CN117187059A - 一种类器官培养与反馈系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种类器官培养与反馈系统及方法，包括：控制模块，用于控制所述类器官培养与反馈系统；微球制备模块，用于基于所述控制模块制备微球；培养模块，用于将所述微球进行培养，得到微球类器官；其中，所述培养模块包括反应器装置；图像评价模块，用于对所述微球类器官进行明场及荧光成像，并对微球类器官拍摄和保存，用于记录和分析微球类器官的实时生长动态。本发明可以选择性地统一获取处在活跃生长期微球类器官，并在后续的应用中以均一的微球类器官为研究对象，降低了微球类器官的异质性和批次差异，提高实验的可重复性；自动化、标准化的培养方式，能够广泛应用于大批量的类器官生产与扩增，从而实现规模化的药物筛查。

Description

一种类器官培养与反馈系统及方法

技术领域

本发明涉及一种类器官培养技术领域，尤其涉及一种类器官培养与反馈系统及方法。

背景技术

利用原代细胞或2D细胞系进行体外试验通常是药物进行动物体内实验或人体临床试验之前的必经之路。然而，传统的细胞培养由于单一的细胞结构与功能，通常难以有效地反应动物或者人体内真实情况，导致体外实验结果不可靠，致使一些潜在疗效好的药物在细胞体外试验阶段无法获得好的结果，而一些疗效差的药物反而进入到体内试验。药物体外试验亟需一个更理想的生物模型。

类器官能够最大程度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养传统的基质胶包埋法是在大量的学术文献中提及的经典类器官培养方法。然而，迄今为止，大部分的类器官还是在高校或者研究单位的实验室环境中培养，因此，类器官培养的好坏在很大程度上与相关技术人员的专业技能相关，并且在高校或者研究单位实验室一次只能构建少量的类器官，无法满足大规模药物筛选实验的需求。此外，由于类器官培养方法通常是由操作人员根据自己的专业经验和操作习惯制定的，导致不同的实验室，甚至不同的实验操作人员应用不同的类器官培养方法，难以形成标准化的步骤，这也意味着不同批次培养的类器官在进行试验后的结果可能无法直接横向比较。

综上，要实现生物医药领域的类器官工业化，就需要有一种方法可以大量生产在结构和功能上高度一致的类器官，从而推动类器官在药物试验中更广泛的应用，并提高实验结果的可重复性和可比性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种类器官培养与反馈系统及方法，解决了现有技术中传统点胶式类器官贴壁、静态的培养方法，缩短了培养时间，实现了大规模、低成本的类器官培养。

本发明采用的技术方案如下：

一种类器官培养与反馈系统，包括：

控制模块，用于控制所述类器官培养与反馈系统；

微球制备模块，用于基于所述控制模块制备微球；

培养模块，用于将所述微球进行培养，得到微球类器官；

图像评价模块，用于对所述微球类器官进行明场及荧光成像，并对微球类器官拍摄和保存，用于记录和分析微球类器官的实时生长动态。

作为优选，所述微球制备模块具体包括：

微流控剪切芯片，用于制备微球；

基质加样锥形管，设置于所述剪切微流控芯片，并与所述微流控剪切芯片连通，用于基质加样；

微流控微管，其一端与所述剪切微流控芯片的通道口相连，用于输送微球；

三通喷头，其第一连通口连接所述微流控微管，第二连通口连接有空气喷头，第三连通口连接所述培养模块，用于将微球输送至所述培养模块中；其中，所述空气喷头与所述控制模块电连接。

作为优选，所述培养模块包括反应器装置，所述反应器装置具体包括：

反应罐；

顶盖，设置于所述反应罐；所述顶盖上设置有进液孔、出液孔、进样孔和抽样孔，所述进液孔通过蠕动泵组连接有培养基储液罐，所述出液孔通过蠕动泵组连接有废液储液罐，所述进样孔连接所述微球制备模块，所述抽样孔通过采样蠕动泵连接所述图像评价模块；

搅拌机构，包括旋转电机、搅拌轴和扇叶，所述搅拌轴的顶端连接所述旋转电机，所述搅拌轴的另一端贯穿所述顶盖并延伸至所述反应罐中，所述搅拌轴的外表面均布设置有多个所述扇叶；

pH计，贯穿设置于所述顶盖；

溶氧量测定器，贯穿设置于所述顶盖；

无菌过滤器，其底端连接有进气管，所述进气管贯穿设置于所述顶盖。

作为优选，所述图像评价模块具体包括：

孵育单元，用于对抽取的微球类器官进行孵育成像；

采样皿，其上设置有包埋的荧光标记物，用于与抽取的微球类器官反应；

机械臂，其连接所述控制模块，用于抓取和摆放所述采样皿；

储皿站，其连接所述控制模块，用于储存所述采样皿；

荧光成像单元，其连接所述控制模块，用于对微球类器官进行明场及荧光成像。

作为优选，所述孵育单元具体包括：

箱体，其上设置有容纳槽，所述容纳槽用于容纳所述采样皿，所述箱体的一端设置有气管连接孔，用于外接气体保持所述箱体内的空气环境；

加热块，设置于所述箱体上，并嵌入所述箱体的侧壁内；

顶盖框，设置于所述箱体上表面，所述顶盖框与所述箱体通过磁吸连接，所述顶盖框上表面设置有镶嵌槽，所述镶嵌槽契合连接有透明玻璃顶盖；

底孔玻璃，固定设置于所述箱体的下表面，用于荧光成像。

本发明还提供一种类器官培养与反馈方法，所述方法采用上述任一项所述的系统，至少包括以下步骤：

步骤S1：解离组织以产生细胞悬液，并加入到基质加样锥形管中，在剪切微流控芯片中形成氟油包裹的细胞微球，通过微流控微管传输至三通喷头；

步骤S2：控制模块控制空气喷头以预设脉冲向三通喷头施加压缩空气，氟油包裹的细胞微球被喷射出去，氟油在三通喷头的出口处挥发，细胞微球通过进样孔进入反应罐；

步骤S3：启动旋转电机，带动搅拌轴旋转，搅拌轴带动扇叶的搅拌形成动态层流培养环境；同时，pH计监测反应罐内的培养基pH变化；溶氧量测定器检测反应罐内的培养基的溶氧量，用于提供溶氧量支持微球的生长；无菌过滤器过滤获得无菌空气，并经进气管进入反应罐中，为微球生长提供氧气；

步骤S4：在预设pH值范围、预设单次换液量和预设间隔时间内，培养基储液罐通过蠕动泵组与反应罐上的进液孔连接，用于补充培养基；废液储液罐通过蠕动泵组与反应罐上的出液孔连接，用于抽取废液；

步骤S5：通过采样蠕动泵与反应罐上的抽样孔连接，抽取培养好的微球类器官至孵育单元内的采样皿中进行孵育；

步骤S6：对孵育后的微球类器官通过图像评价模块拍摄和保存，并基于图像识别算法判断微球类器官的生长动态，根据生长状态的结果对微球类器官进行扩增或冻存。

作为优选，步骤S4包括以子步骤：

步骤S41：设定预设pH值范围、预设单次换液量和预设间隔时间；

步骤S42：换液，并实时更新换液时间，监测反应罐内的培养基pH变化；

步骤S43：判断pH是否小于预设pH值范围，若是，则进入步骤S42；反之，则进入下一步；

步骤S44：培养至换液间隔时间，重复步骤S42-步骤S43。

作为优选，步骤S4中，

预设单次换液量为占总体积的比例10-80%；

预设间隔时间为12-72h；

蠕动泵组的速度为1-500ml/min。

作为优选，步骤S5中，

所述采样皿中预包埋Calceine活细胞荧光标记染料；

所述孵育单元内的温度为36.5-37.5℃，CO₂浓度为5%，孵育时间为15-30min。

作为优选，步骤S6包括以子步骤：

步骤S61：对孵育后的微球类器官明场及荧光成像，根据图像识别算法及预设条件判断单个微球类器官的合格状态；

步骤S62：计算合格的微球类器官的合格率，对满足合格率的微球类器官进行扩增或冻存。

本发明的有益效果至少包括：

1、本发明可批量制备特定大小的微球类器官，并选择性地统一获取处在活跃生长期的微球类器官，在后续的应用中以均一的微球类器官为研究对象，减少了微球类器官的异质性和批次差异，提高实验的可重复性。

2、悬浮并且伴随搅动的培养方式可以确保所有的基质胶包裹的细胞可以与外界培养基有充分的接触，良好的营养通路和氧气供应。这确保了微球中所有类器官细胞都能以最佳状态生长，并形成大量的微球类器官可用于药物筛选等应用。

3、集成化灌注性的类器官培养系统，将传感器、泵体、显微镜和荧光成像孵育箱一体化集成，实现自动化类器官实时观察与动态扩增培养。

4、自动化、标准化的培养方式，能够广泛应用于大批量的类器官生产与扩增，从而实现规模化的药物筛查。

附图说明

图1为本发明一种类器官培养与反馈系统的整体示意图；

图2为本发明反应器装置的结构示意图；

图3为本发明不同进气速率下，反应罐内部流体结构图；

图4为本发明孵育单元的爆炸图；

图5为本发明孵育单元的结构示意图；

图6为本发明一种类器官培养与反馈方法的整体示意图；

图7为本发明培养模块流程图；

图8为本发明判断单个微球类器官的合格状态的流程图；

图9为本发明基于图像识别算法评估单个微球类器官合格与否的流程图。

图10为本发明基于图像识别算法评估微球类器官合格率的流程图

附图标记说明

1-微流控剪切芯片，2-基质加样锥形管，3-微流控微管，4-三通喷头，5-空气喷头，6-反应器装置，601-反应罐，602-顶盖，603-进液孔，604-出液孔，605-进样孔，606-抽样孔，607-搅拌机构，608-pH计，609-溶氧量测定器，610-无菌过滤器，611-进气管，7-蠕动泵组，8-培养基储液罐，9-废液储液罐，10-采样蠕动泵，20-孵育单元，201-箱体，202-容纳槽，203-气管连接孔，204-加热块，205-顶盖框，2051-镶嵌槽，206-磁吸，207-透明玻璃顶盖，208-底孔玻璃，30-采样皿，40-机械臂，50-储皿站，60-荧光成像单元。

具体实施方式

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参见图1，一种类器官培养与反馈系统，包括：

控制模块，用于控制所述类器官培养与反馈系统；

微球制备模块，用于基于所述控制模块制备微球；

所述微球制备模块具体包括：

微流控剪切芯片1，用于制备微球；

基质加样锥形管2，设置于所述剪切微流控芯片1，并与所述微流控剪切芯片1连通，用于基质加样；

微流控微管3，其一端与所述剪切微流控芯片1的通道口相连，用于输送微球；

混有细胞的细胞基质被加入基质加样锥形管2中，流入微流控剪切芯片1内，并在交汇处经氟油剪切成大小均一的微球。微球的直径，由剪切速度和微流控微管3的直径决定，推荐直径范围为200μm-1000μm之间，优选为500μm。

三通喷头4，其第一连通口连接所述微流控微管3，第二连通口连接有空气喷头5，第三连通口连接所述培养模块，用于将微球输送至所述培养模块中；其中，所述空气喷头5与所述控制模块电连接。

微球通过微流控微管3，被输送至三通喷头4处，空气喷头5以设定脉冲向三通喷头4处施加压缩空气。包裹着微球的氟油随即被快速喷射出去。氟油在出口处散开成小微球并迅速挥发，微球则被射入反应罐601中的培养基中，进行下一步培养。

培养模块，用于将所述微球进行培养，得到微球类器官；

参见图2，所述培养模块包括反应器装置6，所述反应器装置6具体包括：

反应罐601；

顶盖602，设置于所述反应罐601；所述顶盖602上设置有进液孔603、出液孔604、进样孔605和抽样孔606，所述进液孔603通过蠕动泵组7连接有培养基储液罐8，所述出液孔604通过蠕动泵组7连接有废液储液罐9，所述进样孔605连接所述微球制备模块，所述抽样孔606通过采样蠕动泵10连接所述图像评价模块；

与废液储液罐9连接的出液孔604中配有疏水过滤网，防止换液抽液时，样本被吸出。根据反应器大小，用户可设定单次换液的液体体积占总体积的比例（推荐范围为10%—80%）、换液时蠕动泵组7的速度（推荐流速1ml/min—500ml/min，优选100ml/min）、预设换液间隔时间（推荐间隔时间为12-72h，优选为48h）。

搅拌机构607，包括旋转电机、搅拌轴和扇叶，所述搅拌轴的顶端连接所述旋转电机，所述搅拌轴的另一端贯穿所述顶盖602并延伸至所述反应罐601中，所述搅拌轴的外表面均布设置有多个所述扇叶；微球被喷射至培养基中后，顶盖602与反应罐601闭合，旋转电机以设定速度带动搅拌轴及扇叶搅拌反应罐601中的流体。同时，空气泵将空气抽入，并经空气过滤器过滤后，由空气导管导入培养基内。导入的空气在培养基内形成气泡，带动微球在培养基内游动充分接触培养基。

参见图3，不同进气速率下，反应罐601内部流体结构图，从图3中的（a）可见，进气速率0.1L/min-0.6L/min，描述下，从图3中的（b）可见，进气速率0.6L/min-1L/min，描述下，图3中的（c）可见，进气速率1L/min-1.5L/min。

pH计608，贯穿设置于所述顶盖602；

溶氧量测定器609，贯穿设置于所述顶盖602；

无菌过滤器610，其底端连接有进气管611，所述进气管611贯穿设置于所述顶盖602。

传统的2D细胞培养通常包括将分离的细胞平铺在细胞培养皿或TC处理过的培养瓶中，并补充细胞培养基。2D细胞通常是37℃静态培养并且补充5%的二氧化碳，细胞与培养基只在垂直方向上接触，细胞与细胞间则通常在水平方向相互作用。相比之下，反应器装置6允许微球内细胞-细胞，细胞-基质，微球与培养基间的全3D相互作用。因此，反应器装置6更容易促进细胞的增殖与3D分化。

另外，反应器装置6提供了一个动态的培养系统，而不是传统细胞培养的静态培养系统。在静态培养中，营养物质运输以自由扩散为主，由于氧浓度随培养时间下降以及有毒代谢物浓度的增加，通常静态培养下的微球类器官生长容易被限制在500μm以内。相比之下，反应器装置6提供了动态的营养运输，允许微球类器官在毫米到厘米尺度上生长。

在本发明的实施例中，反应器装置6可以是批进料生物反应器或灌流型生物反应器，两者都能制造培养基的流动从而促进营养物质的扩散。批进料生物反应器通常每隔几天需要更换一次培养基。批进料生物反应器可分为搅拌瓶式生物反应器和旋转壁式生物反应器，这两种反应器都引入了培养基的对流从而是营养物质更为持续得均匀分布。搅拌瓶生物反应器通常使用磁性搅拌棒来制造培养基得流动和混合。旋转壁生物反应器则是使培养基发生一种动态的层流。

在本发明的优选实施例中，反应器装置6为灌流型生物反应器。灌流生物反应器使用泵系统连续或不连续地向反应器装置6内的培养物提供新鲜培养基。在灌注生物反应器系统中，氧气和养分通过扩散和对流两种方式供应到反应器装置6内部。灌流的流速可以根据营养物质的需求，尤其是对于氧气进行优化。灌注生物反应器可以为类器官提供持续的营养支持，发明者发现这种培养方式可以显著改善类器官的生长。

优选的，通过控制进气量和搅拌子的搅拌速度，可以控制微球类器官在反应器装置6内的运动搅拌轨迹，从而根据培养的组织类型，优选不同的运动搅拌轨迹。

在本发明实施例中，反应器装置6可向微球类器官连续提供营养物质。营养物通常以培养基的形式提供，如上述的微球类器官培养基中各生长因子得组分的浓度可随时间增加或减少，以最大限度地使微球类器官生长均匀。例如，可以将恒定浓度的培养基进行不同稀释率的连续进料，或稳定灌注不同浓度组分的培养基。换句话说，营养物质可以被间断性得以不同的稀释度或者浓度加入到反应器装置6中。例如，规律性的培养基灌注可以是以1分钟或1小时或1天为间隔给予不同量的培养基。

微球类器官在反应器装置6中培养形成成熟类器官。一个1L的灌流培养瓶可以产生至少100万或至少200万成熟类器官。在本发明中，大约可形成50万个成熟的类器官。随着灌流装置体积的增加，可生产的类器官的数量可以提高到100万，500万，1000万甚至更多。形成类器官的微胶滴可培养不少于24小时或不少于36小时。在本发明的实施例中，类器官培养时间为24h至96h，优选为36h至约72h。在本发明的优选实施例中，类器官培养时间约为48小时。

通过类器官恢复试剂从胶滴中将生长成熟的类器官释放出来。类器官恢复试剂的作用是分解细胞外支持基质，无损伤得释放出类器官。由于独特的微流控细胞微球制备技术，使得本专利制备的器官胶滴中细胞外基质含量较少,可以用冰冷的PBS代替类器官恢复试剂进行类器官的收集。

从反应器装置6中获得成熟类器官后，将类器官悬浮在类器官培养基中。然后，将类器官通过至少两个具有不同网格尺寸的细胞过滤器进行筛分，从而获得直径40μm至80μm的最终产品级类器官。

如上所述，类器官的大小可以通过调节细胞过滤器的网格孔径控制。例如，类器官过滤器可具有20μm和200μm的孔径尺寸，优选30μm和100μm，更优选约40μm和约80μm的孔径尺寸。更详细地说，类器官悬浮液先通过具有较大孔径(例如80μm)的一号细胞过滤器，所有大于该尺寸的类器官将被丢弃。过滤后的内容物随后可通过孔径尺寸小于二号类器官过滤器(例如40μm)的二号类器官过滤器，小于该孔径尺寸的所有细胞碎片均被丢弃。因此，所保留的产品级类器官的尺寸将由一号和二号类器官过滤器的孔径大小决定。在上面的例子中，产品级类器官的直径大约在40μm到80μm之间。

图像评价模块，用于对所述微球类器官进行明场及荧光成像，并对微球类器官拍摄和保存，用于记录和分析微球类器官的实时生长动态。

所述图像评价模块具体包括：

孵育单元20，用于对抽取的微球类器官进行孵育成像；

参见图4-图5，所述孵育单元20具体包括：

箱体201，其上设置有容纳槽202，所述容纳槽202用于容纳所述采样皿30，所述箱体201的一端设置有气管连接孔203，用于外接气体保持所述箱体201内的空气环境；

加热块204，设置于所述箱体201上，并嵌入所述箱体201的侧壁内；

顶盖框205，设置于所述箱体201上表面，所述顶盖框205与所述箱体201通过磁吸206连接，所述顶盖框205上表面设置有镶嵌槽2051，所述镶嵌槽2051契合连接有透明玻璃顶盖207；

底孔玻璃208，固定设置于所述箱体201的下表面，用于荧光成像。

箱体201与采样蠕动泵10相连，主要用于对抽取的样本进行明场及荧光成像。加热块204生热，将箱体201温度维持在37℃。箱体201主体外部为金属结构，内部设有温度传感器，用于控制箱体201内的温度。气管连接孔203主要用于连接5%CO₂，以保持箱体201内正常的空气环境。

采样皿30，其上设置有包埋的荧光标记物，用于与抽取的微球类器官反应；

箱体201底部配有水平摇床结构，当样本溶液抽入采样皿30中后，摇床摇动，使预包埋于皿内的染料充分溶于溶液中，并与微球类器官充分结合。

机械臂40，其连接所述控制模块，用于抓取和摆放所述采样皿30；

储皿站50，其连接所述控制模块，用于储存所述采样皿30；

荧光成像单元60，其连接所述控制模块，用于对微球类器官进行明场及荧光成像。

由机械臂40自动从储皿站50中取出，并放置于箱体201内，采样皿30中预包埋了Calceine活细胞荧光标记染料。采样蠕动泵10可根据设定时间间隔，将箱体201中的微球类器官悬浮液抽出至采样皿30中，此时箱体201内的温度维持在36.5-37.5℃间，优选为37℃，CO₂推荐浓度为5%的条件下，孵育15-30min间，优选为20min。随后，荧光成像单元60将样本的明场与活细胞图像拍摄并保存，用于记录和分析微球类器官的实时生长动态。

类器官通常具有三个特征：自组装、多细胞和功能性。换句话说，类器官是由细胞在体外自组装形成与体内某种器官类似的三维(3D)结构，结构中会包含某种器官中特有的多种细胞类型，并且这些细胞会具有它们在原器官中具备的一些功能。例如，小鼠肠道类器官，以单层上皮细胞生长模拟体内肠道隐窝-绒毛结构，包含了不同类型的肠道细胞(肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞和干细胞)，并形成一个囊腔(Sato)。

细胞来源：如本发明所描述的，类器官构建可以来源于组织样本中分离的细胞，包括正常组织包括消化道、乳腺、前列腺、肺、肝、卵巢、胰腺、皮肤、肾脏等等以及各正常组织对应的手术、穿刺肿瘤组织以及恶性积液。

参见图6，一种类器官培养与反馈方法，所述方法采用上述任一项所述的系统，至少包括以下步骤：

步骤S1：解离组织以产生细胞悬液，并加入到基质加样锥形管2中，在剪切微流控芯片1中形成氟油包裹的细胞微球，大小为300μm至1mm，通过微流控微管3传输至三通喷头4；

组织样本被解离成单细胞或者细胞团块。通过筛子后，未被解离的组织块仍留在过滤器上。滤液中主要包含单个细胞和细胞团块，其直径可为约10μm至1000μm，优先选择直径约10μm至约200μm，更优先选择直径约10μm至约60μm的团块或细胞。

组织解离过滤后的细胞团块和细胞外基质混合后制备的每个微球可以包含50~1000个细胞，更好则是50~500个细胞每微球，最好是100~300个细胞每微球。构建好的微球以10~1000个微球/ml的密度转移至培养基储液罐8中，并在反应器装置6中培养。培养基储液罐8中还可以包括一种或多种激酶抑制剂，例如Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。这类抑制剂可降低离体细胞的凋亡，促进细胞的恢复和生长。ROCK激酶抑制剂的浓度可为0.1μM~100μM，最好为1μM~20μM。在本发明的实施例中，细胞培养基可包含浓度约为10μM的激酶抑制剂。

解离组织样本是指使用胰蛋白酶(一种裂解蛋白质的蛋白水解酶)将组织内彼此粘附的细胞分离的过程。包括EDTA在内的螯合剂也可以作为一种替代物用于解除细胞-细胞间的连接。

典型的类器官培养培养基包括氨基酸、盐、葡萄糖和维生素，也可能包括酚红。适合于本发明使用的培养基可以通过对现有常规类器官培养基进行成分调整而产生。类器官培养基可以是Dμlbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，并且可以包括一种或多种额外成分，例如营养混合物(例如Ham’s F12)、抗生素/抗真菌药物(例如青霉素/链霉素)、缓冲液(例如HEPES)、谷氨酰胺和n-乙酰半胱氨酸。类器官培养基还可以包括无血清补充物，如N2补充物和/或B27补充物，Wnt3a蛋白，Rspondin蛋白。

本发明细胞外支持基质为凝胶状的细胞外基质，可以是合成的或天然的。比如说，细胞外支持基质可以是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底提取物，这种肿瘤组织中富含细胞外基质蛋白，如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、entactin/nidogen和一些生长因子。所述细胞外支持基质包括至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白与一种层粘连蛋白。在本发明的实施例中，细胞外支持基质可以是Matrigel™(包括层粘连蛋白、entactin和IV型胶原)或Cμltrex™BME(包括层粘连蛋白、entactin、IV型胶原和硫酸肝素蛋白聚糖)。细胞外支持基质优选为Matrigel™。）

步骤S2：控制模块控制空气喷头5以预设脉冲向三通喷头4施加压缩空气，氟油包裹的细胞微球被喷射出去，氟油在三通喷头4的出口处挥发，细胞微球通过进样孔605进入反应罐601；

步骤S3：启动旋转电机，带动搅拌轴旋转，搅拌轴带动扇叶的搅拌形成动态层流培养环境；同时，pH计608监测反应罐601内的培养基pH变化；溶氧量测定器609检测反应罐601内的培养基的溶氧量，用于提供溶氧量支持微球的生长；无菌过滤器610过滤获得无菌空气，并经进气管611进入反应罐601中，为微球生长提供氧气；

参见图7，步骤S4：在预设pH值范围、预设单次换液量和预设间隔时间内，培养基储液罐8通过蠕动泵组7与反应罐601上的进液孔603连接，用于补充培养基；废液储液罐9通过蠕动泵组7与反应罐601上的出液孔604连接，用于抽取废液；

步骤S41：设定需换液pH值范围为6.8-7.0，预设停止换液pH值范围为7.2-7.4、预设单次换液量为占总体积的比例10-80%和预设间隔时间12-72h；

步骤S42：换液，并实时更新换液时间，监测反应罐601内的培养基pH变化；

步骤S43：判断pH是否小于预设pH值范围，若是，则进入步骤S42；反之，则进入下一步；

步骤S44：培养至换液间隔时间，重复步骤S42-步骤S43。

步骤S5：通过采样蠕动泵10与反应罐601上的抽样孔606连接，蠕动泵组7的速度为1-500ml/min，抽取培养好的微球类器官至孵育单元20内的采样皿30中进行孵育；

所述采样皿30中预包埋Calceine活细胞荧光标记染料；

所述孵育单元20内的温度为36.5-37.5℃，CO₂浓度为5%，孵育时间为15-30min。

步骤S6：对孵育后的微球类器官通过图像评价模块拍摄和保存，并基于图像识别算法判断微球类器官的生长动态，根据生长状态的结果对微球类器官进行扩增或冻存。

步骤S61：如图10，对孵育后的微球类器官明场及荧光成像，根据图像识别算法及预设条件判断单个微球类器官的合格状态；

参见图8，采样蠕动泵10将微球类器官吸入采样皿30中，荧光成像单元60利用明场图像识别采样皿30中微球类器官个数，当视野内微球类器官少于N个，N>10，则再次抽样，直至满足数量要求。

随后，箱体20下的载架开始轻微摇动，将微球类器官与预包埋在采样皿30内的荧光染料充分混合。推荐摇晃速率为40-120转/min，推荐摇晃时间为30-120s。

参见图9，孵育结束后，基于图像识别算法，对微球类器官内的类器官进行识别，分割和评价。具体过程如下：

首先，筛选单个微球类器官中符合要求大小的类器官，推荐大小：φ>80μm，可根据需求调整；

其次，筛选单个微球类器官中满足大小的类器官所占面积与单个微球类器官总面积的占比： 。推荐/>>30%即为合格的微球类器官，可根据需求调整；

，其中，微球类器官为i，共n个，单个类器官的面积为Si，微球类器官的面积为S。

步骤S62：参考图10，通过计算采样皿中微球类器官的合格率来评估生物反应器中类器官的生长状态，对满足合格率的微球类器官进行扩增或冻存。

合格率：γ，γ的推荐范围为50%以上，当时，认为该批次中，反应器中的微球类器官达到培养要求。其中，X为合格的微球类器官的个数。

产品级类器官可以进行冷冻储存或运输。更详细地说，产品级类器官可在类器官冻存液中重悬，浓度约为每200ml冻存液中包含1万至50万个类器，优选每200ml冻存液中包含约2万至30万个类器官，更优选为每200ml冻存液中约5万至约10万个类器官。产品级类器官可以在-80℃冷冻。冻存液中包含二甲亚砜(DMSO)，也可能包括胎牛血清(FCS)，也可以用商业化的冻存液比如说STEMCELL的C10。

综上所述，本申请克服了以下难点：

1、形态学

目前传统的类器官制造方法，主要是利用移液枪，进行手动点胶的方法制造；在制造过程中，基质胶先点在培养皿底部，置于37度下恒温凝固后（基质胶升温凝固，低温为液态）再加入培养基培养，置于培养箱进行静态培养。凝固后的基质胶滴已经牢牢粘在皿底，此时若用外力将微球从皿底剥离，则容易造成成型的基质胶滴碎裂，预先包埋在基质胶中的细胞散落在培养基中。

本发明提及的微球类器官，在进入培养基之前，已经由微流控的方式剪切成小微球，并在微流控管子内固化后，喷射进培养基中。即：以固态微球的形式，进入反应器装置6进行培养。

微球类器官通常形态为微球状，相比于摊在皿底的拱形手动微胶滴（如上图）其所有位置都可以与培养基接触，比表面积更大，物质的转运个代谢效率更高。

基质胶能够为许多细胞提供天然的生长支架，如原代肿瘤细胞（不贴壁生长，悬浮培养易死亡）等，利用以基质胶等为细胞外支架的培养方式，能够有效培养各类肿瘤类器官。

基于上述分析，微球类器官的制造和成型方式，有先天的优势，应用于反应器装置6的大量培养和快速扩增。

2、传统方式培养周期长，扩增速度慢

利用传统的类器官培养手段，其培养周期通常在1-3周之间，增殖速度慢，难以适应大规模筛药的类器官用量需求。

针对上述问题，本发明结合反应器装置6技术，和微球类器官先天的制造和形态优势，能够加快类器官的生长，缩短类器官的培养时间，并大批量培养高度均一的类器官。

3、基于类器官培养的自动换液

传统类器官培养过程中，换液的方式主要为人力手动换液。主要方式：设定换液间隔（如两天）——到时间换液，或若细胞长得很快，观察培养基颜色，若培养基颜色变黄，则开始换液。该方法，在进行换液时，其液体环境本身，对于类器官生长，是较为恶劣的环境，且单次换液为全部换液，系统波动大，类器官需要一定时间进行适应和恢复。

本发明允许使用人员根据不同类器官生长特性（自身培养经验），自主设定换液时间间隔，换液量和pH波动进行换液，可自定义程度高，广泛适用于各类类器官培养的自动换液。其中，pH设定的波动范围越小，单次换液量越少，其换液越频繁，且系统波动越小，用户可自定义设置。

4、基于图像，自动监测类器官的生长状态

目前，对于类器官生长状态的评价，主要依靠操作人员经验，在明场显微镜下，观察类器官的形态进行判断，当样本过多时，往往劳动力密集，且明场中所包含的信息有限，无法对类器官生长状态做定量评估。

本发明中，基于荧光成像单元60，将活细胞荧光染色剂预包埋在采样皿30内，可定期自动监测类器官的生长形态，包括明场形态，细胞存活率等，并定期记录培养形态。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种类器官培养与反馈系统，其特征在于，包括：

控制模块，用于控制所述类器官培养与反馈系统；

微球制备模块，用于基于所述控制模块制备微球；

培养模块，用于将所述微球进行培养，得到微球类器官；

图像评价模块，用于对所述微球类器官进行明场及荧光成像，并对微球类器官拍摄和保存，用于记录和分析微球类器官的实时生长动态。

2.根据权利要求1所述的一种类器官培养与反馈系统，其特征在于，所述微球制备模块具体包括：

微流控剪切芯片（1），用于制备微球；

基质加样锥形管（2），设置于所述剪切微流控芯片（1），并与所述微流控剪切芯片（1）连通，用于基质加样；

微流控微管（3），其一端与所述剪切微流控芯片（1）的通道口相连，用于输送微球；

三通喷头（4），其第一连通口连接所述微流控微管（3），第二连通口连接有空气喷头（5），第三连通口连接所述培养模块，用于将微球输送至所述培养模块中；其中，所述空气喷头（5）与所述控制模块电连接。

3.根据权利要求1所述的一种类器官培养与反馈系统，其特征在于，所述培养模块包括反应器装置（6），所述反应器装置（6）具体包括：

反应罐（601）；

顶盖（602），设置于所述反应罐（601）；所述顶盖（602）上设置有进液孔（603）、出液孔（604）、进样孔（605）和抽样孔（606），所述进液孔（603）通过蠕动泵组（7）连接有培养基储液罐（8），所述出液孔（604）通过蠕动泵组（7）连接有废液储液罐（9），所述进样孔（605）连接所述微球制备模块，所述抽样孔（606）通过采样蠕动泵（10）连接所述图像评价模块；

搅拌机构（607），包括旋转电机、搅拌轴和扇叶，所述搅拌轴的顶端连接所述旋转电机，所述搅拌轴的另一端贯穿所述顶盖（602）并延伸至所述反应罐（601）中，所述搅拌轴的外表面均布设置有多个所述扇叶；

pH计（608），贯穿设置于所述顶盖（602）；

溶氧量测定器（609），贯穿设置于所述顶盖（602）；

无菌过滤器（610），其底端连接有进气管（611），所述进气管（611）贯穿设置于所述顶盖（602）。

4.根据权利要求1所述的一种类器官培养与反馈系统，其特征在于，所述图像评价模块具体包括：

孵育单元（20），用于对抽取的微球类器官进行孵育成像；

采样皿（30），其上设置有包埋的荧光标记物，用于与抽取的微球类器官反应；

机械臂（40），其连接所述控制模块，用于抓取和摆放所述采样皿（30）；

储皿站（50），其连接所述控制模块，用于储存所述采样皿（30）；

荧光成像单元（60），其连接所述控制模块，用于对微球类器官进行明场及荧光成像。

5.根据权利要求4所述的一种类器官培养与反馈系统，其特征在于，所述孵育单元（20）具体包括：

箱体（201），其上设置有容纳槽（202），所述容纳槽（202）用于容纳所述采样皿（30），所述箱体（201）的一端设置有气管连接孔（203），用于外接气体保持所述箱体（201）内的空气环境；

加热块（204），设置于所述箱体（201）上，并嵌入所述箱体（201）的侧壁内；

顶盖框（205），设置于所述箱体（201）上表面，所述顶盖框（205）与所述箱体（201）通过磁吸（206）连接，所述顶盖框（205）上表面设置有镶嵌槽（2051），所述镶嵌槽（2051）契合连接有透明玻璃顶盖（207）；

底孔玻璃（208），固定设置于所述箱体（201）的下表面，用于荧光成像。

6.一种类器官培养与反馈方法，所述方法采用如权利要求1-5任一项所述的系统，其特征在于，至少包括以下步骤：

步骤S1：解离组织以产生细胞悬液，并加入到基质加样锥形管（2）中，在剪切微流控芯片（1）中形成氟油包裹的细胞微球，通过微流控微管（3）传输至三通喷头（4）；

步骤S2：控制模块控制空气喷头（5）以预设脉冲向三通喷头（4）施加压缩空气，氟油包裹的细胞微球被喷射出去，氟油在三通喷头（4）的出口处挥发，细胞微球通过进样孔（605）进入反应罐（601）；

步骤S3：启动旋转电机，带动搅拌轴旋转，搅拌轴带动扇叶的搅拌形成动态层流培养环境；同时，pH计（608）监测反应罐（601）内的培养基pH变化；溶氧量测定器（609）检测反应罐（601）内的培养基的溶氧量，用于提供溶氧量支持微球的生长；无菌过滤器（610）过滤获得无菌空气，并经进气管（611）进入反应罐（601）中，为微球生长提供氧气；

步骤S4：在预设pH值范围、预设单次换液量和预设间隔时间内，培养基储液罐（8）通过蠕动泵组（7）与反应罐（601）上的进液孔（603）连接，用于补充培养基；废液储液罐（9）通过蠕动泵组（7）与反应罐（601）上的出液孔（604）连接，用于抽取废液；

步骤S5：通过采样蠕动泵（10）与反应罐（601）上的抽样孔（606）连接，抽取培养好的微球类器官至孵育单元（20）内的采样皿（30）中进行孵育；

步骤S6：对孵育后的微球类器官通过图像评价模块拍摄和保存，并基于图像识别算法判断微球类器官的生长动态，根据生长状态的结果对微球类器官进行扩增或冻存。

7.根据权利要求6所述的一种类器官培养与反馈方法，其特征在于，步骤S4包括以子步骤：

步骤S41：设定预设pH值范围、预设单次换液量和预设间隔时间；

步骤S42：换液，并实时更新换液时间，监测反应罐（601）内的培养基pH变化；

步骤S43：判断pH是否小于预设pH值范围，若是，则进入步骤S42；反之，则进入下一步；

步骤S44：培养至换液间隔时间，重复步骤S42-步骤S43。

8.根据权利要求6-7任一项所述的一种类器官培养与反馈方法，其特征在于，步骤S4中，

预设单次换液量为占总体积的比例10-80%；

预设间隔时间为12-72h；

蠕动泵组（7）的速度为1-500ml/min。

9.根据权利要求6所述的一种类器官培养与反馈方法，其特征在于，步骤S5中，

所述采样皿（30）中预包埋Calceine活细胞荧光标记染料；

所述孵育单元（20）内的温度为36.5-37.5℃，CO₂浓度为5%，孵育时间为15-30min。

10.根据权利要求6所述的一种类器官培养与反馈方法，其特征在于，步骤S6包括以子步骤：

步骤S61：对孵育后的微球类器官明场及荧光成像，根据图像识别算法及预设条件判断单个微球类器官的合格状态；

步骤S62：计算合格的微球类器官的合格率，对满足合格率的微球类器官进行扩增或冻存。