CN117187297B - 一种在珠子参细胞中合成人参皂苷ck的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在珠子参细胞中合成人参皂苷CK的方法，该方法是将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中，或者将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中；获得能合成人参皂苷CK的珠子参细胞；其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；本发明实现了CK在珠子参细胞中的合成和积累，对人参属物种合成非天然人参皂苷CK提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种在珠子参细胞合成人参皂苷CK的方法，属于生物医药制备技术领域。
背景技术
五加科(Araliaceae)人参属(Panax)药材的主要活性成分为三萜皂苷，包括人参皂苷、竹节参皂苷等，这些药用成分具有防治心脑血管疾病、抗疲劳、抗氧化、增强免疫力以及保肝护肝等多种药理功效。根据苷元结构的不同，可将人参属药用植物的三萜皂苷分为达玛烷型皂苷、齐敦果烷型皂苷两大类。
人参皂苷化合物Compound K(以下简称CK)是一种“非天然”的原人参二醇(PPD)型皂苷，具有抗癌、抗炎、抗氧化、皮肤保护、神经保护等功效。传统共识认为，CK为天然人参皂苷进入体内以后的代谢产物，而人参属植物不具备直接合成CK的能力。
自然条件下，珠子参细胞不能够合成人参皂苷CK，CK目前主要通过Rb1、Rb2、Rd和Rc的去糖基化制备，方法主要包括加热、酸水解、碱水解、微生物转和酶促转化。但是，这些方法制备的分离工艺复杂，制备时间长，制备量小，溶剂需求量大。此外，人参皂苷CK在人参属植物中含量低，人参属植物的栽培时间长，以及化学提取过程存在效率低、环境污染等问题，使得CK的价格较高，其在医药和保健行业的应用受到一定限制。
发明内容
本发明提供一种在珠子参细胞合成人参皂苷CK的方法，该方法是将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷CK的珠子参细胞；其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
或者将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷CK的珠子参细胞；其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明目的通过以下技术方案实现：
1、从珠子参中提取总RNA，逆转录合成珠子参cDNA，以合成的cDNA第一链为模板，通过PCR扩增分别获得基因UGTPj20、干扰UGTPj3基因的RNAi片段、干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段，其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
2、构建过表达载体pCAMBIA2300s-UGTPj20、RNAi干扰载体pHellsagte-UGTPj3、RNAi干扰载体pHellsagte-CYP716A53v2，转化农杆菌，通过PCR筛选出阳性单克隆；
3、利用农杆菌介导的遗传转化法，将pCAMBIA2300s-UGTPj20、pHellsagte-UGTPj3或者pCAMBIA2300s-UGTPj20、pHellsagte-UGTPj3、pHellsagte-CYP716A53v2导入珠子参细胞表达，通过抗生素筛选和qRT-PCR筛选阳性转基因细胞系；
4、提取珠子参转基因和非转基因细胞系中的皂苷，分析转基因和非转基因细胞系人参皂苷CK的含量差异。
本发明首次实现了“非天然”的人参皂苷CK在人参属植物细胞中的合成，CK具有安全性高、生物功能多样的优点，但CK在珠子参药材中不含有，发明人发现珠子参(P.japonicus)具有合成CK所需的基因元件，本发明基于已被解析的人参皂苷的合成途径，对合成途径中关键酶活性进行探究，发现了人参属植物中不合成CK的可能机制；珠子参细胞中合成CK所需的酶UGTPj20与底物PPD亲和力较差，而同样以PPD为底物合成原人参三醇(PPT)以及人参皂苷Rh2的两个酶CYP716A53v2和UGTPj3，其与PPD的亲和力均较强。由于三种酶催化活性的显著差异，导致以PPD为底物的皂苷合成代谢流主要用于合成PPT和人参皂苷Rh2，而不能够利用PPD合成CK；然后通过基因调控方法，在没有引入外源基因的情况下，巧妙地在珠子参细胞中合成人参皂苷CK，丰富了珠子参中皂苷的种类和含量；本发明为深入了解和认识人参皂苷的生物合成网络提供了技术方法和新的策略。
本发明通过RNAi手段抑制与PPD亲和力较强两个关键基因UGTPj3、CYP716A53v2的表达，弱化人参皂苷Rh2和PPT的合成，引导皂苷合成代谢流进入CK合成通路；同时采用基因过表达的方法提高人参皂苷CK合成通路上的关键酶基因UGTPj20的表达，强化CK合成通路，使皂苷合成代谢流更多地用于CK合成，从而实现CK在珠子参细胞中的合成和积累。本发明解决了珠子参不合成CK的技术问题，对于人参属物种合成非天然人参皂苷CK提供了新途径。
附图说明
图1是UGTPj20基因(左图)和UGTPj3基因(右图)PCR扩增电泳图，其中M：DNAmarker DL2502；
图2是UGTPj20基因连接PMD18-T载体转DH5α菌液的PCR检测结果示意图，其中M：DNA marker DL2502；1-8：单克隆菌液；-：阴性对照；+：PCR扩增产物；
图3是UGTPj20基因连接pCAMBIA1300s载体转DH5α菌液的PCR检测结果示意图，其中M：DNA marker DL2502；1-8：单克隆菌液；-：阴性对照；+：PCR扩增产物；
图4是pCAMBIA2300s-UGTPj20质粒双酶切电泳检测结果示意图，其中M：DNAmarker DL2504；A：pCAMBIA2300s-UGTPj20双酶切产物；
图5是pCAMBIA2300s-UGTPj20质粒转LBA4404菌液的PCR检测结果示意图，其中M：DNA marker DL2502；1-8：菌液样品；-：水作为阴性对照；+：PCR扩增产物作为阳性对照；
图6是UGTPj3基因RNAi片段；
图7是CYP716A53v2基因RNAi片段；
图8是带attB重组位点的RNAi片段扩增产物，其中M：DNA marker DL2501；A图：UGTPj3基因RNAi片段PCR扩增产物；B图：CYP716A53v2基因RNAi片段PCR扩增产物；
图9是pHellsagte-UGTPj3载体转入大肠杆菌DH5α的鉴定电泳图，其中M：DNAmarker DL2501；1-8：单克隆菌液；-：阴性对照；+：PCR扩增产物；
图10是pHellsagte-CYP716A53v2载体转入大肠杆菌DH5α的鉴定电泳图，其中M：DNA marker DL2501；1-8：单克隆菌液；-：阴性对照；+：PCR扩增产物；
图11是pHellsagte-UGTPj3载体转入农杆菌LBA4404的鉴定电泳图，其中M：DNAmarker DL2501；1-8：单克隆菌液；-：阴性对照；+：PCR扩增产物；
图12是pHellsagte-CYP716A53v2载体转入农杆菌LBA4404的鉴定电泳图，其中M：DNA marker DL2501；1-8：单克隆菌液；-：阴性对照；+：PCR扩增产物；
图13是PCR检测转基因珠子参愈伤组织细胞的电泳图，其中M：Marker DL2502；1-7：UGTPj20基因转基因珠子参细胞系；
图14是实时荧光定量PCR检测转基因珠子参细胞中单独过表达UGTPj20基因相对表达量的检测结果，其中WT：非转基因珠子参细胞系；T1-1～T1-7：转基因珠子参细胞系；
图15是实时荧光定量PCR检测转基因珠子参细胞中同时过表达UGTPj20和干扰表达UGTPj3基因相对表达量的检测结果，其中WT：非转基因珠子参细胞系；T2-1～T2-6：转基因珠子参细胞系；
图16是实时荧光定量PCR检测转基因珠子参细胞中同时过表达UGTPj20基因且干扰表达UGTPj3和CYP716A53v2基因相对表达量的检测结果，其中WT：非转基因珠子参细胞系；T3-1～T3-4：转基因珠子参细胞系；
图17是转基因珠子参细胞系中皂苷含量图，其中WT：非转基因珠子参细胞系；T1：过表达UGTPj20基因的转基因珠子参细胞系；T2：同时过表达UGTPj20和干扰表达UGTPj3基因的转基因珠子参细胞系、T3：同时过表达UGTPj20基因且干扰表达UGTPj3和CYP716A53v2基因的珠子参细胞系。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：UGTPj20基因、UGTPj3基因的获取和UGTPj20基因过表达载体的构建
1、珠子参总RNA的提取
采用改良的异硫氰酸胍法提取珠子参总RNA，体操作如下：将珠子参根茎切成薄片于液氮瞬间冻结后，在超低温液氮下研磨成粉，根据粉末的量加入适当体积的TRIzol和巯基乙醇，使组织粉末立即充分匀浆于裂解液中，静置提取珠子参的RNA，后续经过氯仿抽提及异丙醇沉淀等常规操作步骤回收RNA，分装后置于-80℃冰箱保存，用于后续实验。整个提取过程需在封闭无人员流动且最好是无菌环境下进行。回收到的RNA通过琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的完整性；总RNA经电泳分离后，在胶快上呈现出三条明显的主带，分别为5SrRNA、18S rRNA和28S rRNA。若胶快上呈现出的条带不明显或发生较大范围的弥散，代表了RNA已经降解，无法使用。选择符合要求的珠子参总RNA，加入超微量分光光度计的样品池中，检测所提RNA的浓度和纯度。
2、cDNA第一链的合成
选取质量较好的RNA利用Promega公司的GoScript反转录系统合成cDNA第一链，将Oligo(dT)15 1.0μL、Total RNA 5.0μg、Nuclease-free Water补至10μL充分温和混匀，并将其置于70℃水浴锅中水浴5min进行预变性，然后立即置于冰上冰浴5min，再加入如下试剂：Nuclease-free Water 1.6μL、GoScriptTM5×Reaction Buffer 4.0μL、PCR NucleotideMix 1.0μL、MgCl2(25mM)2.0μL、Recombinant Ribonuclease Inhibitor 0.4μL、GoScriptTM Reverse Transcriptase 1.0μL混匀，瞬时离心，25℃退火5min，42℃水浴延伸90min，最后，放置70℃水浴锅中水浴15min，终止逆转录酶活性，即得珠子参cDNA第一链。
3、UGTPj20基因和UGTPj3基因合成
根据人参中报道的糖基转移酶UGTPg1和UGTPg45的基因序列，以珠子参cDNA为模板，分别以两组引物(UGTPj20-SacⅠ-F：GAGCTCATGAAGTCAGAATTGATATTCTTGCC和UGTPj20-BamHⅠ-R-GGATCCCATAATTTCCTCAAATAGCTTCGC、UGTPj3-BamHⅠ-F-GGATCCATGGAGAGAGAAATGTTGAGCAAA和UGTPj3-SalⅠ-R-_GTCGACGGAGGAAACAAGCTTTGAAATGA)按照以下体系和程序进行目的基因的扩增：珠子参cDNA模板1μL、2×PrimerSTAR MaxPremix 25μL、F引物1.4μL、R引物1.4μL、Nuclease-free water 21μL混匀，瞬时离心，98℃、5min；98℃、10s，55℃、10s，72℃、15s，35cycles；72℃、7min；结果见图1，扩增得到长度分别为1428bp和1373bp的基因片段，分别命名UGTPj20和UGTPj3基因，序列见SEQ ID NO:3-4所示。
4、UGTPj20基因过表达载体的构建
(1)将步骤3中获得的UGTPj20基因与pMD18-T载体连接，连接体系如下：pMD18-T载体1.0μL、目的DNA片段4.0μL、SolutionⅠ5.0μL，在200μL Eppendorf管中加入上述体系，轻轻混匀后瞬时离心，置于16℃超低温水槽中连接16h。连接结束后，拿出Eppendorf管置于冰上；采用热激法将上述连接反应液中的载体转入大肠杆菌感受态细胞中，在超净台内，将含有Amp抗性的LB液体培养基分装于无菌离心管中，每管1mL，使用无菌牙签小心挑取单克隆，确保牙签不同时接触两个单菌落，将沾有单菌落的牙签放入无菌离心管中，搅动使菌体融入培养基中，将离心管于37℃、200rpm振荡培养，菌液浑浊后得到单克隆菌液；以菌液为模板按以下PCR反应体系和扩增条件扩增目的基因：菌液1μL、2×Taq PCR StarMix 10μL、F引物0.4μL、R引物0.4μL、Nuclease-free water 8.2μL混匀，瞬时离心，94℃、5min；94℃、30s，61℃、30s，72℃、1min30s，32个循环；72℃、10min；筛选阳性单克隆。PCR结果见图2，扩增出的目的片段大小为1428bp，可初步认定UGTPj20基因以连接至pMD18-T载体上并成功转入大肠杆菌，选择阳性单克隆菌液进行测序，测序结果显示UGTPj20基因序列与UGTPg1基因序列相似性为96.99％，因此判断扩增出的UGTPj20基因序列正确，可进行后续实验。
(2)质粒DNA的提取及双酶切
对步骤(1)所得的阳性克隆扩培15h，获得大量菌体用于质粒提取，使用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒提取质粒，收集菌体并裂解和质粒的纯化，具体操作步骤如下：
①分4次将总量为6mL菌液离心收集于2mL的离心管中，高速离心，确保菌体沉积于管底且最好无培养液残留；
②离心管中加入300μL Buffer P1后盖紧，经漩涡振荡仪剧烈振荡后菌体重悬；要确保离心管壁无菌体附着且管内无絮块存在；
③向离心管中加入50μL Buffer P2后就立即轻微晃动，室温静置2-4min，使细菌裂解，确保在5min内加入500μL Buffer P3，轻微晃动使之充分中和终止裂解，静置2min，室温下13500g离心20min；
④通过低速离心，使上清液中的质粒保留在吸附柱中；由于所用吸附柱的吸附能力有限，为获得更高浓度的质粒，将上述多管上清液分多次上柱离心，使质粒富集于同一吸附柱上；
⑤加入500μL去蛋白Bufferf DW1，9000g离心30s后倒掉废液，除去吸附柱上残留的蛋白；
⑥加入500μL Wash Solution，同样条件离心后倒掉废液，此步骤操作两次；
⑦为去除洗脱住上残留的洗脱液，空柱离心后晾干吸附柱；
⑧吸取60μL加热至60℃的Elution Buffer，枪头对准吸附柱内部吸附膜中心部位，打入液体；将吸附柱转入新的离心管中，10000g离心2min，得到质粒溶液(pMD18-T-UGTPj20)；
pMD18-T-UGTPj20与pCAMBIA2300s的双酶切反应体系如下：质粒DNA或pCAMBIA2300s 5μg、缓冲液5.0μL、BamHⅠ2.5μL、SacⅠ2.5μL、Nuclease-free water 35μL；在200μL Eppendorf管中加入上述体系，轻轻混匀后瞬时离心，置于37℃水浴锅中反应3.5h左右；酶切反应结束后，取适量酶切产物进行电泳分析，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收目的片段。
(3)UGTPj20与pCAMBIA2300s的连接
按照T4 DNA Ligase的说明书，在200μL Eppendorf管中加入如下体系：InsertDNA fragment 6.0μL、Digested pCAMBIA2300s DNA 2.0μL、T4 DNA Ligase 1.0μL、10×T4DNA Ligase Buffer 1.0μL；轻轻混匀后瞬时离心，在16℃低温水槽中连接16h。
(4)pCAMBIA2300s-UGTPj20转入DH5α大肠杆菌
将连接产物采用热激法转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，振荡培养1h30min后，菌液离心，弃部分上清，保留适量菌液重悬菌体，涂布于LB固体平板(含50mg/L Kana)，恒温箱37℃倒置过夜培养12h，挑取单克隆于含1mL LB液体培养基(含50mg/L Kana)的EP管中，37℃、200r/min震荡过夜扩繁，菌液PCR鉴定阳性单克隆，反应体系和扩增条件同步骤4(1)，结果见图3，样品均在1500bp处有单一亮带，表明重组载体已经转入大肠杆菌中，可以初步确定pCAMBIA2300s-UGTPj20过表达载体构建成功。
(5)过表达载体酶切验证
为进一步证明UGTPj20基因已经连接到了pCAMBIA2300s载体上，选择阳性菌液扩培15h，进行质粒提取和双酶切实验(同步骤4(2))，验证结果见图4，胶快上呈现两条DNA带，大小分别与pCAMBIA2300s和UGTPj20大小吻合，说明UGTPj20从pCAMBIA2300s载体上被切下，pCAMBIA2300s-UGTPj20载体构建成功，可用于转化LBA404农杆菌感受态细胞。
(6)pCAMBIA2300s-UGTPj20转入LBA4404农杆菌
通过液氮冻融法将载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，振荡培养4h后，菌液离心，弃部分上清，保留适量菌液重悬菌体，涂布于LB固体平板(含50mg/L Kana和20mg/LRif)，恒温箱28℃倒置培养36h，挑取单克隆于含1mL LB液体培养基(含有50mg/L Kana和20mg/LRif)的EP管中，28℃、200r/min震荡过夜扩繁，菌液PCR鉴定阳性单克隆；结果见图5，从图中可以看出所扩增出来的条带约为1428bp，符合预期，表明UGTPj20基因已经成功转化到农杆菌中。
实施例2：干扰UGTPj3基因的RNAi片段、干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段的获取以及RNAi表达载体的构建
1、干扰基因UGTPj3的RNAi片段、干扰基因CYP716A53v2的RNAi片段的合成
根据实施例1获得的珠子参UGTPj3基因全长序列以及CYP716A53v2基因(KF935232.1)，利用PrimerPremier5.0设计特异性引物UGTPj3-F：5’-GCTTTTTCCCCATTTCCT-3’和UGTPj3-R:5’-TCCCCTTATCATTGCCCT-3’；CYP716A53v2-F:5’-CACAGCCAAACCCAGTAGAGACG-3’和CYP716A53v2-R：5’-GTTCACCTTAACAAAAGC-3’；以上述获得的珠子参cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶Ex Taq的作用下进行高保真PCR扩增，PCR反应条件：98℃、3min；98℃、10s，60℃、15s，72℃、30s，35cycles；72℃、5min；将获得的扩增产物于琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离回收的干扰基因UGTPj3的RNAi片段是UGTPj3基因的99-566位核苷酸序列，干扰基因CYP716A53v2的RNAi片段是CYP716A53v2基因的33-740位核苷酸序列；
目的片段回收后与pGEM T-easy载体连接，转入大肠杆菌DH5α，随机挑选平板上的单菌落，进行菌液PCR扩增，检测阳性克隆，将菌液PCR检测为阳性的单克隆送测序，利用NCBI中Blast软件将测序后的序列和UGTPj3、CYP716A53v2基因序列进行比对，结果见图6和图7，核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示，比对结果正确，将结果正确的大肠杆菌单克隆接种于含有壮观霉素的液体LB培养基中扩培，37℃、200rpm振荡培养15h，使用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒提取质粒(T-UGTPj3和T-CYP716A53v2)。
2、UGTPj3、CYP716A53v2基因RNAi表达载体的构建
(1)连有attB重组位点的RNAi片段的克隆
根据Gateway TM的技术原理，设计的所需引物UGTPj3-attB-F(5’-GGGGACAAGTTT GTACAAAAAAGCAGGCTCTGGAAAGGCGTGCGAA-3’)，UGTPj3-attB-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGA AAGCTGGGTCAAAGAGATCAGGAAAGGTG-3’)和CYP716A53v2-attB-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAA AAAGCAGGCTTGAGTAGATCCGTCCTTGCA-3’)，CYP716A53v2-attB-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAG AAAGCTGGGTTGACCGAAATAAACTTGTGGA-3’)(下划线部分为attB重组位点)，采用PCR手段将接头加到RNAi片段两端，使得目的片段与载体发生同源重组；利用以上引物，以步骤1抽提的质粒为模板，进行attB-PCR扩增，PCR反应条件与实施例2步骤1相同，扩增后，RNAi片段两侧均接上了attB重组位点，胶回收PCR产物，结果见图8，显示分别在500～750bp大小间和750～1500bp大小间有单一亮带，与预计大小一致。
(2)UGTPj3、CYP716A53v2基因RNAi表达载体的构建
依据BP ClonaseTMII Enzyme Mix试剂盒说明书进行RNAi载体的构建，反应体系如下：attB-PCR胶回收产物0.15μg、pHellsagte 2载体质粒0.15μg、BP lonaseTMⅡEnzyme Mix 2.00μL、TE缓冲液(pH＝8.0)补至10μL；依次加入上述溶液，用移液枪吹打混匀，置于25℃水浴锅中水浴，反应4h，然后向反应液中加入1μL蛋白酶K，37℃水浴锅中水浴10min，终止反应，反应产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，菌液PCR验证阳性单克隆，结果见图9和图10，样品均在500bp处和75bp处有单一亮带，表明重组载体pHellsgate-UGTPj3和pHellsgate-CYP716A53v2已经转入大肠杆菌中，可以初步确定干扰表达载体构建成功。对其阳性单克隆菌液进行扩大培养，随后进行质粒(pHellsgate-UGTPj3，pHellsgate-CYP716A53v2)抽提，对得到的质粒分别用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ进行单酶切，酶切体系如下：pHellsagte-UGTPj3/pHellsgate-CYP716A53v2质粒各5.0μg、10×Buffer 2.0μL、限制性内切酶XbaⅠ/XhoⅠ1.5μL、ddH2O水补至20μL；
酶切体系置于37℃水浴锅中进行5h的酶切反应，反应结束后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切产物电泳条带大小判断UGTPj3、CYP716A53v2基因RNAi表达载体是否构建成功；然后通过液氮冻融法将载体转入农杆菌LBA4404农杆菌感受态细胞中，同时将空载pHellsagte 2也转化到LBA4404农杆菌感受态细胞中，作为空载对照，结果见图11和图12，从图中可以看出所扩增出来的条带分别约为526bp和766bp，符合预期，表明UGTPj3和CYP716A53v2基因的RNAi片段已经成功转化到农杆菌中。
实施例3：根癌农杆菌介导的珠子参遗传转化
1、珠子参细胞预培养
(1)采集珠子参茎叶，使用珠子参愈伤组织培养基(MS培养基+2,4-D 4mg/L+KT1mg/L，培养基pH5.6)，培养条件为固体培养，温度25±1℃，避光培养，培养周期28天，获得的珠子参愈伤组织；将获得的珠子参愈伤组织采用含2,4-D 4mg/L、KT 2mg/L的MS固体培养基继代培养15天，获得珠子参继代培养细胞；
(2)选取生长状态良好的珠子参愈伤组织细胞转接于珠子参愈伤组织细胞预培养基(在珠子参愈伤组织培养基中添加乙酰丁香酮至40mg/L)上，平铺覆盖培养基整个表面，并置于25℃条件下暗培养3天；
2、珠子参愈伤组织细胞侵染与共培养
将实施例1、2获得的三种LBA4404农杆菌菌液(携带pCAMBIA2300s-UGTPj20、携带pHellsgate-UGTPj3和携带pHellsgate-CYP716A53v2重组质粒)使用接种环蘸取菌液分别划线于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB固体培养基平板上(该步骤可与珠子参愈伤组织细胞预培养同时进行)，在28℃培养箱中倒置培养2-3天，用接种环取生长良好的菌团于含40mg/L乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，于28℃摇床振荡培养至菌液OD600为0.6-0.8。首先使用含pCAMBIA2300s-UGTPj20质粒的农杆菌LBA4404菌液侵染步骤1预培养3天的珠子参愈伤组织细胞，放置于25℃黑暗条件下共培养3天，使目的基因转移至珠子参愈伤组织细胞中，其中珠子参愈伤组织细胞共培养基与珠子参愈伤组织细胞预培养基相同。待后续筛选(详细步骤见以下的除菌培养和筛选培养)出过表达UGTPj20基因的阳性珠子参细胞系后，再将携带RNAi表达载体质粒pHellsgate-UGTPj3和pHellsgate-CYP716A53v2的LBA4404农杆菌菌液依次侵染至过表达UGTPj20基因的转基因珠子参愈伤组织细胞系中；同时以分别转化pCAMBIA1300S空载体和pHellsgate2空载体的农杆菌侵染珠子参愈伤组织细胞系作为空白对照。
3、除菌培养
共培养后的珠子参愈伤组织小心转接至除菌培养基(在珠子参愈伤组织培养基中添加头孢霉素)中，除菌培养基中头孢霉素含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L，按浓度从高到底的顺序，依次在除菌培养基上放3天，直至培养基表面没有农杆菌生长。
4、筛选培养和继代
除菌培养9天后，将珠子参愈伤组织细胞转接至筛选培养基(在珠子参愈伤组织培养基中添加新霉素至终浓度为50mg/L)，大约35天左右继代一次，经过4-5次继代筛选，可获得以下三种转基因珠子参细胞系：
过表达UGTPj20的珠子参细胞系；同时过表达UGTPj20和干扰UGTPj3表达的细胞系；同时过表达UGTPj20且干扰UGTPj3和CYP716A53v2表达的细胞系。
实施例4：测定转基因珠子参细胞中UGTPj20、UGTPj3和CYP716A53v2基因表达水平
1、转基因珠子参细胞系基因组DNA水平检测
采用改良的CTAB法提取转基因珠子参细胞系基因组DNA，根据pCAMBIA2300s载体中的T-DNA上卡那霉素npt II抗性基因序列设计上下游引物npt-F(5’-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3’)和npt-R(5’-CCCTGATGCTCTTCGTCCA-3’)，以所提珠子参基因组DNA为模板进行PCR检测，筛选阳性转基因的珠子参细胞。结果见图13，图中均扩增出一条大小约为430bp的特异性条带，与预期大小相符，表明六株珠子参转基因细胞系均已导入外源DNA并整合到了基因组DNA上稳定遗传，初步确定获得了UGTPj20基因转基因细胞系；因为上述实验已经证明农杆菌LBA4404对于珠子参愈伤组织细胞有较好的遗传转化效率，且所用细胞材料已经具有Kan抗性，所以同时过表达UGTPj20和干扰UGTPj3表达的细胞系、同时过表达UGTPj20且干扰UGTPj3和CYP716A53v2表达的细胞系不再做DNA水平上的筛选。
2、转基因珠子参细胞荧光定量PCR检测
分别提取三种类型阳性转基因(过表达UGTPj20；同时过表达UGTPj20和干扰UGTPj3表达；同时过表达UGTPj20且干扰UGTPj3和CYP716A53v2表达)珠子参细胞株和非转基因珠子参细胞株的总RNA，反转录成cDNA，具体操作步骤与实施例1中相同；
反转录合成的cDNA稀释5倍，以稀释后的cDNA为模板，根据18S rRNA基因(登录号D85171.1)、珠子参中UGTPj20、UGTPj3和CYP716A53v2基因序列设计用于荧光定量PCR的引物：18S-F：5’-AGCAAGCCTACGCTCTGGATAC-3’，18S-R：5’-TGACTATGAAATACGAATGCCCC-3’；UGTPj20-F：CCGATGAGGCTGCTGTGAT；UGTPj20-R：GGATAGACGGACGCAAGGAC；UGTPj3-F：GCGTGAAGCACAACCTCGG；UGTPj3-R：CTGCCTCTGCCAAGAAATCG；CYP716A53v2-F：GTTACGCAAACTTCATCATTCCC；CYP716A53v2-R：GGCACATCCTTGGTCCTCCTC。反转录合成的cDNA稀释5倍，即将20μL cDNA稀释至100μL；以系稀释后的cDNA为模板，采用上述荧光定量PCR的引物进行荧光定量PCR，根据 qPCRMaster Mix说明书进行操作，每个样品对应的每个基因重复检测3次。利用2-ΔΔCt法进行数据处理，检测UGTPj20、UGTPj3和CYP716A53v2的表达情况，结果如下：
UGTPj20基因的表达量结果见图14，与对照相比(WT)，除了T1-2株，UGTPj20基因在6株细胞系中的表达水平均明显升高。其中，T1-3和T1-5株系中基因UGTPj20的表达量上升更加显著。因此，将T1-3和T1-5株转基因珠子参细胞系作为后续侵染材料；
用含有pHellsgate-UGTPj3载体的农杆菌渗透细胞，经过共培养、除菌培养和30d的筛选培养后，结果见图15，与对照相比(WT)，UGTPj20基因在6株转基因珠子参细胞系中的表达水平均保持上升，同时UGTPj3基因表达水平也有不同程度的下降，说明UGTPj3成功实现了在过表达UGTPj20的细胞系中的干扰表达。其中，T2-2和T2-5株系中UGTPj3基因表达的干扰效果更加显著。因此，T2-2和T2-5株系作为后续的实验材料；
用含有pHellsgate-CYP716A53v2载体的农杆菌渗透细胞，经过共培养、除菌培养和30d的筛选培养后，结果见图16，与对照相比(WT)，UGTPj20基因在4株转基因珠子参细胞系中表达水平均保持上升，UGTPj3基因表达水平保持下降，同时CYP716A53v2基因表达水平也有不同程度的下降，说明CYP716A53v2成功实现了在过表达UGTPj20和干扰表达UGTPj3的细胞系中的干扰表达。成功获得了我们所需要的转基因珠子参细胞系。
实施例5：转基因珠子参细胞中CK含量检测
(1)样品溶液的制备
收集实施例3中获得的三种株系的转基因珠子参愈伤组织细胞：T1(过表达UGTPj20)、T2(同时过表达UGTPj20和干扰UGTPj3表达)、T3(同时过表达UGTPj20且干扰UGTPj3和CYP716A53v2表达)和未转基因的普通珠子参愈伤组织细胞，置于50～55℃烘箱中烘干(约12h)，烘干后将其充分研磨成粉末。各称取0.5g的未转基因和转基因珠子参细胞粉末，分别放置于50mL离心管中，各加入50mL的70％甲醇溶液并浸泡过夜，超声波提取1.5h；超声结束后，提取液4000rpm离心30min，收集上清液，并将上清液放置于50～55℃烘箱中进行烘干；烘干后，用10mL蒸馏水进行溶解，并用等体积的水饱合正丁醇萃取3次，收集萃取液，并将萃取液放置于50～55℃烘箱中进行烘干；烘干后用适量甲醇溶液进行溶解并定容至25mL，经0.45μM的微孔滤膜过滤后即为皂苷溶液。
(2)高效液相色谱分析
利用HPLC检测转基因珠子参细胞中皂苷的种类及其含量，HPLC检测条件如下：色谱柱为Waters-XTerra-MS-C18(5μm，250mm×4.6mm，USA)；流动相为水和乙腈；梯度洗脱：0-20min，20％乙腈；20-30min，20％-35％乙腈；30-40min，35％乙腈；40-50min，35-40％乙腈；50-60min，40-100％乙腈；流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长203nm；结果见图17，结果表明，经过基因调控的珠子参细胞能够合成CK，而野生型珠子参细胞不合成CK。
Claims (2)
1.一种在珠子参细胞中合成人参皂苷CK的方法，其特征在于：将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷CK的珠子参细胞；其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种在珠子参细胞中合成人参皂苷CK的方法，其特征在于：将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷CK的珠子参细胞；其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
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