CN117157414A - 制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法 - Google Patents

制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117157414A
CN117157414A CN202280027678.1A CN202280027678A CN117157414A CN 117157414 A CN117157414 A CN 117157414A CN 202280027678 A CN202280027678 A CN 202280027678A CN 117157414 A CN117157414 A CN 117157414A
Authority
CN
China
Prior art keywords
shell
combination
microspheres
additive
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280027678.1A
Other languages
English (en)
Inventor
S·里库尔特
P·马森内特
E·劳伦斯
N·戈姆利
J·戴维森
K·施耐德
A·弗朗卡斯
J·沃尔什
J·S·巴苏基
S·戈利扎德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Irumina Singapore Ltd
Illumina Cambridge Ltd
Illumina Inc
Original Assignee
Irumina Singapore Ltd
Illumina Cambridge Ltd
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Irumina Singapore Ltd, Illumina Cambridge Ltd, Illumina Inc filed Critical Irumina Singapore Ltd
Publication of CN117157414A publication Critical patent/CN117157414A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • B01J13/043—Drying and spraying
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/20—After-treatment of capsule walls, e.g. hardening
    • B01J13/22—Coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及一种包含包围核的壳的组合物，其中该核包含一种或多种冻干微球。本文还描述了一种方法，该方法包括提供一种或多种冻干微球；以及在有效包封该一种或多种冻干微球的条件下，用壳包被该一种或多种冻干微球。本公开还涉及一种系统，该系统包含一种或多种如本文所述的组合物和一种或多种冻干团块，其中该一种或多种组合物和该一种或多种冻干团块在有效形成再水合系统的条件下组合。本文还描述了一种控制一种或多种包封的微球的释放的方法，该方法包括提供如本文所述的组合物以及在有效控制一种或多种冻干微球从该组合物中释放的第一条件下将该组合物与再水合溶液混合。

Description

制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法
本申请要求2021年4月13日提交的美国临时专利申请序列号63/174,325的权益，该美国临时专利申请据此全文以引用方式并入。
技术领域
本公开总体上涉及制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法。
背景技术
许多当前测序平台使用“边合成边测序”(“SBS”)技术和基于荧光的检测方法。期望将允许更具成本效益、更快速和更方便的测序和核酸检测的替代测序方法和改善的样品制备过程作为SBS的补充。
用于SBS技术的当前方案通常采用将DNA或RNA转化成片段化的可测序模板的文库的样品制备过程。样品制备方法通常涉及多个步骤、材料转移以及昂贵的仪器来实现片段化，并且因此往往是困难、繁琐、昂贵且低效的。
通常按任何合适的方式制备包含多核苷酸的文库，以将寡核苷酸衔接子附着到目标多核苷酸上。测序可导致确定目标多核苷酸的全部或部分序列。通过使用转座酶介导的片段化和加标签，可使在准备用于簇形成和测序的溶液中将核酸转化成衔接子修饰的模板所涉及的步骤数量减少或在一些情况下甚至最小化。该过程称为“标签片段化”(tagmentation)，其涉及通过转座体复合物修饰核酸，该转座体复合物包含与包括转座子末端序列的衔接子复合的转座酶，如例如WO 2016/130704中所述。在测序之前用于固定和扩增的方法描述于例如美国专利号8,053,192、WO 2016/130704、美国专利号8,895,249和美国专利号9,309,502中。模板文库可用于通过固相扩增且更具体地通过固相等温扩增来制备核酸集落的聚类阵列，如美国专利公布号2005/0100900、美国专利号7,115,400、WO00/18957和WO 98/44151中所述。
测序可以使用任何合适的测序技术来进行，并且用于确定固定和扩增的衔接子-目标-衔接子分子的序列的方法(包括链再合成)是本领域已知的并且描述于例如美国专利号8,053,192、WO2016/130704、美国专利号8,895,249和美国专利号9,309,502中。SBS技术通常包括通过针对模板链反复加入核苷酸进行的新生核酸链的酶促延伸。在传统的SBS方法中，可在每次递送中在存在聚合酶的情况下将单个核苷酸单体提供给靶核苷酸。示例性SBS系统和方法描述于美国专利公布号2007/0166705、2006/0188901、2006/0240439、2006/0281109、2012/0270305和2013/0260372、美国专利号7,057,026、WO 05/065814、美国专利公布号2005/0100900、WO 06/064199和WO 07/010,251、美国专利公布号2013/0079232中。
包括例如PCR的样品制备所涉及的试剂的稳定性根据多种因素而变化。历史上，试剂是湿的，因此往往涉及冷冻以进行运输和储存。转为干试剂可允许环境运输和储存，但干试剂可能比湿试剂对环境条件更敏感。如果试剂在制造、运输、储存时或在文库制备期间暴露于不期望的环境条件，则所得文库的质量和效率可能受到影响。类似地，试剂如SBS缓冲剂的pH在测序期间变化，并且需要改善这些缓冲剂的稳定性以提高SBS性能。样品制备所涉及的试剂可能对湿度、光和水分的变化高度敏感，因此，众所周知难以保持稳定。
而且，可用于样品制备的冻干微球往往在运输和储存期间暴露于机械应力时降解，并且可能不利地脱落它们的外部覆盖物。所得粉末可能因阻塞用于样品制备的膜而存在问题，并且在已经实现再水合之后可能导致所需最终浓度的变化。静电荷也是分配和干燥复合微球的风险。
通过颗粒-颗粒和/或颗粒-壁相互作用所产生的(摩擦)接触实现摩擦荷电。在接触期间，发生电荷转移，并且在分开之后获得两个带相反电荷的物体。静电通过材料(颗粒或壁)耗散静电荷的能力来实现，静电荷与材料的导电性相关。
冻干微球通常由非导电材料(例如，海藻糖)制成。在干燥环境中处理和储存冻干微球的必要性归因于微球对环境湿度的耐受性有限。因此，在干燥环境中，预计冻干微球中存在静电行为和摩擦荷电，其通过微球粘附到容器壁上而表现出来。与静电相关的风险是难以处理微球以干燥填充到药筒中。在干燥储存时，微球倾向于粘附到药筒的壁上，这导致药筒孔之间的交叉污染和再水合期间的不精确。
因此，需要改善的样品制备组合物和方法。具体而言，需要具有改善的稳定性的测序试剂以及展示出工作流程和标签片段化文库生产的效率改善，并且进而展示出所得文库的读段富集增加的相关方法。还需要将改善所得文库的读段富集以及简化工作流程的组合物和方法。
本公开涉及克服本领域中的这些和其他缺陷。
发明内容
第一方面涉及一种包含包围核的壳的组合物，其中该核包含一种或多种冻干微球。
在一个具体实施中，该壳包含以下项中的一种或多种：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林(fullalin)、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该壳包含壳添加剂。在一个具体实施中，该壳添加剂包含静电缓解材料、防潮材料或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的90％w/w浓度的量存在的防潮材料。在一个具体实施中，该壳添加剂以该壳的至少10％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该壳添加剂的量介于该壳的约10％w/w与约90％w/w之间。在一个具体实施中，该壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该硬脂酸衍生物或该油酸衍生物选自硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。在一个具体实施中，该氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或/>(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该核包含选自以下项中的一种或多种试剂：一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物(organic osmolite)、磁珠、分子探针、拥挤剂(crowding agent)、小分子、带标记的核苷酸、荧光团或它们的任何组合。在一个具体实施中，该试剂为聚合酶。在一个具体实施中，该核中的该试剂的体积介于约0.1μL与约50μL之间。
在一个具体实施中，该壳包含试剂。
在一个具体实施中，该核还包含一种或多种附加试剂，其中该附加试剂选自一种或多种糖、一种或多种氨基酸、一种或多种聚合物、一种或多种介孔二氧化硅、一种或多种季胺以及它们的任何组合。在一个具体实施中，当附加试剂包含一种或多种糖时，糖选自海藻糖、甘露糖醇、环糊精、葡聚糖、蔗糖或它们的任何组合。在另一个具体实施中，当附加试剂包含一种或多种具有疏水侧链的氨基酸时。在另一个具体实施中，当附加试剂包含一种或多种聚合物时，该聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的组合。
在一个具体实施中，该核包含核添加剂。在一个具体实施中，该核添加剂包含静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂是以不超过该核的25％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂以该核的至少0.5％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该核添加剂的量介于该核的约2％w/w与约10％w/w之间。在一个具体实施中，该核添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该核添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、导电促进剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚醚化合物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，该组合物用于进行多个共测定反应。在一个具体实施中，该壳包含多于一种冻干微球，并且其中该多于一种冻干微球中的试剂是不同的。
第二方面涉及一种方法。该方法包括提供一种或多种冻干微球；以及在有效包封该一种或多种冻干微球的条件下，用壳包被该一种或多种冻干微球。
在一个具体实施中，该方法还包括在用外层有效包围所包封的微球的条件下，用外层覆盖该壳。在一个具体实施中，该覆盖进行足以提供具有限定厚度的外层的时间段。
在一个具体实施中，该壳、该外层、或该壳和该外层两者包含以下项中的一种或多种：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该壳包含壳添加剂。在一个具体实施中，该壳添加剂包含静电缓解材料、防潮材料或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的90％w/w浓度的量存在的防潮材料。在一个具体实施中，该壳添加剂以该壳的至少10％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该壳添加剂的量介于该壳的约10％w/w与约90％w/w之间。在一个具体实施中，该壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该硬脂酸衍生物或油酸衍生物选自硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。在一个具体实施中，该氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或/>(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该壳包围核，该核包含选自以下项中的一种或多种试剂：一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸、荧光团或它们的任何组合。在一个具体实施中，该试剂为聚合酶。在一个具体实施中，该核中的该试剂的体积介于约0.1μL与约50μL之间。
在一个具体实施中，该壳包含试剂。
在一个具体实施中，包封的微球的直径介于约100μm与1000μm之间。
在一个具体实施中，该核还包含一种或多种附加试剂，其中该附加试剂包含一种或多种糖、一种或多种氨基酸、一种或多种聚合物、一种或多种介孔二氧化硅、一种或多种季胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，当附加试剂包含一种或多种糖时，糖选自海藻糖、甘露糖醇、环糊精、葡聚糖、蔗糖或它们的任何组合。在另一个具体实施中，当附加试剂包含一种或多种具有疏水侧链的氨基酸时。在另一个具体实施中，当附加试剂包含聚合物时，该聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的组合。
在一个具体实施中，该核包含核添加剂。在一个具体实施中，该核添加剂包含静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂是以不超过该核的25％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂以该核的至少0.5％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该核添加剂的量介于该核的约2％w/w与约10％w/w之间。在一个具体实施中，该核添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该核添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、导电促进剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚醚化合物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。
在一个具体实施中，该方法还包括使这些试剂与样品接触以进行多个共测定反应。在一个具体实施中，该壳包含多于一种冻干微球，并且该多于一种冻干微球中的试剂是不同的。
第三方面涉及一种系统。该系统包含一种或多种如本文所述的组合物和一种或多种冻干团块，其中该一种或多种组合物和该一种或多种冻干团块在有效形成再水合系统的条件下组合。
在一个具体实施中，该系统还包含位于该一种或多种包封的微球和该一种或多种冻干团块之间的一个或多个壳层。在另一个具体实施中，该壳层包含选自以下的材料：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该壳包含壳添加剂。在一个具体实施中，该壳添加剂包含静电缓解材料、防潮材料或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的90％w/w浓度的量存在的防潮材料。在一个具体实施中，该壳添加剂以该壳的至少10％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该壳添加剂的量介于该壳的约10％w/w与约90％w/w之间。在一个具体实施中，该壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该硬脂酸衍生物或油酸衍生物选自硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。在一个具体实施中，该氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或/>(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
第四方面涉及一种控制一种或多种包封的微球的释放的方法。该方法包括提供如本文所述的组合物以及在有效控制一种或多种冻干微球从组合物中释放的第一条件下将该组合物与再水合溶液混合。
在一个具体实施中，该方法还包括将第一条件改变为第二条件。在一个具体实施中，改变第一条件包括以下项中的一种或多种：改变温度、改变暴露时间、改变再水合溶液pH或改变包封的微球在再水合溶液中的位置。在另一个具体实施中，第一条件和/或第二条件下的温度介于约10℃与约90℃之间。在另一个具体实施中，再水合溶液的pH介于约6.0与约10.0之间。
在一个具体实施中，第一条件有效释放第一冻干微球。在另一个具体实施中，第二条件有效释放第二冻干微球，其中第二冻干微球的内容物不同于第一冻干微球的内容物。在另一个具体实施中，改变第一条件允许一种或多种冻干微球的依次释放。
在一个具体实施中，该壳包含角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该壳包含壳添加剂。在一个具体实施中，该壳添加剂包含静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂以该壳的至少10％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该壳添加剂的量介于该壳的约10％w/w与约90％w/w之间。在一个具体实施中，该壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该硬脂酸衍生物或油酸衍生物选自硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。在一个具体实施中，该氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或/>(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
在一个具体实施中，该核包含选自以下项中的一种或多种试剂：一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物(organic osmolite)、磁珠、分子探针、拥挤剂(crowding agent)、小分子、带标记的核苷酸、荧光团或它们的任何组合。在一个具体实施中，该试剂为聚合酶。
在一个具体实施中，改变第一条件有效释放两种或更多种冻干微球，其中该两种或更多种冻干微球包含不同的试剂。在一个具体实施中，该核中的该试剂的体积介于约0.1μL与约50μL之间。
在一个具体实施中，该壳还包含试剂。
在一个具体实施中，该核和/或该再水合溶液还包含一种或多种附加试剂，其中该附加试剂选自一种或多种糖、一种或多种氨基酸、一种或多种聚合物、一种或多种介孔二氧化硅、一种或多种季胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，当附加试剂包含糖时，糖选自海藻糖、甘露糖醇、环糊精、葡聚糖、蔗糖或它们的任何组合。在另一个具体实施中，当附加试剂包含一种或多种具有疏水侧链的氨基酸时。在另一个具体实施中，当附加试剂包含聚合物时，该聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的组合。
在一个具体实施中，该核包含核添加剂。在一个具体实施中，该核添加剂包含静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂是以不超过该核的25％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂以该核的至少0.5％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该核添加剂的量介于该核的约2％w/w与约10％w/w之间。在一个具体实施中，该核添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该核添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、导电促进剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚醚化合物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。
在一个具体实施中，该方法还包括提供本文所述的附加组合物，以及在有效控制一种或多种冻干微球从附加组合物中释放的第三条件下混合附加组合物。
在一个具体实施中，该方法还包括使这些试剂与样品接触以进行多个共测定反应。在一个具体实施中，该壳包含多于一种冻干微球，并且其中该多于一种冻干微球中的试剂是不同的。在一个具体实施中，该方法还包括提供一种或多种冻干团块，以及使该一种或多种冻干团块再水合。
根据本公开，本文所述的组合物、系统和方法具有许多益处，包括例如增加微球的稳定性、允许多批次药筒的大囊包封、以及允许简化工作流程和减少试剂孔数目的微囊包封。
为了增加测序试剂的稳定性和简化工作流程，对包封的冻干微球有极大兴趣和未满足的需要。本公开描述了与包封的冻干试剂有关，使得冻干试剂能够依次释放的组合物、系统和方法。使得冻干试剂能够依次释放的一种方式是通过温度触发释放，例如，通过将填充有微球的明胶胶囊浸入石蜡中。此类方法使得微球能够在不同温度下释放，例如对于天然明胶胶囊而言介于约30℃与约50℃之间并且对于包衣胶囊而言介于约50℃与约90℃之间。类似地，此类方法使得能够通过向再水合溶液中添加添加剂(例如氨基酸)来实现时间触发的释放，这些添加剂可以延迟团块的再水合速率。
本文所述的组合物、系统和方法有许多益处。例如，包封的冻干微球通过中和电荷并降低摩擦荷电亲和力而提供抗静电保护，从而降低计量和制造处理复杂性(例如，介孔二氧化硅、离子液体、季胺)。静电荷已被鉴定为分配和干燥复合微球的最高风险，因为它对制造期间干燥微球粉末的计量和混合具有显著影响。在如本文所述的组合物、系统和方法中包封所描述的微球通过例如用具有低摩擦荷电亲和力的中性材料包被颗粒来中和微球的电荷，这极大地改善了测序的稳定性。
同样，本文所述的组合物、系统和方法通过低氧渗透性聚合物包衣(例如，包衣中的聚乙烯醇和/或除氧剂)提供氧保护。类似地，本文所述的组合物、系统和方法通过施用两亲性包衣(例如，氨基酸和/或PVP共聚物)提供防潮保护。本文所述的组合物、系统和方法还提供对机械应力的保护，例如通过防止或减少制造中的片段化(例如，通过提供40％溶质含量的壳)。此类保护性包衣提高了微球及其内容物在制造和运输期间的机械坚固性，并且消除了粉末从微球上脱落，否则脱落可能导致粉末阻塞膜。
本文所述的组合物、系统和方法还可提供防止曝光的保护，因为保护试剂免于曝光，从而降低制造光约束。冻干微球的包封可以改善测序质量，使得单锅文库制备成为可能，并简化制造。例如，具有包衣或壳的微球可包含染料或其他添加剂，这些染料或其他添加剂是不透明的或以其他方式防止或减少入射到微球的核上的光量。
已知SBS缓冲剂的pH随测序运行而变化。本文所述的组合物、系统和方法可使用对原本会对pH变化有反应的颗粒的包封来稳定这些颗粒(例如，缓冲剂)以提高SBS性能。本文所述的组合物、系统和方法还可改善对溶液(例如，掺入混合物(“ICM”))的pH的控制，溶液pH在静置于仪器上时可能随时间而变化。在SBS循环的整个长度内可以使用各种溶液，SBS循环可能需要数小时，因此，溶液中存在的试剂在环境暴露时易于降解。这是通过开发pH敏感性微球来实现的，这些微球在缓冲液浸入低于指定pH时释放以释放离子并使缓冲液恢复至期望的pH。类似地，本文所述的组合物、系统和方法可改善对微球的外部电荷的控制，以利于分配并防止或减少混合块中的分层，并且还容许试剂组分SBS裂解混合物的分离，以防止或减少和/或控制单个锅或孔中不期望的相互作用。例如，裂解混合物可受益于试剂的分离以降低混合试剂的热敏性，这在本文所述的组合物、系统和方法中实现。同样，如果涉及粘转平(polishing)，则本文所述的组合物、系统和方法在完全官能化核苷酸(“ffN”)粘转平期间保护聚合酶，并保护光敏ffN免于光降解，特别是在粘转平所涉及的环境条件会使酶降解的情况下。
使用两种不相容的竞争性聚合酶(粘转平聚合酶和测序聚合酶)矫正一个孔(掺入混合试剂孔)内的去封闭冻干ffN的问题可以通过使用本文所述的组合物、系统和方法在空间和时间上分离聚合酶得以解决。具体而言，该问题可以通过将一种聚合酶(测序聚合酶，因为该聚合酶在粘转平聚合酶之后使用)包封在水溶性、缓慢溶解的膜(例如，聚乙烯醇)中得以解决。对测序聚合酶从其胶囊中释放进行定时以与粘转平过程的完成一致的问题可通过调节水溶性膜中的成分及其相对量来解决。也可以使用温度或光反应性添加剂以实现甚至更精细水平的控制。
将ffN冻干与它们的液体形式相比实现增加的稳定性，但是产生升高的3'OH水平，从而增加了预定相并且导致运行质量降低。粘转平工作流程的实验室使用可能很复杂。单独制备和组合粘转平混合物(ffN、粘转平聚合酶、粘转平寡聚物、Mg)，在50℃的高温下温育长达一小时(以利于粘转平反应)，然后添加到发现测序聚合酶的掺入混合物的剩余部分中。使用者和呈其当前形式的测序仪装置在这种工作流程中的这种复杂程度是不期望的，并且在规模上甚至更小。如在本公开的组合物、系统和方法中所述，具有最小和/或没有使用者触点的解决方案(其与当前测序仪工作流程一样复杂或不如当前测序仪工作流程复杂)是对现有工作流程的可行改进。
在唯一的掺入试剂孔中，分配松散的“粘转平微球”(其可包括ffN、粘转平聚合酶、粘转平寡聚物和镁酶辅因子)。在该孔中还有测序聚合酶微球；然而，这些被包封在水溶性、定时溶解膜中。这种设置允许多种益处，包括例如减少孔数。如果按照当前单独制备粘转平混合物，接着与大的ICM混合物混合，对于粘转平试剂而言可能需要单独的孔。利用本文所述的包封的组合物、系统和方法有利于在一个孔中发生多个连续反应，从而使孔的数目最小化。这也影响药筒足迹，在环境影响方面，包括例如塑料的使用和焚化废弃物方面，具有连锁(knock-on)增益。本文所述的组合物、系统和方法可容易地缩放，同时还提供减少的流体和阀调，从而降低测序仪复杂性和相关成本。当再水合缓冲液(诸如水)分配到孔中时，松散的粘转平微球快速溶解并且粘转平反应开始矫正所有未封闭的ffN。该再水合缓冲液也开始溶解包封测序聚合酶的水溶性膜。
本文所述的组合物、系统和方法能够实现除上述那些之外的益处。例如，使用冻干材料和分离的冻干材料，意指可以将酶的附加辅因子诸如镁添加到微球本身，而不是具有单独的附加再水合缓冲液。这可以使得不同浓度和/或类型的酶的试剂(全部需要或受益于不同量的辅因子、盐、pH等)仅单独用水或甚至经大气水捕获而再水合。这促进了在测序过程中使用的塑料的量以及碳足迹的连锁减少，考虑到了在浓缩和/或冻干形式时试剂的重量减少。
本文所述的包封方法可适用于实现调节试剂浓度的简易方式。例如，与较大的胶囊相比，较小的胶囊可以含较少量的冻干试剂，并且可以根据使用者的需要将多个这种胶囊放置在孔中。这促进了在吞吐量方面改善的使用者灵活性，而没有稀释度/浓度计算所造成的潜在误差。基于单位的方法(其中X个胶囊＝Y次运行)以更加受控的方式允许这种灵活性。此类方法还可以在测序深度方面给予使用者灵活性。涉及深度测序的应用(例如癌症筛查)可以使用许多胶囊，而浅表筛查(例如MRSA)可以使用较少的胶囊。
本文所述的组合物、系统和方法实现改善水平的对试剂释放的控制(例如，第一试剂的再水合，接着一段时间后一种或多种后续试剂的延迟再水合)以及机械保护、缓冲液稳定化、电荷控制、两种或更多种不同试剂在单个微球、单个孔或单个锅中的组合以及光保护。具体而言，通过使用本文所述的包封的冻干微球的试剂的受控瞬时释放允许用于文库制备的一锅法。通过包封PCR试剂并使其在预定时间释放来解决PCR所涉及的试剂对标签片段化的抑制。
为了解决静电和摩擦荷电的问题，建议将添加剂直接掺入微球中(作为冻干基质)或作为包封微球的包衣掺入。添加剂的基本原理是，首先，防止或减少电荷累积(增加导电性)，其次，通过扩散和/或耗散减少表面电荷。
防止或减少电荷累积可以通过将在经由水分子的竞争性屏蔽下出现的更高的离子浓度、结晶度或盐度，并且因此出现接受电荷的低倾向或更高的电荷耗散实现。水屏蔽还会引起内摩擦角的减小，并因此引起静电电荷的减小。
此类添加剂示例为钠盐(即，氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠)、Trizma(Tris.HCl)、MOPS、HEPES、铵盐(四烷基氯化铵、IO 6783或三(羟乙基)烷基氯化铵)、咪唑鎓盐(即，/>IO 6786或1-乙基-3-甲基咪唑鎓盐、聚季铵盐或乙烯基吡咯烷酮和乙烯基咪唑鎓的共聚物，示例为/>FC550、FC370)、聚苯胺、氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)。同时，通过降低与容器壁(即，不锈钢)的接触角或减小颗粒间摩擦，还可以通过微球表面上的润滑作用实现降低表面电荷。
进一步地此类添加剂示例为硬脂酸衍生物(即，硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60)、油酸衍生物(即，三油酸甘油酯、/>80)、月桂酸衍生物(即，月桂酸二乙醇酰胺、/>20、月桂醇聚醚硫酸钠)、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯和/>17R4(聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物)。
附图说明
图1说明包封的类型。
图2A至图2E示出了用于实施本文所述的组合物、系统和方法的核试剂的制剂概述。图2A展示样品提取的概述，图2B展示文库制备的概述，图2C展示富集的概述，图2D展示聚类的概述，并且图2E展示测序的概述。
图3描绘了在制造、运输、储存期间和打开时在微球上经受的各种应力。
图4A至图4B描绘了本公开的一个具体实施，其中明胶胶囊填充有微球并且其中明胶胶囊(其填充有微球)可以包被在外部覆盖物(例如，石蜡)中。图4A示出了用微球填充的OTS明胶胶囊(102)和用微球填充并快速浸入热蜡中的OTS明胶胶囊(104)。图4B示出了用微球填充，在37℃下溶解的OTS明胶胶囊(106)和用微球填充并快速浸入热蜡中，在58℃下溶解的OTS明胶胶囊(108)。
图5示出了使得包封的冻干微球能够在不同温度下释放的明胶胶囊的石蜡包衣的结果。
图6示出了明胶在Nextera Flex标签片段化中的相容性测试结果。
图7A至图7B示出了无转移反应的时间控制释放。图7A展示了赋形剂的百分比和它们各自的再水合时间。图7B示出了本文所述的示例组合物的再水合。
图8A至图8C显示在本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球使得一锅连接方案成为可能。图8A展示了一锅连接方案的步骤。图8B展示了微球的时间依赖性释放。图8C示出了试剂A、试剂B和附加试剂即试剂B'的数据。
图9A至图9D示出了如本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球的一个具体实施，其中多合一粘转平微球可含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物，而测序聚合酶微球可含有测序聚合酶。图9A示出了含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物的多合一粘转平微球(402)。图9B示出了含有测序聚合酶的测序聚合酶微球(404)。图9C示出了单个孔(408)中的包封的聚合酶微球(406)和多合一粘转平微球(402)。图9D示出了在高温的单个孔(408)中并且用水再水合的包封的聚合酶微球(406)和多合一粘转平微球(402)。
图10A至图10D示出了如本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球的一个具体实施，其中多合一粘转平微球可含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物，而测序聚合酶微球可含有测序聚合酶，其中相同的单位剂量可在不同的试剂中重复以获得更大的剂量。图10A示出了含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物的多合一粘转平微球(402)。图10B示出了含有测序聚合酶的测序聚合酶微球(404)。图10C示出了单个孔(408)中的包封的聚合酶微球(406)(×3个单位)和多合一粘转平微球(402)(×3个单位)。图10D示出了在不同试剂中重复以获得总的x3(三倍)剂量的相同单位剂量。
图11A至图11F示出如本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球的一个具体实施。图11A示出了可含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物的多合一粘转平微球(402)。图11B示出了测序聚合酶微球(404)，其可含有测序聚合酶并且可以被包封(406)并且处于单个孔内在多合一粘转平微球(402)旁边。图11C显示包封的冻干微球(406)可在50℃下用水再水合。图11D显示在一小时之后，多合一微球(402)开始溶解，并且开始粘转平。图11E显示多合一微球(402)溶解，粘转平完成，并且包封的聚合酶微球(406)在延迟之后溶解。在图11F中，所有微球变得完全溶解，然后ICM即可使用。
图12提供了如本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球的制造方法详情。
图13描述了如本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球的制造和使用点。
图14A至图14B描绘了如本公开的组合物、系统和方法中描述的包封的冻干微球和团块的制造和使用点。图14A描述了包封的冻干微球的制造和使用点。图14B示出了管中第一团块、蜡和第二团块的具体实施。
图15A至图15C描述了用于本公开的组合物、系统和方法的SBS的应用。图15A示出了在核中具有Pd(550)和在壳中具有THP(552)的AOM SBS裂解混合物。图15B示出了在核中具有Pol(554)和在壳中具有ffN(556)的ffN/Pol小珠。图15C示出了在核中具有ffN(560)且具有遮光壳(558)的ffN的光保护。
图16A至图16I示出了添加剂的高通量测序筛选。对特定添加剂，诸如IO6783进行滴定，以找到浓度极限。图16A示出了各种添加剂的定相和预定相量度。图16B示出了各种添加剂的错误率和Q30。图16C示出了图16A和图16B中添加剂的所有道和所有通道的强度。图16D示出了各种添加剂的定相和预定相量度。图16E示出了各种添加剂的错误率和Q30。图16F示出了图16D和图16E中添加剂的所有道和所有通道的强度。图16G示出了/>IO 6783测序的滴定，尤其是定相和预定相量度。图16H示出了/>IO 6783的错误率和Q30。图16I示出了图16G和图16H的所有道和所有通道的强度。
图17A至图17F示出了在60℃温育1-2天后，与液体形式的对照相比，掺有1％添加剂的ffC的稳定性。示出了与本文所述的添加剂一起并且在60℃热阶段温育1天和2天的ffC的HPLC分析结果。ffC峰面积的减小和3'OH以及DiP的增加指示ffN的降解。将添加剂的效果与对照进行比较。图17A示出了ffN的峰面积。图17B示出了ffN的3'OH。图17C示出了ffN的二磷酸盐。图17D示出了第二ffN的峰面积。图17E示出了第二ffN的3'OH。图17F示出了第二ffN的二磷酸盐。
图18示出了与本文所述的添加剂一起温育的排阻扩增(ExAmp)溶液的DNA重组酶活性。
图19A至图19B示出了通过cBOT第一碱基测定的具有包衣材料的ExAmp刺突的聚类性能，尤其是经由cBOT第一碱基掺入动力学测定的与本文所述的添加剂一起温育的ExAmp溶液的ExAmp平均强度(图19A)和聚类功能性(图19B)。
图20描绘了含有不同浓度的添加剂(基质)的ExAmp粉末状冻干团块的电荷电势(经由Keyence)测量(在3％ RH下)。
图21示出了含有不同浓度的添加剂(基质)的ExAmp粉末状冻干团块的电荷电势(经由Keyence)测量(在40％ RH下)。
图22描绘了含有不同浓度的添加剂(基质)的ExAmp粉末状冻干团块的电荷电势(经由Keyence)测量(在3％ RH下)。
图23描绘了含有不同浓度的添加剂(基质)的ExAmp粉末状冻干团块的电荷电势(经由Keyence)测量(在40％ RH下)。
图24示出了含有不同浓度的盐/缓冲剂的ExAmp粉末状冻干团块的电荷电势(经由Keyence)测量(在3％和40％ RH下)。
图25A至图25C示出了含有作为基质形式的添加剂的Atto和FSCN(荧光素)微球。添加剂的抗静电特性通过微球对容器的粘附性来评估，并且它们的电荷密度通过GranuCharge来测量。低Δq值指示低摩擦荷电。1％IO 6783的基质形式使摩擦荷电最小化。图25A示出了测试的第一组添加剂(Atto 20％，+1％/>IO 6783，+1.5％Tris.Hcl，和+1％Tween 20)在视觉效果(顶部)和损失百分比(底部)方面的结果。图25B示出了测试的第二组添加剂(FSCN 20％对照、+1％/>IO 6783、+2％/>IO 6783和+1％/>IO 6786)在视觉效果(顶部)和损失百分比(底部)方面的结果。图25C示出了在基质形式的抗静电剂/>IO 6783的帮助下将Atto和FSCN(均为20％海藻糖)干燥复合。
图26A至图26C示出了含有作为基质形式的添加剂的ffN微球。添加剂的抗静电特性通过对容器的粘附性来评估并通过GranuCharge来测量。图26A示出了第一组添加剂(ffN+25％T对照、+1％IO 6783、+1％/>IO 6786、+1.5％ Tris.HCl、+2％异亮氨酸)的视觉效果。图26B示出了第二组添加剂(第二ffN+20％T对照、+0.5％ LDA、+1％/>17R4、+1.5％/>VA64、+2％/>Protect)的视觉效果。图26C展示了图26A和图26B中测试的各种添加剂的电荷密度。
图27A至图27E示出了用L100和硬脂酸镁包被的FSCN(荧光素)和MB(亚甲蓝)微球。如GranuCharge测量和微球干混实验所示，通过包衣的存在缓解了微球的静电和摩擦荷电行为。图27A示出了根据本公开的示例壳和核。图27B显示来自包衣的增重为5％-7％。图27C示出包被的组合物与未包被的组合物相比静电减少。图27D示出包被的组合物与未包被的组合物相比增加的防潮。图27E示出包衣组合物中触发的释放。
图28A至图28F示出了用VA64、/>IO 6783和PEG以不同包衣水平包被的荧光素(FSCN)、DNA重组酶/BSA和ffN微球的SEM图像。图28A和图28B示出了用KollidonVA64和/>IO 6783和PEG(#6)包被的800μm FSCN Wurster-Spray 20％的多个(图28A)和单个(图28B)微球的图像。图28C和图28D示出了用Kollidon VA64和/>IO 6783和PEG(#8)包被的Rec/BSA 15％的低温离子研磨SEM的多个(图28C)和单个(图28D)微球的图像。图28E和图28F示出了用Kollidon VA64和/>IO 6783和PEG(#11)包被的ffN 10％的低温离子研磨SEM的多个(图28E)和单个(图28F)微球的图像。
图29A至图29B描绘了含有作为包衣形式的添加剂的ffN微球。添加剂的抗静电特性通过对容器的粘附性来评估并通过GranuCharge来测量。图29A示出了含有作为包衣形式的添加剂的各种ffN微球的视觉表示。图29B示出了图29A中各种ffN微球的电荷密度。
图30A至图30B示出了含有作为包衣形式的添加剂的DNA重组酶/BSA微球。添加剂的抗静电特性通过对容器的粘附性来评估并通过GranuCharge来测量。图30A示出了含有作为包衣形式的添加剂的各种DNA重组酶/BSA微球的视觉表示。图30B示出了图30A中各种DNA重组酶/BSA微球的电荷密度。
图31A至图31F描绘了本文所述组合物的稳定性。图31A示出了ffN微球。图31B示出了在干燥基质中的5％VA64。图31C示出了在干燥基质中的5％/>17R4。图31D示出了在干燥基质中的5％/>6783。图31E示出了在干燥基质中的10％/>Protect。图31F示出了在不同水分和时间条件下干燥基质中的7.5％异亮氨酸(右下)。
图32A至图32F示出了通过动态蒸汽吸附测量微球对相对湿度的耐受性的结果。基质中的异亮氨酸增加ffN微球的湿度耐受性。图32A展示了ffN对照(18％ T，2％ HCD)的结果。图32B展示了2％Protect基质(10％干燥)的结果。图32C示出了+1％/>IO 6783基质(5％干燥)的结果。图32D示出了1％/>VA64基质(5％干燥)的结果。图32E示出了+1.5％ Trizma基质(7.5％干燥)的结果。图32F示出了+1.5％异亮氨酸基质(7.5％干燥)的结果。
图33A至图33D描绘了Protect和VA64包衣的结果，该包衣提供了改善的Rec/BSA MS防潮性。图33A示出了在20％ RH极限下Rec/BSA(AP1)未包被对照的结果。图33B示出了在30％ RH极限下用15％protect和/>IO 6783包被的Rec/BSA。图33C示出了在20％-30％RH极限下用15％/>VA64和/>IO 6783包被的Rec/BSA。图33D示出了图33A至图33C中的包被组合物在暴露于湿气之后的图像。
图34A至图34B显示包衣使Rec/BSA微球的水分吸收最小化。图34A示出了在不同湿度条件下各种微球的图像。图34B示出了在铝盘上分级的30mg样品中，在35℃下在30％、55％和80％ RH下24小时，％RH对未包被的Rec-BSA微球相对于包被的Rec-BSA微球的影响。具体而言，就防潮而言，Protect包衣比/>VA64表现更佳。
图35描绘了溶解度筛选的概念。
图36示出了可溶于喷涂溶液(15％水/溶剂)和缓冲液中的VA64、/>的结果。
图37A至图37C示出了在聚合物的存在下特定ffC的二磷酸盐水平(图37A)，在聚合物的存在下特定ffC的3'OH和二磷酸盐水平(图37B)，在聚合物的存在下特定ffC的二磷酸盐水平(图37C)。
图38示出了在聚合物的存在下特定ffC的荧光强度。
图39示出了在聚合物的存在下特定ffC的荧光强度。
图40A至图40C示出了基于测序相容性进行包衣材料筛选的结果。图40A示出了所测试的各种包衣材料的相位和预定相量度。图40B示出了测试的各种包衣的错误率和Q30。图40C示出了图40A和图40B中描述的包衣材料的所有道和所有通道的强度。
图41A至图41B示出了筛选聚合物的DNA重组酶活性和聚类性能(cBOT)以及在如本文所述的聚合物的存在下ExAmp的DNA重组酶活性的结果。图41A示出了掺有聚合物的ExAmp(TCS1 v1.0)溶液的DNA重组酶活性。图41B示出了在40℃处温育24小时后的DNA重组酶活性。
图42A至图42B示出了分级后在如本文所述的聚合物的存在下ExAmp的DNA结合蛋白活性的结果以及分级后在如本文所述的聚合物的存在下ExAmp的DNA结合蛋白活性的结果。图42A示出了掺有聚合物的ExAmp(TCX1 v1.0)溶液的DNA结合蛋白3活性。图42B示出了在40℃处温育24小时后的DNA结合蛋白活性。
图43A至图43D显示微包封改善SBS试剂稳定性。图43A示出了溶解度的改善。图43B示出了酶相容性的改善。图34C示出了ffN相容性的改善。图34D示出了测序的改善。
图44描绘了包封的微球的物理表征。
图45A至图45B显示所测试的ffN的质量可能不受喷涂工艺影响：峰面积(图45A)和3'OH含量(图45B)与对照相当，并且没有检测到二磷酸盐。
图46A至图46C显示壳包封改善防潮并缓解静电。图46A示出了暴露于潮湿条件后的天然微球。图46B示出了暴露于潮湿条件后的基质微球。图46C示出了暴露于潮湿条件后，用本文所述的组合物包被的核-壳微球。
图47示出了如本文所述的方法。
图48示出了如本文所述的方法。
图49A至图49C示出了具有释放的连续pH触发因素的三层包衣微球。图49A示出了具有带三种壳-壳1：Eudragit S100(荧光素)、壳2：Eudragit L100(淡蓝色)和壳3：Eudragit L100-55(罗丹明)的包衣微球的组合物的运行1、运行2和运行3的结果。图49B示出了图49A的包衣微球从pH 5转移到pH 6、pH 7、pH 8。图49C示出了各种包衣组合物在不同pH条件下的释放。
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分并且可用于实现本文所述的益处和优点。
具体实施方式
第一方面涉及一种包含包围核的壳的组合物，其中该核包含一种或多种冻干微球。
应当理解，本公开的某些方面、模式、具体实施、变型和特征在下面以各种细节水平进行描述，以便提供对本技术的实质理解。除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义通常与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式的使用不是限制性的。如本公开中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含”和“包括”都将被解释为具有开放式含义。即，术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。
术语“基本上”、“大约”、“约”、“相对”或可在整个本公开(包括权利要求书)中使用的其他此类类似术语用于描述和说明例如由于处理中的变化而来自参考或参数的小波动。此类小波动也包括来自参考或参数的零波动。例如，波动可以指小于或等于±10％，诸如小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
还应理解，本文所述的某些特征(为了清楚起见，其在单独具体实施的上下文中描述)也可在单个具体实施中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个具体实施的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或者以任何合适的子组合提供。
术语“连接”、“接触”和/或“耦接”包括各种布置和组件。这些布置和技术包括但不限于：(1)一个部件和另一个部件的直接接合，其间没有居间部件(即，部件直接物理接触)；以及(2)一个部件和另一个部件的接合，其间具有一个或多个部件，前提条件是该一个部件“连接到”或“接触”或“耦接到”该另一个部件在某种程度上是与该另一个部件是操作性连通(例如，电气、流体、物理、光学连通等)(任选地在其间存在一个或多个附加部件)。彼此直接物理接触的一些部件可彼此电接触和/或流体接触或者可不彼此电接触和/或流体接触。此外，电连接、电耦接、光学连接、光学耦接、流体连接或流体耦接的两个部件可直接物理接触或可不直接物理接触，并且一个或多个其他部件可定位在这两个连接部件之间。
如本文所述，术语“阵列”可包括可附接到一个或多个固相基底的一组传导通道或分子，使得这些传导通道或分子可基于其位置彼此区分。如本文所述，阵列可包括各自位于固相基底上的不同可识别位置(例如，在不同传导通道处)的不同分子。另选地，阵列可包括各自带有不同分子的单独的固相基底，其中可根据固相基底在固相基底附接的表面上的位置或基于固相基底在液体(诸如流体流)中的位置来识别不同的探针分子。其中单独基底位于表面上的阵列的示例包括具有小珠的孔，如美国专利号6,355,431、美国专利公布号2002/0102578和WO 00/63437中所述，所有这些专利全文据此以引用方式并入。阵列的分子可以是核酸引物、核酸探针、核酸模板或核酸酶诸如聚合酶和核酸外切酶。
如本文所述，术语“附着”可包括当两个物体彼此接合、扣紧、粘附、连接或结合时。反应组分如聚合酶可通过共价键或非共价键附着到固相组分如传导通道。如本文所述，短语“共价附着”或“共价结合的”是指形成特征在于原子之间共享电子对的一个或多个化学键。非共价键是不涉及共享电子对的非共价键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文所述，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物。如本文所用，术语还涵盖cDNA，即由RNA模板例如通过逆转录酶的作用产生的互补DNA或拷贝DNA。在一个具体实施中，待例如通过使用所述系统的测序进行分析的核酸被固定在基底(例如，流通池内的基底或基底诸如流通池上的一个或多个小珠等)上。如本文所用，术语“固定”旨在包括直接或间接的共价或非共价附着，除非另外明确指出或通过上下文指出。在旨在使用载体的条件下，诸如在核酸测序应用中，分析物(例如，核酸)可以保持固定或附着到载体。在一个具体实施中，模板多核苷酸是附着到基底的多个模板多核苷酸中的一个模板多核苷酸。在一个具体实施中，附着到基底的多个模板多核苷酸包括文库多核苷酸的拷贝的簇，如本文所述。
核酸包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似物结构可具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种主链键，诸如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(RNA)中)。
在RNA中，糖为核糖，并且在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可为嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子可结合到嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。
核酸可包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可包括天然的或非天然的碱基。天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。
如本文所述，术语核苷酸可包括天然核苷酸及其类似物、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸以及被称为核苷酸的其他分子。如本文所述，“核苷酸”可包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸可以是核酸序列的单体单元，例如以识别DNA或RNA链中存在的亚基。核苷酸还可包括不一定存在于聚合物中的分子，例如能够通过聚合酶以依赖于模板的方式掺入到多核苷酸中的分子。核苷酸可包括例如在5'碳上具有0、1、2、3个或更多个磷酸基团的核苷单元。核苷四磷酸、核苷五磷酸和核苷六磷酸可以是有用的，在5'碳上具有超过6个磷酸基团(诸如7、8、9、10或更多个磷酸基团)的核苷酸也可以是有用的。天然存在的核苷酸的示例包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。
非天然核苷酸包括核苷酸类似物，诸如不存在于天然生物系统中或基本上不通过聚合酶在其天然环境下(例如在表达聚合酶的非重组细胞中)掺入到多核苷酸中的那些核苷酸。非天然核苷酸包括那些通过聚合酶以一种速率掺入到多核苷酸链中的那些非天然核苷酸，该速率显著快于或慢于另一种核苷酸(诸如具有与相同沃森-克里克互补碱基进行碱基配对的天然核苷酸)通过聚合酶掺入到链中的速率。例如，当与天然核苷酸的掺入速率相比时，非天然核苷酸可以至少2倍不同、5倍不同、10倍不同、25倍不同、50倍不同、100倍不同、1000倍不同、10000倍不同或更多倍不同的速率掺入。将非天然核苷酸掺入到多核苷酸中后能够被进一步延伸。示例包括具有3'羟基的核苷酸类似物或在3'位置具有可逆终止子部分的核苷酸类似物，该核苷酸类似物可被移除以允许掺入了该核苷酸类似物的多核苷酸进一步延伸。可逆终止子部分的示例描述于例如美国专利号7,427,673、7,414,116和7,057,026，以及WO 91/06678和WO 07/123744中，这些专利中的每一者全文据此以引用方式并入。应当理解，在一些示例中，具有3'终止子部分或缺乏3'羟基的核苷酸类似物(诸如双脱氧核苷酸类似物)可在已掺入核苷酸类似物的多核苷酸不被进一步延伸的条件下使用。在一些示例中，核苷酸可不包含可逆终止子部分，或该核苷酸将不包含不可逆终止子部分，或该核苷酸将根本不包含任何终止子部分。
本公开涵盖包括荧光标记的核苷酸(或任何其他检测标签)，该荧光标记可用于本文公开的任何方法中，其本身掺入较大分子结构或缀合物中或与较大分子结构或缀合物缔合。
荧光标记可包括选自任何已知荧光物质的化合物，例如罗丹明或花青。如本文所公开的荧光标记可附着到核苷酸碱基上的任何位置，并且可以任选地包括连接基。连接基的功能通常是帮助荧光标记与核苷酸的化学附着。在特定具体实施中，仍然可以对所得的类似物进行沃森-克里克碱基配对。连接基基团可用于将染料共价附着到核苷或核苷酸。连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接到化合物，使得该化合物不显著干扰核酸复制酶对核苷酸的总体结合与识别。因此，连接基还可包括间隔区单元。间隔区距离为例如核苷酸碱基距裂解位点或标记的距离。
如本文所用，“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。术语“核苷”在本文中以本领域技术人员所理解的常规含义使用。示例包括但不限于包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子已被碳取代和/或碳已被硫或氧原子取代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖部分的单体。
术语“嘌呤碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选地取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的示例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)。
如本文所述，术语基底(或固体载体)可包括核酸可附着到其上的任何惰性基底或基质，例如玻璃表面、塑料表面、胶乳、葡聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅晶片。例如，基底可以是玻璃表面(例如，流通池通道的平面表面)。在一个具体实施中，基底可以包括已经被“官能化”的惰性基底或基质，例如通过施加中间材料的层或包衣，该中间材料包括允许共价附着到分子诸如多核苷酸的反应性基团。载体可包括负载在惰性基底诸如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶。分子(例如，多核苷酸)可直接共价附着至中间材料(例如，水凝胶)。载体可以包括多个颗粒或小珠，每个颗粒或小珠具有不同的附着分析物。
如本文所用，“衍生物”或“类似物”意指具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Bücher，NUCLEOTIDE ANALOGS(John Wiley&Son，1980)和Uhlmann等人，“Antisense Oligonucleotides:A NewTherapeutic Principle,”Chemical Reviews 90:543-584(1990)中进行了讨论，这两篇文献全文据此以引用方式并入。核苷酸类似物还可包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键和氨基磷酸酯键。如本文所用，“衍生物”、“类似物”和“修饰的”可以互换使用，并且由本文所述的术语“核苷酸”和“核苷”涵盖。
本文所述的组合物、系统和方法包括包围核的壳，并且该核可包括一种或多种冻干微球(即，该组合物可包含包封的冻干微球)。
如本文所述，“包封”包括封入一种或多种如本文所述的微球。如本文所述的微囊包封是指将至少一种成分(例如活性剂)包埋到至少一种其他材料(例如壳材料)中。根据本公开的包封包括但不限于散装包封、大囊包封、微囊包封、纳米包封、单分子和离子包封。根据本公开，本文所述的组合物、系统和方法具有许多益处，包括例如增加微球的稳定性、使用大囊包封以允许多批次药筒、以及使用微囊包封以允许简化工作流程和减少试剂孔数目。本文所述的组合物、系统和方法使用对原本会对pH变化有反应的颗粒的包封来稳定这些缓冲剂和提高SBS性能。本文所述的组合物、系统和方法还使用包封来降低静电荷的风险，否则静电荷会在制造期间给微球的分配和干混带来困难。
如本文所用，“微球”包括球形颗粒，这些球形颗粒包括壳和核并且具有0.1μm至1,000μm的直径。例如，微球可具有约0.1μm、0.5μm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm的直径，或介于约0.1μm与约1,000μm之间的任何直径。在一个具体实施中，包封的微球的直径介于约100μm与1000μm之间。
微球通常由聚合物壳，例如生物可降解的聚合物组成。根据本公开的微球包括通过本领域技术人员已知的常规技术制备的微球。例如，微球可通过将液体冷冻成冷冻粒料，接着将冷冻微球放置在干燥器(例如旋转干燥器)中来制备。
如本文所述，“大球”可包括多个微球。大球通常具有比微球更大的直径，例如介于0.1mm与1,000mm之间。本文所述的大球可以例如具有约0.1mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、50mm、100mm、200mm、300mm、400mm、500mm、600mm、700mm、800mm、900mm、1,000mm的直径，或介于约0.1mm与约1,000mm之间的任何直径。在一个具体实施中，大球(例如，大胶囊)将具有范围在约5mm×5mm×9mm至约7cm×7cm×2cm之间的尺寸。
根据本公开的大球包括通过本领域技术人员已知的常规技术制备的微球。本文所述的组合物、系统和方法可包括单个冻干微球，或者可包括多个冻干微球并且因此可以形成大球。例如，本文所述的组合物可包含1个与超过1,000,000个之间的冻干微球。在一个具体实施中，该组合物包含1个冻干微球，或少于100个冻干微球，或少于500个冻干微球，或介于约1与约1,000,000之间的任何数目的微球。在一个具体实施中，当壳包围多于一个冻干微球时，冻干微球的核中的试剂是不同的。
如本文所述，“壳”包括包围核的组合物。在一个具体实施中，壳包括微球的外层和，或在替代方案中，包括大球的外层。在一个具体实施中，该壳包括例如选自由以下各项组成的组的壳材料：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。在一个示例中，该壳可包括但不限于淀粉、纤维素、水胶体、藻酸盐、胶原以及它们的任何组合。壳材料的量包括例如适于产生期望的壳结果的任何量。在一个具体实施中，壳材料以介于壳的约1重量％与约100重量％之间的量存在。例如，壳材料可以以壳的约1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、100重量％或介于之间的任何量存在。在一个具体实施中，壳材料以介于壳的约10重量％与约90重量％、或约10重量％与约80重量％、或约10重量％与约70重量％、或约10重量％与约60重量％、或约10重量％与约50重量％之间的量存在。
如本文所述，壳可包括一层或不同组成的多层。例如，壳可包括一层、两层、三层、四层、五层、六层、七层、八层、九层、十层或多于十层。每个层可包括与壳中存在的其他层相同或不同的材料。
在一个具体实施中，如本文所述的壳可包括壳添加剂。壳添加剂可以介于壳的约0.01％w/w与壳的约99％w/w之间的量存在。在一个具体实施中，壳添加剂以介于壳的约10％w/w与约90％w/w之间的量存在。在一个具体实施中，壳添加剂以介于约10％w/w与约40％w/w之间的量存在。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的90％w/w的量存在的防潮材料。在一个具体实施中，该壳添加剂以该壳的至少10％w/w浓度的量存在。例如，在一个具体实施中，壳添加剂可以介于壳的0.1％w/w与壳的约15.0％w/w之间的量存在。例如，壳添加剂可以以约0.01％w/w、0.05％w/w、0.1％w/w、0.5％w/w、1.0％w/w、1.5％w/w、2.0％w/w、2.5％w/w、3.0％w/w、3.5％w/w、4.0％w/w、4.5％w/w、5.0％w/w、5.5％w/w、6.0％w/w、6.5％w/w、7.0％w/w、7.5％w/w、8.0％w/w、8.5％w/w、9.0％w/w、9.5％w/w、10.0％w/w、10.5％w/w、11.0％w/w、11.5％w/w、12.0％w/w、12.5％w/w、13.0％w/w、13.5％w/w、14.0％w/w、14.5％w/w、15％w/w的量或介于之间的任何量存在。壳添加剂的量可以是减少本文所述的组合物的摩擦荷电和/或提供合适的防潮的任何合适的量。可调节壳添加剂的量以适应特定的试剂或试剂的组合，或适应特定的微球组合物。
在一个具体实施中，该壳添加剂包含静电缓解材料、防潮材料或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该壳添加剂是以不超过该壳的90％w/w浓度的量存在的防潮材料。在一个具体实施中，该壳添加剂以该壳的至少10％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该壳添加剂的量介于该壳的约10％w/w与约90％w/w之间。在一个具体实施中，该壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该硬脂酸衍生物或油酸衍生物选自硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。在一个具体实施中，该氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或/>(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，该壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。壳可以由聚合物组成，并且壳中聚合物的最大浓度可以为约90％(呈干燥形式)。可以将一种或多种静电缓解添加剂添加到聚合物包衣中，并且在壳中可以存在干燥形式的约10％至约40％范围的壳添加剂。
在各种具体实施中，壳添加剂可包括化合物的有益组合以获得与SBS试剂改善的且意想不到的相容性。例如，壳添加剂可包括聚醚化合物和聚合物和/或共聚物，或者可替代地，包括聚醚化合物、PVA和/或聚合物和/或共聚物。在一个具体实施中，壳添加剂包括聚乙二醇、VA64和/>IO 6783或它们的化学等效物。在另一个具体实施中，壳添加剂包括聚乙二醇和/>VA64，或它们的化学等效物。在另一个具体实施中，壳添加剂包括聚乙二醇、/>Protect和/>IO/>或它们的化学等效物。在另一个具体实施中，壳添加剂包括聚乙二醇和/>Protect，或它们的化学等效物。在一个具体实施中，铵盐充当导电促进剂。在一个具体实施中，咪唑鎓盐充当导电促进剂。
如本文所述，“核”或“核区”包括周围壳内的任何材料。根据本公开的核包含一种或多种冻干微球。
如本文所用，术语“相容”意指能够一起存在或出现而没有冲突，即，例如，基本上不会降低一起存在或出现的一种或多种物质的性能或活性。同样，如本文所用，术语“不相容”意指不能一起存在或出现而没有冲突，即，例如，基本上不会降低一起存在或出现的一种或多种物质的性能或活性。
根据本公开的冻干包括根据本领域技术人员已知的常规技术的方法。冻干在本文中也称为冷冻干燥。在本公开中，术语“冻干”或“冻干物”将用作“冻干的”、“冻干物”或“冷冻干燥的”的等效术语，例如，关于本文所述的组合物、系统或方法。
可冻干制剂可以重构成溶液、悬浮液、乳液或任何其他适于施用或使用的形式。可冻干制剂通常首先制备成液体，然后冷冻并冻干。冻干前的总液体体积可以小于、等于或大于冻干制剂的最终重构体积。优选地，冻干制剂的最终重构体积小于冻干前的总液体体积。冻干方法是本领域普通技术人员已知的，并且通常包括水在受控条件下从冷冻制剂中升华。
冻干制剂可以在宽范围的温度下储存。冻干制剂可在25℃以下储存，例如在2℃-8℃冷藏，或在室温(例如，大约25℃)下储存。优选地，冻干制剂在约25℃以下储存，更优选地在约4℃-20℃下储存；在约4℃以下；在约-20℃以下；在约-40℃；在约-70℃或约-80℃下储存。冻干制剂的稳定性可以以本领域已知的多种方式测定，例如，通过微球和/或团块的视觉外观和/或通过水分含量来测定。本公开的组合物还可经受在运输期间可能发生的温度剧增，例如高达70℃，持续短暂的时间段。
冻干制剂通常通过添加水溶液以溶解冻干制剂而再水合(在本文中可互换地称为“重构”)。多种水溶液可用于重构冻干制剂，包括水、盐水或另一种电解质或非电解质稀释剂。优选地，本文所述的冻干微球用水重构。冻干制剂可以用包含水(例如，USP WFI或注射用水)或抑菌水(例如，含0.9％苄醇的USP WFI)的溶液再水合。然而，包含添加剂、缓冲剂、赋形剂和/或载体的溶液也可以使用并且在本文中有描述。
冷冻干燥制剂或冻干制剂通常由液体制备，即由溶液、悬浮液、乳液等制备。因此，要经历冷冻干燥或冻干的液体优选包含最终重构液体制剂中所期望的所有组分。因此，当再水合或重构时，冷冻干燥制剂或冻干制剂将在重构时产生期望的液体制剂。核添加剂和/或壳添加剂，当存在时，可在本文所述组合物再水合时整合到试剂中。
在一个具体实施中，该核包括但不限于一种或多种试剂，例如一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸、荧光团或它们的任何组合。在一个优选的具体实施中，核不是水性介质。
如本文所用，术语“试剂”描述可用于与样品反应、与样品相互作用、稀释样品或添加到样品中的单一试剂或两种或更多种试剂的混合物，并且可包括用于核酸反应的试剂，包括例如缓冲剂、化学品、酶、聚合酶、引物(包括大小小于50个碱基对的引物)、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。在某些具体实施中，如本文所述的试剂可包括酶，诸如聚合酶、连接酶、重组酶或转座酶；结合伴侣，诸如抗体、表位、链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、凝集素或碳水化合物；或其他生物化学活性分子。其他示例试剂包括用于生物化学方案的试剂，诸如核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、酶促测定方案、测序方案和/或用于分析生物流体的方案。根据本文公开的一些具体实施，根据特定工作流程和/或下游应用，试剂可以包括一个或多个小珠，尤其是磁珠。
在一个具体实施中，根据本公开的试剂是聚合酶。根据本公开内容的聚合酶可以包括能够耐受掺入磷酸标记的核苷酸的任何聚合酶。根据本公开可能有用的聚合酶的示例包括但不限于phi29聚合酶、klenow片段、DNA聚合酶I、DNA聚合酶III、GA-1、PZA、phi15、Nf、G1、PZE、PRD1、B103、GA-1、9oN聚合酶、Bst、Bsu、T4、T5、T7、Taq、Vent、RT、polβ和polγ。可以使用被设计成具有特定特性的聚合酶。在一个示例中，核区可包括但不限于粘转平微球、测序微球以及它们的任何组合。如本文所述的粘转平微球可包括但不限于ffN、可用于粘转平的聚合酶(“粘转平聚合酶”)、可用于粘转平的寡聚物(“粘转平寡聚物”)、镁酶辅因子及它们的任何组合。在另一个示例中，测序微球可包括但不限于用于测序的聚合酶(“测序聚合酶”)。
如本文所公开的引物包括可以与所关注靶序列杂交的核酸分子。在几个具体实施中，引物可用作底物，核苷酸可通过聚合酶聚合到该底物上。然而，在一些示例中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。
可以包封在微球内的核酸分子的非限制性示例包括上述那些，例如DNA，诸如基因组或cDNA；RNA，诸如mRNA、sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂交体。核还可包含带标记的核苷酸。
术语“盐”可包括由毒性或无毒酸或碱(包括无机酸和无机碱以及有机酸和有机碱)制备的盐。盐可以由例如药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。
本领域技术人员已知的任何表面活性剂均可用作核中的试剂。表面活性剂可以是非离子型的或离子型的(特别是阳离子型的或阴离子型的)或者可以是两性离子的。合适的表面活性剂的示例包括但不限于聚丙烯酸盐表面活性剂、有机硅表面活性剂和/或其他可商购的表面活性剂或洗涤剂。阳离子表面活性剂的示例是鲸蜡基二甲基铵乙酰胺、十八烷基-二甲基铵乙酰胺、十四烷基-二甲基铵乙酰胺、十二烷基-二甲基铵乙酰胺、鲸蜡基三甲基铵、十八烷基-三甲基铵、十四烷基-三甲基铵、十二烷基-三甲基铵、二甲基二(十八烷基)铵、二(十八烷基)二甲基铵及它们的混合物。阳离子表面活性剂的这些阳离子的合适来源包括但不限于烷基三甲基铵盐：诸如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)或鲸蜡基三甲基氯化铵(CTAC)；氯化十六烷基吡啶鎓(CPC)；二甲基二(十八烷基)氯化铵；二(十八烷基)二甲基溴化铵(DODAB)；鲸蜡基二甲基乙酰胺溴化铵；或其他阳离子表面活性剂同样，包括脂质。可替代地，表面活性剂可以是苄基十六烷基二甲基氯化铵(BHDC)。核可包括阴离子表面活性剂，该阴离子表面活性剂在一端含有阴离子官能团，诸如硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根官能团。阴离子表面活性剂的一个示例是十二烷基硫酸钠。核可包含中性表面活性剂，例如聚乙二醇月桂基醚。
核可以进一步或在替代方案中包括酶抑制剂、分子探针、拥挤剂、有机渗透物、环糊精、三磷酸腺苷(ATP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、肌氨酸激酶、肌氨酸磷酸酯、钯、硫辛酸、六乙二醇、三羟基丙烷膦、抗坏血酸钠或它们的任何组合。如本文所述的酶抑制剂包括与酶结合并降低其活性的任何分子。如本文所述的分子探针包括，例如，地高辛、8-苯胺基萘-1-磺酸(“ANS”)、卟啉、BODIPY、花青或它们的任何组合。如本文所述的拥挤剂包括本领域技术人员已知的任何拥挤剂。示例包括但不限于聚乙二醇、ficoll、葡聚糖和血清白蛋白。
测序技术领域的技术人员将理解存在本文未明确描述的可用于本公开的组合物、系统和方法的附加试剂。
在一个具体实施中，如本文所述的核还可包括一种或多种附加试剂。核中的一种或多种附加试剂改善了控制一种或多种冻干微球释放的能力。在一个具体实施中，附加试剂选自一种或多种糖、氨基酸、聚合物、介孔二氧化硅、季胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，当附加试剂包含糖时，糖选自海藻糖、甘露糖醇、环糊精、葡聚糖、蔗糖或它们的任何组合。在另一个具体实施中，当附加试剂包含氨基酸时，该氨基酸具有疏水性侧链。在另一个具体实施中，当附加试剂包含聚合物时，该聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的组合。在一些具体实施中，该附加试剂可以是例如一种或多种共聚物、离子液体或它们的任何组合。该附加试剂可以以适于产生期望效果的任何量添加，例如介于核的约0.1重量％至约50重量％之间。在一个具体实施中，核中附加试剂的浓度为约0.1重量％、0.5重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％或介于之间的任何量。
在一个具体实施中，核还包括核添加剂。核添加剂可以介于核的约0.01％w/w与核的约100％w/w之间的量存在。例如，在一个具体实施中，核添加剂可以介于核的0.1％w/w与核的约20.0％w/w之间的量存在。在一个具体实施中，核添加剂可介于核的约2％w/w与约10％w/w之间。例如，核添加剂可以以约0.01％w/w、0.05％w/w、0.1％w/w、0.5％w/w、1.0％w/w、1.5％w/w、2.0％w/w、2.5％w/w、3.0％w/w、3.5％w/w、4.0％w/w、4.5％w/w、5.0％w/w、5.5％w/w、6.0％w/w、6.5％w/w、7.0％w/w、7.5％w/w、8.0％w/w、8.5％w/w、9.0％w/w、9.5％w/w、10.0％w/w、10.5％w/w、11.0％w/w、11.5％w/w、12.0％w/w、12.5％w/w、13.0％w/w、13.5％w/w、14.0％w/w、14.5％w/w、15.0％w/w、15.5％w/w、16.0％w/w、16.5％w/w、17.0％w/w、17.5％w/w、18.0％w/w、18.5％w/w、19.0％w/w、19.5％w/w、20.0％w/w的量或介于之间的任何量存在。核添加剂的量可以是减少本文所述的组合物的摩擦荷电的任何合适的量。可调节核添加剂的量以适应特定的试剂或试剂的组合，或适应特定的微球组合物。
在一个具体实施中，该核添加剂包含静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂是以不超过该核的25％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。在一个具体实施中，该核添加剂以该核的至少0.5％w/w浓度的量存在。在一个具体实施中，该核添加剂的量介于该核的约2％w/w与约10％w/w之间。在一个具体实施中，该核添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该核添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、导电促进剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚醚化合物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。在一个具体实施中，该聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。在一个具体实施中，该缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在一个具体实施中，本文所述的组合物可由约20％冻干制剂制备(即，该制剂含有20％冻干赋形剂，诸如海藻糖和其他添加剂)。因此，可将添加剂(缓解静电或防潮)掺入和/或掺加到冻干制剂中，接着干燥以得到干燥形式的适当浓度。在一个具体实施中，铵盐充当导电促进剂。在一个具体实施中，咪唑鎓盐充当导电促进剂。
在一个具体实施中，本文所述的核添加剂可包括水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，核添加剂可包括以下项中的一种或多种：钠盐、缓冲剂、螯合剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。在一个具体实施中，将一种或多种水溶性核添加剂添加到核中。在一个具体实施中，该钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。在另一个具体实施中，缓冲剂是Trizma(Tris.HCl)。在一个具体实施中，该铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的任何组合。在一个具体实施中，该咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。在另一个具体实施中，一种或多种水溶性添加剂诸如/>IO 6783、/>IO 6786、/>80、/>17R4、月桂酸二乙醇酰胺或这些添加剂中的一种或多种的任何组合可包括在核添加剂组合物中。在另一个具体实施中，一种或多种水不溶性添加剂诸如三油酸甘油酯、聚苯胺、癸二酸哌啶酯、氨基酸、维生素E(醋酸生育酚酯)、/>60或这些添加剂中的一种或多种的任何组合可以包括在核添加剂组合物中。在一个具体实施中，/>IO 6783用作核添加剂，其量适于降低组合物的摩擦荷电行为(例如，量为核的约5％w/w)。
该组合物(即，包封的冻干微球)可以是适于包封一种或多种试剂并适合在用于测序的文库制备中使用的任何适当的大小或体积。在一个具体实施中，该组合物在核区中具有介于约0.1μL与约50μL之间的试剂体积。例如，该组合物(即，包封的冻干微球)可具有约0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL的活性试剂体积，或介于约0.1μL与约50μL之间的任何体积。在一个具体实施中，活性试剂体积介于约10μL与约40μL之间。该组合物(即，包封的冻干微球)可具有例如约2μm至约120μm的直径，例如2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm或120μm的直径，或在由上述值中的任两个值限定的范围内的直径。
本文所述的组合物可在微球的壳中包含附加试剂。在一个具体实施中，包封的微球在微球壳中包含试剂或添加剂。壳中的试剂可包括例如前述试剂或添加剂中的任一种。在一个具体实施中，壳不含核酸分子，例如，壳不含DNA。在一个具体实施中，壳含有多于一种试剂和，或在替代方案中，含有多于一种添加剂。
同样，本文所述的组合物(例如，包封的冻干微球)可包括低氧渗透性聚合物包衣，例如聚乙烯醇和/或除氧剂。类似地，本文所述的组合物(例如，包封的冻干微球)可包括两亲性包衣，例如氨基酸和/或PVP共聚物。本文所述的包封的冻干微球还可提供对机械应力的保护，例如通过防止或减少制造中的片段化，例如，具有40％溶质含量的壳。本文所述的组合物(例如，包封的冻干微球)还可提供防止曝光的保护，因为可以保护试剂免于曝光，从而降低制造光约束。
本文所述的组合物可用于多个依次共测定，包括裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、标签片段化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、SBS技术、使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq)、邻近性保留转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增或依次执行的它们的任何组合。在一个具体实施中，该组合物用于进行多个共测定反应。在一个具体实施中，本文所述的组合物、系统和方法(例如，冻干微球的包封)可以改善测序质量，使得能够进行一锅文库制备，并且简化制造。如本文所用，术语“一锅反应”也可称为“无转移反应”。
可制备本文所述的组合物、系统和方法用于测序的各个阶段，包括但不限于样品提取、文库制备、富集、聚类和测序。在样品提取组合物中，核可包括酶、盐、表面活性剂、缓冲剂以及它们的任何组合。样品提取可在约7.5的pH下进行，反应体积介于约1mL与约5mL之间。在文库制备组合物中，核可包括酶抑制剂、盐、引物、酶、核苷酸、有机渗透物、磁珠及它们的任何组合。文库制备可以在约7的pH下进行，反应体积为约0.05mL。在富集组合物中，核可包括核苷酸、分子探针、酶、磁珠、拥挤剂及它们的任何组合。富集可在约8.5的pH下进行，反应体积介于约0.1mL与约0.2mL之间。在聚类组合物中，核可包括盐、酶、一种或多种核苷酸、小分子、表面活性剂、引物及它们的任何组合。聚类可在约8.6的pH下进行，反应体积介于约1mL与约5mL之间。在测序组合物中，核可包括带标记的核苷酸、荧光团、表面活性剂、盐、酶、小分子及它们的任何组合。测序可在约7至约10的pH下进行，反应体积介于约30mL与约100mL之间。
在一个具体实施中，壳可以在介于1与14之间的pH下再水合。在一个具体实施中，壳可以包括一个或多个壳层，并且每一层可以在相同或不同的条件下再水合。例如，壳可以包括在不同条件下再水合的多个层。在一个具体实施中，壳可以包括在不同pH水平释放的两个或更多个层(例如，三个或更多个层)，例如，一个层可在pH 5下释放，一个层可在pH5.5下释放，一个层可在pH 6下释放，一个层可在pH 6.5下释放，一个层可在pH 7下释放，一个层可在pH 7.5下释放，和/或一个层可在pH 8下释放。
核可包括许多与本文所述的那些不同的试剂或可用于促进测序系统(例如，SBS技术)效用的任何试剂。
在一个具体实施中，生物样品接触该组合物。生物样品可以包括例如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰、脑脊髓液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸腔积液、漏出液、渗出液、胆囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、含有单个或多个细胞的液体、含有细胞器的液体、流化组织、流化生物体、含有多细胞生物体的液体、生物拭子和生物洗液。生物样品可以包括核酸，诸如DNA、基因组DNA、RNA、mRNA或其类似物；核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物诸如具有终止子部分的类似物，诸如在以下文献中描述的那些：Bentley等人，“Accurate Whole Human Genome SequencingUsing Reversible Terminator Chemistry,”Nature 456:53-59(2008)；WO/2013/131962；美国专利号7,057,026；WO/2008/042067；WO/2013/117595；美国专利号7,329,492；美国专利号7,211,414；美国专利号7,315,019；美国专利号7,405,281；和美国专利公布号20080108082，其全部全文据此以引用方式并入。
第二方面涉及一种方法。该方法包括提供一种或多种冻干微球；以及在有效包封该一种或多种冻干微球的条件下，用壳包被该一种或多种冻干微球。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于一种或多种冻干微球及其包衣、壳、核和包封的特征。
可使用任何合适的方法来形成微球。标准的微球制造技术将是本领域技术人员已知的，并且包括制备冷冻粒料和将那些粒料放置在如本文所述的干燥器中。根据本公开的组合物、系统和方法考虑多种微球，并且包括例如持续释放、立即脉冲、定时脉冲释放、有机酸小珠和碱性缓冲剂/>小珠微球。本文所述的组合物、系统和方法还涵盖多种类型的包封，包括但不限于散装包封、微囊包封、纳米包封、单分子包封和离子包封。
对标准微球生产的修改用于制造本文所述的组合物。例如，可以将一个或多个附加的进料缓冲罐和一个或多个合适的喷嘴和/或喷嘴板添加到标准微球生产设备中。可进行其他修改，尤其是对固化系统进行修改，以产生各种类型的壳，并且包括如本文所述的诸如水胶体、藻酸盐和果胶等的化合物。
在一个具体实施中，制备两种液体溶液：用于核的一种液体溶液和用于壳的一种液体溶液。可安装允许开始生产的双喷嘴系统(即，单喷嘴系统或具有环形间隙喷嘴的多喷嘴系统)。其他因素也很重要，并且可基于试图制备的组合物的大小和类型进行调节。例如，界面张力、核和壳的粘度、内喷嘴和外喷嘴的喷嘴直径比以及核和壳的压力比全部可以考虑和调节。
在一个具体实施中，使用喷枪来产生包封的冻干微球。在一个具体实施中，可以添加滤膜，并且可以减少在吹气清刷期间离开腔室的冻干微球的量。在另一个具体实施中，使用气雾器。
根据本文所述的组合物、系统和方法，形成液体，接着在环境条件下储存一至两天，然后将微球喷雾冷冻并且可在-80℃下储存。冻干微球可以放置在托盘或旋转干燥器中，接着将微球干燥分配到消耗品和/或胶囊中，最后，可以在塑料消耗品上用箔热密封。
组合物(例如，包封的冻干微球)可用一种或多种附加组合物包被以提供对微球释放的增强控制。在一个具体实施中，该方法还包括在用外层有效包围所包封的微球的条件下，用外层覆盖该壳。
可以将组合物浸入蜡包衣中持续特定的时间，使得组合物不熔化，并且获得特定的厚度来消除包衣过厚的风险。在一个具体实施中，该覆盖进行足以提供具有限定厚度的外层的时间段。在一个具体实施中，限定厚度例如为约50μm。在其他具体实施中，限定厚度小于50μm，或者可替代地大于50μm。在一个示例中，为胶囊填充一种或多种冻干微球，并将该胶囊浸入热蜡中以提供外层。该方法允许微球在两个不同的温度下释放，胶囊可在介于约30℃与约50℃之间溶解，而蜡包衣可在介于约50℃与约80℃之间溶解。
在一个具体实施中，外层包括以下项中的一种或多种：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
本方面可适用于实现试剂浓度调节。例如，与较大的胶囊相比，较小的胶囊可以含较少量的冻干试剂，并且可以根据使用者的需要将多个这种胶囊放置在孔中。在一个具体实施中，适用基于单位的方法，其中X个胶囊＝Y次运行。
第三方面涉及一种系统。该系统包含一种或多种如本文所述的组合物和一种或多种冻干团块，其中所述一种或多种组合物和所述一种或多种冻干团块在有效形成再水合系统的条件下组合。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于一种或多种冻干微球及其包衣、壳、核和包封的特征。
在一个具体实施中，该系统还包括位于该一种或多种包封的微球和该一种或多种冻干团块之间的一个或多个壳层。在一个具体实施中，该壳层包含选自以下的材料：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
第四方面涉及一种控制一种或多种包封的微球的释放的方法。该方法包括提供如本文所述的组合物以及在有效控制一种或多种冻干微球从组合物中释放的第一条件下将该组合物与再水合溶液混合。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于一种或多种冻干微球及其包衣、壳、核和包封的特征。
在一个具体实施中，该方法还包括将第一条件改变为第二条件。在一个具体实施中，改变第一条件包括以下项中的一种或多种：改变温度、改变暴露时间、改变再水合溶液pH或改变包封的微球在再水合溶液中的位置。
如本文所述，在一个具体实施中，为胶囊填充一种或多种冻干微球，并将该胶囊浸入包衣(例如，热蜡)中以提供外层。该方法允许微球在不同温度下在无转移反应中受控释放。该胶囊使得微球能够在介于约30℃与约50℃之间、优选介于约30℃与约40℃之间的温度下释放，而包衣(例如，热蜡)使得微球能够在介于约50℃与约90℃、优选介于约55℃与约85℃之间的温度下释放。包衣可以是热蜡的，优选石蜡的。在一个具体实施中，第一条件和/或第二条件下的温度介于约10℃与约90℃之间；优选介于约30℃与约50℃之间或介于约50℃与约90℃之间，这取决于壳和/或外包衣的组成。
同样，改变第一条件可通过使用本文所述的添加剂，将一种或多种添加剂添加到再水合溶液中或添加到本文所述的组合物来实现。在一个具体实施中，该核，或在替代方案中，该再水合溶液还包含一种或多种附加试剂。附加试剂可以是上述任何单一的附加试剂，或者可以是上述两种或更多种附加试剂的任何组合。例如，氨基酸单独或与另一种氨基酸组合可用于改变第一条件并促进微球的受控释放。该一种或多种添加剂的含量将变化并且取决于所用的组合物和反应条件(例如，时间、温度和pH)。在一个具体实施中，该一种或多种添加剂介于该组合物和/或再水合溶液的约0.1重量％与40重量％之间。例如，该一种或多种添加剂的浓度可为0.1重量％、0.5重量％、1.0重量％、5.0重量％、10.0重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％或介于之间的任何量。
如本文所用的再水合(或重构)溶液可包括水、去离子水、盐水溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液，并且可与前述再水合溶液一致。在一个优选具体实施中，再水合溶液是水。在一个具体实施中，本文所述的具有不同浓度、不同类型的酶和不同量的辅因子、盐、pH等的试剂可单独用水或甚至经大气水捕获再水合。可以在再水合溶液中提供如本文所述的附加添加剂以进一步改善对微球释放的控制。
在一个具体实施中，再水合溶液的pH介于约6.0与约10.0之间。再水合溶液的pH可以是例如约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0或介于之间的任何量。再水合时间将根据组合物含量和反应条件(例如，试剂、温度、pH)而变化。在一个具体实施中，再水合时间可以介于0.1秒与10小时之间。例如，再水合时间可以是约0.1秒、1秒、10秒、30秒、45秒、60秒、5分钟、10分钟、12分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、2小时、5小时、8小时、10小时或介于之间的任何时间量。
在一个具体实施中，第一条件有效释放第一冻干微球。该具体实施中的第一冻干微球与本文所述的冻干微球和组合物一致。
在一个具体实施中，第二条件有效释放第二冻干微球，其中第二冻干微球的内容物不同于第一冻干微球的内容物。该具体实施中的第二冻干微球与本文所述的冻干微球和组合物一致。
在一个具体实施中，改变第一条件有效释放两种或更多种冻干微球，其中该两种或更多种冻干微球包含不同的试剂。在一个具体实施中，第一冻干微球的内容物包括与第二冻干微球的试剂不同的试剂，并且可因此降低混合试剂的热敏性。
在一个具体实施中，该方法还包括提供与本文所述的组合物一致的附加组合物，以及在有效控制一种或多种冻干微球从附加组合物中释放的第三条件下混合附加组合物。该具体实施中的冻干微球与本文所述的冻干微球和组合物一致。在一个具体实施中，将SBS裂解混合物中的试剂组分分离到至少两种不同的冻干微球中，并且可以由此防止或减少和/或控制不期望的相互作用。
如本文所述“改变”第一条件、第二条件或第三条件包括包封的微球中和(或在替代方案中)再水合溶液中一种或多种条件的任何变化。在一个实施方案中改变条件允许一种或多种冻干微球的依次释放。使得冻干试剂能够依次释放的一种方式是通过温度触发释放，例如，通过将填充有微球的明胶胶囊浸入如本文所述的石蜡中。此类方法使得微球能够在不同温度下释放，例如对于天然明胶胶囊而言介于约30℃与约50℃之间并且对于包衣胶囊而言介于约50℃与约90℃之间。类似地，此类方法使得能够通过向再水合溶液中添加添加剂(例如氨基酸)来实现时间触发的释放。除了时间和(或在替代方案中)温度之外或代替时间和温度，可以改变其他反应特征。例如，可以改变pH和湿度以进一步控制一种或多种包封的微球和包含在其中的试剂的释放。
在另一个实施方案中，本文所述的组合物、系统和方法保护第一组合物(例如，包封的冻干微球)中的聚合酶。在一个具体实施中，在完全官能化核苷酸(“ffN”)粘转平期间保护第一组合物中的聚合酶可以保护光敏ffN免于光降解。
将试剂(例如测序聚合酶)从包封开始的释放定时为与期望反应(例如粘转平过程)的完成一致的问题可通过调节本文所述的组合物和再水合溶液中的各种成分以及那些成分的相对量来解决。也可以使用温度或光反应性添加剂以实现甚至更精细水平的控制。例如，使用两种不相容的竞争聚合酶(精加工和测序)矫正一个孔(掺入混合试剂孔)内的去封闭冻干ffN的问题可以通过使用本公开的组合物、系统和方法在空间上和时间上分离聚合酶来解决。
在一个示例中，两个胶囊可以处于单支管中，并且那些胶囊可以用不同的触发因素溶解。在另一个示例中，两个或更多个胶囊可沿y轴或x轴堆叠在窄管中，并且第一胶囊释放后在与液体接触时第二胶囊溶解，接着第二胶囊释放后在与液体接触时第三胶囊溶解，这对于与特定堆叠中存在的胶囊一样多的胶囊重复。这些具体实施同样可以通过温度改变诸如加热来触发。在另一个示例中，管包括通过冻干形成的团块，可将蜡移液到管中并将胶囊放入。使用者可以添加液体，该液体首先溶解胶囊，然后当温度升高时，蜡熔化并且团块再水合。在另一个示例中，管包括通过冻干形成的第一团块，然后将蜡移液到管中。然后使第二液体沉积，重复冻干，接着沉积新的蜡(具有例如不同的熔融温度)。一旦蜡依次熔化，使用者就添加液体以再水合不同的团块。
在一个具体实施中，该方法还包括提供一种或多种冻干团块，以及使该一种或多种冻干团块再水合。
应当理解，前述概念和本文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。
在本公开中，参考了形成本公开的一部分的附图，并且在附图中通过图示的方式示出了可以实施的特定具体实施。详细描述这些实施式案以使本领域的技术人员能够实践本公开，并且应当理解，可利用其他具体实施，并且可在不脱离本公开的范围的情况下作出结构、逻辑和电改变。因此，下面对示例性具体实施的描述不应被理解为限制性的。
本公开可通过参考以下示例进一步说明。
实施例
以下实施例旨在说明，但决不旨在限制如在所附权利要求中阐述的本公开的范围。
实施例1-包封的冻干微球的生产。
在此，生产包封的冻干微球。
可以使用标准技术生产微球。首先制备冷冻粒料。液体以一定的液体流速和振动频率流入具有一定的喷嘴直径的容器中。在给定的塔温和高度下使用偏转电源(静电环)并产生冷冻粒料。喷雾塔可用于制备微球。将托盘放入盘式干燥器中，并将散装形式的微球放置在干燥器例如旋转干燥器中。用于本文所述的包封的冻干微球的微球生产可以建立于标准的微球生产技术之上和或在替代方案中改变标准的微球生产技术。
如图1所示，本文所述的组合物、系统和方法涵盖多种类型的包封，包括但不限于散装包封、微囊包封、纳米包封、单分子包封和离子包封。
根据本公开使用的包封方法的一个具体实施包括微球的蜡包衣。使用喷枪将包衣施加到包含在腔室中的微球上。喷枪可在腔室中产生通风，导致一些微球离开腔室。缓解包括添加滤膜以防止微球离开腔室或降低微球离开腔室的可能性。代替喷枪或除了喷枪之外，还可以使用气雾器以减少气流产生。气雾器可能对包被粘性溶液更具挑战性。
实施例2-包封的冻干微球的组成。
这里，示出了根据本公开的本组合物、系统和方法的示例性制剂。可制备本文所述的组合物用于测序的各个阶段，包括但不限于样品提取、文库制备、富集、聚类和测序，如图2所示。
在样品提取组合物中，核可包括酶、盐、表面活性剂、缓冲剂以及它们的任何组合。样品提取可在约7.5的pH下进行。反应体积可以介于约1mL与约5mL之间。在文库制备组合物中，核可包括酶抑制剂、盐、引物、酶、核苷酸、有机渗透物、磁珠及它们的任何组合。文库制备可在约7的pH下进行。反应体积可以为约0.05mL。在富集组合物中，核可包括一种或多种核苷酸、分子探针、酶、磁珠、拥挤剂及它们的任何组合。富集可在约8.5的pH下进行。反应体积可以介于约0.1mL与约0.2mL之间。在聚类组合物中，核可包括盐、酶、核苷酸、小分子、表面活性剂、引物及它们的任何组合。聚类可在约8.6的pH下进行。反应体积可以为约1mL。在测序组合物中，核可包括带标记的核苷酸、荧光团、表面活性剂、盐、酶、小分子及它们的任何组合。测序可在介于约7与约10之间的pH下进行。反应体积可以为约30mL至约100mL。
在本文所述的组合物、系统和方法的具体实施中，可将冻干赋形剂的各种制剂添加到核中，包括例如糖、氨基酸和聚合物。糖可包括海藻糖(10％-25％)、甘露糖醇(1％-10％)、环糊精(1％-10％)、葡聚糖(1％-10％)、蔗糖(1％-10％)或它们的任何组合。聚合物可包括聚乙烯基吡咯烷酮(1％-10％)、聚乙烯醇(1％-10％)或它们的组合。可以添加介孔二氧化硅和/或季胺以降低对摩擦荷电的亲和力。
在本文所述的组合物、系统和方法的具体实施中，可将壳成分的各种制剂添加到壳中。壳成分的各种示例包括角叉菜胶、虫胶、海藻糖(20％-40％)、石蜡、明胶、HPMC、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、明胶、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-PVA、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(1％-5％)、聚乙烯醇(1％-10％)或它们的任何组合。对于某些具体实施，所使用的材料不含任何DNA，以便不污染任何反应并且避免使用贵重的测序实体。
如图3所示，在微球上经受了多种应力。在制造期间，一段时间(例如，2天-3天)，微球在包装之前暴露于湿度以及在填充和精加工期间暴露于摩擦荷电。在运输和储存期间，在可达数月(例如，3-6个月)的过程中，微球暴露于温度剧增。一旦消耗品被打开(即使仅打开少于10分钟)，微球上就存在多种新的应力，包括例如环境湿度，环境湿度可在暴露数秒内对微球产生影响。另外，制造、运输和储存都使微球经受附加的机械应力，诸如冲击和振动。本文所述的组合物、系统和方法(例如，冻干微球的包封)缓解了未冻干和包封的微球原本会经受的应力。
而且，静电荷可能是分配和干燥复合微球的相当大的风险。如本文所述的组合物、系统和方法中所述的包封微球显著降低了该风险并且极大地改善了测序的稳定性。
同样，本文所述的组合物、系统和方法通过低氧渗透性聚合物包衣(例如，包衣中的聚乙烯醇、除氧剂)为包封的冻干微球提供改善的氧保护。类似地，本文所述的组合物、系统和方法通过施用两亲性包衣(例如，氨基酸和PVP共聚物)为包封的冻干微球提供改善的防潮保护。本文所述的包封的冻干微球还可提供对机械应力的保护，例如通过防止或减少制造中的片段化(例如，40％溶质含量的壳)。此类保护性包衣提高了微球及其内容物在制造和运输期间的机械坚固性，并且减少或甚至消除了粉末从微球上的脱落。
本文所述的包封的冻干微球还可提供防止曝光的保护，因为可以保护试剂免于曝光，从而降低制造光约束。包封可以改善测序质量，使得单锅文库制备成为可能，并简化制造。根据本文所述的组合物、系统和方法包封冻干微球的益处和应用。本文所述的包封的冻干微球的SBS应用在图15A至图15C中有描述。
图15A中示出了在核中具有Pd(550)和在壳中具有THP(552)的AOM SBS裂解混合物，其中Pd裂解混合物可能需要Pd和THP的分离以降低混合试剂的热敏性。图15B中示出了在核中具有Pol(554)和在壳中具有ffN(556)的ffN/Pol小珠；其中如果需要粘转平，则可以在ffN粘转平期间保护聚合酶。图15C中示出了在核中具有ffN(560)且具有遮光壳(558)的ffN的光保护，其中通过遮光壳(558)保护光敏ffN(在核(560)中发现)免于光降解。
实施例3-冻干试剂的依次释放。
为了增加测序试剂的稳定性和简化工作流程，对包封的冻干微球有极大兴趣。本公开描述了用于将冻干试剂包封在微球中的组合物、系统和方法，可以使得冻干试剂能够依次释放，如例如图47和图48中所示。在如图47所示的第一种方法中，提供一个或多个冻干微球(602)，以及在有效包封该一个或多个冻干微球(604)的条件下用壳包被该一个或多个冻干微球。在如图48所示的另一种方法中，提供本文所述的组合物(702)，以及在有效控制一个或多个冻干微球从组合物(704)中释放的第一释放条件下将该组合物与再水合溶液混合。
使得冻干试剂能够依次释放的一种方式是通过温度触发释放，例如，通过将填充有微球的明胶胶囊浸入石蜡中。此类方法使得微球能够在不同温度下释放，例如对于天然明胶胶囊而言介于约30℃至约50℃之间(例如37℃)并且对于包衣胶囊而言介于约50℃至约90℃之间(例如58℃)。类似地，此类方法使得能够通过向再水合溶液中添加添加剂(例如氨基酸)来实现时间触发的释放，这些添加剂可以延迟团块的再水合速率。
这里，包封的冻干微球用于使冻干试剂能够依次释放。如图4A至图4B中所示，在本公开的一个具体实施中，明胶胶囊可以填充有微球，并且填充有微球的明胶胶囊可以浸入热石蜡中(或包被在任何适当的外层中)一段时间。图5描绘了用于无转移反应的温度控制释放。如图4A至图4B和图5所示，明胶胶囊的石蜡包衣使得微球能够在不同温度下释放。图4A示出了用微球填充的OTS明胶胶囊(102)和用微球填充并快速浸入热蜡中的OTS明胶胶囊(104)。图4B示出了用微球填充，在37℃下溶解的OTS明胶胶囊(106)和用微球填充并快速浸入热蜡中，在58℃下溶解的OTS明胶胶囊(108)。明胶胶囊(102)和/或(106)能够在介于约30℃与约50℃之间(例如，37℃和/或50℃)释放微球，而石蜡包衣(104)和/或(108)能够在介于约50℃与约90℃之间(例如，58℃和/或85℃)释放微球。在该具体实施中，用微球填充胶囊并将该胶囊快速浸入热蜡中，这应足够快，使得胶囊不会开始熔化并限制蜡壳的厚度。
图6示出了明胶在Nextera Flex标签片段化中的相容性测试。在标签片段化反应中可以容许大约80mM明胶而不降低文库产率。在Nextera Flex反应(n＝3)中对明胶(用于OTC胶囊中)进行滴定。Flex按照标准方案进行(100ng输入；5次循环扩增)。在2侧SPRI之后以量子比特测量产率。相对于无明胶对照将产率归一化。将结果与无DNA/无明胶的对照进行比较。
图7A至图7B示出了无转移反应的时间控制释放。图7A展示了赋形剂的百分比和它们各自的再水合时间。图7B示出了本文所述的示例组合物在干燥时(202)、1分钟后(204)、2分钟后(206)、5分钟后(208)、10分钟后(210)和12分钟后(212)的再水合。氨基酸赋形剂的添加使得冻干材料能够延迟释放。添加不同量的赋形剂，并且再水合时间不同。在一个示例中，如图7A至图7B所示，添加1％亮氨酸和4％海藻糖导致再水合时间为12分钟(如(202)、(204)、(206)、(208)、(210)和(212)所示)。测试各种其他氨基酸赋形剂，包括不同浓度的单独的海藻糖、与海藻糖组合的苯丙氨酸和与海藻糖组合的异亮氨酸，导致不同的再水合时间。因此，有各种材料可以在再水合之前添加到包封的冻干微球中，或者在替代方案中，在再水合期间添加到再水合溶液中，允许改善微球内容物的控制和稳定性以及延迟释放，这些材料包括氨基酸、PVP共聚物、介孔二氧化硅、离子液体、季胺、聚乙烯醇、除氧剂、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、聚乙烯醇、藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、明胶、HPMC、石蜡、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-PVA和果胶。可用于控制本公开的包封的冻干微球的释放和触发机制的添加剂和措施的其他示例包括聚乙烯醇、藻酸盐、壳聚糖、明胶、角叉菜胶、POD、水凝胶、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-PVA、胶囊、蜡、果胶、金属有机框架、CNT、改性RBC、聚合物基质和逻辑门光笼(photocage)。本文所述的各种添加剂和措施促进包封的冻干微球的稳定性，允许大囊包封以使得多运行药筒成为可能，并且允许微囊包封以使得简化工作流程成为可能，例如减少试剂孔数。
实施例4-用于一锅连接方案的包封的冻干微球和包封的冻干微球的受控释放。
这里，所描述的包封的冻干微球使得如图8A至图8C所示的一锅连接方案成为可能。一锅连接方案的步骤如图8A所例示。图8B展示了在具有两种不同微球的单个罐(306)中微球的时间依赖性释放：(302)，对应于图8A中的试剂A，和(304)，对应于图8A中的试剂B。图8C中示出了试剂A、试剂B和附加试剂即试剂B'的活性试剂体积、微球数目、活性试剂组合物、包封壳组合物和包封释放触发因素的示例。
通过本文所述的组合物、系统和方法实现包封的冻干微球的延迟释放(例如，微球中第一试剂再水合，接着相同或不同微球中一种或多种后续试剂在一段时间后在相同再水合溶液中再水合)以及机械保护、缓冲液稳定化、电荷控制、试剂组合(例如，在单个微球、单个孔、单个锅中两种或更多种不同试剂的组合)和光保护。具体而言，通过使用本文所述的包封的冻干微球的试剂的受控瞬时释放允许一锅法文库制备。通过包封PCR试剂并使其在预定时间释放来解决PCR所涉及的试剂对标签片段化的抑制。图8A至图8C示出了在单一再水合溶液中具有不同核试剂的包封的冻干微球的存在。例如，试剂A能够在小于1分钟内再水合，而在该示例中，试剂B在5分钟后再水合，从而避免试剂A与试剂B之间的任何不期望的反应，并且允许试剂A和试剂B存在于单个锅或孔中，并且可以允许无转移反应。该概念可用于在单个锅或孔中多于两种类型的试剂。例如，如图8A至图8C中所述的试剂A、试剂B和试剂B'，各自含有一种或多种不同的包封的冻干微球以及一种或多种不同的试剂，可以在单个孔或锅中组合并且以时间依赖性方式再水合。不同量的活性试剂、微球数目以及试剂本身的组成可以与不同组成的壳一起使用不同的时间段，全部在单个锅或孔内使用。该发现允许用于测序应用的PCR中的各个步骤全部在相同的锅或孔内进行，并且独特地允许无转移反应。
本文所述的组合物、系统和方法能够实现除上述那些之外的益处。例如，使用冻干材料和分离的冻干材料，意指可以将酶的附加辅因子诸如镁添加到微球本身，而不是具有单独的附加再水合缓冲液。这可以使得不同浓度、类型的酶的所有试剂(全部需要或受益于不同量的辅因子、盐、pH等)仅单独用水或甚至经大气水捕获而再水合。这促进了在测序过程中使用的塑料的量以及碳足迹的连锁减少，考虑到了在浓缩和/或冻干形式时试剂的重量减少。
包封方法可适用于实现调节试剂浓度的简易方式。例如，与较大的胶囊相比，较小的胶囊可以含较少量的冻干试剂，并且可以根据使用者的需要将多个这种胶囊放置在孔中。这促进了在吞吐量方面增加的使用者灵活性，而没有稀释度/浓度计算所造成的潜在误差。基于单位的方法(其中X个胶囊＝Y次运行)以更加受控的方式允许这种灵活性。另一种选择包括更深度的测序或更长的测序(2×500)运行，这些运行可以使用三倍数目的胶囊(“3X”)，而快速浅表筛查测试可以使用较少倍数的胶囊(“X”)。
实施例5-矫正一个孔中的去封闭冻干ffN。
使用两种不相容的竞争性聚合酶(粘转平聚合酶和测序聚合酶)矫正一个孔(例如，掺入混合试剂孔)内的去封闭冻干ffN的问题可以通过在空间和时间上分离聚合酶得以解决，如图9A至图9D、图10A至图10D和图11A至图11F所示。具体而言，在空间和时间上分离两种聚合酶的问题可以通过将一种聚合酶(测序聚合酶，因为该聚合酶在粘转平聚合酶之后使用)包封在水溶性、缓慢溶解的膜(例如，聚乙烯醇)中得以解决。对测序聚合酶从其胶囊中释放进行定时以与粘转平过程的完成一致的问题可通过调节水溶性膜中的成分及其相对量来解决。也可以使用温度或光反应性添加剂以实现甚至更精细水平的控制。
将ffN冻干与它们的液体形式相比实现增加的稳定性，但是产生升高的3'OH水平，增加了预定相，从而导致运行质量降低。粘转平工作流程的实验室使用可能很复杂。单独制备和组合粘转平混合物(包括ffN、粘转平聚合酶、粘转平寡聚物和Mg)，在50℃的高温下温育长达一小时(以利于粘转平反应)，然后添加到发现测序聚合酶的掺入混合物的剩余部分中。使用者和呈其当前形式的测序仪装置在这种工作流程中的这种复杂程度是不期望的，并且在规模上甚至更小。具有最少和/或没有使用者触点的解决方案是可行的选择，与当前测序仪工作流程一样复杂或不如当前测序仪工作流程复杂。
本公开的组合物、系统和方法提出可行的替代方案。在唯一的掺入试剂孔中，可以分配松散的“粘转平微球”(其可包括ffN、粘转平聚合酶、粘转平寡聚物和镁酶辅因子)。在该孔中还可以有测序聚合酶微球；然而，如图19A至图19D和图10A至图10D所示，这些可被包封在水溶性、定时溶解膜中。这种设置允许多种益处，包括例如减少孔数。如果按照当前单独制备粘转平混合物，接着与大的ICM混合物混合，对于粘转平试剂而言可能需要单独的孔。利用本文所述的包封的组合物、系统和方法有利于在一个孔中发生多个连续反应，从而使孔的数目最小化。这也影响药筒足迹，在环境影响方面，包括例如塑料的使用和焚化废弃物方面，具有连锁(knock-on)增益。本文所述的组合物、系统和方法可容易地缩放，同时还提供减少的流体和阀调，从而降低测序仪复杂性和相关成本。当再水合缓冲液(诸如水)分配到孔中时，松散的粘转平微球快速溶解并且粘转平反应开始矫正所有未封闭的ffN。该再水合缓冲液也开始溶解包封测序聚合酶的水溶性膜，参见，例如图10A至图10D和图11A至图11F。
例如在图9A中示出了含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物的多合一粘转平微球(402)。含有测序聚合酶的测序聚合酶微球(404)示于例如图9B中。图9C中示出了单个孔(408)中的包封的聚合酶微球(406)和多合一粘转平微球(402)。包封的聚合酶微球(406)和多合一粘转平微球(402)可以放置在高温的单个孔(408)中并且用水再水合，如图9D所示。
在图10A中进一步示出了含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物的多合一粘转平微球(402)。含有测序聚合酶的测序聚合酶微球(404)示于例如图10B中。图10C中示出了单个孔(408)中的包封的聚合酶微球(406)(×3个单位)和多合一粘转平微球(402)(×3个单位)。如图10D所示，相同的单位剂量可以在不同的试剂中重复以实现总的×3剂量。
例如在图11A中进一步示出了可含有ffN、粘转平聚合酶和粘转平寡聚物的多合一粘转平微球(402)。测序聚合酶微球(404)可以被包封(406)并且可以含有测序聚合酶，并且可以处于单个孔内在多合一粘转平微球(402)旁边，如图11C所示。包封的冻干微球(406)可以在50℃下用水再水合，如图11C所示。在一小时之后，多合一微球(402)开始溶解，并且开始粘转平，如图11D所示。多合一微球(402)溶解，粘转平完成，并且包封的聚合酶微球(406)在延迟之后溶解，如图11E所示。微球变得完全溶解，然后ICM即可使用，如图11F所示。
实施例6-控制一种或多种包封的冻干微球释放的讨论和益处。
已知SBS缓冲剂的pH随测序运行而变化。本文所述的组合物、系统和方法使用对原本会对pH变化有反应的颗粒的包封来稳定这些缓冲剂和提高SBS性能。
本文所述的组合物、系统和方法有许多益处。例如，包封的冻干微球通过中和电荷并降低摩擦荷电亲和力而提供抗静电保护，从而降低计量和制造处理复杂性(例如，使用介孔二氧化硅、离子液体、季胺)。静电荷可能是微球的显著风险，因为它对制造期间干燥微球粉末的计量和混合具有显著影响。包封可用于通过用具有低摩擦荷电亲和力的中性材料包被颗粒来中和微球的电荷。
本文所述的组合物、系统和方法还通过开发pH敏感性微球来改善对溶液pH的控制，在溶液静置于仪器(例如ICM)上时溶液pH可能随时间而变化，pH敏感性微球在缓冲液浸入低于特定pH时释放以释放离子并且使缓冲液恢复至期望的pH。类似地，本文所述的组合物、系统和方法改善对微球外部电荷的控制，以利于分配和减少(如果不是，则防止)混合块中的分层，并且还容许试剂组分SBS裂解混合物的分离，以减少混合试剂的热敏感性，以减少或防止和/或控制不期望的相互作用。同样，本文所述的组合物、系统和方法提供包封的冻干微球，如果使用粘转平，这些包封的冻干微球在ffN粘转平期间保护聚合酶，并且保护光敏ffN免于光降解，特别是在粘转平所涉及的环境条件会使酶降解的情况下。
本文所述的组合物、系统和方法(例如，包封的冻干微球)的各种应用。在一个示例中，两个或更多个胶囊可以在单支管中彼此相邻，并且那些胶囊可以用不同的触发因素溶解。在另一个示例中，两个或更多个胶囊可沿窄管的y轴或x轴堆叠，并且第一胶囊释放后在与液体接触时第二胶囊溶解，接着第二胶囊释放后在与液体接触时第三胶囊溶解，这对于与特定堆叠中存在的胶囊一样多的胶囊重复。这些具体实施同样可以通过温度改变诸如加热来触发。在另一个示例中，管可包括通过冻干形成的团块，可将蜡移液到管中并将胶囊放入。使用者可以添加液体，该液体首先溶解胶囊，然后当温度升高时，蜡熔化并且团块再水合。在另一个示例中，管可包括通过冻干形成的第一团块，然后可将蜡移液到管中。使第二液体沉积，并重复冻干，然后沉积新的蜡(具有例如不同的熔融温度)。一旦蜡依次熔化，使用者就添加液体以再水合不同的团块。
图12中示出了本文所述的包封的冻干微球的一个具体实施的制造方法详情。大量形成液体，接着在环境条件下储存一段时间，例如一天至两天，然后将微球喷雾冷冻并在-80℃下储存。然后将冻干微球放置在托盘或旋转干燥器中，接着将微球干燥分配到消耗品和/或胶囊中，最后，在塑料消耗品上用箔热密封。胶囊可以紧靠彼此放置在单支管中并且用不同的触发因素溶解，或者可替代地，可以堆叠在窄管中并且在先前的胶囊释放后并且当与液体接触时溶解(该具体实施可以类似地通过加热触发)，如本文所述。
图13中示出了本文所述的包封的冻干微球的一个具体实施的制造和使用点。在一个具体实施中，在制造期间，液体将一种或多种试剂分配在消耗品中，将该消耗品冷冻干燥，分配热蜡，将蜡冷却以固化屏障，并且将胶囊添加到消耗品。可通过冻干形成冻干团块，然后可将蜡移液到管中并且可将胶囊放入。在一个具体实施中，在使用点期间，使用者添加液体，该液体溶解胶囊，将来自该胶囊的冻干微球再水合，升高温度以使蜡熔化，并且将冻干团块再水合。
图14A至图14B中示出了本文所述的包封的冻干微球和团块的一个具体实施的制造和使用点。在一个具体实施中，在制造期间，液体将一种或多种试剂分配在消耗品中，将该消耗品冷冻干燥，分配热蜡，并将蜡冷却以固化屏障。重复该过程获得附加层。可通过冻干形成冻干团块，然后可将蜡移液到管中并且可将胶囊放入。沉积第二液体，重复冻干，接着是具有不同熔融温度的新的蜡沉积物。在一个具体实施中，在使用点期间，使用者添加液体，第一温度使第一蜡熔化，第一团块再水合，第二温度使第二蜡熔化，并且第二团块再水合。重复该过程获得附加层。
实施例7-本文所述的组合物的显著发现的讨论。
本公开的重要方面包括四个主要的研究和开发活动：(1)针对ffN和测序的添加剂的相容性筛选；(2)添加剂对ExAmp和聚类的相容性筛选；(3)将添加剂掺入冻干基质中以缓解静电；以及(4)将添加剂掺入微球包衣上以缓解静电。
在本实施例和实施例8-实施例13中，以水溶性添加剂为例，但也可以使用水不溶性添加剂。存在金属纳米颗粒、石墨烯填料、碳纳米管和介孔二氧化硅，这些可以掺入本文所述的冻干试剂或干燥试剂中。这些添加剂通常用于电子应用的固体塑料或聚合物中。
在药物或生物技术应用中，此类添加剂的使用受到它们对与活性成分的相容性的影响的限制。冻干微球形式的干燥试剂含有酶、寡核苷酸和ffN(核苷酸)。因此，必要的是试剂微球中添加剂的选择受添加剂的相容性和添加剂缓解干燥微球的静电行为的功能驱动。特别地，本文所述的冻干微球受益于在干燥环境中处理，这有利于静电荷的积聚。将此类添加剂作为基质或包衣形式掺入微球中有助于缓解干式填充和复合(共混)中的静电和摩擦荷电。再水合后，预计冻干微球的基质或包衣中的添加剂也可溶于水溶液中。然而，如果存在添加剂的原位分离方法，即滤膜，则上述水不溶性添加剂可以在技术上适用以及包被微球。
在表1中，基于添加剂在水溶液以及有机溶剂(即异丙醇)中的溶解度来筛选添加剂。
表1.被选择用于缓解冻干微球的静电和摩擦荷电的添加剂的溶解度筛选。总结了 可溶性添加剂的重量％及其对溶液pH的影响(有前景的添加剂)。
当添加剂作为包衣应用于冻干微球时，有机溶剂溶解性可能是有益的。除了在水溶液(即，MOPS和ICM缓冲液)中的溶解性之外，重要的是发现添加剂不改变用于储存或稳定活性成分的缓冲液的pH。
在该实施例中，水溶性添加剂诸如IO 6783、6786、/>80、/>17R4、月桂酸二乙醇酰胺可能是有益的，因为它们可直接掺入冻干微球的基质中。水不溶性添加剂，诸如三油酸甘油酯、聚苯胺、癸二酸哌啶酯、维生素E(醋酸生育酚酯)、/>60可在DMSO的帮助下掺入微球中。
实施例8-添加剂对ffN和测序的相容性筛选。
为了筛选它们对测序性能的相容性，将添加剂掺加到含有ffN和聚合酶的掺入混合物(IMX)中。通过定相、预定相量度和误差率的增加以及Q30的降低来监测它们的有害作用。如图16A至图16I所示，月桂酸二乙醇酰胺、17R4和/>IO 6783可以是相容的，因为它们的测序结果与对照(非掺加IMX)相当。
在IMX中掺加的不同浓度下筛选有前景的材料，诸如IO 6783，以测定相容性极限(即，2％w/v)。
据报道用作抗静电剂的添加剂诸如乙氧基化PEI和FC550对于测序可能是不相容的。添加剂的测序结果汇总在下表2中，测序结果有助于缩小SBS微球(ffN和聚合酶)的抗静电添加剂的选择范围。
表2.掺有添加剂的IMX(SBS掺入混合物)的测序性能汇总
除了掺入IMX之外，还筛选了添加剂与ffN的相容性(图17A至图17F)。由于它们对去封闭(3'OH生成)和三磷酸水解(DiP生成)的热敏性，选择了来自不同测序平台的两种蓝色ffC。将添加剂与ffN含水制剂(或再水合的冻干制剂)在60℃温育1天和2天。与对照相比，观察到3'OH和DiP的显著增加以及峰面积的减小。除Tris.HCl外，有前景的添加剂诸如IO 6783可与ffN相容。/>
实施例9-添加剂对ExAmp和聚类的相容性筛选。
也将相同的添加剂与含水ExAmp制剂(TCX V1.0)一起温育。在0.1％和1％w/v的添加剂的存在下评估DNA重组酶(ExAmp的敏感性酶组分)的活性(图18)。除IO 6786、和/>外，大多数添加剂产生与对照相当的活性。
使用cBOT第一碱基掺入动力学评估ExAmp的聚类功能性(图19A至图19B)。结果确证DNA重组酶活性测定。不相容的添加剂诸如和/>表现出低聚类强度。另一方面，Ekfa IO 6783对DNA重组酶活性和聚类功能性略微有害，特别是当ExAmp在较高温度下分级时(即40℃下1天)。因此，/>IO 6783的浓度可受益于保持在低于约1％w/v的ExAmp溶液(或再水合微球)中。
这些添加剂也以冻干团块的形式掺入ExAmp中。为了测定添加剂的抗静电特性，将团块粉末化并使用Keyence(作为基质形式)测量它们的电荷电势。在干燥环境(3％相对湿度)中，静电更明显(图20)。出乎意料的是，IO 6783甚至以0.1％w/v在20％冻干制剂中也有效。
而且，VA64、/>IO 6786和/>在0.1％和1％w/v下有效。然而，/>和/>IO 6786与ExAmp不充分相容。
在较高的相对湿度(40％ RH，图21)下，粉末状冻干团块的电荷电势降低，指示小的静电和摩擦荷电行为。
由于人们对更大的抗静电添加剂文库感兴趣，因此在该ExAmp相容性测定中研究了水不溶性添加剂。也添加与添加剂浓度相同的DMSO以有助于这些疏水性添加剂的水溶性。由于TCX V1.0的冻干制剂可以含有7.5％HPBCD，它也有助于添加剂的水溶性。
图22和图23分别示出在3％和40％相对湿度下ExAmp的粉末状冻干团块的电荷电势测量结果。经证实月桂酸二乙醇酰胺、香豆素6、生育酚乙酸酯、双(4-癸二酸哌啶酯)和甚至DMSO会降低ExAmp粉末的电荷电势。
探索了冻干制剂赋形剂对ExAmp粉末状团块的电荷电势的影响(图24)。无论如何，这些赋形剂中的许多赋形剂是在冻干制剂中使用的盐和缓冲剂。发现HEPES、MOPS和四烷基氯化铵在两种浓度(掺加到20％冻干制剂中的0.1％和1％w/v)下均有效降低ExAmp粉末的电荷电势。这一出乎意料的发现有助于冻干制剂的设计，特别是使用盐/缓冲剂，这也有望缓解冻干微球形式的静电和摩擦荷电。具体而言，经证实它们也与ExAmp中的DNA重组酶活性相容。
实施例10-将添加剂掺入冻干基质中以缓解静电。
为了测试微球中添加剂的抗静电有效性，将这些添加剂作为基质形式一起冻干。图25A至图25C示出了在Atto微球以及荧光素(FSCN)微球中添加剂作为基质形式(均含有20％海藻糖)掺入。添加剂的抗静电特性通过微球对容器的粘附性来评估，并且它们的电荷密度通过GranuCharge来测量。低Δq值指示低摩擦荷电。1％IO 6783的基质形式使摩擦荷电最小化。图25A示出了测试的第一组添加剂(Atto 20％，+1％/>IO 6783，+1.5％ Tris.Hcl，和+1％ Tween 20)在视觉效果(顶部)和损失百分比(底部)方面的结果。图25B示出了测试的第二组添加剂(FSCN 20％对照、+1％/>IO 6783、+2％/>IO6783和+1％/>IO 6786)在视觉效果(顶部)和损失百分比(底部)方面的结果。图25C示出了在基质形式的抗静电剂/>IO 6783的帮助下将Atto和FSCN(均为20％海藻糖)干燥复合
微球粘附到容器的玻璃和塑料(聚丙烯)壁上指示它们的静电和摩擦荷电行为。掺有1％IO 6783的冻干制剂基质似乎展示出低静电和摩擦荷电。使用GranuCharge的电荷密度测量确证/>IO 6783的抗静电和抗摩擦荷电行为(低q0和Δq值)。而且，当Atto和FSCN两种微球都掺有/>IO 6783时，它们可以更均匀地共混。
在添加剂(作为基质形式)的存在下筛选ffN微球的静电和摩擦荷电行为。IO 6783、月桂酸二乙醇酰胺和异亮氨酸似乎在玻璃容器中有效。然而，/>IO 6783、IO 6786和/>17R4似乎在塑料容器中有效。GranuCharge测量提供了含有基质形式的添加剂的微球的电荷密度(图26A至图26C)。图26A至图26C中示出了含有作为基质形式的添加剂的ffN微球。添加剂的抗静电特性通过对容器的粘附性来评估并通过GranuCharge来测量。图26A示出了第一组添加剂(ffN+25％T对照、+1％/>IO 6783、+1％/>IO 6786、+1.5％Tris.HCl、+2％异亮氨酸)的视觉效果。图26B示出了第二组添加剂(第二ffN+20％T对照、+0.5％LDA、+1％/>17R4、+1.5％/>VA64、+2％Protect)的视觉效果。图26C展示了图26A和图26B中测试的各种添加剂的电荷密度。
来自含有IO 6783和异亮氨酸的微球的低电荷密度确证在玻璃容器内的行为。
实施例11-将添加剂掺入到微球的包衣上以缓解静电。
水不溶性添加剂，如硬脂酸镁，可用作微球表面上的包衣，因为在微球的喷涂过程中通常使用有机溶剂。图27A至图27E展示，通过GranuCharge测量，L100和硬脂酸镁包衣降低微球的电荷密度。如基质形式所表现的，由于包衣中存在添加剂，包被的微球在玻璃和塑料容器上的粘附大大减少。可通过包衣实现微球(核：海藻糖和染料)的干混。然而，在再水合后，硬脂酸镁由于其疏水性可能是一个挑战。如果此类添加剂可以通过离心或滤膜原位分离，则硬脂酸镁可以是用于微球的有吸引力的抗静电添加剂。
基于ffN、测序和ExAmp的相容性筛选，选择IO 6783、/>VA64、IR和PEG作为替代性的水溶性包衣材料。图28A至图28F展示了用/>VA64、/>IO 6783和PEG以不同包衣水平包被的荧光素(FSCN)、DNA重组酶/BSA和ffN微球的SEM图像。可以观察到包封冻干微球的包衣的存在。图28A和图28B中示出了用KollidonVA64和/>IO 6783和PEG(#6)包被的800μm FSCN Wurster-Spray 20％的多个(图28A)和单个(图28B)微球的图像。图28C和图28D中示出了用Kollidon VA64和/>IO 6783和PEG(#8)包被的Rec/BSA 15％的低温离子研磨SEM的多个(图28C)和单个(图28D)微球的图像。图28E和图28F中示出了用Kollidon VA64和/>IO 6783和PEG(#11)包被的ffN 10％的低温离子研磨SEM的多个(图28E)和单个(图28F)微球的图像。
与未包被的对照微球相比，评估包被微球的静电和摩擦荷电行为(图29A至图29B)。虽然未包被的对照微球在容器粘附实验和GranuCharge测量中表现出高摩擦荷电，但是包衣的存在似乎会降低微球的电荷密度。具体而言，IO 6783的存在减少包被微球在玻璃容器上的粘附。然而，含有/>Protect的包衣似乎表现出通过GranuCharge测量的较低摩擦荷电。
将相同的包衣制剂(A：VA64对比C：/>Protect)施加于DNA重组酶/BSA微球上。在这些微球的包衣过程中研究了不同的包衣水平(图30A至图30B)。7.5％的包衣水平(通过包衣增加重量)没有显著改善微球在玻璃和塑料容器上的粘附。然而，在15％的较高包衣水平下，包被微球在塑料容器上的粘附大大减少。这一点通过GranuCharge测量的较低电荷密度Δq值得以证明，指示摩擦荷电降低。值得注意的是，/>Protect包衣似乎在玻璃容器上更有效，同时两种包衣材料(/>VA64和/>Protect)当它们含有/>IO 6783时降低包被微球在塑料容器上的粘附。
图31A至图31F中示出了本文所述的组合物，包括ffN微球、干燥基质中的5％VA64、干燥基质中的5％/>17R4、干燥基质中的5％/>6783、干燥基质中的10％/>Protect和干燥基质中的7.5％异亮氨酸在不同水分和时间条件下的稳定性。
图32A至图32F中示出了通过动态蒸汽吸附测量微球对相对湿度的耐受性的结果。基质中的异亮氨酸增加ffN微球的湿度耐受性。图32A展示了图32A中示出的ffN对照(18％T，2％ HCD)的结果，图32B中示出了2％Protect基质(10％干燥)的结果，图32C中示出了+1％/>IO 6783基质(5％干燥)的结果，图32D中示出了1％/>VA64基质(5％干燥)的结果，图32E中示出了+1.5％ Trizma基质(7.5％干燥)的结果，并且图32F中示出了+1.5％异亮氨酸基质(7.5％干燥)的结果。
图33A至图33D中示出了Protect和/>VA64包衣的结果，该包衣提供了改善的Rec/BSA MS防潮性。包衣使Rec/BSA微球的水分吸收最小化(图34A至图34B)。使用两种不同的包衣材料对Rec/BSA微球进行测试：/>VA64(#8)和Protect(#9)。通过包衣水平或在微球表面上施加的包衣重量来调节包衣厚度。在这种情况下，展示了7.5％和15％的包衣水平，这通过喷到微球上的包衣材料的量来控制。具体而言，就防潮而言，/>Protect包衣比/>VA64表现更佳。这些是意想不到的发现。具有15％包衣水平的微球展示出优于未包衣对照的改善。具体而言，它们显示出高10％的湿度耐受性(通过动态蒸汽吸附DVS测定)，在不同湿度水平下更慢的水分吸收，以及具有包衣的微球更小的收缩和熔化。含有/>Protect的7.5％和15％包衣水平的微球比/>VA64表现更佳。
基于本公开的发现，发现了许多意想不到的结果。例如，鉴定了与抗ExAmp活性相容的添加剂。第二，鉴定了与ffN稳定性相容的添加剂。第三，鉴定了与测序相容的添加剂。第四，鉴定了以干燥形式作为冻干微球(基质形式)展示出抗静电特性(最小化摩擦荷电)的添加剂。第五，鉴定了在包被微球中(作为包衣制剂的赋形剂的共混物)展示出抗静电特性(最小化摩擦荷电)的添加剂。
实施例12-壳添加剂和核添加剂的讨论。
发现各种壳添加剂会改善本文所述组合物的壳和核两者的稳定性。
水溶性聚合物，诸如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙烯醇已用于药物片剂的薄膜包衣。根据本公开，使用这些材料是由于它们的商业可用性。延时释放可以HPMC或Methocel包衣例示。
阳离子和阴离子带电聚合物由于它们的肠溶性或肠溶性保护而用作药物包衣的薄膜包衣。阳离子带电聚合物示例为氨基二甲基或二乙基甲基丙烯酸酯共聚物，这些在商业上称为E和/>Smartseal30D。阴离子带电聚合物示例为甲基丙烯酸共聚物或/>S/L，由此L100-55、L100和S100分别在pH 5.5、7.0和8.0下用于触发释放。另一种阴离子聚合物是纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素(Akucel)、邻苯二甲酸乙酸纤维素(Aquacoat CPD)、乙酸丁酸纤维素(Eastman CAB)。根据本公开，使用这些带电聚合物是由于它们的商业可用性。
水不溶性聚合物通常设计成提供药物的持续释放或延长释放。作为包衣材料，这些聚合物可以与水溶性聚合物诸如PEG或PVP共混，由此后者形成孔(致孔剂)以使得药物能够从核中缓慢扩散。这些水不溶性聚合物示例为乙基纤维素(Ethocel)、乙酸纤维素(Opadry CA)、氨溶甲基丙烯酸酯共聚物(RS100/RL100)和聚乙酸乙烯酯(SR)。根据本公开，使用这些聚合物是由于它们的商业可用性。
总之，用于控制释放的材料可以包括例如用于立即释放的材料，诸如Opadry AMB(II)、Opadry II(TF)、AquaPolish、淀粉1500、Methocel E3、E5、VA64、Protect/IR和Soluplus。用于控制释放的其他材料可包括持续释放材料，诸如RL PO、/>RS PO、Methocel E15、K4M、/>SR(30D)、Surelease、Ethocel/Klucel、Methocel E15、K4M、Aquacoat、Opadry CA。用于控制释放的其他材料可以包括延迟释放材料，诸如/>MAE-100、/>L100、/>S100、Sureteric、HPMC乙酸琥珀酸酯或CMC。
典型地，用于防潮薄膜包衣的聚合物表现出低透水性，水不溶性聚合物常常表现出这种低透水性。然而，也研究了水溶性聚合物诸如VA64、/>Protect、L100/S100的水分吸收。常常高的包衣厚度/水平(≥20％)或添加疏水性/水不溶性添加剂(诸如硬脂酸)有助于减少水分吸收。
可以使用的材料还包括下表3中描述的那些。基于它们的化学和物理特性对这些材料进行了综述。基于商业产品规格和化学特性估计它们对于防潮和静电缓解的潜在功能。
实施例13-核-壳形式：可溶于喷雾溶剂和再水合缓冲液中的赋形剂。
溶解度筛选的概念示于图35中。
图36中示出了可溶于喷涂溶液(15％水/溶剂)和缓冲液中的VA64、/>的结果。
表4中描述了聚合物溶解度和pH筛选结果。优选聚合物，诸如IR、Protect、/>VA64、Methocel和Metolose是由于它们在水溶液中的溶解度。
表4.被选择使冻干微球的水分吸收最小化的聚合物的溶解度筛选。可溶性聚合物 的重量％及其对溶液pH的影响(有前景的添加剂)。
对于包衣应用，不溶于有机溶剂(例如，IPA)的聚合物可以配制为在水/醇混合物中的固体分散体。例如，IR和Methocel不溶于溶剂中并且使用一部分水，其参数描述于下表5中。
将IPA添加到预溶解的中保持2.5％聚合物悬浮(25％水/IPA)。降低含水率导致沉淀。将IPA添加到预溶解的HPMC中保持1.4％HPMC在溶液中(14％水)。发现用乙醇代替IPA(并去除丙酮)会改善制剂以保持聚合物在稳定的固体分散体中，该固体分散体被认为对于包被过程是可喷雾的。
表5. IR和Methocel与含水率。/>
除外，测试的许多聚合物在1％时没有显著降低IMX的pH。/>V64和K30以10％w/v溶于水溶液和IPA两者中，这适于相关喷涂方法。测试的其他聚合物不溶于IPA；水/溶剂混合物可能是有益的，由此可以使用大于15％v/v的水。大多数聚合物降低IMX的pH，由此/>L100更有效而HPMC不太有效(这是优选的)(参见下表6)。
表6.聚合物在掺入缓冲液(IMX pH 9.9)中的溶解度及其对溶液pH的影响。
在本文所述的聚合物的存在下，ffC的3'OH和二磷酸水平相当(如图38、图39、图40A至图40C、图41A至图41B、图42A至图42B和图43A至图43D中所示)。
基于测序相容性的包衣材料筛选结果示于表7中。
表7.包衣材料筛选结果
图45A至图45B和图46A至图46C中示出了本文所述的针对DNA重组酶活性和聚类性能(cBOT)的聚合物筛选结果。所测试的ffN的质量基本上不受喷涂工艺影响：峰面积(图45A)和3'OH含量(图45B)与对照相当，并且没有检测到二磷酸盐。图46A至图46C显示经证实壳包封会改善防潮并缓解静电(图46A至图46C)。
图41A至图41B和图42A至图42B中示出了分级后在如本文所述的聚合物的存在下ExAmp的相当的DNA重组酶和DNA结合蛋白活性。
表8中示出了基于它们的ExAmp和聚类能力的聚合物包衣的汇总。
表8.基于ExAmp和聚类相容性的聚合物和静电缓解添加剂的汇总。
实施例14-微囊包封对SBS试剂稳定性的改进。
图43A至图43D中示出了改善SBS试剂稳定性的微囊包封。减少静电和增加防潮的制剂经由筛选管道而缩小选择范围。
表9示出了本文所述组合物的材料汇总。
使用ffN和DNA重组酶/BSA的微球(～20％w/v)，其中目标包衣水平引起10％-15％的增重。所测试的包衣制剂的干燥内容物：制剂A：PEG(增塑剂)、VA64、/>IO6783；制剂B：PEG、/>VA64；制剂C：PEG、/>Protect、/>IO 6783；以及制剂D：PEG、/>Protect。包封的微球的物理表征几乎完成，分级和活性测试示于图44中。
ffN的质量基本上不受喷涂工艺影响：峰面积和3'OH水平与对照相当，并且没有检测到二磷酸盐(参见图45A至图45B)。
壳包封改善防潮并缓解静电(参见图46A至图46C)。如图46A至图46C所示和所述，基质包封可限于静电缓解，而核壳可以解决这两者。
关于基于pH触发因素(例如，pH 5、pH 6、pH 7、pH 8)的依次释放而言，三层包被的球(例如，在壳1中用S100(荧光素)，在壳2中用/>L100(淡蓝色)，以及在壳3中用/>L100-55(罗丹明))提供了改善的结果，如图49A至图49C所示。
虽然本文可能已经详细描绘和描述了优选的具体实施，但是对于相关领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的实质的情况下可以做出各种修改、添加、替换等，因此这些修改、添加、替换等被认为是在如以下权利要求书中所限定的本发明的范围内。

Claims (101)

1.一种组合物，所述组合物包含：
围绕核的壳，其中所述核包含一种或多种冻干微球。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述壳包含以下项中的一种或多种：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、第一聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述壳包含壳添加剂。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述壳添加剂包含静电缓解材料、防潮材料或它们的组合。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述壳添加剂是以不超过所述壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述壳添加剂是以不超过所述壳的90％w/w浓度的量存在的防潮材料。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述壳添加剂以所述壳的至少10％w/w浓度的量存在。
8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述壳添加剂的量介于所述壳的约10％w/w与约90％w/w之间。
9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。
10.根据权利要求3所述的组合物，其中所述壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的组合物，其中所述硬脂酸衍生物或油酸衍生物是硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中所述聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中所述钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的组合物，其中所述铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的组合物，其中所述咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。
19.根据权利要求3至18中任一项所述的组合物，其中所述壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述核包含选自以下项中的一种或多种试剂：一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸、荧光团或它们的任何组合。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述试剂是聚合酶。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述核中的所述试剂的体积介于约0.1μL与约50μL之间。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述壳包含试剂。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述核还包含一种或多种附加试剂，其中所述附加试剂选自一种或多种糖、一种或多种氨基酸、一种或多种聚合物、一种或多种介孔二氧化硅、一种或多种季胺以及它们的任何组合。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，当所述附加试剂包含一种或多种糖时，所述糖选自海藻糖、甘露糖醇、环糊精、葡聚糖、蔗糖或它们的任何组合。
26.根据权利要求24所述的组合物，其中，当所述附加试剂包含一种或多种具有疏水侧链的氨基酸时。
27.根据权利要求24所述的组合物，其中，当所述附加试剂包含一种或多种聚合物时，所述聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的组合。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述核包含核添加剂。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核添加剂包含静电缓解材料。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述核添加剂是以不超过所述核的25％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。
31.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核添加剂以所述核的至少0.5％w/w浓度的量存在。
32.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核添加剂的量介于所述核的约2％w/w与约10％w/w之间。
33.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。
34.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、导电促进剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚醚化合物或它们的任何组合。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的组合物，其中所述聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的组合物，其中所述铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的组合物，其中所述咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于进行多个共测定反应。
41.根据权利要求20至40中任一项所述的组合物，其中所述壳包含多于一种冻干微球，并且其中所述多于一种冻干微球中的所述试剂是不同的。
42.一种方法，所述方法包括：
提供一种或多种冻干微球；以及
在有效包封所述一种或多种冻干微球的条件下，用壳包被所述一种或多种冻干微球。
43.根据权利要求42所述的方法，所述方法还包括：
在用外层有效包围所述包封的微球的条件下，用所述外层覆盖所述壳。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述覆盖进行足以提供具有限定厚度的所述外层的时间段。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述壳和所述外层包含以下项中的一种或多种：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-
PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述壳包含壳添加剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述壳添加剂包含静电缓解材料、防潮材料或它们的组合。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述壳添加剂是以不超过所述壳的40％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述壳添加剂是以不超过所述壳的90％w/w浓度的量存在的防潮材料。
50.根据权利要求46所述的方法，其中所述壳添加剂以所述壳的至少10％w/w浓度的量存在。
51.根据权利要求46所述的方法，其中所述壳添加剂的量介于所述壳的约10％w/w与约90％w/w之间。
52.根据权利要求46所述的方法，其中所述壳添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述壳添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、铵盐、导电促进剂、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、月桂酸衍生物、聚醚化合物、氨基酸、醋酸生育酚酯、癸二酸哌啶酯、钠盐、缓冲剂、螯合剂、咪唑鎓盐、聚苯胺或它们的任何组合。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述硬脂酸衍生物或油酸衍生物选自硬脂酸镁、硬脂酸三甘油酯、60、/>60、三油酸甘油酯、/>80或它们的任何组合。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述氨基酸选自以下项中的一种或多种：亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或它们的任何组合。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述钠盐选自以下项中的一种或多种：氯化钠、亚硫酸氢钠、柠檬酸钠或它们的任何组合。
59.根据权利要求53至58中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。
60.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。
61.根据权利要求53至60中任一项所述的方法，其中所述咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。
62.根据权利要求53至61中任一项所述的方法，其中所述壳添加剂包含铵盐、共聚物、聚乙烯醇接枝聚乙二醇共聚物、聚乙烯醇(PVA)或它们的任何组合。
63.根据权利要求42至62中任一项所述的方法，其中所述壳包围核，所述核包含选自以下项中的一种或多种试剂：一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸、荧光团或它们的任何组合。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述试剂是聚合酶。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述核中的所述试剂的体积介于约0.1μL与约50μL之间。
66.根据权利要求42至65中任一项所述的方法，其中所述壳包含试剂。
67.根据权利要求42至66中任一项所述的方法，其中所述包封的微球的直径介于约100μm与1000μm之间。
68.根据权利要求42至67中任一项所述的方法，其中所述核还包含一种或多种附加试剂，其中所述附加试剂包含一种或多种糖、一种或多种氨基酸、一种或多种聚合物、一种或多种介孔二氧化硅、一种或多种季胺或它们的任何组合。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，当所述附加试剂包含一种或多种糖时，所述糖选自海藻糖、甘露糖醇、环糊精、葡聚糖、蔗糖或它们的任何组合。
70.根据权利要求68所述的方法，其中，当所述附加试剂包含一种或多种具有疏水侧链的氨基酸时。
71.根据权利要求68所述的方法，其中，当所述附加试剂包含聚合物时，所述聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或它们的组合。
72.根据权利要求42至71中任一项所述的方法，其中所述核包含核添加剂。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述核添加剂包含静电缓解材料。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述核添加剂是以不超过所述核的25％w/w浓度的量存在的静电缓解材料。
75.根据权利要求72所述的方法，其中所述核添加剂以所述核的至少0.5％w/w浓度的量存在。
76.根据权利要求72所述的方法，其中所述核添加剂的量介于所述核的约2％w/w与约10％w/w之间。
77.根据权利要求72所述的方法，其中所述核添加剂是水不溶性添加剂、水溶性添加剂、肠溶性添加剂或它们的任何组合。
78.根据权利要求72所述的方法，其中所述核添加剂包含以下项中的一种或多种：聚合物、共聚物、嵌段共聚物、第二聚乙烯醇(PVA)、导电促进剂、铵盐、咪唑鎓盐、聚醚化合物或它们的任何组合。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述聚醚化合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、衍生自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的嵌段共聚物或它们的任何组合。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中所述聚合物是中性的、阳离子的或阴离子的。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂是Trizma、Tris.HCl或它们的组合。
82.根据权利要求78至81中任一项所述的方法，其中所述铵盐选自四烷基氯化铵、三(羟乙基)烷基氯化铵或它们的组合。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的方法，其中所述咪唑鎓盐选自1-乙基-3-甲基-咪唑鎓盐或聚季铵或(乙烯基吡咯烷酮和季铵化乙烯基咪唑的共聚物)或它们的组合。
84.根据权利要求42至83中任一项所述的方法，所述方法还包括：
使所述试剂与样品接触以进行多个共测定反应。
85.根据权利要求42至84中任一项所述的方法，其中所述壳包含多于一种冻干微球，并且其中所述多于一种冻干微球中的所述试剂是不同的。
86.一种系统，所述系统包括：
一种或多种根据权利要求1至41中任一项所述的组合物，以及一种或多种冻干团块，其中所述一种或多种组合物和所述一种或多种冻干团块在有效形成再水合系统的条件下组合。
87.根据权利要求86所述的系统，所述系统还包括：
位于所述一种或多种包封的微球和所述一种或多种冻干团块之间的一个或多个壳层。
88.根据权利要求87所述的系统，其中所述壳层包含选自以下的材料：角叉菜胶、虫胶、海藻糖、石蜡、明胶、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、孚拉林、除氧剂、藻酸盐、壳聚糖、淀粉膜、苯并氧杂硼戊环-聚(乙烯醇)(苯并氧杂硼戊环-PVA)、果胶、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇或它们的任何组合。
89.一种控制一种或多种包封的微球的释放的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1至41中任一项所述的组合物，以及
在有效控制一种或多种冻干微球从所述组合物中释放的第一条件下，将所述组合物与再水合溶液混合。
90.根据权利要求89所述的方法，所述方法还包括：
将所述第一条件改变为第二条件。
91.根据权利要求90所述的方法，其中改变所述第一条件包括以下项中的一种或多种：改变温度、改变暴露时间、改变再水合溶液pH或改变包封的微球在所述再水合溶液中的位置。
92.根据权利要求90或权利要求91所述的方法，其中在所述第一条件和/或所述第二条件下的温度介于约10℃与约90℃之间。
93.根据权利要求89至92中任一项所述的方法，其中所述再水合溶液的pH介于约6.0与约10.0之间。
94.根据权利要求89至93中任一项所述的方法，其中所述第一条件有效释放第一冻干微球。
95.根据权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述第二条件有效释放第二冻干微球，其中所述第二冻干微球的含量不同于所述第一冻干微球的含量。
96.根据权利要求90至95中任一项所述的方法，其中改变所述第一条件允许一种或多种冻干微球的依次释放。
97.根据权利要求90至96中任一项所述的方法，其中改变所述第一条件有效释放两种或更多种冻干微球，其中所述两种或更多种冻干微球包含不同的试剂。
98.根据权利要求89至97中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供根据权利要求1至41中任一项所述的附加组合物，以及在有效控制一种或多种冻干微球从所述附加组合物中释放的第三条件下，将所述附加组合物混合。
99.根据权利要求89至98中任一项所述的方法，所述方法还包括：
使一种或多种试剂与样品接触以进行多个共测定反应。
100.根据权利要求89至99中任一项所述的方法，其中所述壳包含多于一种冻干微球，并且其中所述多于一种冻干微球中的所述试剂是不同的。
101.根据权利要求89至100中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供一种或多种冻干团块，以及
使所述一种或多种冻干团块再水合。
CN202280027678.1A 2021-04-13 2022-04-13 制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法 Pending CN117157414A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163174325P 2021-04-13 2021-04-13
US63/174,325 2021-04-13
PCT/US2022/024549 WO2022221368A1 (en) 2021-04-13 2022-04-13 Compositions, systems, and methods of making and using encapsulated lyophilised microspheres

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117157414A true CN117157414A (zh) 2023-12-01

Family

ID=83603053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280027678.1A Pending CN117157414A (zh) 2021-04-13 2022-04-13 制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220331770A1 (zh)
EP (1) EP4323548A1 (zh)
JP (1) JP2024513970A (zh)
KR (1) KR20230169127A (zh)
CN (1) CN117157414A (zh)
AU (1) AU2022259587A1 (zh)
BR (1) BR112023020963A2 (zh)
CA (1) CA3212595A1 (zh)
IL (1) IL305884A (zh)
TW (1) TW202305144A (zh)
WO (1) WO2022221368A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230193147A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-22 Illumina Cambridge Limited Wax-microsphere matrix compositions and methods of making and using the same
CN117159480B (zh) * 2023-11-01 2024-03-01 江西赛基生物技术有限公司 一种重组人IFN-γ蛋白冻干小球及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843347A (en) * 1993-03-23 1998-12-01 Laboratoire L. Lafon Extrusion and freeze-drying method for preparing particles containing an active ingredient
US6328967B1 (en) * 1998-03-12 2001-12-11 Allergenics, Inc. Delivery system to modulate immune response
US20070259348A1 (en) * 2005-05-03 2007-11-08 Handylab, Inc. Lyophilized pellets
BE1019142A3 (fr) * 2011-01-21 2012-03-06 Vesale Pharma S A Substance probiotique microencapsulee.

Also Published As

Publication number Publication date
EP4323548A1 (en) 2024-02-21
WO2022221368A1 (en) 2022-10-20
KR20230169127A (ko) 2023-12-15
AU2022259587A1 (en) 2023-09-07
US20220331770A1 (en) 2022-10-20
CA3212595A1 (en) 2022-10-20
BR112023020963A2 (pt) 2023-12-12
IL305884A (en) 2023-11-01
TW202305144A (zh) 2023-02-01
JP2024513970A (ja) 2024-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN117157414A (zh) 制备和使用包封的冻干微球的组合物、系统和方法
US11649485B2 (en) Generating capture probes for spatial analysis
Frankel et al. Polyamine/nucleotide coacervates provide strong compartmentalization of Mg2+, nucleotides, and RNA
US20220033888A1 (en) Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) Generating capture probes for spatial analysis
CN114127309A (zh) 使用空间阵列进行单细胞测序的方法
CN110249050B (zh) 无标签编码化合物文库
ES2923458T3 (es) Una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra
Köse Nucleotide incorporated magnetic microparticles for isolation of DNA
BR112019012414A2 (pt) Carregamento de moléculas em poços de amostra para análise
Dinarvand et al. Preparation, characterization and in vitro drug release of isosorbide dinitrate microspheres
US20230348967A1 (en) Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres
US20230086755A1 (en) Reagent compositions, methods, cartridges, and systems
US20230193147A1 (en) Wax-microsphere matrix compositions and methods of making and using the same
Guerrero et al. Preparation of crosslinked alginate-cellulose derivative microparticles for protein delivery
US20240132956A1 (en) Nucleic acid sequencing components including a glycolipid bi-layer
US20230399692A1 (en) Nucleic acid delivery scaffolds
WO2022272260A1 (en) Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents
WO2023060527A1 (zh) 皂苷类化合物在核酸测序中的用途
CHOWDHURY et al. EFFECT OF DIFFERENT POLYMERS AND STORAGE TEMPERATURE ON DRUG RELEASE FROM SALBUTAMOL SULPHATE LOADED MICROSPHERES PREPARED BY USING W/O EMULSION SOLVENT EVAPORATION TECHNIQUE

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination