CN117205205A - 小分子抑制剂Curaxin在骨肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及抗肿瘤技术领域，具体提供一种小分子抑制剂Curaxin在骨肿瘤抑制或制药中的应用。

Description

小分子抑制剂Curaxin在骨肿瘤中的应用

技术领域

本申请属于抗肿瘤技术领域，具体涉及一种小分子抑制剂Curaxin在骨肿瘤抑制或制药中的应用。

背景技术

骨肿瘤(Bone Tumor)是发生于骨骼或其附属组织的肿瘤。有良性，恶性之分，良性骨肿瘤易根治，预后良好，恶性骨肿瘤发展迅速，预后不佳，死亡率高。恶性骨肿瘤分为原发性和继发性。从体内其他组织或器官的恶性肿瘤经血液循环、淋巴系统转移至骨骼为继发性恶性骨肿瘤。骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨肿瘤的一种，是儿童及青少年时期最常见的原发骨源性恶性肿瘤，严重威胁儿童及青少年的生命健康。以铂类为基础的化疗使得骨肉瘤的五年生存率得到了大幅提升，为骨肉瘤患者构筑了较为坚实的第一道防线。然而过去30年以来，骨肉瘤的五年生存率始终维持在60％左右的“平台期”，而对于一线化疗耐药的患者，目前国际上的二线治疗方案有效率低，这类患者的五年生存不足20％。如何寻找更有效的二线干预手段，加强骨肉瘤治疗的第二道防线,是延长骨肉瘤患者的总生存期的关键一环，是目前骨肉瘤综合治疗亟待解决的重要难题之一。

组蛋白分子伴侣FACT复合体是一种较为保守的异元二聚体，由SUPT16H和SSRP1两个蛋白亚基组成。自1999年发现以来，经过20多年的研究，我们对FACT的功能及其分子机制有了更深入的了解。然而，关于FACT在不同DNA模板中的确切作用仍有许多悬而未决的问题有待探索。FACT长期以来被认为是一种转录延伸因子，其可以通过直接结合包括解旋酶MCM2-7和DNA聚合酶α在内的DNA复制复合物上的多种成分，介导核小体的解聚，促进RNAPol II在染色质模板上延伸。同时，FACT也可以使解聚的核小体重新组装，既往研究显示，FACT通过增强DNA损伤位点的组蛋白H2A/H2B转换来促进转录重启。

FACT功能亚基SSRP1在包括肝癌、黑色素瘤在内的多种肿瘤中高表达，并与患者的不良预后、转移等危险因素相关。更为重要的是SSRP1在细胞命运决定和分化中的新作用，在未分化细胞中的表达明显高于成熟体细胞。然而，SSRP1的高表达与细胞增殖无关，并随着细胞分化而降低。因此，成人组织中的大多数细胞在蛋白水平上都无法检测到SSRP1的表达，这一证据表明，高水平的SSRP1表达与细胞的分化细胞状态相关。值得注意的是，SSRP1在肿瘤细胞中也高表达，抑制SSRP1的表达会极大地抑制肿瘤细胞的生长，这为其作为肿瘤靶向治疗新靶标及相应的新型药物开发提供了很好的生物学基础。研究发现SSRP1小分子抑制剂Curaxin处理会引起SSRP1复合物的重新分布，从转录活性区域转到非活性区域，从而抑制肿瘤细胞中的关键致癌基因的转录表达，发挥抗癌活性。目前未见Curaxin在骨肿瘤中的研究和应用，本研究的实施也将进一步丰富Curaxin相关作用机制，加速其进一步临床转化。

有鉴于此，提出本申请。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请公开了一种小分子抑制剂Curaxin在制备抗骨肿瘤药物中的新应用。实验表明，小分子抑制剂Curaxin对于骨肿瘤肿瘤细胞具有较好的体外杀伤作用，通过阻滞细胞周期，并促进细胞凋亡；此外，通过建立裸鼠荷瘤模型，予以Curaxin灌胃处理，结果显示骨肿瘤的生长被显著抑制，这一结果在体内进一步验证了Curaxin对于骨肿瘤的杀伤作用。

具体的，本申请提出如下技术方案：

本申请首先提供一种小分子抑制剂Curaxin在体内或体外调控骨肿瘤或骨肿瘤细胞中的方法。

进一步的，所述调控为促进或抑制。

进一步的，所述抑制为抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长。

进一步的，所述促进为促进骨肿瘤或骨肿瘤细胞的凋亡。

本申请还提供一种小分子抑制剂Curaxin在制备骨肿瘤抑制剂或治疗骨肿瘤药物中的用途。

进一步的，所述调控为促进或抑制。

进一步的，所述抑制为抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长。

进一步的，所述促进为促进骨肿瘤或骨肿瘤细胞的凋亡。

本申请还提供一种评价或筛选骨肿瘤抑制剂的方法，包括在骨肿瘤体系中通过与小分子抑制剂Curaxin进行接触的步骤。

本申请还提供一种用于治疗骨肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含有效剂量的小分子抑制剂Curaxin，及其药学上可接受的载体。

在一些优选方式中，上述所述骨肿瘤优选为骨肉瘤。

与现有技术相比，本申请至少具有如下优势：

本申请首次提出了小分子抑制剂Curaxin在体内或体外可用于骨肿瘤的抑制，尤其证明了该抑制剂能够抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长，以及促进细胞凋亡方面的应用。本申请为小分子抑制剂Curaxin在骨肿瘤方面成药奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.Curaxin药物结构式图。

图2.细胞活力图：骨肿瘤细胞系143B、U2OS、HOS/MNNG、SJSA1和人间充质干细胞HMSC在指定浓度下用Curaxin处理48小时的CCK8测定细胞活力。

图3.Curaxin对于骨肿瘤细胞系生长的抑制图：克隆形成实验用于评价细胞克隆形成，骨肿瘤细胞系143B和HOS/MNNG在Curaxin处理下克隆形成减少。

图4.克隆形成实验统计结果图：Curaxin处理后细胞克隆形成显著减少，(****p<0.0001)。

图5.ModFit软件进行分析结果图：用指定浓度的Curaxin处理细胞24小时，然后用PI染色进行流式细胞术分析细胞周期变化。

图6.ModFit软件进行分析结果图：用指定浓度的Curaxin处理细胞24小时，然后用Annexin-V-FITC/PI染色进行流式细胞术分析细胞凋亡情况。

图7.流式细胞术分析细胞周期结果图：Curaxin处理后细胞周期阻滞于G2/M期，同时伴随着G1期的减少。

图8.流式细胞术分析细胞凋亡结果图：Curaxin处理后细胞凋亡增加。

图9.裸鼠皮下成瘤实验结果图：将骨肿瘤细胞注入裸鼠皮下，注射一周后，每天以Curaxin(30mg/kg)或DMSO灌胃处理。13天后处死小鼠，观察皮下瘤生长情况。

图10.裸鼠皮下瘤体积测量结果图：自注射药物启，每隔三天测量一次肿瘤体积，肿瘤体积＝(长X宽2)/2。

图11.裸鼠皮下瘤体积统计解脱图：最后一次肿瘤体积测量统计，Curaxin处理后显著抑制肿瘤生长。

图12.裸鼠体重测量结果图：自注射药物启，每隔三天测量一次小鼠体重，Curaxin处理后不影响小鼠体重。

图13.肿瘤组织免疫组织化学染色结果图：两组肿瘤组织，分别进行H&E染色以及C-C3和PCAN染色。

具体实施方式

下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。

如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。

本申请的用途

本申请公开了小分子抑制剂Curaxin在体内或体外调节或调控骨肿瘤或骨肿瘤细胞中的用途；在一些具体的实施方式中，上述骨肿瘤为骨肉瘤。

本申请所述的小分子抑制剂Curaxin在国际专利公开号WO2010/042445中进行了描述，其内容通过引用整体并入本文，Curaxin的结构表示如下：

Curaxin是可激活p53(EC50:0.37μM)并抑制NF-κB(EC50:0.47μM)，它在功能上使易化染色质转录复合物(FACT)失活，对p53和NF-κB产生影响，并促进癌细胞死亡。Curaxin在小鼠口服时具有广泛的抗癌活性，可清除耐药癌干细胞，并增强吉西他滨在胰腺癌临床前模型中的疗效。

本申请所述的“调节”或“调控”是指活性或功能或数量的变化。变化可以是活性、功能或数量的增加或减少、增强、促进或抑制。

在一些实施方式中，所述调控作用包括促进或抑制。比如，在一些具体的实施方式中，抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长，或在一些具体的实施方式中，促进骨肿瘤或骨肿瘤细胞的凋亡。

本申请所述的“抑制”意指减少或降低活性、水平、反应、病状、疾病或其他生物参数。这可以包括但不限于活性、反应、病状或疾病的完全消融。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病状或疾病的10％抑制或降低。因此，在一些方面中，与天然或对照水平相比，抑制或降低可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何降低量。在一些方面中，与天然或对照水平相比，抑制或降低是10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％。在一些方面中，与天然或对照水平相比，抑制或降低是0％-25％、25％-50％、50％-75％或75％-100％。

本申请所述的“提升”和“促进”是指活性、反应、病状、疾病或其他生物参数的增加。这可以包括但不限于活性、反应、病状或疾病的开始。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病状或疾病增加10％。因此，在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，或介于两者之间的任何提升量。在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升是10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％。在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升是0％-25％、25％-50％、50％-75％或75％-100％或更多，诸如200％、300％、500％或1000％。在一些方面中，与天然或对照水平相比，增加或提升可以是大于100％，诸如与天然或对照水平相比，增加或提升100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更多。

治疗方法

本申请公开了可用于治疗骨肿瘤或预防或减少患有骨肿瘤的受试者的小分子抑制剂Curaxin。可以通过小分子抑制剂Curaxin，以防止癌细胞增殖、生长和/或定殖等。

术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、缓和特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制或减缓其进展，降低其严重程度和/或降低其发病率。可向未表现出疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者施用治疗，目的是降低发展出与所述疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。例如，疾病、病症和/或病状，本文可以是骨肿瘤。

如本文所用，术语“治疗(Treatment/treating)”指向受试者施用或施加治疗剂(例如，本文所描述的小分子抑制剂curaxin)或对受试者实施程序或方式，目的是获得疾病或健康相关病状的治疗益处。例如，治疗可以包括施用药学上有效量的小分子抑制剂Curaxin。

本申请所述的“受试者”是指所施用的靶标，例如人类。因此，所公开方法的受试者可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。术语“受试者”还包括家养动物(例如，猫、犬等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。在一个方面中，所述受试者为哺乳动物。在另一个方面中，所述受试者为人类。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成人、儿童、青少年和新生儿受试者，以及胎儿，无论是雄性还是雌性。

本申请所述的“患者”是指患有疾病或病状的受试者。术语“患者”包括人类和兽医受试者。在所公开方法的一些方面中，诸如(例如)在施用步骤之前，“患者”已经被诊断为需要治疗。

药物组合物

本申请公开了组合物，例如药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的小分子抑制剂Curaxin，可用于治疗骨肿瘤相关病症。因此本申请还公开了小分子抑制剂Curaxin在制备骨肿瘤抑制剂或药物中的用途。在一些实施方式中，所述调控作用包括类促进或抑制。比如，在一些具体的实施方式中，抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长，或在一些具体的实施方式中，促进骨肿瘤或骨肿瘤细胞的凋亡。

本申请的药物组合物也可以作为联合疗法，即与其他药剂联合施用。例如，联合疗法可以包括与至少一种其他抗癌剂联合。

本申请所述的“药学上可接受的载体”包括生理学上兼容的任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体可以适用于静脉内、肌肉内、皮下或肠胃外施用(例如，通过注射或输注)。

本申请的药物组合物中可以采用的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)，以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散液的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质和药剂的用途是本领域中熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不兼容，考虑将其用于本申请的药物组合物中。补充性有效化合物也可并入组合物中。

治疗组合物在制造和储存的条件下通常必须是无菌的和稳定的。组合物可被配制为适于高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散液的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，诸如糖类、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)引起可注射组合物的延长吸收。

可通过将活性化合物以要求的量与本文列举的一种成分或成分组合一起并入适合的溶剂中，根据需要，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入含有基础分散介质和来自本文列举的那些成分的所需其他成分来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是产生活性成分外加来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。

可与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，按照100％计，这个量将范围介于约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的活性成分以及药学上可接受的载体。

调整剂量方案以提供所需的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，几个分次剂量可以随时间施用或剂量可以按比例减少或增加，如由治疗情况的紧急程度所指示。为便于施用和剂量均匀，配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的。本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的与所需药物载体结合的预定量的活性化合物。本申请剂量单位形式的规格由以下决定且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的配制技术中固有的局限性。

对于施用，剂量范围可介于为0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至15mg/kg、15mg/kg至20mg/kg或20mg/kg至25mg/kg宿主体重。在一些方面中，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。在一些方面中，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、15mg/kg体重、20mg/kg体重、25mg/kg体重或30mg/kg体重或在1-30mg/kg的范围内。在一些方面中，剂量可以是约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是5mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是15mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是20mg/kg体重。在一些方面中，剂量可以是25mg/kg体重。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每三个月一次或每三至六个月一次施用。

本申请的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得有效实现特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应的活性成分的量，而对患者没有毒性。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本申请特定组合物的活性；施用途径；施用时间；所采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和既往病史；以及医学领域中众所周知的类似因素。

本申请的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。本申请抑制剂的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。

试剂盒和诊断

本申请公开了包含一种或多种治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒可用于制备和/或施用本文公开的疗法。试剂盒可以包括一个或多个密封小瓶，所述小瓶含有本文公开的任何药物组合物。试剂盒可包括例如至少一种小分子抑制剂Curaxin以及用于制备、配制和/或施用一种或多种本文公开的组合物的组分或执行本申请方法的一个或多个步骤的试剂。在一些方面中中，试剂盒还可以包括合适的容器，其可以是不会与试剂盒的组分发生反应的容器，诸如埃普多夫管(eppendorf tube)、测定板、注射器、瓶子或管。容器可由可灭菌材料制成，诸如塑料或玻璃。

试剂盒还可包括概述本文所阐述的方法的程序步骤的指令单，并且将遵循与本文所描述或本领域普通技术人员已知的基本相同的程序。指令信息可以在含有机器可读指令的计算机可读媒体中，当使用计算机执行所述指令时，使得显示递送药物有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。

筛选方法

本申请公开了可用于评价或筛选骨肿瘤抑制剂，在一些实施方式中，包括了在体系中通过与小分子抑制剂Curaxin进行接触的步骤，进而评价标的抑制剂对骨肿瘤的效果。

下面为本申请具体的实施例。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本申请的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了其实践的优选模式。然而，鉴于本公开，本领域的技术人员应理解可在不背离本申请的精神和范围的情况下在公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍获得类似或相似的结果。

本申请实验材料

人骨肉瘤细胞株143B,U2OS,HOS和SJSA1购自美国菌种保藏中心(ATCC)。Curaxin(一种新型FACT复合体抑制剂)购于MCE公司，将其溶于二甲基亚砜中，配置成工作母液，置于-20℃的冰箱中备用，使用前用DMEM血清培养液调至所需浓度。

实验试剂及仪器：DMEM高糖培养基，胎牛血清(美国Thermo公司)；PCNA、cleaved-Caspase3、p-PARP抗体(CST公司)，CellTiter-Glo检测试剂盒(Promega公司)，二甲基亚砜(美国Sigma公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

实施例1Curaxin对骨肿瘤肿瘤细胞增殖影响

细胞培养

将骨肉瘤细胞株143B,U2OS,MG63和SJSA1培养在DMEM完全培养液中(含有体积分数为10％胎牛血清、0.1g/L链霉素、100U/mL青霉素)，于37℃、体积分数为5％CO2恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到85％左右时，用0.02％EDTA+0.25％胰蛋白酶混合消化液进行消化，然后收集细胞1000r/min离心3min，传代培养。

CellTiter-Glo检测Curaxin对肿瘤细胞增殖影响

为评估Curaxin(结构如图1)抗骨肉瘤细胞系143B,U2OS,MG63和SJSA1生长的抑制作用，收集对数生长期的143B,U2OS,MG63和SJSA1细胞，HMSC正常作为对照。PBS清洗，计数，分管，按1000个/孔细胞数加入96孔板中，培养24h使细胞贴壁，之后加入不同物质的量浓度Curaxin(0.25,0.5,1,2μM)进行培养72h，然后加入CellTiter-Glo，水平摇床混合后，使用酶标仪检测各孔的吸光度值。

结果表明，Curaxin对骨肿瘤细胞系的抑制具有明显地抑制作用，并且呈现时间和浓度依赖性(图2)，随着Curaxin浓度的升高，细胞的增殖率下降。进一步我们利用克隆形成试验，进一步验证了Curaxin对于骨肿瘤细胞系生长的抑制作用，结果显示curaxin可以显著抑制骨肿瘤细胞的克隆形成(图3、4)。

实施例2、Curaxin对骨肿瘤肿瘤细胞周期影响

用0.5μM的Curaxin对143B和HOS/MNNG细胞进行处理1周，吸去上层液体，用4％多聚甲醛固定15min，PBS漂洗3次，用0.1％结晶紫染色10min，PBS漂洗2次，风干后拍照。

将143B和HOS/MNNG细胞加入到含有不同浓度Curaxin(0.5,1μM)的培养液中进行培养，24h后收集细胞，1000r/min离心1min，PBS清洗。用70％乙醇固定，加入周期试剂盒PI染液，室温避光孵育15min，用BD流式细胞仪进行检测。图像使用ModFit软件进行分析。重复实验3次

以骨肉瘤细胞系143B和HOS/MNNG为靶细胞进行细胞周期的检测，结果表明，经过Curaxin的处理，细胞发生了G2/M周期阻滞。同时伴随着G1期的减少(图5、6)。

实施例3、Curaxin对骨肿瘤肿瘤细胞凋亡影响

将143B和HOS/MNNG细胞加入到含有不同浓度Curaxin(0.5,1μM)的培养液中进行培养，24h后收集细胞，1000r/min离心1min，PBS清洗。然后使用Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测其凋亡情况，将细胞加入到100μL 1×Binding缓冲液中重悬，添加5μLAnnexin V-FITC和2.5μL DAPI染料，进行避光振荡混匀，室温反应15min，流式细胞仪进行检测。重复试验3次。

结果表明，0.5μM的Curaxin就能够引起骨肿瘤细胞发生凋亡，1μM时，肿瘤细胞发生显著的凋亡(图7、8)。

实施例4、Curaxin抑制骨肿瘤体内生长

为了研究Curaxin对骨肿瘤荷瘤模型的体内生长的影响，我们采用注射器将骨肉瘤细胞接种于裸鼠皮下，1周后随机分为溶媒组(DMSO)和化合物组(30mg/kg Curaxin灌胃给药)，每组6只，每周3次口服给予溶媒或化合物，连续给药2周后终点，收集并测量肿瘤。监测肿瘤生长曲线和小鼠体重，免疫组化检测增殖相关PCNA及凋亡相关C-C3的表达水平。具体的：收取1x 10⁶细胞/100ul，利用注射器接种于裸鼠皮下，1周后随机分为两组：溶媒组(DMSO)和化合物30mg/kg Curaxin灌胃给药组，每组6只，每周3次口服给予溶媒或化合物，连续给药2周后终点，收集并测量肿瘤。

结果表明，由实验结果可见，给药组小鼠的肿瘤体积相对于溶媒对照组显著减小(图9-12)，Curaxin显著抑制PCNA的表达(图13)，并促进肿瘤细胞的凋亡。说明Curaxin对骨肿瘤生长具有明显的抑制作用。

综上实施例可知，Curaxin能够明显抑制骨肿瘤的生长，诱导其周期阻滞，促进其凋亡，具有较好的临床应用潜力。

前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种小分子抑制剂Curaxin在体内或体外调控骨肿瘤或骨肿瘤细胞中的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控为促进或抑制。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抑制为抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述促进为促进骨肿瘤或骨肿瘤细胞的凋亡。

5.一种小分子抑制剂Curaxin在制备骨肿瘤抑制剂或治疗骨肿瘤药物中的用途。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调控为促进或抑制。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抑制为抑制骨肿瘤或骨肿瘤细胞的增殖、分化和生长。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述促进为促进骨肿瘤或骨肿瘤细胞的凋亡。

9.一种评价或筛选骨肿瘤抑制剂的方法，其特征在于，包括在骨肿瘤体系中通过与小分子抑制剂Curaxin进行接触的步骤。

10.一种用于治疗骨肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含有效剂量的小分子抑制剂Curaxin及其药学上可接受的载体。