CN117209584A - 一种刺激细胞同时产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的多肽、重组多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种刺激细胞同时产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的多肽、重组多肽及其用途。本发明提供了一种多肽，其中，所述多肽来自人干扰素基因刺激因子(STING)蛋白或其同源蛋白，所述多肽能够：(a)抑制STING与ESCRT的相互作用，优选抑制STING与ESCRT的亚基TSG101的相互作用；(b)抑制STING的降解；和/或，(c)促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子。本发明提供的多肽同时刺激细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子，可以用于抗病菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节剂、疫苗佐剂等，以及可以用于现有一切利用干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子治疗的疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种刺激细胞同时产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的多肽、重组多肽及其用途。
背景技术
干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)作为重要的免疫相关基因，被激活后可以诱导干扰素和炎症因子产生。STING是一个内质网蛋白，由N端的4次跨膜区和C端的环二苷酸结合区构成。在结合了环二核苷酸后，STING多聚化并被转运出内质网，到达高尔基体、内体、最终在溶酶体内降解。在此过程中STING招募TBK1，磷酸化下游的转录因子IRF3和NF-κB，最终激活的IRF3和NF-κB进入细胞核，激活下游控制的干扰素、多种干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)和多种炎症因子的表达。产生的干扰素、多种干扰素刺激基因产物和多种炎症因子具有抗肿瘤、抗病菌、抗病毒和疫苗佐剂等作用。在STING从内质网到溶酶体的运输过程，STING的活性在任何一步均有可能被调控。例如，抑制STING从内质网运出会抑制STING的激活；抑制STING从高尔基体运出会激活其活性。但是STING在高尔基体后的活性调控并不是很清楚。而且现在也没有针对STING在高尔基体后活性调控的小分子或小肽。如果研发出这种小分子或小肽，便可以利用这种小分子或小肽同时调控干扰素、多种干扰素刺激基因产物和多种炎症因子的表达来达到抗肿瘤、抗病菌、抗病毒和疫苗佐剂等作用。
已有针对激活STING的小分子化合物，例如2′3′-cGAMP和DMXAA，在临床前实验。2′3′-cGAMP作为STING的内源配体，可以激活STING的活性和下游的细胞因子表达。可以通过激活和招募CD8+T细胞抑制肿瘤生长，也可以与免疫监察点抑制剂联用产生更好的抗肿瘤效果(临床试验识别号：NCT03010176,NCT03172936)。然而对于STING激活剂2′3′-cGAMP，由于其容易被血清中细胞外核苷二磷酸焦磷酸酶/磷二酯酶1(EctonucleotidePyrophosphatase/Phosphodiesterase 1,ENPP1)降解，导致其效果可能不够理想。
DMXAA通过激活鼠源STING和破坏肿瘤血管结构诱导肿瘤相关巨噬细胞的激活并释放趋化因子达到抗肿瘤的目的。然而，DMXAA只能结合鼠的STING而不能结合人的STING，导致其在人体内没有作用。
现相关疾病的临床治疗使用单独生产的干扰素、干扰素刺激基因产物或炎症因子，例如单独使用用于恶性肿瘤：包括毛细胞白血病、慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。用于病毒性皮肤病：如尖锐湿疣、单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹等。用于某些炎症性皮肤病：如白塞病、遗传过敏性皮炎、瘢痕疙瘩、硬皮病、环状肉芽肿等。使用原核系统表达的干扰素或炎症因子产量高成本低，但因缺少翻译后修饰，导致作用效果较差且长期使用容易产生对应的抗体，降低作用效果。使用哺乳动物细胞生产的干扰素或炎症因子具有转录后修饰，效果较好，但成本较高。
此外，哺乳动物细胞生产的干扰素、干扰素刺激基因产物或炎症因子一般为分别生产，在治疗疾病时可能需要根据实际需要，进行比例调配，但对于单独的病人个体很难确认最适比例，也无法产生干扰素或炎症因子以外未知的有利因素的影响。
引用文献1、2和3公开了STING由转运必需内体分选复合物(endosomal sortingcomplex required for transport,ESCRT)驱动的基于泛素化的微自噬降解。敲除ESCRT的组分Tsg101和Vps4，导致STING囊泡在胞质溶胶中积聚，产生持续的I型干扰素反应。然而引用文献1、2和3并未公开与申请人所描述的机制来阻断ESCRT对STING的作用以及方法和试剂，尤其是小分子或小肽等试剂，以调控STING的活性。
引用文献
引用文献1：Kuchitsu Y,Mukai K,Uematsu R,et al.STING signalling isterminated through ESCRT-dependent microautophagy of vesicles originatingfrom recycling endosomes.Nat Cell Biol.2023；25(3):453-466.
引用文献2：Gentili M,Liu B,Papanastasiou M,Dele-Oni D,et al.ESCRT-dependent STING degradation inhibits steady-state and cGAMP-inducedsignalling.Nat Commun.2023Feb 4；14(1):611.
引用文献3：Balka KR,Venkatraman R,Saunders TL,et al.Termination ofSTING responses is mediated via ESCRT-dependent degradation.EMBO J.2023Jun15；42(12):e112712.
发明内容
发明要解决的问题
一旦STING被激活，STING会诱导下游干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子的表达，同时STING也会被送到溶酶体中降解从而终止其活性。通过抑制STING的降解，可以延长STING激活的时间，提高干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子的表达。
引用文献1，2和3虽然公开了ESCRT通过泛素机制驱动的微自噬降解STING，然而引用文献1，2和3并未公开与本发明后文将描述的机制来阻断ESCRT对STING的作用，也未公开同样的手段阻断ESCRT(例如其TSG101)和STING的相互作用，来调控STING的活性。
本发明创造性的发现了STING和ESCRT的TSG101的相互作用区段，并设计、合成了该区段相对应的多肽。并验证了该肽段具有调控STING活性以及调控对干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子表达的活性。
用于解决问题的方案
本发明的第一方面，提供了一种多肽，其中，所述多肽来自人干扰素基因刺激因子(STING)蛋白或其同源蛋白，所述多肽能够：
(a)抑制STING与ESCRT的相互作用，优选抑制STING与ESCRT的亚基TSG101的相互作用；
(b)抑制STING的降解；和/或，
(c)促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子；
以及，优选地，
(d)所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；
(iii)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；或者，
(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
在一些实施方案中，人干扰素基因刺激因子蛋白的同源蛋白包括来自小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(Gallus gallus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、家牛(Bos taurus)、家猪(Sus scrofa)、星型海葵(Starlet sea anemone)、恒河猴(Macacamulatta)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、黄毛狐蝠(Eidolon helvum)、斑马鱼(Danio rerio)或绵羊(Ovis aries)的STING蛋白。
在一些实施方案中，来自人干扰素基因刺激因子蛋白的同源蛋白的多肽选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项：
(v)以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列；
(vi)与SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列具有至少70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性；
(vii)在SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性；或者，
(viii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
在一些实施方案中，所述多肽包括在(i)或(v)所示序列的多肽的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
本发明的第二方面，提供了一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括本发明第一方面所述的多肽，以及与所述多肽融合的外源多肽；可选地，所述外源多肽包括细胞穿透肽，以及，可选的，用于连接所述细胞穿透肽和所述多肽的接头；优选地，所述细胞穿透肽包括TAT细胞穿透肽；更优选地，所述TAT细胞穿透肽的序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列，或包含编码本发明第二方面所述重组多肽的核苷酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含本发明第三方面所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。
本发明的第五方面，提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含本发明第三方面所述的多核苷酸，或本发明第四方面所述的核酸构建体。
本发明的第六方面，提供了一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的重组多肽、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的核酸构建体，或者本发明第五方面所述的重组表达载体。
本发明的第七方面，提供了一种药物或疫苗组合物，其包含本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的重组多肽、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的核酸构建体、本发明第五方面所述的重组表达载体，或本发明第六方面所述的重组宿主细胞；以及，任选的，药学上可接受的载体。
本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的重组多肽、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的核酸构建体、本发明第五方面所述的重组表达载体、或本发明第六方面所述的重组宿主细胞选自以下的任一项用途：
(A)在制备用于促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的试剂的用途；
(B)在制备用于预防和/治疗疾病的药物或疫苗中用途；
(C)与干扰素基因刺激因子(STING)激动剂联合在制备用于预防和/治疗疾病的药物或疫苗中用途；
(D)在制备抑制干扰素基因刺激因子(STING)的降解、提高干扰素基因刺激因子(STING)和/或提高干扰素基因刺激因子(STING)激动剂活性的试剂中的用途；
(E)在制备免疫调节剂或免疫佐剂中的用途；
任选地，所述疾病是与STING相关或经STING调节的疾病；
可选地，所述与STING相关或经STING调节的疾病包括炎症、过敏性或自体免疫疾病、感染性疾病和癌症中的至少一种。
在一些实施方案中，所述STING激动剂包括DMXAA、cGAMP、HT-DNA中的至少一种。
在一些实施方案中，所述干扰素包括I型干扰素，任选的，所述I型干扰素包括IFN-α和IFN-β，优选的，所述I型干扰素包括IFN-β；和/或，所述干扰素刺激基因产物包括CXCL10、IFIT1、ISG15、USP18和CCL8中的至少一种；和/或，所述炎症因子包括TNFα、IL-1β和IL-6中的至少一种。
在一些实施方案中，产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的细胞包括免疫细胞和非免疫细胞；任选地，所述免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞中的至少一种；任选地，所述非免疫细胞包括内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞中的至少一种。
在一些实施方案中，所述疾病是受试者中的疾病；可选地，所述受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
发明的效果
在本发明中的一些实施方案中，发现了STING和ESCRT中的TSG101的相互作用区段，并合成了该区段相对应的多肽。将鼠源和人源的对应多肽与细胞穿透肽相连，直接导入细胞。这些多肽通过抑制STING和ESCRT蛋白TSG101的相互作用和STING的降解，最终导致STING的激活时间延长，下游干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子的表达量显著升高。
在本发明中的一些实施方案中，所述多肽促进干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的表达，并且可以有效地抗病菌、抗病毒、抗肿瘤，也可作为免疫调节剂和免疫佐剂。
本发明中的一些实施方案中，所述多肽只有24个氨基酸，生产快速，成本低，直接进入细胞作用，效果好。
本发明中的一些实施方案中，所述多肽通过激活干扰素或炎症因子的上游通路，除产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子还可以产生很多已知、未知的其他有利影响。更为重要的是，通过这种方式产生的各种细胞因子的比例是机体内部根据自身需要产生的比例，而非人工调配的比例，可以因个体的不同而产生不同的最佳比例。
附图说明
图1-图3.抑制ESCRT的功能促进干扰素β、干扰素刺激基因产物和炎症因子的表达，其中小鼠中相关基因以小写字母表示，人中相关基因以大写字母表示。
图4.抑制ESCRT的功能抑制STING的降解。
图5-图6.STING通过胞质侧的环型序列和ESCRT的亚基TSG101相互作用。
图7.源自人和小鼠的多肽刺激鼠源细胞产生IFN源、干扰素刺激基因产物和炎症因子。
图8.源自人和小鼠的多肽刺激人源细胞产生IFN源、干扰素刺激基因产物和炎症因子。
图9.源自人和小鼠的多肽抑制HSV-1的复制，其中小鼠中相关基因以小写字母表示，人中相关基因以大写字母表示。
图10.不同来源的STING胞质侧的环型序列高度保守。
图11.多肽作用机制示意图。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
本说明书中，术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。
本说明书中，所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本说明书中，氨基酸“添加”指在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸。根据本发明，氨基酸“缺失”指可以从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸。根据本发明，氨基酸“插入”指在氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻。
本说明书中，氨基酸“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代；其中，“取代”可以是保守氨基酸取代。
本说明书中，“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
本说明书中，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
本说明书中，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
本说明书中，术语“重组多肽”或“融合肽”是指以采用基因工程的方法，使两种或两种以上的多肽融合表达。
本说明书中，在两种核酸或多肽比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。
本公开涉及的测定“序列同一性”或“同一性百分比”的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
本说明书中，“中等至非常高等严格条件”包括“中等严格条件”，“中-高严格条件”，“高严格条件”或“非常高严格条件”，其描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法，且可以使用任一种。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。
本说明书中，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
本说明书中，术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、突变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
本说明书中，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
本说明书中，术语“表达载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。
本说明书中，术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
本说明书中，术语“核酸构建体”包含与适合的调控序列有效地连接的编码多肽或结构域或模块的多核苷酸，该调控序列对于在所选细胞或者菌株进行多核苷酸的表达是必需的。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。
本说明书中，术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的突变体多肽、编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。
在本说明书中，术语“受试者”是指人(即，任何年龄段的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))或非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴)、商业相关的哺乳动物(例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或鸟。非人动物可以是处于任何发育阶段的雄性或雌性。非人动物可以是转基因动物或基因工程化动物。
本说明书中，“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
本说明书中，“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的重组免疫细胞，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。
在本说明书中，术语“预防”是指对现在没有和过去没有疾病但有发展成疾病的风险或过去患有疾病，现在没有疾病但有疾病复发风险的受试者的预防性治疗。
本说明书中，“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
在本说明书中，“治疗有效量”是足以在病症的治疗中提供治疗益处或足以延迟或最小化与病症有关的一种或多种症状的量。治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在病症的治疗中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以包括改善总体疗法；减少或避免病症的症状、体征或原因；和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。
在本说明书中，“预防有效量”是足以预防病症或与病症相关的一种或多种症状或预防其复发的量。预防有效量是指单独或与其它药剂组合的治疗剂的量，其在预防病症中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。
在本说明书中，术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”、“可药用的”)是指适当时在施用于动物或人时不产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体及组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包含可以使用作为药学可接受物质之介质的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂及吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。
<多肽>
在本发明的一些方面中，提供了一种多肽，其中，所述多肽来自人干扰素基因刺激因子(STING)蛋白或其同源蛋白。
在一些实施方案中，所述多肽抑制STING与ESCRT的相互作用，具体地，抑制STING与ESCRT的亚基TSG101的相互作用。
在一些实施方案中，所述多肽抑制STING的降解。
在一些实施方案中，所述多肽促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子。
在一些具体的实施方案中，所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；
(iii)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；或者，
(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
在本发明的一些实施方案中，同源蛋白是指氨基酸序列具有明显的同一性或相似性(例如，具有至少70％同一性)，在不同生物体或同一机体内行使相同或相似功能的蛋白质。在本发明另一些实施方案中，同源蛋白指进化上相关的蛋白质，即不同物种中具有相同或相似功能的蛋白质，同一性或相似性较低的蛋白质之间也可能是同源蛋白。
在一些实施方案中，人干扰素基因刺激因子蛋白的同源蛋白包括来自小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(Gallus gallus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、家牛(Bos taurus)、家猪(Sus scrofa)、星型海葵(Starlet sea anemone)、恒河猴(Macacamulatta)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、黄毛狐蝠(Eidolon helvum)、斑马鱼(Danio rerio)或绵羊(Ovis aries)的干扰素基因刺激因子蛋白。
在一些具体的实施方案中，来自人干扰素基因刺激因子蛋白的同源蛋白的多肽选自：
(v)以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列；
(vi)与SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列具有至少70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性；
(vii)在SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性；或者，
(viii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
在一些实施方案中，所述多肽包括在(i)或(v)所示序列的多肽的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
本发明发现了同时刺激细胞产生干扰素(interferon，IFN)、干扰素刺激基因(ISGs)产物和炎症因子(Inflammatory factor)的小肽。其可以用于抗病菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节剂、疫苗佐剂等，以及可以用于现有一切利用干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子治疗的疾病。
<重组多肽>
在本发明的一些方面中，提供了一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括前文<多肽>部分中所述的多肽，以及与所述多肽融合的外源多肽。在本发明中，重组多肽也可称为融合肽。
在一些实施方案中，所述外源多肽包括细胞穿透肽，以及，可选的，用于连接所述细胞穿透肽和所述多肽的接头。
在本说明书中，“细胞穿透肽(Cell-penetrating peptide,CPP)”在本文中可互换使用，并且应理解为涉及相对短的肽(通常小于50个氨基酸)，具有可以进入几乎任何细胞类型的内部的能力。CPP通常是具有高阳离子度的并且富含精氨酸和/或赖氨酸氨基酸。此外，许多有效的CPP是两亲性的，具有一系列疏水性氨基酸。另外，一些CPP可以具有散布在氨基酸之间的脂肪族间隔子，以便调节疏水性、结合性质、两亲性等。CPP具有能够将多种共价(缀合)和/或非共价附着的货物(例如，蛋白质(以及如本发明中的多肽)、寡核苷酸、有机化合物)载入细胞和/或细胞外囊泡(extracellular vehicles,EV)的特殊性质。本发明的CPP包含但不限于转运肽(transportan)、转运肽10、穿透素、MTS、VP22、CADY肽、MAP、KALA、PpTG20、富含脯氨酸的肽、MPG肽、PepFect肽、Pep-1、L-寡聚物、降钙素-肽、富含精氨酸的CPP(例如，多聚精氨酸)、TAT及其组合。
在一些具体的实施方案中，所述细胞穿透肽包括TAT细胞穿透肽。
在一些更具体的实施方案中，所述TAT细胞穿透肽的序列如SEQ ID NO:15所示。
在本说明书中，术语“接头”可指共价接头(例如，共价键)、非共价接头、化学基团或连接两个分子或部分的分子，例如，重组多肽的两个结构域，如多肽和细胞穿透肽。接头可以位于两个基团、分子或其他部分之间或两侧，并通过共价键或非共价相互作用连接到每一个，从而连接这两者。
在一些具体的实施方案中，所述接头可以是AEEA(NH2-PEG2-CH2COOH)。
在一些更具体的实施方案中，所述多肽的N端或C端通过接头(例如AEEA接头)与穿膜肽(例如TAT穿膜肽)连接形成融合肽。
本发明的实施例中示例性的将鼠源和人源的对应肽段与TAT序列相连，直接导入细胞，可以抑制STING和TSG101的相互作用和STING的降解，最终导致STING的激活时间延长，下游干扰素和干扰素刺激基因和炎症因子的表达量显著升高。这些基因表达的升高有效地抑制HSV-1病毒的扩增。这也证实了该肽段诱导下游干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的表达的效果。
<多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞>
在本发明的一些方面中，提供了一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码前文所述的多肽的核苷酸序列，或包含编码前文所述的重组多肽的核苷酸序列。
在本发明的一些方面中，提供了一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含前文所述的多核苷酸，所述的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。
在本发明的一些方面中，提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含前文所述的多核苷酸，或前文所述的核酸构建体。
在本发明的一些方面中，提供了一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体，或者所述的重组表达载体。
<药物、疫苗组合物、用途及方法>
在本发明的一些方面中，提供了一种药物或疫苗组合物，其包含前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体，或所述的重组宿主细胞；以及，任选的，药学上可接受的载体。
在本发明的一些方面中，提供了一种前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞选自以下的任一项用途：
(A)在制备用于促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的试剂的用途；
(B)在制备用于预防和/治疗(或辅助治疗)疾病的药物或疫苗中用途；
(C)与干扰素基因刺激因子(STING)激动剂联合在制备用于预防和/治疗(或辅助治疗)疾病的药物或疫苗中用途；
(D)在制备抑制干扰素基因刺激因子(STING)的降解、提高干扰素基因刺激因子(STING)活性和/或提高干扰素基因刺激因子(STING)激动剂活性的试剂中的用途；
(E)在制备免疫调节剂或免疫佐剂中的用途。
在本发明的一些方面中，提供了一种促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的方法，其包括施用有效量的前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞的步骤。
在本发明的一些方面中，提供了一种前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞，其用于促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子。
在本发明的一些方面中，提供了一种预防和/治疗疾病的方法，其包括施用有效量的前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞的步骤，或者其包括施用有效量的前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞与干扰素基因刺激因子(STING)激动剂的组合的步骤。
在本发明的一些方面中，提供了一种前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞，或者前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞与干扰素基因刺激因子(STING)激动剂的组合，用于预防和/治疗疾病。
在本发明的一些方面中，提供了一种抑制干扰素基因刺激因子(STING)的降解、提高干扰素基因刺激因子(STING)活性和/或提高干扰素基因刺激因子(STING)激动剂活性的方法，其包括施用有效量的前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞的步骤。
在本发明的一些方面中，提供了前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞，其用于抑制干扰素基因刺激因子(STING)的降解、提高干扰素基因刺激因子(STING)活性和/或提高干扰素基因刺激因子(STING)激动剂活性。
在本发明的一些方面中，提供了前文所述的多肽、所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞，其用于免疫调节剂或免疫佐剂。
疾病
在一些实施方案中，所述疾病是与STING相关或经STING调节的疾病。
在一些可选的实施方案中，与STING相关或经STING调节的疾病包括，但不限于炎症、过敏性或自体免疫疾病(例如，多发性硬化症)、感染性疾病(例如新型冠状病毒感染)和癌症中的至少一种(参见例如Sasaki,Nobunari et al.“Targeting the loss of cGAS/STING signaling in cancer.”Cancer science,10.1111/cas.15913.20Jul.2023,doi:10.1111/cas.15913(PMID:37475576)；Liu,Zezhong et al.“A novel STING agonist-adjuvanted pan-sarbecovirus vaccine elicits potent and durable neutralizingantibody and T cell responses in mice,rabbits and NHPs.”Cell research vol.32,3(2022):269-287.doi:10.1038/s41422-022-00612-2(PMID:35046518)；Paulis,Annalaura,and Enzo Tramontano.“Unlocking STING as a Therapeutic AntiviralStrategy.”International journal of molecular sciences vol.24,87448.18Apr.2023,doi:10.3390/ijms24087448(PMID:37108610)；Van Herck,Simon etal.“Delivery of STING agonists for adjuvanting subunit vaccines.”Advanceddrug delivery reviews vol.179(2021):114020.doi:10.1016/j.addr.2021.114020(PMID:34756942)；Humphries,Fiachra et al.“A diamidobenzimidazole STING agonistprotects against SARS-CoV-2infection.”Science immunology vol.6,59(2021):eabi9002.doi:10.1126/sciimmunol.abi9002(PMID:34010139)；Li,Minghua et al.“Pharmacological activation of STING blocks SARS-CoV-2infection.”Scienceimmunology vol.6,59(2021):eabi9007.doi:10.1126/sciimmunol.abi9007(PMD:34010142)；Chen,Tian et al.“The nucleotide receptor STING translocates to thephagosomes to negatively regulate anti-fungal immunity.”Immunity vol.56,8(2023):1727-1742.e6.doi:10.1016/j.immuni.2023.06.002(PMID:37379835)；Watson,Robert O et al.“Extracellular M.tuberculosis DNA targets bacteria forautophagy by activating the host DNA-sensing pathway.”Cell vol.150,4(2012):803-15.doi:10.1016/j.cell.2012.06.040(PMID:22901810)；Marinho,Fabio V et al.“The Emerging Roles of STING in Bacterial Infections.”Trends in microbiologyvol.25,11(2017):906-918.doi:10.1016/j.tim.2017.05.008(PMID:28625530)；Ahn,Jeonghyun,and Glen N Barber.“STING signaling and host defense againstmicrobial infection.”Experimental&molecular medicine vol.51,12 1-10.11Dec.2019,doi:10.1038/s12276-019-0333-0(PMID:31827069))。
在一些具体的实施方案中，所述感染性疾病包括细菌感染和病毒感染中的至少一种。
在一些具体的实施方案中，所述病毒感染包括、但不限于人乳头瘤病毒(HPV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)、流感病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、新冠病毒(SARS-CoV2)等。
在一些具体的实施方案中，所述细菌感染包括、但不限于结核分枝杆菌感染。
在一些具体的实施方案中，所述过敏性或自体免疫疾病包括、但不限于全身性红斑性狼疮、牛皮癣、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、皮肌炎及休格连氏综合征(Sjogren'ssyndrome；SS)。
在一些具体的实施方案中，所述癌症包括、但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
在一些更具体的实施方案中，与STING相关或经STING调节的疾病包括、但不限于恶性肿瘤：如毛细胞白血病、慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等；病毒性皮肤病：如尖锐湿疣、单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹等。如某些炎症性皮肤病：如白塞病、遗传过敏性皮炎、瘢痕疙瘩、硬皮病、环状肉芽肿等。
在一些更具体的实施方案中，所述疾病是受试者中的疾病；可选地，所述受试者是哺乳动物；优选地，所述受试者是人。
可以理解的是，如前所述，本发明提供的多肽(以及，所述的重组多肽、所述的多核苷酸、所述的核酸构建体、所述的重组表达载体、或所述的重组宿主细胞)具有抑制干扰素基因刺激因子(STING)的降解、提高干扰素基因刺激因子(STING)活性和/或提高干扰素基因刺激因子(STING)激动剂活性的功能，因此，可以理解的是，本发明提供的多肽在用于预防和/治疗(或辅助治疗)疾病时，也类似于STING激动剂，可以与疫苗或疫苗佐剂联用、与抗病毒/抗病菌药物联用、或与免疫检查点抑制剂联用，从而用于预防或治疗前文所述的疾病。例如，本发明提供的多肽可以与免疫检查点抑制剂联用以用于治疗癌症。
在一些情况下，也可以将本发明提供的多肽与STING激动剂以及疫苗或疫苗佐剂、抗病毒/抗病菌药物、或与免疫检查点抑制剂联用，用于预防或治疗前文所述的疾病。
STING激动剂
在本说明书中，术语“激动剂”是指与STING接触后引起以下一种或多种的任何化合物，例如STING激动剂：(1)刺激或激活STING蛋白，(2)增强、增加或促进、诱导或延长STING的活性、功能或存在和/或(3)增强、增加、促进或诱导STING的表达。激动剂活性可以通过本领域已知的各种测定法在体外测量，例如但不限于细胞信号传导、细胞增殖、免疫细胞活化标记、细胞因子产生的测定。激动剂活性还可以通过测量替代终点的各种测定法在体内测量，例如但不限于测量免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)增殖或细胞因子产生，特别是I型干扰素。
在本发明的一些实施方案中，所述STING激动剂包括，但不限于DMXAA、cGAMP、HT-DNA中的至少一种。
干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子
在一些具体的实施方案中，所述干扰素包括I型干扰素。
在一些更具体的实施方案中，所述I型干扰素包括IFN-α和IFN-β，优选的，所述I型干扰素包括IFN-β。
在一些具体的实施方案中，所述干扰素刺激基因产物包括，但不限于CXCL10、IFIT1、ISG15、USP18和CCL8中的至少一种。所述干扰素刺激基因产物也可以是本领域已知的其他干扰素刺激基因产物。
在一些具体的实施方案中，所述炎症因子包括，但不限于TNFα、IL-1β和IL-6中的至少一种。所述炎症因子也可以是本领域已知的其他炎症因子。
在本发明的一些实施方案中，产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的细胞包括免疫细胞和非免疫细胞。
所述免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞中的至少一种，但不限于此。
所述非免疫细胞包括内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞中的至少一种，但不限于此。
免疫调节剂和免疫佐剂
在本说明书中，免疫调节剂和免疫佐剂都是用于调节和增强免疫系统功能的药物或物质。
免疫调节剂主要通过调节免疫系统的活性和功能来平衡免疫反应，例如，可以通过增强或抑制特定的免疫细胞或分子来调节免疫反应。免疫调节剂常用于治疗免疫相关疾病，如自身免疫疾病、器官移植排斥等。它们可以减轻过度活跃的免疫系统或增强免疫系统的功能。免疫调节剂通常用于有免疫系统异常的患者，如免疫功能低下的患者或免疫失调的患者。综上，免疫调节剂主要用于调节和平衡免疫系统的活性和功能，常用于治疗免疫相关疾病
免疫佐剂则是一种激活免疫系统的物质，作用于抗原上，刺激免疫细胞的活性和抗原呈递的能力。免疫佐剂主要用于增强疫苗的免疫效果，促进疫苗诱导的免疫反应(即疫苗佐剂)。免疫佐剂可以用于广泛的人群，以增强疫苗的免疫效果。综上免疫佐剂主要用于增强疫苗的免疫效果，具有激活免疫系统的作用。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实验材料
HT-DNA(生产商：Sigma,货号：438545-06-3)
DMXAA(生产商：MCE,货号：HY-10964)
cGAMP(生产商：InvivoGen,货号：tlrl-cga23-s)
HSV-1(武汉大学钟波实验室赠送)
实施例1多肽的筛选与制备
STING在许多人类疾病中是一个关键的信号传导中心，包括传染性疾病、自身免疫性疾病和神经退行性疾病等。以往的研究主要集中在STING激活的机制上，然而现有技术中对于STING活性的终止机制仍知之甚少。已知ESCRT复合体通过内体来介导跨膜蛋白的降解，因此本实施例对ESCRT是否参与到跨膜蛋白STING的降解及其活性的终止进行了深入研究。
在6孔板中用高糖DMEM细胞培养液(10％血清)培养小鼠胚胎成纤维细胞(Mouseembryonic fibroblasts,MEF，来源于SV40转染永生化的小鼠胚胎成纤维细胞)，每孔1毫升培养液，每孔0.8×105个细胞。用RNAiMAX(Invitrogen)转染阴性对照siRNA以及所有的ESCRT及ESCRT相关蛋白siRNA(siRNA由Thermo Fisher BLOCK-iTTMRNAi Designer设计，委托上海吉玛公司负责合成)，8小时候换新鲜高糖DMEM细胞培养液(10％血清)，48小时后用lipo6000(碧云天)转染HT-DNA(鲱鱼睾丸DNA,2μg/ml)，3小时后再用TransZol UP(全式金，货号：ET111-01-V2)裂解细胞提取RNA，最后用定量RT-PCR检测细胞干扰素-β(interferon-β,Ifnb)的mRNA表达。通过qPCR分析发现，单独敲低ESCRT-0亚基(Stam1)、ESCRT-I亚基(Tsg101、Vps37b、Mvb12a和Ubap1)、ESCRT-III亚基(Chmp3、Chmp4c、Chmp6)或ESCRT相关蛋白(Vps4b)，而不是其他亚基，可以显著增加细胞干扰素-β的表达，其中Tsg101敲低后细胞干扰素-β的升高最为显著(图1中的A)。同样本实施例在12孔板中用高糖DMEM细胞培养液(10％血清)+50ng M-CSF(PEPROTECH)培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDM)，每孔700μl培养液，每孔0.5×106个细胞，将这些敲低后细胞干扰素-β表达有显著升高的ESCRT在用siRNA转染试剂(PepMuteTM,SignaGen)在BMDM中进行敲低，48小时后用HSV-1(4×106PFU/ml,50微升)感染6h或8h，HSV-1感染6h的BMDM用TransZol UP提取RNA，最后用定量RT-PCR检测细胞干扰素-β的mRNA表达。通过qPCR分析发现，这些ESCRT的敲低同样能够显著增加细胞干扰素-β的表达(图1中的B)。同时本实施例收集了感染8小时的BMDM上清液用IFN-βELISA试剂盒(四正柏)进行检测，同样敲低这些基因后细胞干扰素-β的分泌也有明显增加(图1中的C)。以上的结果中也显示在MEF和BMDM中Tsg101敲低都对升高细胞干扰素-β的表达最为显著。
接下来本实施例用不同的刺激剂HT-DNA(2μg/ml)、DMXAA(100μg/ml)、cGAMP(1μg/ml)或HSV-1(4×106PFU/ml,100微升)处理敲低这些阳性ESCRT基因的MEF细胞，并检测干扰素刺激基因(趋化因子配体10(Cxcl10)、四肽重复干扰素诱导蛋白1(Ifit1)、干扰素刺激基因15(Isg15)、泛素特异性肽酶18(Usp18)、CC基序趋化因子配体8(Ccl8))以及炎症因子(肿瘤坏死因子α(Tnf)、白细胞介素-1β(Il1b)和白细胞介素-6(Il6))的表达。在HT-DNA刺激后，提取RNA通过定量RT-PCR检测ISG(IFN刺激基因)以及促炎因子的mRNA表达。本实施例发现同NC(阴性对照)相比，这些阳性ESCRT基因的敲低能够显著增加细胞干扰素-β、趋化因子配体10以及肿瘤坏死因子α的表达，其中Tsg101敲低对提高这些因子的表达最为显著(图1中的D-图1中的O和图2中的A-图2中的X)。同时本实施例也用HT-DNA(2μg/ml)、cGAMP(1μg/ml)或HSV-1(4×106PFU/ml,100微升)处理敲低这些阳性ESCRT的人皮肤成纤维细胞(Humanfibroblast，BJ，西南医学研究中心燕南实验室赠送)。用qPCR的方法检测细胞干扰素-β(IFNB)、趋化因子配体10(CXCL10)、四肽重复干扰素诱导蛋白1(IFIT1)、干扰素刺激基因15(ISG15)以及肿瘤坏死因子α(TNF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-1β(IL1B)的表达，发现在人的细胞中这些阳性ESCRT基因的敲低同样能够显著增加这些基因的表达(图3中的A-图3中的U)，其中敲低Tsg101的影响也是最为显著的。
下面本实施例通过蛋白印迹来检测这些阳性ESCRT对STING激活及降解的影响。由于内源性STING在凝胶电泳中会产生多个分子量不同的条带，因此免疫印迹法对STING蛋白进行定量是有问题的。因此，本实施例建立了一种基于溶酶体GFP切割的检测方法来检测STING的降解。首先本实施例制备STING-GFP插入慢病毒质粒，之后在表达SV40 T-抗原基因的人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney 293T，HEK293T)中进行慢病毒包装收集上清获得病毒颗粒，将收集的上清感染小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF，来源于经SV40转染永生化小鼠胚胎成纤维细胞)或人的皮肤成纤维细胞(Humanfibroblast,BJ)来构建稳定表达STING-GFP的细胞系。其中STING-GFP被递送到溶酶体进行降解，然后GFP从STING-GFP上裂解下来，通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)可以将GFP与STING-GFP分离。因此，溶酶体中的STING的降解可以通过检查残余GFP水平来确定。本实施例在6孔板中用高糖DMEM细胞培养液(10％血清)培养稳定表达STING-GFP的MEF细胞，每孔1毫升培养液，每孔0.8×105个细胞。用RNAiMAX(Invitrogen)转染阴性对照以及阳性ESCRT的siRNA，8小时后换新鲜高糖DMEM细胞培养液(10％血清)，48小时后用lipo6000(碧云天)转染HT-DNA(2μg/ml)3、8小时，用SDS上样缓冲液(1M Tris-Hcl:PH6.8,DTT,SDS,β-ME,BPB,Glycerol)收集细胞，蛋白印迹发现通过残余GFP测量的STING-GFP降解在这些阳性ESCRT基因敲低细胞中被显著抑制(图4中的A-图4中的C)。与这些结果一致的是，TBK1和IRF3的磷酸化也随着这些ESCRT的敲低而显著增加(图4中的A-图4中的C)。其中Tsg101的作用最为明显。
因此以上结果表明在ESCRT组分中，Tsg101的敲除对于细胞干扰素-β、ISG和促炎细胞因子的表达以及STING活化后的STING降解抑制效果最强(图1-图4)。
下面本实施例进一步将TSG101作为代表性的ESCRT组分来探究其对STING终止作用的机制。首先同构建STING-GFP一样去构建稳定表达TSG101-mKATE2的细胞系，将TSG101插入到C端带有mKATE2标签的慢病毒质粒上，之后在人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney293T，HEK293T)中进行慢病毒包装收集上清获得病毒颗粒，将收集的上清感染稳定表达STING-GFP的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF，来源于经SV40转染永生化小鼠胚胎成纤维细胞)来构建同时稳定表达STING-GFP和TSG101-mKATE2的细胞系。稳定表达STING-GFP和TSG101-mKATE2的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonicfibroblasts,MEF，来源于经SV40转染永生化小鼠胚胎成纤维细胞)经过HT-DNA(2μg/ml)、DMXAA(100μg/ml)、cGAMP(1μg/ml)或HSV-1(4×106PFU/ml,100微升)处理后，免疫荧光染色显示，STING形成点状结构，并且这些结构明显与TSG101的信号共定位(图5中的A)。此外，TSG101与STING有相互作用(图5中的E，第3泳道)。结合本实施例上述的发现，并且在其降解中起到必要的作用，这些结果表明TSG101直接参与了STING的降解过程。
由于本实施例通过免疫共沉淀在STING激活状态下检测不到其上的泛素化修饰(图5中的B)，因此，推测ESCRT亚基介导的STING降解不依赖ESCRT亚基与泛素化的STING结合，而很有可能是依赖于ESCRT亚基与STING的直接结合。因此，本实施例制备了一系列TSG101缩短变体(参见表1)以确定其与STING相互作用的区域，发现缺乏C-末端SB结构域(321-391aa)的变体中，它们与STING的相互作用消失(图5中的C和图5中的E)。此外，STING的缺失突变体显示其N-末端结构域(NTD,1-134aa)与TSG101表现出最强的结合能力，而缺失N-末端尾巴(△NTT,18-134aa)并不妨碍STING与TSG101的相互作用(图5中的D和图5中的F)。此外，STING的C-末端结构域(CTD)与TSG101之间没有相互作用(图5中的D和图5中的F)。这些结果说明STING面向细胞质侧的环型序列是STING-TSG101相互作用的关键部分(图6中的A)。
本实施例中涉及的TSG101相关的氨基酸序列如下表1所示。
表1：
本实施例中涉及的STING相关的氨基酸序列如下表2所示。
表2：
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这个环型序列含有24个氨基酸(具体序列：ELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCP(SEQ IDNO:1))，本实施例用一个与STING不相关蛋白面向细胞质的环型序列(来源于人的PQLC2，具体序列为：KAYKTGNMDQALSRTNFLRKSTQG(SEQ ID NO:17))替换STING环型序列的24个氨基酸来生成一个变体(NTD loop swap)。在人胚肾细胞(293T)中用PEI(1mg/ml，DNA:PEI＝1μg：3μl)转染Flag-TSG101和STING的NTD及其变体(NTD loop swap)，24小时后收集细胞进行免疫共沉淀。结果显示NTD loop swap完全破坏了STING和TSG101之间的相互作用(图6中的B和图6中的C)。这一结果表明面向细胞质的环型序列对STING-TSG101的相互作用是必需的。进一步的丙氨酸扫描实验证明，替换STING的第一个6氨基酸基序(5A1)和第四个5氨基酸基序(5A4)对其与TSG101的相互作用没有影响，替换第五个5氨基酸基序(5A5)导致其无法表达(图6中的C和图6中的D)。然而，替换STING的第二个和第三个5氨基酸基序(5A2和5A3)破坏了其与TSG101的相互作用(图6中的D)，表明这些氨基酸对于该区域的功能是必需的。进一步的突变实验显示，在5A3中的MU2、MU3-1和MU3-2突变体显著地抑制了TSG101与STING的相互作用，而5A2中的MU4、MU5、MU6突变体不行(图6中的C和图6中的E)。与此相一致，蛋白印迹显示5A3、MU2、MU3-1和MU3-2突变体能够抑制STING活化诱导的STING-GFP剪切(图6中的F和图6中的G)，同时也显著增加了在稳态和HT-DNA活化状态下的细胞干扰素-β、趋化因子配体10、白细胞介素-6(Il6)及肿瘤坏死因子α的表达水平(图6中的H和图6中的I)。综上所述，这些结果表明STING通过其面向细胞质的环型序列与TSG101相互作用来介导STING的降解及随后的活性终止。
基于以上实验结果本实施例将人源和鼠源STING的这24个氨基酸与穿膜肽连接进行效果测试(实施例2-5)。后续实施例中，委托强耀生物公司将这24个氨基酸的人源(ELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCP(SEQ ID NO:1))、鼠源(ELCHVQSRYQGSYWKAVRACLGCP(SEQ IDNO:2))以及对照多肽(MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKL(SEQ ID NO:16))制备成具有穿膜作用的肽：这些多肽的N端通过AEEA(NH2-PEG2-CH2COOH)与穿膜肽TAT(YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:15))连接形成融合肽。具体参见下表3。
表3：
实施例2
在6孔板中用高糖DMEM细胞培养液(10％血清)培养小鼠胚胎成纤维细胞(Mouseembryonic fibroblasts,MEF，来源于SV40转染永生化的小鼠胚胎成纤维细胞)，每孔1毫升培养液，每孔0.8×105个细胞。用10μM(灭菌超纯水配置)的(实施例1中制备)鼠源融合肽(mSTING肽段)、人源融合肽(hSTING肽段)、或对照融合肽(Ctrl肽段)分别加入在6孔板中培养的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF，来源于SV40转染永生化的小鼠胚胎成纤维细胞)中预处理3小时，再用STING的激活剂DMXAA(100μg/ml)、cGAMP(1μg/ml)或HT-DNA(2μg/ml)分别处理2小时、2小时、3小时后，用TransZol UP(全式金，货号：ET111-01-V2)裂解细胞提取RNA，最后用定量RT-PCR检测基因的mRNA表达，发现与对照多肽相比，鼠源和人源多肽都可以显著增强鼠源细胞干扰素-β、干扰素刺激基因(趋化因子配体10(Cxcl10)、四肽重复干扰素诱导蛋白1(Ifit1)、干扰素刺激基因15(Isg15))和炎症因子(肿瘤坏死因子α(Tnf)、白细胞介素-1β(Il1b)和白细胞介素-6(Il6))的基因表达(图7中的A-图7中的G)。ELISA实验室结果显示细胞干扰素-β蛋白分泌相对对照多肽有显著升高。(图7中的H)。此外，在人胚肾细胞(293T)中用PEI(1mg/ml，DNA:PEI＝1μg：3μl)转染Flag-TSG101和STING-HA 24小时后，用10μM(灭菌超纯水配置)的实施例1中制备的鼠源、人源融合肽或对照融合肽分别处理3个小时，收集细胞进行免疫共沉淀，结果显示鼠源多肽和人源多肽都可以显著抑制STING与TSG101的相互作用(图7中的I)。同样采用实施例1中GFP切割的检测方法来探究鼠源、人源融合肽或对照融合肽对STING降解的影响，在稳定表达STING-GFP的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF，来源于SV40转染永生化的小鼠胚胎成纤维细胞)中分别加入10μM(灭菌超纯水配置)的实施例1中制备的鼠源、人源融合肽或对照融合肽处理3个小时，再用HT-DNA(2μg/ml)处理6小时后，用SDS上样缓冲液(1M Tris-Hcl:PH6.8,DTT,SDS,β-ME,BPB,Glycerol)收集细胞，蛋白印迹发现与未加融合肽或对照融合肽相比，鼠源、人源融合肽显著抑制了STING-GFP的剪切(图7中的J和K)。
本实施例使用的qPCR引物如下表4。
表4：
qPCR条件：1.扩增循环：预变性94℃2分钟，变性94℃15秒，退火61℃15秒，延伸72℃15秒，39个循环。2.熔解程序：扩增循环结束后，降温至65℃，然后加热升温至95℃。
实施例3
用10μM(灭菌超纯水配置)的实施例1中制备的鼠源、人源融合肽或对照融合肽分别预处理人的皮肤成纤维细胞(Human fibroblast,BJ)(西南医学研究中心燕南实验室赠送)3小时后，再用STING的刺激剂(cGAMP或HT-DNA)分别处理2小时、3小时。本实施例用TransZol UP(全式金，货号：ET111-01-V2)裂解细胞提取RNA后，用定量RT-PCR检测基因的mRNA表达，发现与对照多肽相比，鼠源和人源多肽都可以显著增强人源细胞干扰素-β(IFNB)、干扰素刺激基因(趋化因子配体10(CXCL10)、四肽重复干扰素诱导蛋白1(IFIT1)、干扰素刺激基因15(ISG15)和炎症因子(肿瘤坏死因子α(TNF)、白细胞介素-1β(IL1B)和白细胞介素-6(IL6))的基因表达(图8中的A-图8中的G)。ELISA实验室结果显示细胞干扰素-β蛋白分泌相对对照多肽有显著升高(图8中的H)。此外，采用与实施例2类似的方法，证明了鼠源和人源多肽都可以显著抑制STING与TSG101的相互作用及STING-GFP的剪切(图7中的I和图8中的I-图8中的J)。
以上实施例2和3结果证明，鼠源、人源多肽均可以促进细胞干扰素-β、干扰素刺激基因产物(趋化因子配体10、四肽重复干扰素诱导蛋白1、干扰素刺激基因15)和炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6)的表达。
本实施例使用的qPCR引物如下表5。
表5：
qPCR条件：1.扩增循环：预变性94℃2分钟，变性94℃15秒，退火61℃15秒，延伸72℃15秒，39个循环。2.熔解程序：扩增循环结束后，降温至65℃，然后加热升温至95℃。
实施例4
用10μM(灭菌超纯水配置)的鼠源、人源融合肽或对照融合肽(实施例1中制备)分别预处理MEF或BJ细胞3小时后，再用HSV-1病毒(4×106PFU/ml,100微升)感染细胞6小时，本实施例用TransZol UP(全式金，货号：ET111-01-V2)裂解细胞提取RNA后，用定量RT-PCR检测基因的mRNA表达，发现与对照多肽相比，鼠源和人源多肽都可以显著抑制病毒增殖(图9中的A和图9中的B)，同时病毒感染导致的细胞干扰素-β、干扰素刺激基因(趋化因子配体10、四肽重复干扰素诱导蛋白1、干扰素刺激基因15和炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6)的基因表达也显著降低。(图9中的C-图9中的I和图9中的J-图9中的P)。
该结果说明鼠源和人源多肽的处理激活了STING下游的细胞干扰素-β、干扰素刺激基因和炎症因子的表达，且这些基因的表达产生了预期的效果，抑制了HSV-1的增殖，进而也最终降低了细胞自身细胞干扰素-β、干扰素刺激基因和炎症因子的表达。
实施例5
人和小鼠的多肽高度保守，仅有6个氨基酸不同，而且这6个氨基酸都属于性质类似的氨基酸(图10中的A)。在不同物种亦可以观察到，该多肽序列高度保守(图10中的B-图10中的D)。如实施例2～3所证实的，免疫共沉淀结果显示，与对照多肽相比，鼠源和人源的多肽都可以显著抑制STING和TSG101的相互作用(图7中的I)，同时免疫印迹实验结果显示鼠源和人源的多肽抑制鼠源和人源细胞中的STING的降解并同时激活STING下游TBK1和IRF3的磷酸化(图7中的J-图7中的K，图8中的I-图8中的J)。
这些结果说明，人和小鼠的多肽序列高度相似，序列中不同的氨基酸性质也相似，人和小鼠的多肽序列均可以促进细胞干扰素-β、干扰素刺激基因(趋化因子配体10、四肽重复干扰素诱导蛋白1、干扰素刺激基因15和炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6)的表达。由于该多肽序列物种间也高度保守，如下表6及图10中所示的其他物种的对应多肽序列十分有可能具有同样的作用。
表6：
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需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (14)
1.一种多肽，其中，所述多肽来自人干扰素基因刺激因子(STING)蛋白或其同源蛋白，所述多肽能够：
(a)抑制STING与ESCRT的相互作用，优选抑制STING与ESCRT的亚基TSG101的相互作用；
(b)抑制STING的降解；和/或，
(c)促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子；
以及，优选地，
(d)所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：
(i)以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；
(iii)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；或者，
(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，人干扰素基因刺激因子蛋白的同源蛋白包括来自小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(Gallus gallus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、家牛(Bos taurus)、家猪(Sus scrofa)、星型海葵(Starlet sea anemone)、恒河猴(Macaca mulatta)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、热带爪蟾(Xenopustropicalis)、黄毛狐蝠(Eidolon helvum)、斑马鱼(Danio rerio)或绵羊(Ovis aries)的STING蛋白；
任选地，来自人干扰素基因刺激因子蛋白的同源蛋白的多肽选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项：
(v)以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列；
(vi)与SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列具有至少70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性；
(vii)在SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性；或者，
(viii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2～14中任一项所示的氨基酸序列的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，所述多肽包括在(i)或(v)所示序列的多肽的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。
4.一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括权利要求1～3中任一项所述的多肽，以及与所述多肽融合的外源多肽；
可选地，所述外源多肽包括细胞穿透肽，以及，可选的，用于连接所述细胞穿透肽和所述多肽的接头；
优选地，所述细胞穿透肽包括TAT细胞穿透肽；
更优选地，所述TAT细胞穿透肽的序列如SEQ ID NO:15所示。
5.一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码权利要求1～3中任一项所述多肽的核苷酸序列，或包含编码权利要求4所述重组多肽的核苷酸序列。
6.一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含权利要求5所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。
7.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求5所述的多核苷酸，或权利要求6所述的核酸构建体。
8.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含权利要求1～3中任一项所述的多肽、权利要求4所述的重组多肽、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的核酸构建体，或者权利要求7所述的重组表达载体。
9.一种药物或疫苗组合物，其包含权利要求1～3中任一项所述的多肽、权利要求4所述的重组多肽、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的核酸构建体、权利要求7所述的重组表达载体，或权利要求8所述的重组宿主细胞；以及，任选的，药学上可接受的载体。
10.权利要求1～3中任一项所述的多肽、权利要求4所述的重组多肽、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的核酸构建体、权利要求7所述的重组表达载体、或权利要求8所述的重组宿主细胞选自以下的任一项用途：
(A)在制备用于促进细胞产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的试剂的用途；
(B)在制备用于预防和/治疗疾病的药物或疫苗中用途；
(C)与干扰素基因刺激因子(STING)激动剂联合在制备用于预防和/治疗疾病的药物或疫苗中用途；
(D)在制备抑制干扰素基因刺激因子(STING)的降解、提高干扰素基因刺激因子(STING)活性和/或提高干扰素基因刺激因子(STING)激动剂活性的试剂中的用途；
(E)在制备免疫调节剂或免疫佐剂中的用途；
任选地，所述疾病是与STING相关或经STING调节的疾病；
可选地，所述与STING相关或经STING调节的疾病包括炎症、过敏性或自体免疫疾病、感染性疾病和癌症中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述STING激动剂包括DMXAA、cGAMP、HT-DNA中的至少一种。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中，
所述干扰素包括I型干扰素，任选的，所述I型干扰素包括IFN-α和IFN-β，优选的，所述I型干扰素包括IFN-β；和/或，
所述干扰素刺激基因产物包括CXCL10、IFIT1、ISG15、USP18和CCL8中的至少一种；和/或，
所述炎症因子包括TNFα、IL-1β和IL-6中的至少一种。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的用途，其中，产生干扰素、干扰素刺激基因产物和炎症因子的细胞包括免疫细胞和非免疫细胞；
任选地，所述免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞中的至少一种；
任选地，所述非免疫细胞包括内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞中的至少一种。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的用途，其中，
所述疾病是受试者中的疾病；
可选地，所述受试者是哺乳动物；
优选地，所述受试者是人。
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2023
- 2023-09-11 CN CN202311177300.2A patent/CN117209584A/zh active Pending
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