CN117230110A - 一种病毒介导的向马铃薯中引入Sli基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种病毒介导的向马铃薯中引入Sli基因的方法，具体是构建含有Sli基因的TRV‑P19病毒表达载体，并通过所述载体将外源显性Sli基因导入栽培种马铃薯中。本发明通过烟草脆裂病毒载体将野生品种的St‑Sli的基因引入到栽培种四倍体马铃薯中，打破其自交不亲和性，开花结果并获得自交种子，其实验相较于传统研究中通过转基因的方法获得自交种子，时间大大缩短，病毒侵染的方法也可以在短时间内侵染不同品种的马铃薯，相较于传统的块茎繁殖，利用种子进行种植，是极大的技术进步，降低极大降低马铃薯薯块的运输成本，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种病毒介导的向马铃薯中引入Sli基因的方法。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上最重要的块茎类粮食作物，是继玉米、水稻、小麦之后的全球第四大粮食作物，在保障国家粮食安全、经济发展等方面起着重要的作用。长期以来，我国马铃薯的研究和生产主要以几个来源于欧洲的高产量、强抗逆的四倍体栽培种马铃薯为对象。但欧洲马铃薯品种普遍存在亲和不自交(SI)现象，致使其育种困难，种质资源少，生产单一化。马铃薯的自交不亲和性(self-incompatibility,SI)系统在自然界中广泛存在，是为花柱基因——S基因所控制，其中主要包括控制花粉管生长的SLF(S-locus F-box)基因和控制花柱抗性的S-RNase基因,有实验表明，在不相容的情况下，非泛素化的S-RNase以某种方式进入花粉管的细胞质，通过降解破坏花粉的核糖体RNA来抑制花粉管的伸长和生长。
利用野生马铃薯(Solanum chacoense Bitt.)中鉴定的S位点抑制因子(S-locusinhibitor,Sli)是传统克服自交不亲和的一种方法。黄三文等人通过转基因手段将Sli基因导入二倍体马铃薯，从而打破其自交不亲和性，开花结果并获得自交种子。但，目前二倍体马铃薯的产量低于商业化四倍体马铃薯。然而，通过转基因技术向商业化四倍体马铃薯引入Sli基因的方法存在转基因育种周期长(10-15年)、效率低和遗传分析非常复杂的问题。
植物病毒在侵染植物后，可在植物体内进行大量增殖，有些病毒可终生持续带毒，植物体内也存在一系列防御机制，如植物的RNA沉默机制和病毒编码沉默抑制子就是防御—反防御斗争的经典作用方式。烟草脆裂病毒被广泛用于构建病毒诱导的基因沉默载体、外源蛋白表达载体和产生引导RNA的基因编辑体。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种病毒介导的克服马铃薯自交不亲和性的方法。
一种病毒介导的克服马铃薯自交不亲和性的方法，具体为：
构建含有Sli基因的TRV-P19病毒表达载体，并通过所述载体将外源显性Sli基因导入栽培种马铃薯中，获得。
作为优选，所述Sli基因为St-Sli基因。
作为优选，所述方法包括如下步骤：
S1、获取野生马铃薯(Solanum chacoense Bitt.)的Sli同源基因St-Sli，然后设计TRV病毒的表达载体构建的引物；
S2、提取野生马铃薯的RNA，将经逆转录获得的高质量cDNA作为靶基因片段的扩增模板，用同源重组方式将片段导入线性化处理的pTRV2载体；
S3、将TRV1农杆菌与St-Sli-TRV2农杆菌按体积1:1混合，混合后瞬时转化本氏烟，接种后7天，收集病液，通过汁液摩擦接种马铃薯叶片的方法，将已构建并表达目的基因的TRV病毒转染到马铃薯上。
作为优选，所述马铃薯为四倍体马铃薯。
本发明的第二个目的是提供一种自交亲和的马铃薯的培育方法，具体为构建含有Sli基因的TRV-P19病毒表达载体，并通过所述载体将外源显性Sli基因导入栽培种马铃薯四倍体中，获得自交亲和的马铃薯。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明成功通过烟草脆裂病毒载体将野生品种的St-Sli的基因引入到栽培种四倍体马铃薯中，打破其自交不亲和性，开花结果并获得自交种子，其实验相较于传统研究中通过转基因的方法导入获得自交种子，时间大大缩短，病毒侵染的方法也可以在短时间内侵染不同品种的马铃薯，这是一种快速，高通量的马铃薯育种技术，相较于传统的块茎繁殖，利用种子进行种植，是极大的技术进步，降低极大降低马铃薯薯块的运输成本，提高经济效益。本发明对于马铃薯的品质提高也具有重要意义，可在短时间内获得大量样本的纯合四倍体马铃薯自交系，对于其产量和抗病性的提高提供了有效的新途径，同时也为其他作物自交育种提供借鉴。
附图说明
图1为通过PDS沉默表型验证TRV病毒对于马铃薯的侵染，其中A为载体构建图接种，B为StPDSi-TRV约14天的烟草，C为烟草马铃薯TRV检测，泳道从左到右1：Nb-StPDSi-TRV-1、2：Nb-StPDSi-TRV-2、3：Nb-WT、4：St-St-PDSi-TRV-1、5：St-StPDSi-TRV-2、6：St-WT、7：ck-、Marker：Takara DL5000；
图2为马铃薯TRV检测结果，泳道从左到右Marker:Takara DL2000、2：St-sli、3：Sl-sli、4：Nb-sli、5：St-WT；
图3为摩擦接种7-28天后，侵染植株与WT植株中不同Sli基因表达量差异，从左到右依次为St-Sli、Sl-Sli、Nb-Sli,不同星号表示差异显著(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；
图4为马铃薯表型，其中A为开花的马铃薯植株，B为凋落的马铃薯花枝，C为引入外源St-Sli基因的马铃薯果实，D为成熟的马铃薯果实，E为成熟的马铃薯果实剖面，F为马铃薯自交所得实生种子。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
1.材料与方法
1.1实验材料
栽培种马铃薯为实验材料，野生马铃薯品种(Solanum chacoense Bitt.)为Sli基因克隆来源；Cloning Vector为中间载体；烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)的双组份侵染克隆，pTRV1(pYL196)和pTRV2(pYL156)改造载体为最终病毒载体；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101作为病毒侵染介体，本氏烟(Nicotianabenthamiana)作为TRV的中间寄主，上述实验材料均由本发明室提供，植物生长于25℃恒温温室，光照16/黑暗8h。栽培种马铃薯前期置于恒温温室，后期移栽至室外。
1.2实验处理
1.2.1引物设计与载体构建
首先通过访问茄科植物信息库Solanaceae Genomics Network，获取了野生马铃薯、番茄(Solanum lycopersicum L.,Sl)和烟草三个物种的Sli同源基因St-Sli、Sl-Sli和Nb-Sli的基因序列。之后利用生物综合软件SnapGene版本4.2.4进行基于TRV病毒的表达载体构建的引物设计，引物设计具体见实验记录002表1。提取三个物种的RNA将经逆转录获得的高质量cDNA作为靶基因片段的扩增模板，用同源重组方式将片段导入线性化处理的pTRV2载体(图1A)，测序验证正确的阳性克隆载体通过电击法导入农杆菌GV3101。
1.2.2马铃薯处理
将TRV1农杆菌分别和St-Sli-TRV2、Sl-Sli-TRV2、NB-Sli-TRV2农杆菌按体积1:1混合，混合后瞬时转化本氏烟，接种后7天，收集病液，通过汁液摩擦接种马铃薯叶片的方法，将已构建并表达目的基因的TRV病毒转染到马铃薯上。收集第7、10、14、21、28天的被St-Sli-TRV、Sl-Sli-TRV、Nb-Sli-TRV侵染的马铃薯样品，液氮冷冻后在-80℃冰箱中保存。
1.3基因的qRT-PCR及数据分析
提取采集样品的总RNA，所用试剂盒为Easy Plant RNA Extraction Kit，并通过荧光定量+逆转录套装(购自易思得生物科技有限公司)逆转录得到cDNA，配置qRT-PCR体系，使用CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)对本发明中Sli基因表达量进行检测。以EF1a基因为内参基因，将未作任何处理的栽培种马铃薯的Sli基因表达量作为对照，使用法对荧光定量PCR的数据进行分析。
1.4数据处理
实验数据采用IBM SPSS Statistics 20进行t检验，Origin 2021作图。所有结果均包含三个重复，误差棒表示3次重复的标准差(SD)，t检验用星号表示显著性差异(*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001)
2.结果与分析
2.1通过PDS沉默表型验证TRV病毒对于马铃薯的侵染
在侵染马铃薯前，先行使用PDS沉默载体检测VGIS病毒载体TRV在马铃薯植株中的侵染和复制能力，以及是否可以实现基因沉默。PDS基因一般作为TRV诱导基因沉默的报告基因，首先选取本氏烟草摸索了实现基因沉默所需的条件。
接种了含有StPDSi-TRV质粒的农杆菌的烟草，在培养14天左右便出现了较为明显的叶片白化和光敏感症状(图1B)，白化程度随时间的增加而增加，并且新生叶也呈现白化状态，表明TRV在烟草中稳定增殖并表达；相同处理马铃薯的，并未表现出明显的白化症状，但对马铃薯和烟草进行叶片组织TRV检测，由呈现电泳结果可知TRV成功侵染马铃薯和烟草，并在其叶片组织中较稳定地表达(图1C)，本发明构建的TRV载体能够侵染马铃薯植株，并使目的基因表达。
2.2病毒介导的不同茄科植物来源Sli基因在马铃薯上的检测
TRV载体构建PCR鉴定成功后经测序验证无误后，转入农杆菌GV3101，转化本氏烟并收集病叶，获得富集TRV病毒的烟草研磨汁。通过汁液摩擦接种马铃薯叶片的方法，将在烟草中含有的已构建并表达Sil基因的TRV病毒转染到马铃薯上。经检测，携带外源基因St-Sli、Nb-Sli的TRV已成功侵入马铃薯植株(图2)，重新复接后Sl-Sli-TRV也成功侵染。
2.3三种同源Sli基因接种后的表达量测定
St-Sli基因来自野生二倍体马铃薯品种Solanum chacoense Bitt.，是其显性基因S因座抑制子，负责分解花柱不相容反应。经验证PDS基因沉默载体的有效性基础上，通过烟草研磨液、农杆菌接种等方式将带有Sli基因的载体转入马铃薯植株中，接种后的植株分别于接种后第7/10/14/21/28日采样，通过qPCR进行Sli基因表达量的测定，结果显示(图3)，从表达量变化趋势上看，7日后，St-Sli侵染的马铃薯植株基因表达量与野生型有显著差异，随着时间推移，表达水平呈上升趋势，至28日基因表达量与野生型植株有极显著的差异；经Sl-Sli侵染后，7日基因的表达量下调，10至28日基因表达量明显上调，与阴性对照组有极显著差异；对于Nb-Sli侵染的马铃薯植株，7至14日定量结果与WT植物无显著差异；接种21日后，Sli基因表达量上升，较野生型显著性提高。
从表达量上看，总体而言，St-Sli基因的表达量为三者最高，Sl-Sli居中，Nb-Sli表达量为三者中最小，且后二者数值波动较大。在侵染28日内，接种了St-Sli基因的植株中始终有载体病毒的表达，而对于Sl-Sli与Nb-Sli基因，二者表达量较低。
2.4表型观察
接种TRV病毒且马铃薯植株开花后，为提高自花授粉的效率，使用的人工授粉方法，收集花粉并将其授粉至原先的马铃薯植株上。观察马铃薯植株结实情况并记录，如图4所示，图4中：开花的马铃薯植株(A)，凋落的马铃薯花枝(B)，引入外源St-Sli基因的马铃薯果实(C)，成熟的马铃薯果实(D)，成熟的马铃薯果实剖面(E)，马铃薯自交所得实生种子(F)。导入三种Sli基因的马铃薯植株均实现开花，其中St-Sli基因成功表达的马铃薯结出了果实，与三种同源Sli基因接种后的表达量测定结果相比，马铃薯实际结实率相对较低，可能由于TRV反复侵染导致植株育性不高，或是因为人工传粉效率有限。最终从成熟的果实中剖取获得自交种子。
Sli蛋白参与了花粉管的生长和花粉的成熟过程，比较分析定量检测和表型观察，仅接种了St-Sli基因的马铃薯植株有较高且稳定的表达量，在其开花期后结果，并获得了实生种子，其果径为2厘米，青色，种子成熟后果皮不变色，内部种子发育外形正常无异，其育性需进一步研究；其余二者定量值相对较低，且均未有果实产生。此外，作为阴性对照的同一期栽培的未引入外源Sli基因的同种四倍体马铃薯在其花期后未结果产生实生种子；本发明中通过PCR和结果表型初步表明本研究所构建的外源Sli基因病毒表达载体在马铃薯中成功表达并赋予四倍体马铃薯花粉受精的自我相容性，进一步还需要从蛋白互做方面的实验进一步验证病毒介导的Sli基因在四倍体马铃薯中的功能及其解除自交不育的机制，另外对于不同来源的Sli蛋白在促进马铃薯花粉发育的过程中功能差异性研究来解释St-Sli蛋白具有较高的调控能力的原因。
Claims (5)
1.一种病毒介导的克服马铃薯自交不亲和性的方法，其特征在于，构建含有Sli基因的TRV-P19病毒表达载体，并通过所述载体将外源显性Sli基因导入栽培种马铃薯中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Sli基因为St-Sli基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、获取野生马铃薯的Sli同源基因St-Sli，然后设计TRV病毒的表达载体构建的引物；
S2、提取野生马铃薯的RNA，将经逆转录获得的高质量cDNA作为靶基因片段的扩增模板，用同源重组方式将片段导入线性化处理的pTRV2载体；
S3、将TRV1农杆菌与St-Sli-TRV2农杆菌按体积1:1混合，混合后瞬时转化本氏烟，接种后7天，收集病液，通过汁液摩擦接种马铃薯叶片将已构建并表达目的基因的TRV病毒转染到马铃薯上。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述马铃薯为四倍体马铃薯。
5.一种自交亲和的马铃薯的培育方法，其特征在于，构建含有Sli基因的TRV-P19病毒表达载体，并通过所述载体将外源显性Sli基因导入栽培种马铃薯四倍体中，获得自交亲和的马铃薯。
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