu Thr Ile

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Leu Ser Ala Ala Glu Asp Val Leu Phe His Ile Leu Lys Trp Leu Ser

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Leu Val Asp Asn His Ala Ser Val Trp Ala Cys Ala Ser Phe Gln Glu

65 70 75 80

Leu Trp Pro Ser Pro Gly Asn Leu Lys Leu Phe Glu Arg Ala Ala Glu

85 90 95

Lys Gly Asn Phe Glu Ala Ala Val Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Leu Tyr

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Asn Glu Gly Leu Ser Val Ser Asp Glu Ala Arg Ala Glu Val Asn Gly

115 120 125

Leu Lys Ala Ser Arg Phe Phe Ser Leu Ala Glu Arg Leu Asn Val Gly

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Ala Ala Pro Phe Ile Trp Leu Phe Ile Arg Pro Pro Trp Ser Val Ser

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Gly Ser Cys Cys Lys Ala Val Val His Glu Ser Leu Arg Ala Glu Cys

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Gln Leu Gln Arg Thr His Lys Ala Ser Ile Leu His Cys Leu Gly Arg

180 185 190

Val Leu Ser Leu Phe Glu Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Ala His Asp

195 200 205

Leu Phe Glu Glu Ala Ala His Gln Gly Cys Leu Thr Ser Ser Tyr Leu

210 215 220

Leu Trp Glu Ser Asp Arg Arg Thr Asp Val Ser Asp Pro Gly Arg Cys

225 230 235 240

Leu His Ser Phe Arg Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Ala Lys Gly Cys Trp

245 250 255

Glu Ala Gln Leu Ser Leu Ala Lys Ala Cys Ala Asn Ala Asn Gln Leu

260 265 270

Gly Leu Glu Val Arg Ala Ser Ser Glu Ile Val Cys Gln Leu Phe Gln

275 280 285

Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Gln Val Phe Ser Val Gln Lys Gly

290 295 300

Leu Asn Asp Thr Met Arg Tyr Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val

305 310 315 320

Ala Thr Met Lys Asp Phe Thr Ser Leu Cys Leu His Leu Thr Val Glu

325 330 335

Cys Val Asp Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Leu Val Pro Arg Tyr Arg Leu

340 345 350

Gln Leu Leu Gly Ile Ala Cys Met Val Ile Cys Thr Arg Phe Ile Ser

355 360 365

Lys Glu Ile Leu Thr Ile Arg Glu Ala Val Trp Leu Thr Asp Asn Thr

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Tyr Lys Tyr Glu Asp Leu Val Arg Met Met Gly Glu Ile Val Ser Ala

385 390 395 400

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Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Glu Leu Arg Thr Gln His Leu Cys Ser

420 425 430

Phe Leu Cys Glu Leu Ser Leu Leu His Thr Ser Leu Ser Ala Tyr Ala

435 440 445

Pro Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr His

450 455 460

Gly Gln Thr Gln Pro Trp Thr Thr Gln Leu Trp Asp Leu Thr Gly Phe

465 470 475 480

Ser Tyr Glu Asp Leu Ile Pro Cys Val Leu Ser Leu His Lys Lys Cys

485 490 495

Phe His Asp Asp Ala Pro Lys Asp Tyr Arg Gln Val Ser Leu Thr Ala

500 505 510

Val Lys Gln Arg Phe Glu Asp Lys Arg Tyr Gly Glu Ile Ser Gln Glu

515 520 525

Glu Val Leu Ser Tyr Ser Gln Leu Cys Ala Ala Leu Gly Val Thr Gln

530 535 540

Asp Ser Pro Asp Pro Pro Thr Phe Leu Ser Thr Gly Glu Ile His Ala

545 550 555 560

Phe Leu Ser Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Lys Arg Lys Arg Glu Asn

565 570 575

Ser Leu Gln Glu Asp Arg Gly Ser Phe Val Thr Thr Pro Thr Ala Glu

580 585 590

Leu Ser Ser Gln Glu Glu Thr Leu Leu Gly Ser Phe Leu Asp Trp Ser

595 600 605

Leu Asp Cys Cys Ser Gly Tyr Glu Gly Asp Gln Glu Ser Glu Gly Glu

610 615 620

Lys Glu Gly Asp Val Thr Ala Pro Ser Gly Ile Leu Asp Val Thr Val

625 630 635 640

Val Tyr Leu Asn Pro Glu Gln His Cys Cys Gln Glu Ser Ser Asp Glu

645 650 655

Glu Ala Cys Pro Glu Asp Lys Gly Pro Gln Asp Pro Gln Ala Leu Ala

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Leu Asp Thr Gln Ile Pro Ala Thr Pro Gly Pro Lys Pro Leu Val Arg

675 680 685

Thr Ser Arg Glu Pro Gly Lys Asp Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Ser

690 695 700

Val Ser Thr Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Asp Gly Gly Leu Gly Ala

705 710 715 720

Leu Pro Gln Pro Thr Ser Val Leu Ser Leu Asp Ser Asp Ser His Thr

725 730 735

Gln Pro Cys His His Gln Ala Arg Lys Ser Cys Leu Gln Cys Arg Pro

740 745 750

Pro Ser Pro Pro Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Gln Val Lys Arg Ile

755 760 765

Asn Leu Cys Ile His Ser Glu Glu Glu Asp Met Asn Leu Gly Leu Val

770 775 780

Arg Leu

785

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

Leu Ala Leu Lys Leu Ala Gly Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu

1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu

1 5 10 15

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

Leu Ser Ser His Phe Gln Glu Leu Ser Ile

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

Asp His Ala Glu Lys Val Ala Glu Lys Leu Glu Ala Leu Ser Val

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

Gln Leu Val Glu Glu Leu Leu Lys Ile Ile Cys Ala Phe Gln Leu

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 17

Thr Asn Leu Glu Ala Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu

1 5 10 15

Claims (53)

1.一种核酸分子，其包括经修饰的细胞周期蛋白F多肽的编码序列，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括异源核输出信号(NES)。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述NES包括选自以下的氨基酸序列：LPPLERLTL(SEQ ID NO:8)、LQLPPLERLTLD(SEQ ID NO:9)、LALKLAGLDL(SEQ ID NO:10)、PLQLPPLERLTL(SEQ ID NO:11)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:12)、LSSHFQELSI(SEQ IDNO13)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:14)、DHAEKVAEKLEALSV(SEQ ID NO:15)、QLVEELLKIICAFQL(SEQ ID NO:16)和TNLEALQKKLEELEL(SEQ ID NO:17)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，其中所述NES位于所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的C末端或N末端。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽在一种或两种内源性核定位信号(NLS)中包括NLS失活修饰。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽，内源性NLS的全部或一部分的缺失。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置20-28处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置568-574处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或与其具有至少或约95％序列同一性的序列。

9.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括包含内源性NLS的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代。

10.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括用非碱性氨基酸对K20、R21、R22、R24、R25、R26和R28中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQ IDNO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F。

11.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括用非碱性氨基酸对R568、R569、K571、R572、K574和R574中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，PEST结构域的全部或一部分的缺失。

13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述PEST结构域的在氨基酸位置582-766处的至少或约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或180个氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

14.一种核酸分子，其编码经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽，PEST结构域的全部或一部分的缺失。

15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述PEST结构域的在氨基酸位置582-766处的至少或约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或180个氨基酸的缺失，其中编号相对于SEQID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

16.根据权利要求14或15所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列或与其具有至少或约95％序列同一性的序列。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽进一步包括异源核输出信号(NES)。

18.根据权利要求17所述的核酸分子，其中所述NES包括选自以下的氨基酸序列：LPPLERLTL(SEQ ID NO:8)、LQLPPLERLTLD(SEQ ID NO:9)、LALKLAGLDL(SEQ ID NO:10)、PLQLPPLERLTL(SEQ ID NO:11)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:12)、LSSHFQELSI(SEQ IDNO13)、ERFEMFRELNEALEL(SEQ ID NO:14)、DHAEKVAEKLEALSV(SEQ ID NO:15)、QLVEELLKIICAFQL(SEQ ID NO:16)和TNLEALQKKLEELEL(SEQ ID NO:17)。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的核酸分子，其中所述NES位于所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的C末端或N末端。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽在一种或两种内源性核定位信号(NLS)中包括NLS失活修饰。

21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括相对于SEQ ID NO:2中所示的野生型细胞周期蛋白F多肽，内源性NLS的全部或一部分的缺失。

22.根据权利要求14至21中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置20-28处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

23.根据权利要求14至22中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽，来自所述NLS的在氨基酸位置568-574处的氨基酸残基中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基的缺失，其中编号相对于SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽。

24.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括包含内源性NLS的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代。

25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括用非碱性氨基酸对K20、R21、R22、R24、R25、R26和R28中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQ IDNO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F。

26.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述NLS失活修饰包括用非碱性氨基酸对R568、R569、K571、R572、K574和R574中的一个或多个进行氨基酸取代，其中编号相对于SEQID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽与TDF-43结合。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽保留SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽的TDF-43结合能力的至少或约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括在SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽的位置292-405处的细胞周期蛋白结构域的至少或约20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或110个氨基酸残基。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽形成Skp1-Cul1-F框(SCF)E3泛素-蛋白质连接酶复合物。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽保留SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽形成Skp1-Cul1-F框(SCF)E3泛素-蛋白质连接酶复合物的能力的至少或约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽包括在SEQ ID NO:2中所示的所述野生型细胞周期蛋白F多肽的位置29-76处的F框的至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个或45个氨基酸残基。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽在神经元中表达或递送至神经元时在所述神经元的细胞质中积聚和/或定向至所述神经元的细胞质。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的核酸分子，其包括表达构建体，所述表达构建体包括可操作地连接到所述经修饰的细胞周期蛋白F多肽的所述编码序列的启动子。

35.一种经修饰的细胞周期蛋白F多肽，其由根据权利要求1至34中任一项所述的核酸分子编码。

36.一种递送媒剂，其包括根据权利要求1至34中任一项所述的核酸分子或根据权利要求35所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽。

37.根据权利要求36所述的递送媒剂，其中所述递送媒剂是病毒载体。

38.根据权利要求37所述的递送媒剂，其中所述病毒载体选自腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

39.根据权利要求37或权利要求38所述的递送媒剂，其中所述病毒载体是嗜神经病毒载体。

40.根据权利要求37至39中任一项所述的递送媒剂，其中所述病毒载体选自rAAV2/1、rAAV2/8和rAAV2/9。

41.根据权利要求36所述的递送媒剂，其中所述递送媒剂是非病毒载体。

42.根据权利要求41所述的递送媒剂，其中所述非病毒载体选自大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包含水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。

43.一种用于增强神经元的存活、抑制神经元的变性、抑制神经元中的异常蛋白质积聚、抑制神经元中的聚集或不溶性TDP-43积聚的方法，所述方法包括以下、由或基本上由以下组成：将所述神经元暴露于根据权利要求1至34中任一项所述的核酸分子、根据权利要求35所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或根据权利要求36至42中任一项所述的递送媒剂。

44.一种用于治疗患有神经退行性病状或处于罹患神经退行性病状的风险中的受试者的方法，所述方法包括以下、由或基本上由以下组成：向所述受试者施用根据权利要求1至34中任一项所述的核酸分子、根据权利要求35所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或根据权利要求36至42中任一项所述的递送媒剂。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述神经退行性病状与神经元TDP-43蛋白病相关。

46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述受试者患有家族性神经退行性病状。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述家族性神经退行性病状选自家族性ALS、家族性FTD和家族性AD。

48.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述受试者患有散发性神经退行性病状。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述散发性神经退行性病状选自散发性ALS、散发性FTD和散发性AD。

50.根据权利要求43所述的方法，其中所述神经元是运动神经元。

51.根据权利要求1至34中任一项所述的核酸分子、根据权利要求35所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或根据权利要求36至42中任一项所述的递送媒剂在制备用于治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状的发展的药物中的用途。

52.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至34中任一项所述的核酸分子、根据权利要求35所述的经修饰的细胞周期蛋白F多肽或根据权利要求36至42中任一项所述的递送媒剂，所述试剂盒用于治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性病状的发展的方法中。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其进一步包括用于执行所述方法的说明材料。