CN117186114A - β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物化学和药物学技术领域，提供了β‑三酮‑间苯三酚‑单萜类杂萜化合物、含有该化合物的药物组合物，以及该化合物的制备方法和用途。本发明的β‑三酮‑间苯三酚‑单萜类杂萜化合物具有显著的心肌保护活性，可以用于治疗心衰，尤其是心肌肥大导致的心衰。

Description

β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物化学和药物技术领域，具体而言，涉及一类β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物、含有该化合物的药物组合物、该化合物的制备方法，以及该化合物在制备用于治疗心衰的药物中的应用。
背景技术
在长期的压力或者体积过载、心肌梗塞、心肌缺血等病理因素的刺激下，为了维持机体正常功能需求，心脏会启动一种代偿性心肌反应，表现为心脏体积增加，心脏重量增加，心肌胶原增生，这称为心肌肥大。心肌肥大常表现为心肌细胞体积增大、蛋白质合成量增加及“胚胎期”基因再表达；当心脏发生心肌肥大时，也会伴随着心肌细胞能量代谢的变化，比如糖酵解程度增加、脂肪酸、支链氨基酸代谢减低等。能量代谢包括脂肪酸代谢、葡萄糖代谢、酮体代谢及支链氨基酸代谢。正是这些变化影响着心肌肥大的进展，随着刺激时间的延长心肌肥大会逐渐发展为心衰。
线粒体是真核生物进行有氧呼吸的主要场所，其主要通过三羧酸循(Tricarboxylic acid cycle，TCA)偶联氧化磷酸化途径将糖类、脂肪及蛋白质转化为三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)，为机体提供能量。丙酮酸是多种物质合成代谢和分解代谢的重要中间物质，包括氧化代谢、糖异生途径、TCA循环、脂质从头合成及胆固醇合成等途径，丙酮酸的生成场所主要是细胞质，但其发挥作用的场所是线粒体基质，而丙酮酸只能通过位于线粒体内膜上的转运蛋白-线粒体丙酮酸载体(Mitochondrial pyruvatecarrier，MPC)进入线粒体基质参与三羧酸循环、糖异生以及脂质、氨基酸等代谢过程。因此，MPC可通过调节丙酮酸进入线粒体基质的通量从而调控机体的能量代谢。MPC包括两个成员，线粒体丙酮酸载体1(MPC1,mitochondrial pyruvate carrier 1)和线粒体丙酮酸载体2(MPC2,mitochondrial pyruvate carrier 2)，是线粒体丙酮酸转运和氧化的守护者。尽管在缺血性患者的梗死周围区域诱导MPC表达已经提出心肌病代表一种适应性反应，促进心脏保护；但是，线粒体提供的丙酮酸在衰竭心脏中的摄取和代谢尚不完全清楚。因此，通过抑制MPC活性调控丙酮酸代谢是未来研究MPC生理功能的主要研究领域之一，以探索其在心肌肥大等代谢紊乱性疾病中发挥作用的机理，可为心肌肥大的治疗提供新的思路和治疗靶位点。预防和治疗心肌肥大是治疗心脏病、心肌衰竭和心肌梗塞等多种心血管疾病的有效方法。研究心肌肥大发生时的各种生理病理性变化的分子机制能够为开发更有效的治疗及抑制心肌肥大的发生提供有效的参考。目前市面上治疗心衰的药物主要有血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β受体阻断剂、PKC抑制剂和磷酸二酯酶抑制剂等。但是目前已知的药物都存在一定的副作用，例如，β受体阻断剂药物会导致房室传导障碍，ACE抑制剂可能会引起血管性水肿，而左西孟旦可能具有增加细胞内钙的作用，影响心肌细胞钙平衡。
因此，探索心肌肥大的发病机制以及开发一种新的有效的预防和治疗病理性心肌肥大的药物具有重要的意义。天然产物具有丰富的结构类型，是药物研发的重要资源之一，从天然产物中寻找具有心肌保护的先导化合物有着巨大的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一类新的天然产物，即β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物(callistevimones)，为心衰的治疗提供可选的替代品，尤其是心肌肥大引起的心衰。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
在第一方面，本发明提供了下述结构式1-7所示的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物及其衍生物，例如药学上可接受的盐、前药：
在第二方面，本发明提供了用于治疗心衰的药物组合物，包含作为活性药物成分的上文结构式1-7所示的化合物或其药学上可接受的盐、前药，以及药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。
在第三方面，本发明涉及上文结构式1-7所示的化合物或其药学上可接受的盐或前药在制备用于治疗心衰的药物中的应用。
在第四方面，本发明提供了制备上文结构式1-7所示化合物的方法，包括以下步骤：
1)将红千层属(Callistemon R.Br)植物材料任选地干燥并粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到红千层属植物提取物；
2)对红千层属植物提取物进行柱层析，得到β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物。
在优选的实施方案中，有机溶剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈和甲酸中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有明显的有益效果。具体而言，本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物通过抑制Iso(异丙肾上腺素)诱导的心肌肥大，尤其是在细胞水平上下调心肌肥大的标志物ANP(atrial natriuretic peptide，心钠肽)和BNP(brainnatriuretic peptide，脑钠肽)，从而具有保护心肌、治疗心衰的作用。
附图说明
图1为本发明化合物1-7的化学结构式。
图2为本发明化合物单晶衍射和圆二色谱图，其中，图2a表示化合物1、3、4、5和6的单晶衍射图，图2b表示化合物1-7实验和计算的电子圆二色谱图(ECD)。
图3a和图3b显示了本发明化合物的1-7对Iso诱导的AC16细胞的细胞面积大小的影响，其中图3a：通过鬼笔环肽染色测试细胞面积来反应细胞的大小变化；图3b：化合物的1-7的细胞面积大小变化的统计图。显示的结果是一个独立实验的平均值(±SD)，Iso作为对照。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图3c和图3d显示了本发明化合物的1-7对Iso诱导的AC16细胞的线粒体膜电位的影响。3c：通过线粒体膜电位染色法测试线粒体膜电位高低的变化；3d：化合物的1-7的线粒体膜电位高低变化的统计图。显示的结果是一个独立实验的平均值(±SD)，Iso作为对照。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图3e显示了本发明化合物2、5、6、7对心肌肥大的标志物ANP、BNP和能量代谢中丙酮酸的转运载体MPC1表达水平的影响。显示的结果是三个独立实验的平均值(±SD)，Iso作为对照。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图3f显示本发明的化合物2、5、6、7提高了MPC1的表达水平，其中，左图：westernblot检测化合物2、5、6、7对Iso诱导的AC16细胞中MPC1表达的影响；右图：化合物2、5、6、7对Iso诱导的AC16细胞中MPC1表达含量的统计图。Iso作为对照，***p<0.001；****p<0.0001。
图4a显示了通过给药实验检测本发明化合物1-7对丙酮酸及其代谢物的影响。Iso作为对照，***p<0.001；****p<0.0001。
图4b显示了通过给药实验检测本发明的化合物1-7对葡萄糖及其代谢物的影响。Iso作为对照，***p<0.001；****p<0.0001。
图5a显示了通过800MHz核磁仪测试的AC16细胞中13C-丙酮酸盐及其代谢产物的13C-NMR谱。
图5b显示了通过800MHz核磁仪测试的AC16中细胞13C-葡萄糖盐及其代谢产物的13C-NMR谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的优选实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方案。相反，提供这些实施方案的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所用的术语只是为了描述具体的实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本发明中，为了叙述方便，结构式1-7对应的化合物依次称为callistevimoneA-G，或化合物1-7，例如结构式1对应的化合物可以称为callistevimone A或化合物1，结构式2对应的化合物可以称为callistevimone B或化合物2，以此类推。
根据第一方面，本发明提供了下述结构式1-7所示的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物或其药学上可接受的衍生物，例如盐，或前药：
根据本发明的第二方面，本发明提供了用于治疗心衰的药物组合物，包含作为活性药物成分的上述β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物或其药学上可接受的盐或前药，以及药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
在本发明的实施方案中，本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物可以以一种或多种互变异构形式存在，因此，该化合物可以以互变异构体的混合物形式或单独的互变异构体形式存在。
本领域技术人员应当理解，本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物的药学上可接受的衍生物，例如该化合物的盐、溶剂合物或水合物也可以用于本发明的药物组合物中。
药学上可接受的盐可以是例如药学上可接受的碱加成盐或酸加成盐。
药学上可接受的碱加成盐包括衍生自诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等无机碱的盐。衍生自药学上可接受的无毒有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺以及乙醇胺和三乙醇胺。药学上可接受的酸加成盐包括与无机酸例如碳酸、盐酸、硫酸、苯磺酸等形成的盐，也包括与有机酸例如乙酸、柠檬酸、乳酸等形成的盐。
因此，在本发明药物组合物的实施方案中，活性药物成分可以是本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物、其互变异构体、碱加成盐或酸加成盐。
合适的药物赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包括乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包括微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包括十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包括0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；乳化剂包括聚山梨酯-80、没酸山梨坦、卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包括吐温-80、胆汁、甘油等。
本发明的化合物用作药物时，可以直接施用，或者以药物组合物的形式施用。在本发明的药物组合物中，按药物组合物总重量计，药物组合物可以含有0.1–99％，优选为0.5–90％的本发明的化合物。
本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物或其衍生物的“有效量”是指，足以实现所需生物学效果例如抑制Iso诱导的AC16细胞肥大的量。应当理解，有效剂量会取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重。通常，有效量由实施治疗的人例如治疗医师来决定。
本发明的药物组合物可以以单位体重服用量的形式施用。所有以本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物或其衍生物为有效成分的药物组合物，均可采用制药和食品领域公认的方法来制备成各种剂型，例如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物组合物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行心衰的治疗。
根据第三方面，本发明提供了β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物或其药学上可接受的盐或前药在制备用于治疗心衰的药物中的应用。在不拘泥于理论的情况下，据信本发明的化合物的作用机制是通过上调MPC1的表达增强线粒体丙酮酸的转运，从而促进了丙酮酸的有氧代谢，进而可以治疗心衰。
根据第四方面，提供了制备本发明的β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物的方法，包括以下步骤：
1)将红千层属植物材料任选地干燥、粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到红千层属植物提取物；
2)对红千层属植物提取物进行柱层析，得到该化合物。
在本发明中，红千层属植物是指桃金娘科(Myrtaceae)红千层属(CallistemonR.Br.)中的种类，包括但不限于垂枝红千层(C.viminalis(Soland.)Cheel.)、柳叶红千层(C.salignus)、红千层(C.rigidus)、美花红千层(C.citrinus)、飞凤红千层(C.phoeniceus)、波氏红千层(C.polandii)、多花红千层(C.speciosus)、线叶白树(C.linearifolius)、长蕊红千层(C.pearsonii)、紫光红千层(C.cv.Purple Splendour)、松叶红千层(C.pinifolius)等。在具体的实施方案中，红千层属植物可以为垂枝红千层、柳叶红千层、红千层或美花红千层。在本发明优选的实施方案中，红千层属植物为垂枝红千层。
在具体实施方案中，红千层属植物材料可以是红千层属植物的枝条、叶片、果实或其混合物。在优选的实施方案中，红千层属植物材料是干燥的。对于新鲜的红千层属植物材料或者其水分含量较高，例如水分含量超过15％，可以先进行干燥，然后粉碎或者研磨，从而有利于提取。干燥、粉碎或者研磨可以通过本领域常规技术手段来进行，例如自然日晒干燥、烘箱加热干燥、粉碎机粉碎、研磨粉碎。在进一步优选的实施方案中，红千层属植物材料是垂枝红千层的果实。在进一步优选的实施方案中，垂枝红千层的果实是干燥的。
在本发明的实施方案中，步骤1)中浸提或提取所用有机溶剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、和甲酸中的至少一种，优选，有机溶剂为石油醚、甲醇、乙酸乙酯、丙酮或其混合物。
在本发明的实施方案中，浸提可以用有机溶剂进行至少1次，例如2、3、4、5次，优选3次，并将浸提液合并，每次浸提可以进行约12-72小时，例如12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72小时，优选12、18、24、72小时。
在本发明的实施方案中，有机溶剂与红千层属植物材料的体积比可以为1:1到10:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，以及上述任意两个比例之间的比例，例如1.5:1、2.5:1、3.5:1、4.5:1、5.5:1等，优选为8:1。
在本发明的实施方案中，在步骤2)中，柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、薄层层析和制备或半制备高效液相色谱(HPLC)。在优选的实施方案中，柱层析包括正相硅胶柱层析、聚酰胺树脂柱层析、薄层层析、反相ODS柱层析、制备或半制备高效液相色谱(HPLC)。
在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中，柱层析所用洗脱剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、水和甲酸中的一种或两种以上的组合，例如上述有机溶剂中任意两种的组合，任意三种的组合、任意四种的组合等；优选地，正相硅胶柱层析采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮中的两种按体积比从100:0到0:100梯度洗脱，例如石油醚和乙酸乙酯、石油醚和丙酮以及乙酸乙酯和丙酮，体积比可以为例如100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100、80:100，例如50:1、25:5、10:15、5:1、0:1等；聚酰胺树脂柱层析采用甲醇或丙酮或乙腈或乙醇与水按体积比从100:0到0:100梯度洗脱，例如甲醇与水、丙酮与水或乙腈与水，体积比可以为例如100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100、80:100，例如50:1、25:5、10:15、5:1、0:1等；薄层层析采用石油醚和丙酮按体积比从10:1到1:1，例如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、1:1等；反相ODS柱层析甲醇或丙酮或乙腈与水按体积比从100:0到0:100梯度洗脱，例如，甲醇与水、丙酮与水或乙腈与水，体积比可以为例如100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100、80:100，例如50:1、25:5、10:15、5:1、0:1等；制备或半制备HPLC采用乙腈和水按体积比从90:10到99:1梯度洗脱，例如90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1等。
在本发明的具体实施方案中，本发明的方法还任选地包括步骤3)，即在步骤2)之后对获得化合物进行结晶、重结晶。结晶和重结晶采用的溶剂系统可以为甲醇、丙酮、正己烷或其组合，例如上述有机溶剂中的任意一种，例如甲醇，或者任意两种的组合，例如甲醇与丙酮的组合，其体积比可以为5:3，例如5:1、4:1、3:1，三种的组合，其体积比为(3-5):3:1，例如3:3:1、4:3:1、5:3:1。结晶是本领域的常规技术手段，例如溶剂缓慢挥发法，将样品加热溶解后放置于4℃冰箱内缓慢挥发溶剂形成晶体。在具体实施方案中，加热的具体温度无特别限制，只要样品能够溶解即可。
下面结合附图和实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
在下述实施例中，1H,13C NMR和2D NMR谱在Bruker AV-III 500和AV-III 600核磁共振仪上测定；高分辨质谱(HR-ESI-MS)由Agilent UPLC/Q-Tof液质联用仪测定；紫外光谱(UV)在甲醇中用ShimazuUV-2401PC紫外光谱仪测定；HPLC分析和制备用Agilent 1260型或1100型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent ZORBAX-SB-C18层析柱(5μm；4.6×150mm)或Agilent ZORBAX-SB-C18层析柱(5μm；9.4×250mm)；柱层析用正相硅胶(200–300目)及薄层层析板(thin—layer chromatography,TLC)均为青岛海洋化工厂产品；薄层层析通过10％FeCl3-乙醇溶液观察其斑点；反相材料ODS为Merck公司产品。倒置荧光显微镜(Nikon TI-S，日本)；十万分之一天平(XS/05,Metter Toledo)；高压灭菌锅(YXQ-LS-50S,上海博讯)；二氧化碳培养箱(NU-4950ENUAIRE)；超净工作台(BJ-CD，上海博讯)。DMSO(0231-500ML,Amresco)；PBS(C10010500BT,GIBCO)；DMEM高糖培养基(C11995500BT,GIBCO)；胰酶(25200072,GIBCO)；异丙肾上腺素(Iso)(I5627,Sigma-Aldrich)；细胞裂解液(WB-0072，北京鼎国昌盛)。
实施例1：化合物Callistevimones A-G的制备方法
在本实施例中，采用以下步骤制备Callistevimones A-G：
(1)将垂枝红千层的果实样品进行干燥、粉碎，得到垂枝红千层植物材料；
(2)在室温下，采用石油醚对上述植物材料进行提取，石油醚与植物材料的体积比为8:1，总共提取3次，每次72h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；
(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为1.2:1)，以石油醚/乙酸乙酯(100:0，100:1，50:1，25:1，10:1，0:100，v/v，每个梯度3～5个柱体积)为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析(展开剂为石油醚和丙酮体积比为10:1)的检测下合并得到八个部分即：Fr.A-Fr.H；
(4)将收集得到的Fr.E部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，减压浓缩，以甲醇-水(0:100，50:50，70:30，90:10，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗脱液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为5:1，得到四个馏分Fr.E.1-Fr.E.4。Fr.E.1-Fr.E.4经反相ODS柱层析(甲醇-水：0:100，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比95:5)，得到化合物callistevimone G(300mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(5)将收集得到的Fr.F部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以甲醇-水(50:50，70:30，90:10，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为4:1，得到四个馏分Fr.F.1-Fr.F.4。Fr.F.1-Fr.F.4经反相ODS柱层析(甲醇-水：60:40，70:30，80:20，90:10，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比90:10)，得到化合物callistevimone A(9.5mg)、callistevimone B(4.7mg)、callistevimone C(3.7mg)、callistevimone E(18.5mg)、callistevimone F(6.0mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(6)将收集得到的Fr.G部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以甲醇-水(50:50，70:30，90:10，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为1:1，得到四个馏分Fr.G.1-Fr.G.4。Fr.G.1-Fr.G.4经反相ODS柱层析(甲醇-水：60:40，70:30，80:20，90:10，100:0，v/v)多次洗脱后，进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比92:8)，得到化合物callistevimone D(4.4mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(7)Callistevimone A结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇/丙酮/正己烷的混合物，体积比为3:3:1；callistevimone C结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇/丙酮的混合物，体积比为5:3；callistevimone D结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇；callistevimone E结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇/丙酮/正己烷的混合物，体积比为4:3:1；callistevimone F结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇/丙酮/正己烷的混合物，体积比为5:3:1。Callistevimones A、C、D、E、F的单晶结构如图2a所示。
Callistevimones A的物理常数和波谱数据：黄色针状晶体(MeOH/Acetone/Hexane:3/3/1,v/v)；[α]25 D+17.10(c0.10,MeOH)；λmax(logε)195(-1.06),229(-0.78),276(-0.79)；IR(KBr)νmax:3365,2963,2872,1716,1658,1624,1468,1420,1382,1264,1136cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)195(-103.13),236(+75.27),302(+9.27)nm；HR-ESI-MS:m/z597.3426([M+H]+,C35H48O8 +；calc.597.3426)，1H NMR数据见表1，13C NMR数据见表3。
Callistevimone B的物理常数和波谱数据：黄色油状；[α]25 D+1.75(c0.08,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)196(-0.42),226(-0.08),277(-0.05)；IR(KBr)νmax:3412,2961,2872,1716,1658,1624,1467,1420,1382,1264,1134cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)195(-19.22),236(+14.64),301(+1.49)nm；HR-ESI-MS:m/z611.3581([M+H]+,C36H50O8 +；calc.611.3578)，1H NMR数据见表1，13C NMR数据见表3。
Callistevimone C的物理常数和波谱数据：黄色针状晶体(MeOH/Acetone:5/3)；[α]25 D+41.7(c0.10,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)197(-0.48),228(-0.19),277(-0.13)；IR(KBr)νmax:3426,2969,2872,1715,1660,1623,1468,1417,1382,1254,1134cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)195(2.13),239(+6.20),303(+1.67)nm；HR-ESI-MS:m/z597.3425([M+H]+,C35H49O8 +；calc.597.3349),1HNMR数据见表1，13C NMR数据见表3。
Callistevimone D的物理常数和波谱数据：黄色针状晶体(MeOH)；[α]25 D–73.51(c0.07,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)200(-0.57),225(-0.33),279(-0.28)；IR(KBr)νmax:3419,2966,2853,1715,1650,1624,1467,1418,1382,1257,1134cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)200(16.75),229(-0.38),269(+0.36),317(-0.97)nm；HR-ESI-MS:m/z597.3421([M+H]+,C35H49O8 +；calc.597.3422)，1H NMR数据见表1，13CNMR数据见表3。
Callistevimone E的物理常数和波谱数据：黄色针状晶体(MeOH/Acetone/Hexane:4/3/1)；[α]25 D+87.34(c0.07,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)199(-0.77),230(-0.55),277(-0.52)；IR(KBr)νmax:3418,2967,2873,1715,1657,1624,1467,1418,1380,1263,1133cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)195(2.46),239(+19.01),303(+5.78)nm；HR-ESI-MS:m/z611.3577([M+H]+,C36H50O8 +；calc.611.3578),1H NMR数据见表2,13C NMR数据见表3。
Callistevimone F的物理常数和波谱数据：黄色针状晶体(MeOH/Acetone/Hexane:5/3/1)；[α]25 D+24.43(c0.07,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)196(-0.52),222(-0.26),276(-0.20)；IR(KBr)νmax:3223,2919,2872,1716,1657,1623,1467,1417,1382,1264,1129cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)195(-2.15),237(+10.74),304(+1.64)nm；HR-ESI-MS:m/z611.3570([M+H]+,C36H50O8 +；calc.611.3578)，1HNMR数据见表2，13C NMR数据见表3。
Callistevimone G的物理常数和波谱数据：黄色油状；[α]25 D+54.87(c0.21,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)195(-0.72),226(-0.45),278(-0.47)；IR(KBr)νmax:3419,2966,2872,1716,1657,1623,1467,1416,1380,1263,1133cm-1；CD(MeOH)λmax(Δε)195(2.95),239(+39.12),303(-23.77)nm；HR-ESI-MS:m/z595.3642([M+H]+,C36H50O7 +；calc.595.3629)，1HNMR数据见表2，13C NMR数据见表3。
表1.Callistevimones A-D(1-4)的1HNMR的数据(δin ppm,Jin Hz)
a在600MHz用CDCl3测试；b在500MHz用CDCl3测试
表2.Callistevimones E-F(5-7)的1H NMR的数据(δin ppm,J in Hz)
a在600MHz用CDCl3测试；b在500MHz用CDCl3测试
表3.Callistevimones A-G(1-7)的13C NMR的数据(δin ppm)
a在600MHz用CDCl3测试；b在500MHz用CDCl3测试
实施例2：化合物Callistevimones A-G的制备方法二
(1)将红千层枝叶干燥、粉碎后红千层植物材料；
(2)在室温下，采用甲醇对上述植物材料进行提取，甲醇与植物材料的体积比为5:1，总共提取3次，每次12h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；然后用水溶解之后，选取石油醚萃取，合并石油醚提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；
(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为1.5:1)，以石油醚/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱(体积比100:0,50：2,25:2,10:3,1:1；每个梯度3～5个柱体积)，在薄层层析(展开剂为石油醚和丙酮体积比为6:1)的检测下合并得到八个部分即：Fr.A-Fr.H；
(4)将收集得到的Fr.E部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，减压浓缩，以丙酮-水(30:70，50:50，70:30，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗脱液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为5:1，得到四个馏分Fr.E.1-Fr.E.4。Fr.E.1-Fr.E.4经反相ODS柱层析(丙酮-水：0:100,40:60，60:40，80:20，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比90:10)，得到化合物callistevimone G(300mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(5)将收集得到的Fr.F部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以丙酮-水(50:50，70:30，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为3:1，得到四个馏分Fr.F.1-Fr.F.4。Fr.F.1-Fr.F.4经反相ODS柱层析(丙酮-水：35:65，55:45，75:25，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比95:5)，得到化合物callistevimone A(9.5mg)、callistevimone B(4.7mg)、callistevimone C(3.7mg)、callistevimone E(18.5mg)、callistevimone F(6.0mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(6)将收集得到的Fr.G部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以丙酮-水(25:75，55:45，85:15，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为5:2，得到四个馏分Fr.G.1-Fr.G.4。Fr.G.1-Fr.G.4经反相ODS柱层析(丙酮-水：50:50，70:30，100:0，v/v)多次洗脱后，进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比93:7)，得到化合物callistevimone D(4.4mg)，经HPLC检测其纯度为98％。
实施例3：化合物Callistevimones A-G的制备方法三
(1)将柳叶红千层枝叶干燥、粉碎后红千层植物材料；
(2)在室温下，采用乙酸乙酯对上述植物材料进行提取，乙酸乙酯与植物材料的体积比为6:1，总共提取3次，每次24h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；然后用水溶解之后，选取石油醚萃取，合并石油醚提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；
(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为1.3:1)，以石油醚/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱(体积比100:0，50：3,15:2，5:2,1:1；每个梯度3～5个柱体积)，在薄层层析(展开剂为石油醚和丙酮体积比为7:1)的检测下合并得到八个部分即：Fr.A-Fr.H；
(4)将收集得到的Fr.E部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，减压浓缩，以乙腈-水(10:90，45:55，75:25，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗脱液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为10:1，得到四个馏分Fr.E.1-Fr.E.4。Fr.E.1-Fr.E.4经反相ODS柱层析(乙腈-水：0:100,40:60，60:40，80:20，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比96:4)，得到化合物callistevimone G(300mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(5)将收集得到的Fr.F部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以乙腈-水(30:70，65:35，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为2:1，得到四个馏分Fr.F.1-Fr.F.4。Fr.F.1-Fr.F.4经反相ODS柱层析(乙腈-水：35:65，65:35，95:15，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比91:9)，得到化合物callistevimone A(9.5mg)、callistevimone B(4.7mg)、callistevimone C(3.7mg)、callistevimone E(18.5mg)、callistevimone F(6.0mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(6)将收集得到的Fr.G部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以乙腈-水(40:60，60:40，80:20，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为3:1，得到四个馏分Fr.G.1-Fr.G.4。Fr.G.1-Fr.G.4经反相ODS柱层析(乙腈-水：40:60，70:30，100:0，v/v)多次洗脱后，进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比92:8)，得到化合物callistevimone D(4.4mg)，经HPLC检测其纯度为98％。
实施例4：化合物Callistevimones A-G的制备方法四
(1)将美花红千层枝叶干燥、粉碎后红千层植物材料；
(2)在室温下，采用乙酸乙酯对上述植物材料进行提取，丙酮与植物材料的体积比为4:1，总共提取3次，每次18h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；然后用水溶解之后，选取石油醚萃取，合并石油醚提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；
(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为1.3:1)，以乙酸乙酯/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱(体积比100:0，25：1,15:1，10:3,1:1；每个梯度3～5个柱体积)，在薄层层析(展开剂为石油醚和丙酮体积比为8:1)的检测下合并得到八个部分即：Fr.A-Fr.H；
(4)将收集得到的Fr.E部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，减压浓缩，以乙醇-水(40:60，65:25，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对得到的洗脱液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为4:1，得到四个馏分Fr.E.1-Fr.E.4。Fr.E.1-Fr.E.4经反相ODS柱层析(乙醇-水：35:65，65:35，85:15，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比90:10)，得到化合物callistevimoneG(300mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(5)将收集得到的Fr.F部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以乙醇-水(40:60，80:20，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为3:1，得到四个馏分Fr.F.1-Fr.F.4。Fr.F.1-Fr.F.4经反相ODS柱层析(乙醇-水：45:55，65:25，85:15，100:0，v/v)多次洗脱后进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比90:10)，得到化合物callistevimone A(9.5mg)、callistevimone B(4.7mg)、callistevimone C(3.7mg)、callistevimone E(18.5mg)、callistevimone F(6.0mg)，经HPLC检测其纯度为98％；
(6)将收集得到的Fr.G部分(为黑色油状物)用丙酮脱脂，以乙醇-水(35:65，60:40，85:15，100:0，v/v)为洗脱剂进行聚酰胺树脂柱层析，并对洗出液进行薄层层析检测，展开剂为石油醚和丙酮体积比为1:1，得到四个馏分Fr.G.1-Fr.G.4。Fr.G.1-Fr.G.4经反相ODS柱层析(乙醇-水：55:45，75:25，100:0，v/v)多次洗脱后，进行半制备HPLC(乙腈-水，体积比94:6)，得到化合物callistevimone D(4.4mg)，经HPLC检测其纯度为98％。
实施例5：化合物Callistevimones A-G(化合物1-7)对AC16细胞面积大小的影响(鬼笔环肽染色法)
在本实施例中，利用鬼笔环肽染色法(Zhang H,Li X,Jia M,Ji J,Wu Z,Chen X,et al.Roles of H19/miR-29a-3p/COL1A1 axis in COE-induced lung cancer.EnvironPollut 2022；313:120194)评估化合物Callistevimones A-G(化合物1-7)对Iso诱导的AC16细胞(通派上海生物科技有限公司)心肌肥大的抑制作用。评估采用鬼笔环肽染色法进行，过程如下：
(1)细胞固定并破膜：培养好的AC16细胞爬片，倒去DMEM培养基，用PBS洗涤。用4％多聚甲醛固定30min，用PBS洗3次，每次5min，滴加0.1％Triton(15596026,ThermoScientific)，破膜20min。(2)加鬼笔环肽：稍甩干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈(防止液体流走)，加50-100μl鬼笔环肽(iFluor 350-Phalloidin)工作液，室温孵育2h，PBS洗3次，每次5min。(3)DAPI复染细胞核：用PBS(PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除PBS后，在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。(4)在激光扫描共聚焦倒置显微镜下观察并采集图像。
细胞面积的变化如图3a所示，蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示细胞骨架；红色荧光与蓝色重叠，反应心肌细胞大小的变化。化合物化合物1-7和阳性对照药恩格列净(empagliflozin)分别干预后Iso诱导的AC16细胞面积大小变化如图3b，与Iso模型组比较，经化合物处理的Iso诱导的AC16细胞表面积显著变小(P＜0.05)；与阳性对照组比较，化合物2、3和5处理的Iso诱导的AC16细胞表面积都小于阳性药对照组(P＜0.05)。上述结果表明化合物处理对Iso诱导的AC16细胞肥大具有显著抑制作用，其中化合物2、3、5和7的效果最为明显(P＜0.001)。
实施例6：化合物Callistevimones A-G(化合物1-7)对AC16细胞线粒体膜电位的影响(线粒体膜电位染色法)
在本实施例中，利用线粒体膜电位染色法(Sakamuru S,Attene-Ramos MS,XiaM.Mitochondrial membrane potential assay.High-throughput screening assays intoxicology High-Throughput Screening Assays in Toxicology 20161473:17-22.)检验化合物Callistevimones A-G(化合物1-7)对AC16细胞线粒体膜电位的影响。
首先将Iso诱导的AC16细胞接种在12孔板培养细胞，然后将Iso诱导的AC16细胞(通派上海生物科技有限公司)悬液密度调整为1×106个/mL，24h细胞贴壁后，弃上清，对照组每孔加入1mL的DMEM完全培养基；Iso模型组每孔加入等体积含Iso的DMEM(Dulbecco′sModified Eagle′s Medium,Iso终浓度为10μM)；给药组每孔分别加入等体积含化合物callistevimones A-G，终浓度为10μM和阳性对照药(恩格列净，终浓度为10μM)的DMEM。PBS轻洗一次弃掉细胞液，根据JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，C2006)操作说明，先加入500μL DMEM培养基，再加入500μL JC-1染色工作液(上海碧云天生物技术有限公司，C2006)，充分混匀，置于37℃孵育20min，弃上清，JC-1染色缓冲液洗涤2次，倒置荧光显微镜(Nikon Corp.)下观察并拍照。用Image J计算荧光强度(绿色荧光/红色荧光)，分析线粒体膜电位的变化。
线粒体膜电位的变化如图3c所示，绿色荧光表示线粒体膜电位较低，形成JC-1单体，红色荧光表示线粒体膜电位较高，形成JC-1聚合物，红色荧光与绿色重叠，反应心肌细胞凋亡的变化。当化合物callistevimones A-G分别干预后的线粒体膜电位变化如图3d所示，与Iso(异丙肾上腺素)模型组、阳性对照药组比较，经化合物处理的细胞中线粒体膜电位均有显著性增强(P＜0.05)。说明化合物1-7处理对膜电位的恢复具有积极作用，其中化合物2和5的效果最为明显(P＜0.001)。
实施例7：化合物Callistevimones对ANP、BNP和MPC1表达水平的影响
在本实施例中，利用qPCR和Western Blot检测了心肌肥大标志物ANP和BNP信使核糖核酸(mRNA)以及能量代谢中丙酮酸转运载体MPC1的表达水平，以验证化合物Callistevimones B、E、F和G(即化合物2、5、6和7)是否可以抑制Iso诱导的心肌肥大。
用TRIzol(T9424,Sigma-Aldrich)从AC16细胞中提取总RNA，并按照制造商的说明使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(K1622，Thermo Fisher)制备单链cDNA，以通过qPCR扩增ANP、BNP和MPC1、GAPDH。PCR反应体系为10μL：5μL SYBR Premix Ex Taq(Takara,RR420A)，0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，1μL cDNA，3.2μL dd H2O。采用Prime r5.0软件设计引物，PCR引物序列见表4。PCR扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，在各基因最佳退火温度下退火20s，即72℃20s，共40个循环；PCR反应后绘制熔解曲线以判断扩增产物的正确性，温度以0.5℃/5s的速度从60℃上升到95℃。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶,Millipore,G5262)为内参，对得到的含有ANP、BNP、MPC1各样品的CT值进行均一化处理，在ANP、BNP、MPC1的基因分别与GAPDH的扩增效率基本一致的条件下，以control组(正常AC16细胞组)中上述基因的表达水平为基准，通过2-ΔΔCT法对相关基因的表达水平进行比较分析。
表4.引物序列
引物
将ANP和BNP标准化为同一样本中GAPDH的标准化，48h后，通过公式2-ΔΔCq进行量化，Iso模型组的ANP和BNP mRNA的表达比control组(正常AC16细胞组)显著增加。与Iso模型组相比，化合物2、5、6和7组的ANP和BNP mRNA的表达水平下调，MPC1 mRNA的表达水平上调，且具有统计学意义(图3e)。
MPC1蛋白被认为与心肌肥厚及心衰疾病密切相关，MPC1的下调及缺失会导致心肌肥厚及心衰。为了进一步研究化合物化合物2、5、6和7对能量代谢的影响，还通过蛋白质印迹分析检测了MPC1蛋白的表达变化。Western Blot实验包括MPC1、β-微管蛋白。将AC16细胞用RIPA裂解缓冲液(Millipore,20-188)裂解，总蛋白质含量用BCA试剂盒(23227,ThermoScientific)进行分析，进行蛋白质印迹分析。通过10-15％SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移到PVDF膜(EMD Millipore)上。用5％脱脂乳溶液室温下将PVDF膜封闭1小时，并在4℃下与β-微管蛋白的一级抗体(EP1331Y,Abcam,1:1000)、MPC1的一级抗体(14462,CellSignaling Technology,1:1000)混合。然后用TBS-Tween-20洗涤膜3次，在室温下与HRP偶联的第二抗体(鼠抗，SA00001-2,Proteintech)孵育(1:5000)放置1小时，免疫合物通过化学发光显示。
MPC1表达在Iso模型组低于对照组。在用化合物2、5、6和7预处理后，MPC1蛋白表达与Iso模型组相比MPC1蛋白表达具有上调的趋势，且具有统计学意义。上述证明了化合物2、5、6和7能够提高进入线粒体丙酮酸的量，然后促进MPC1的表达(图3f)。通过qPCR及WesternBlot实验结果表明化合物2、5、6和7能够增强MPC1和降低ANP、BNP的活性。
实施例8：AC16细胞中丙酮酸和葡萄糖的代谢过程
本所述了的目的是研究化合物Callistevimones对AC16细胞中丙酮酸和葡萄糖代谢过程的影响。
首先将AC16细胞接种在24孔板，24小时贴壁后，去掉细胞液，换成含有13C标记的丙酮酸或者葡萄糖的DMEM培养基，条件设置为细胞体积以覆盖NMR检测线圈的有效区域。将化合物2、5、6和7添加到DMEM培养基中，在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养48小时后，收集培养基。分别取500μL的培养基、50μL的重水(D2O)和50μL的乙酰丙酮铬的氘代二甲亚砜溶液(14mg/mL)，然后将三者混合均匀加入到5mm NMR管中。在800-MHz配备低温三共振探头的布鲁克Avance核磁共振仪上测量13C NMR核磁谱图。典型的采集参数如下：频谱宽度，36000Hz；脉冲宽度，12.00μs；数据大小，32K；弛豫时间，20s；扫描次数，200。在298K下在5mm管中获得13C NMR光谱。将峰化学位移和峰分裂与文献中给出的值对比来指认不同的信号峰。
结果发现心力衰竭的心脏中能量代谢发生了明显的紊乱，但是具体的代谢路径的差异还是未知的，需要靶向代谢流实验进一步去验证。为了靶向能量的代谢，具体地探讨代谢的差异，应用核磁共振波谱(NMR)稳定同位素追踪实验就人心肌细胞AC16中13C6标记的丙酮酸的代谢过程(图4a和5a)进行了检测分析。丙酮酸(Pyuvate,P)代谢路径有三条：第一条是在细胞质中转化成乳酸(Lactate,PL)；第二条路径是在细胞质中成丙氨酸(Alanine,PA)；第三条是进入线粒体，即成为进入线粒体的丙酮酸(Pyuvate-mitochondria,Pm)。通过13CNMR定量分析(图5)，并通过以下公式计算进入线粒体的丙酮酸(Pm)：Pm＝P-PL-PA；其结果如图4b所示，消耗等量的丙酮酸，化合物2、5、6和7组的乳酸及丙氨酸累积量低于Iso模型组，但是进入线粒体的丙酮酸积累量明显高于Iso模型组，表明化合物2、5、6和7促进了TCA循环，化合物促进效果由强到弱依次为5、6、2和7。我们进一步分析了葡萄糖的代谢，葡萄糖通过糖酵解可以转化为丙酮酸盐。化合物5、7组的乳酸、丙氨酸和丙酮酸累积量高于Iso模型组，化合物2、6组的乳酸、丙氨酸和丙酮酸累积量低于或相当于Iso模型组；化合物5、6组的α-葡萄糖、β-葡萄糖和总葡萄糖消耗量高于Iso模型组，化合物2、7组的α-葡萄糖、β-葡萄糖和总葡萄糖消耗量低于或相当于Iso模型组；上述结果表明化合物5能够促进α-葡萄糖、β-葡萄糖和总葡萄糖消耗，增加乳酸、丙氨酸和丙酮酸累积。
综上，β-三酮偶联间苯三酚偶联单萜类型的化合物2、5、6和7通过抑制Iso诱导的心肌肥大，尤其是在细胞水平上下调心肌肥大的标志物ANP和BNP，具有心肌保护活性，初步阐明其作用机制可能是通过上调MPC1的表达增强线粒体丙酮酸的转运，从而促进了丙酮酸的有氧代谢。

Claims (10)

1.β-三酮-间苯三酚-单萜类杂萜化合物，其特征在于，其具有以下结构式1-7之一：
2.用于治疗心衰的药物组合物，其特征在于，包含一种或多种权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药，以及药学上可接受载体、佐剂或赋形剂。
3.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐、前药在制备用于治疗心衰的药物中的应用。
4.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将红千层属(Callistemon R.Br)植物材料任选地干燥并粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到红千层属植物提取物；
2)对所述红千层属植物提取物进行柱层析，得到所述化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述红千层属植物材料是红千层属植物的枝条、叶片、花、果实、种子或其混合物，优选，所述红千层属植物是垂枝红千层(C.viminalis)、红千层(C.rigidus)、美花红千层(C.citrinus)或柳叶红千层(C.salignus)。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述有机溶剂和所述红千层属植物材料的体积比为1:1到10:1，优选8:1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述有机溶剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈和甲酸中的至少一种；优选地，所述有机溶剂为石油醚、甲醇、乙酸乙酯、丙酮或其混合物。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、薄层层析和制备或半制备高效液相色谱(HPLC)；优选地，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、聚酰胺树脂柱层析、薄层层析、反相ODS柱层析、制备或半制备高效液相色谱(HPLC)。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述柱层析所用洗脱剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、水和甲酸中的一种或两种以上的组合；优选地，所述正相硅胶柱层析采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮中的两种按体积比从100:0到0:100梯度洗脱；所述聚酰胺树脂柱层析采用甲醇或丙酮或乙腈或乙醇与水按体积比从100:0到0:100梯度洗脱；所述薄层层析采用石油醚和丙酮按体积比从10:1到1:1；所述反相ODS柱层析采用甲醇或丙酮或乙腈与水按体积比从100:0到0:100梯度洗脱；所述制备或半制备HPLC采用乙腈和水按体积比从90:10到99:1梯度洗脱。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还任选地包括在步骤2)之后对所述化合物进行结晶、重结晶，优选，所述结晶以及重结晶采用的溶剂为甲醇、丙酮和正己烷中的至少一种。
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