CN117186218B - 一种靶向rbm47的纳米抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种靶向RBM47的纳米抗体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明提出一种靶向RBM47的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如Seq ID No.1、Seq ID No.2和Seq ID No.3所示。本发明还提出一种上述纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：S1、构建多样性为10⁹的全合成纳米抗体酵母展示文库；S2、将转化后接种于液体培养基的酵母细胞接种于SD‑Trp培养基中二次传代培养；S3、以RBM47为抗原得到所述纳米抗体。本发明提出的纳米抗体能够靶向RBM47并特异性激活其ISGylation修饰。

Description

一种靶向RBM47的纳米抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向RBM47的纳米抗体及其制备方法。

背景技术

RNA结合蛋白在基因表达调控、RNA稳定性、转运、定位、翻译调控以及RNA编辑和修饰等多个层面上发挥关键作用，对细胞命运和基因调控起着重要的调节作用。RNA结合47(RBM47)具有3个RNA结合基序，具有与其靶RNA的内含子和3'-UTR区相结合，调控靶RNA的稳定性的功能，RBM47在不同物种之间保守型高。RBM47在不同组织中具有调节mRNA稳定性、参与miRNA生物发生、选择性剪接和RNA编辑等多种功能。开发特异性靶向RBM47纳米抗体，进一步精准调控RBM47活性，为疾病相关机制研究和临床治疗提供科学工具。

ISGylation是一种类似泛素化过程的蛋白质翻译后修饰，该过程涉及将ISG15(Interferon-Stimulated Gene 15)蛋白与目标蛋白结合。ISG15是一种由干扰素诱导的蛋白质，其修饰过程被认为是一种细胞内免疫响应机制，具有免疫调节、抗病毒、肿瘤发生，参与细胞命运等功能。ISGylation修饰过程涉及多个酶的参与。其中包括E1酶(UBA7)是ISGylation修饰过程中的激活酶，它与ISG15结合形成ISG15-E1复合物。E2酶(UbcH8)是ISGylation修饰过程中的转移酶，它与ISG15-E1复合物相互作用，并将ISG15从E1酶转移到目标蛋白上。E3酶(HERC5)是ISGylation修饰过程中的连接酶，它与E2酶和目标蛋白相互作用，促进ISG15的共轭化到目标蛋白上。去修饰酶USP18是负责去ISGylation修饰的酶，它能够将ISG15从目标蛋白上移除，恢复目标蛋白的原始状态。这些酶共同协作，在ISGylation修饰过程中完成ISG15的激活、转移和连接，以及后续的去ISGylation修饰，调节目标蛋白的功能和细胞过程。ISGylation的研究面临一些挑战和难点：1、低丰度：ISGylation相关的蛋白质和修饰产物通常在细胞中本地表达通常处于低丰度状态，并且其修饰状态的持续时间较短。这使得对ISGylation的检测和定量变得困难。2、特异性和敏感性：ISGylation修饰的特异性和选择性也是研究的挑战之一。

传统的药物处理激活修饰的过程影响范围大，不能单独只激活某一个蛋白上的ISGylation修饰。在细胞中存在多种蛋白质修饰过程，如泛素化和ISGylation修饰在修饰过程中具有相似性。因此，鉴定和区分ISGylation修饰的目标蛋白和修饰位点需要更为特异性的方法。3、技术和方法限制：目前仍缺乏高效、准确且特异性的方法来分析ISGylation修饰的动态变化和功能。同时，由于研究ISGylation修饰通常是转染整个修饰酶系统的，因此捕捉并调控特定蛋白的修饰过程也具有一定的挑战性。克服这些难点需要不断改进和发展新的实验技术、方法和工具，以及加强对ISGylation修饰的分子机制和功能的深入研究。

纳米抗体(Nanobody，Nb)由骆驼重链抗体的抗原结合区组成。由于纳米抗体只有常规抗体的十分之一大小。纳米抗体具有一个长且凸的抗原结合表位(CDR3)，因此能更有效地通过干预蛋白互作拮抗参与信号转导的受体和中和促炎介质。纳米抗体的这些优点使其适用于参与病理过程。利用纳米抗体特异性调控RBM47ISGylation修饰，并进一步探究应用纳米抗体治疗疾病的科学方案。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种靶向RBM47的纳米抗体及其制备方法，解决现有技术中缺乏靶向RBM47纳米抗体的技术问题。

为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种靶向RBM47的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如Seq ID No.1、Seq ID No.2和Seq ID No.3所示。

进一步地，所述纳米抗体的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。

进一步地，所述纳米抗体的核酸序列如Seq ID No.5所示。

进一步地，所述纳米抗体靶向RBM47并特异性激活其蛋白ISGylation修饰。

进一步地，所述纳米抗体连接SPOP后可以降低细胞中RBM47-mCherry或者RBM47蛋白的表达。

进一步地，所述细胞为人胚肾细胞或者人非小细胞肺癌细胞。

此外，本发明还提出一种分子表达载体，所述载体中含有如Seq ID No 1、Seq IDNo.2、Seq ID No.3或者Seq ID No.4所示的氨基酸序列，或者如Seq ID No.5所示的核酸序列。

另外，本发明还提出一种上述纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1、通过同源臂引物连续扩增纳米抗体DNA文库以用于酵母转化，将纳米抗体文库序列与Aga2的C端融合，实现纳米抗体在酵母细胞表面的展示，构建多样性为10⁹的全合成纳米抗体酵母展示文库；

S2、将转化后接种于液体培养基的酵母细胞接种于SD-Trp培养基中二次传代培养；

S3、取二次传代的细胞接种于SD-Trp培养基培养至OD＝0.5-1，细胞重悬于SG-Trp培养基以诱导纳米抗体的表达，诱导至少36h；以RBM47为抗原得到所述纳米抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的纳米抗体能够靶向RBM47并特异性激活其ISGylation修饰，在一定程度上解决了目前无法靶向激活特定蛋白ISGylation修饰的困难。

附图说明

图1是本发明实施例1纳米抗体联合bio-PROTAC系统靶向降解RBM47结果图；图1A用于降解RBM47的设计方案示意图；图1B将RBM47-mCherry、nbRBM47-SPOP、bv025-SPOP质粒转染人胚肾细胞细胞48h，使用RBM47，Flag等特异性抗体进行Western blot分析的结果图。图1C RBM47的降解增加了TSC22D3的表达的结果图。将nbRBM47-SPOP、bv025-SPOP的质粒转染人非小细胞肺癌细胞48h使用所需特异性抗体进行Western blot分析的结果图。

图2是本发明实施例1靶向调控RBM47 ISGylation修饰的纳米抗体的功能验证结果图；图2AnbRBM47与HERC5(HECT结构域)融合来设计方案示意图；图2B nbRBM47在人胚肾细胞HEK-293T中激活RBM47-ISGylation结果图。图2C和图2D分别为nbRBM47-HECT抑制人非小细胞肺癌A549细胞中TSC22D3的蛋白水平和mRNA水平的表达的结果图。

具体实施方式

本具体实施方式提供了一种靶向RBM47的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如Seq ID No.1、Seq IDNo.2和Seq ID No.3所示；所述纳米抗体的氨基酸序列如Seq ID No.4所示，所述纳米抗体的核酸序列如Seq ID No.5所示。

在某些实施例中，所述纳米抗体靶向RBM47并特异性激活其蛋白ISGylation修饰。

在某些实施例中，所述纳米抗体连接SPOP后可以降低细胞中RBM47-mCherry或者RBM47蛋白的表达；进一步地，所述细胞为人胚肾细胞或者人非小细胞肺癌细胞。

本具体实施方式还提出一种分子表达载体，所述载体中含有如Seq ID No 1、SeqID No.2、Seq ID No.3或者Seq ID No.4所示的氨基酸序列，或者如Seq ID No.5所示的核酸序列。

本具体实施方式还提出一种上述纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1、通过同源臂引物连续扩增纳米抗体DNA文库以用于酵母转化，将纳米抗体文库序列与Aga2的C端融合，实现纳米抗体在酵母细胞表面的展示，构建多样性为10⁹的全合成纳米抗体酵母展示文库；

S2、将转化后接种于液体培养基的酵母细胞接种于SD-Trp培养基中二次传代培养；

S3、取二次传代的细胞接种于SD-Trp培养基培养至OD＝0.5-1，细胞重悬于SG-Trp培养基以诱导纳米抗体的表达，诱导至少36h；以RBM47为抗原得到所述纳米抗体。

本发明以RNA结合蛋白RBM47为靶标，筛选到了靶向RBM47纳米抗体并特异性激活其ISGylation修饰，在一定程度上解决了目前无法靶向激活特定蛋白ISGylation修饰的困难。为ISGylation修饰领域提供工具并可进一步探究应用该纳米抗体参与疾病发生发展分子机制的科学方案。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的原理如下：

1)应用bio-PROTAC验证纳米抗体的功能

靶向嵌合体的蛋白水解酶(PROTAC)有三个主要结构：与靶蛋白结合的配体，与E3泛素连接酶结合的配体以及用于缀合这两个配体的接头。它可以通过泛素-蛋白酶体系统降解目标蛋白。PROTAC可在低水平下促进靶蛋白降解，发挥催化作用。bio-PROTAC与一般的PROTAC不同，bio-PROTAC不是用小分子连接配体和E3连接酶，而是通过用结合目标蛋白(POI)的肽或小蛋白直接替换E3连接酶的底物识别结构域，从而对其进行改造。改造后的融合蛋白bio-PROTAC在细胞中表达，以驱动POI的定向降解。本发明将识别RBM47的纳米抗体替代结合目标蛋白(POI)的肽或小蛋白，实现细胞内过表达和内源RBM47的降解。

2)改造bio-PROTAC技术

将能识别RBM47的纳米抗体(nbRBM47)作为识别域构建嵌合型E3连接酶nbRBM47-HECT。HECT是ISGylation的E3连接酶的重要功能区域。由于纳米抗体nbRBM47会靶向细胞内源的RBM47蛋白，即将E3酶带到靶标蛋白RBM47附近后，进而使RBM47发生ISGylation修饰。本发明实现了运用nbRBM47-HECT能达到精准地激活RBM47特定修饰位点发生的ISGylation修饰。为探究ISGylation修饰提供有效工具。

下述实施例中，用到的菌株、细胞、载体与质粒如下：

1)实验菌株

大肠杆菌DH5α为实验室保存菌株。

2)细胞系

表1实验用细胞信息表

3)载体与质粒

真核表达载体pcDNA3.1、pcDNA3.1-3×Flag等均为实验室保存，其他所用质粒均由本发明构建。

实施例1

本实施例提出一种纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)全合成纳米抗体文库的构建和靶向RBM47纳米抗体的筛选

纳米抗体文库的构建：纳米抗体文库的构建如前所述。简而言之，纳米抗体的DNA文库是通过两步重叠延伸PCR构建的。将一组十个引物溶解并混合以制备短、中、长三个混合池，其中CDR3区域分别为7、11和15个随机残基。将三个混合池的全长纳米抗体DNA产物以1:2:1的摩尔比混合，即为纳米抗体DNA文库池，通过同源臂引物连续扩增纳米抗体DNA文库以用于酵母转化，将目的蛋白序列即纳米抗体文库序列与Aga2的C端融合，实现纳米抗体在酵母细胞表面的展示，构建多样性为10⁹的全合成纳米抗体酵母展示文库。需要说明的是，表2中，WMT、TYT、RST、RVT、RSTANT、WAT等大写字母代表三核苷酸组合对对应的氨基酸序列，#代表任意氨基酸。

表2实验用引物信息表

将转化后接种于液体培养基的酵母细胞接种于SD-Trp培养基中二次传代培养以去除死细胞，30℃、250rpm培养过夜(约20h)。以初始浓度OD＝1接种于1L培养基，30℃、250rpm培养3d。2,500g离心5min收集细胞，分装冻存于-80℃。取冻存的细胞于SD-Trp培养基，30℃、225rpm过夜培养。取二次传代的细胞(初始OD为0.1-0.2，细胞量为文库多样性的10倍)接种于SD-Trp(含2％葡萄糖)培养基，30℃、225rpm培养至OD＝0.5-1。2,500g离心5min收集细胞，细胞重悬于SG-Trp(含2％半乳糖)培养基以诱导纳米抗体的表达，在20℃下诱导至少36h。以RBM47为抗原，富集高亲和力纳米抗体，并进行初步功能验证。筛选到的纳米抗体nbRBM47的氨基酸序列如Seq ID No.4所示，核酸序列如Seq ID No.5所示。

靶向RBM47纳米抗体的功能验证

纳米抗体nbRBM47的CDR(互补决定区)为……GRTFSSYA(CDR1)……SRGGSRTN(CDR2)……RYGDYPSSSASYYNY(CDR3)……，CDR1、CDR2和CDR3分别对应序列表中的Seq IDNo 1、Seq ID No.2和Seq ID No.3。

RBM47筛选肽序列为：CKEQYSRYQKAA。

将高亲和力RBM47纳米抗体替代E3泛素连接酶的底物识别域构建bio-PROTAC系统，降解细胞内过表达和内源RBM47，验证纳米抗体靶向降解RBM47的能力。

在细胞内过表达改造后nbRBM47-HECT的纳米抗体。通过检测RBM47及其下游靶基因抗体检测纳米抗体对RBM47 ISGylation修饰活性的调控作用，以及RBM47 ISGylation修饰下游调控靶基因的表达。

纳米抗体联合bio-PROTAC系统靶向降解RBM47

使用ISGylation位点周边的氨基酸肽作为表位来筛选合成纳米抗体的酵母表面展示文库，获得抗RBM47纳米抗体将其命名为nbRBM47。依据bioPROTAC技术，nbRBM47和衔接蛋白SPOP构建融合载体，命名为nbRBM47-SPOP(图1A)。

具体地，第一步，为了生成bioPROTACs质粒，使用特异性引物从合成DNA模板(genecreate)上通过PCR扩增SPOP的DNA片段。特异性引物SPOP序列为正向引物5'GACTACCGGTAGCGTGAACATCTCCGGCCAG 3'，和反向引物5'TTCTGCGGCCGCTCAGCTGTTTCAGTCTTCCTGG 3'。该DNA片段通过AgeI和NotI位点插入pcDNA3-3FLAG载体中。

第二步，为了生成FLAG标记的nbRBM47-SPOP、FLAG标记的bv025-SPOP，使用特定引物从FLAG标记的RBM47和bioPROTACs DNA模板上通过PCR扩增DNA片段。FLAG标记的nbRBM47-SPOP的特定引物是正向引物5'AAAAGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT 3'和反向引物5'AAAAACCGGTTGAGGGTGACCTG 3'。FLAG标记的bv025-SPOP的特定引物是正向引物5'AAAAGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT 3'和反向引物5'AAAAACCGGTGGAGGACGGTCACCTG 3'。该DNA片段通过BamhI和AgeI位点插入pcDNA3-3xFLAG-SPOP载体中以用来获得nbRBM47和SPOP的融合载体以及bv025和SPOP的融合载体。

并同时构建阴性对照纳米抗体bv025-SPOP。从图1B可以看出，与阴性对照相比，nbRBM47-SPOP降低了人胚肾细胞HEK-293T中外源性RBM47-mCherry和内源性RBM47蛋白的表达。从图1C可以看出，在人非小细胞肺癌A549细胞中，nbRBM47-SPOP降低了RBM47的蛋白表达，并使得RBM47下游靶蛋白TSC22D3的表达增加。上述结果表明我们获得了RBM47特异性纳米抗体，通过bioPROTAC策略有效降解了RBM47蛋白水平。

靶向调控RBM47 ISGylation修饰的纳米抗体的功能验证

通过纳米抗体Nb.RBM47-HECT可激活RBM47-ISGylation进而抑制RBM47下游调控基因TSC22D3的表达水平。HERC5作为ISGylation修饰的E3连接酶，其蛋白上第994位半胱氨酸对HERC5自身的连接酶活性是十分重要的。人胚肾细胞HEK-293T细胞与表达UBE1L、UBCH8和FLAG-ISG15的质粒共转染，再加以HA标记的nbRBM47-HECT或bv025-HECT，转染48h后使用抗FLAG特异性抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)然后进行WB分析。基于此，nbRBM47和HECT结构域一起融合构建作为底物的示意图，如图2A所示，命名为nbRBM47-HECT模型。nbRBM47-HECT增加了人胚肾细胞293T中RBM47的ISGylation表达水平。并且阴性对照bv025-HECT组不能用来诱导RBM47 ISGylation。如图2B所示，免疫共沉淀结果表明nbRBM47-HECT有效的增强了ISG15与RBM47的连接效果，进而使得RBM47 ISGylation修饰水平增多。如图2C所示，与之前结果相符合，nbRBM47-HECT增加了人非小细胞肺癌细胞A549中RBM47的ISGylation。将HECT活性位点突变成丙氨酸后(即C994A)该突变使HERC5活性丧失。如图2C所示，我们发现nbRBM47-HECT(C994A)不影响人非小细胞肺癌A549细胞中的RBM47-ISGylation表达水平，以及也不影响其下游靶基因TSC22D3的表达水平，说明模型中HERC5的功能域起到了关键作用，功能域功能的丧失，直接影响该模型使RBM47 ISGylation的激活功能。作为补充验证，在RNA水平也得到了一致的结果。如图2D所示nbRBM47-HECT抑制A549细胞中TSC22D3的mRNA表达。

本发明成功筛选到靶向RBM47的高亲和力纳米抗体。通过bio-PROTAC系统在细胞水平验证了纳米抗体RBM47靶向降解外源和内源RBM47的能力。进一步地，基于bio PRPTAC技术进行改造，成功获得了特异性激活RBM47 ISGylation修饰的纳米抗体。我们的方案与传统给药激活ISGylation修饰的方案具有以下三点优势：第一只针对激活特定蛋白上的特定修饰位点，做到精准调控。第二亲和性高，避免脱靶性。第三免疫原性低，避免对细胞的毒害。我们可以通过该纳米抗体进一步探究RBM47 ISGylation修饰在疾病中功能，为疾病的治疗提供科学方案。

应用bio-PROTAC验证纳米抗体的功能

靶向嵌合体的蛋白水解酶(PROTAC)有三个主要结构：与靶蛋白结合的配体，与E3泛素连接酶结合的配体以及用于缀合这两个配体的接头。它可以通过泛素-蛋白酶体系统降解目标蛋白。PROTAC可在低水平下促进靶蛋白降解，发挥催化作用。bio-PROTAC与一般的PROTAC不同，bio-PROTAC不是用小分子连接配体和E3连接酶，而是通过用结合目标蛋白(POI)的肽或小蛋白直接替换E3连接酶的底物识别结构域，从而对其进行改造。改造后的融合蛋白bio-PROTAC在细胞中表达，以驱动POI的定向降解。本课题将识别RBM47的纳米抗体替代结合目标蛋白(POI)的肽或小蛋白，实现细胞内过表达和内源RBM47的降解。

改造bio-PROTAC技术

将能识别RBM47的纳米抗体(nbRBM47)作为识别域构建嵌合型E3连接酶nbRBM47-HECT。HECT是ISGylation的E3连接酶的重要功能区域。由于纳米抗体nbRBM47会靶向细胞内源的RBM47蛋白，即将E3酶带到靶标蛋白RBM47附近后，进而使RBM47发生ISGylation修饰。这项创新方法实现了运用nbRBM47-HECT能达到精准地激活RBM47特定修饰位点发生的ISGylation修饰。为探究ISGylation修饰提供有效工具。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种靶向RBM47的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如Seq ID No .1、Seq ID No .2和Seq ID No .3所示。

2.根据权利要求1所述的靶向RBM47的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如Seq ID No .4所示。

3.编码根据权利要求1所述的靶向RBM47的纳米抗体的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如Seq ID No .5所示。

4.一种分子表达载体，其特征在于，所述载体中含有如Seq ID No .5所示的核酸序列。