CN117157310A - 针对高致病性冠状病毒的溶细胞性t细胞免疫疗法 - Google Patents

针对高致病性冠状病毒的溶细胞性t细胞免疫疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN117157310A
CN117157310A CN202280009729.8A CN202280009729A CN117157310A CN 117157310 A CN117157310 A CN 117157310A CN 202280009729 A CN202280009729 A CN 202280009729A CN 117157310 A CN117157310 A CN 117157310A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coronavirus
cov
antigen
sars
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280009729.8A
Other languages
English (en)
Inventor
拉斐尔·保罗·维西迪
查尔斯·J·皮文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cha ErsiJPiwen
La FeierBaoluoWeixidi
Original Assignee
Cha ErsiJPiwen
La FeierBaoluoWeixidi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cha ErsiJPiwen, La FeierBaoluoWeixidi filed Critical Cha ErsiJPiwen
Publication of CN117157310A publication Critical patent/CN117157310A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

诱导对致病性和普通感冒冠状病毒的溶细胞性T淋巴细胞(CD8+)应答(即MHC I类限制性T细胞应答)的组合物和方法，所述组合物和方法包括由多离子乳头瘤病毒病毒样颗粒(VLP)组成的抗原递送平台，具有连续的带负电荷的氨基酸，两侧是插入乳头瘤病毒L1蛋白的HI环中的半胱氨酸残基。与所述VLP配对的抗原包括来源于致病性冠状病毒以及通常在人类群体中传播的遗传上最密切相关的人冠状病毒的融合肽/蛋白质，其N末端或C末端氨基酸由之前和/或之后是半胱氨酸残基的、连续的、带正电荷的氨基酸组成，和C末端蛋白水解加工序列(AAYY)，以增强MHC I类表位的呈递。

Description

针对高致病性冠状病毒的溶细胞性T细胞免疫疗法
技术领域
本发明涉及用于诱导对冠状病毒的细胞免疫应答的组合物和方法。
背景技术
冠状病毒(CoV)是有包膜病毒，具有单链正义RNA基因组，大小为大约26-32千碱基。与所有冠状病毒一样，SARS-CoV-2在其基因组的组织和表达方面具有共同特征；通过开放阅读框(ORF)1a/b编码的非结构蛋白，之后是主要结构蛋白刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)(Chen等人,2020)。S糖蛋白介导与宿主受体的附接。S糖蛋白通过宿主蛋白酶被切割成两种单独的多肽，命名为S1和S2。S1构成S蛋白的受体结合结构域，并且是中和抗体的主要靶标，而S2形成刺突分子的茎。M蛋白是最丰富的病毒蛋白，并且参与核心病毒颗粒的形成。N蛋白是唯一核衣壳蛋白，并且形成核心颗粒的与病毒基因组相互作用的部分。基于种系发育，CoV分为四个属α-CoV、β-CoV、γ-CoV和δ-CoV。在β-CoV属内，已识别出四个谱系(A、B、C和D)。
冠状病毒引起动物的各种各样的疾病。在人类中，CoV感染主要涉及上呼吸道和胃肠道，并且主要引起轻微的自限性疾病，诸如普通感冒。这些人冠状病毒中的两种是α-冠状病毒HCoV-229E和HCoV-NL63，而另外两种是β-冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU1。HCoV-229E和HCoV-OC43在近50年前被分离出来，而HCoV-NL63和HCoV-HKU1仅最近被识别出。这些病毒是人类群体中特有的，每年引起15-30％的呼吸道感染。血清阳性率研究表明，对这些病毒的暴露在人类中几乎是普遍的(Severance et al.,2008)。其他人冠状病毒的存在似乎是合理的，但尚不清楚。第一种高致病性人冠状病毒是β冠状病毒SARS-CoV。2012年，中东出现了第二种新型高致病性人CoV。这种病毒名为中东呼吸综合征-CoV(MERS-CoV)，也是一种β-冠状病毒，并且被发现是沙特阿拉伯和中东其他国家中高致病性呼吸道感染的致病物。第三种并且最近的高致病性人冠状病毒SARS-CoV-2，也是一种β-冠状病毒，并且目前导致了持续的大流行。据信，高致病性冠状病毒在人兽共患储存宿主中传播，主要是在蝙蝠物种中，偶尔可能经由中间宿主物种扩散到易感人类群体中。在过去17年中发生3次跨物种传播事件引发了未来可能出现相似病毒的可能。高致病性冠状病毒的明确特征是它们能够导致受感染的个体的严重发病率和死亡率，粗略估计SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和MERS的分别为2.3％、9.5％和34％(Petrosillo等人,2020)。普遍传播的人冠状病毒很少导致严重的发病率或死亡率。
致病性冠状病毒的治疗主要是支持性的。尽管进行了持续的努力，但仍然没有高活性的抗病毒药物。
发明内容
本发明涉及由高致病性冠状病毒SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2及其他相关致病性冠状病毒引起的疾病的治疗和预防。
本发明治疗冠状病毒的方法是利用身体的天然免疫防御的免疫疗法。为了清除现有的病毒感染，免疫防御的范例是MHC 1类限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞，它具有破坏和清除病毒感染的细胞的能力。然而，诱导针对感染性病毒的T细胞是否可以在宿主被击垮之前清除感染是有问题的，因为对免疫的最大应答通常需要数周，可能数月才实现。因此，就高致病性冠状病毒而言，需要一种策略以快速调动有效的抗病毒溶细胞性T细胞应答以控制或清除急性感染。所提出的方法是刺激交叉反应记忆T细胞。记忆T细胞比幼稚细胞对刺激的应答性更强，可以非常快速地进行克隆扩增。最近的研究确定了，交叉反应性T细胞识别2019年病毒出现之前获得的血液样品中的SARS-CoV-2抗原(Grifoni等人,2020；Weiskopf等人,2020；Braun等人,2020；Le等人,2020)。由于普通感冒冠状病毒OC43和HKU1与SARS-CoV-2具有氨基酸相似性，因此这些交叉反应性T细胞可能通过先前感染普通感冒人冠状病毒来诱导。事实上，最近的研究绘制了交叉反应性T细胞所识别的表位，证明了预先存在的记忆CD4+T细胞与SARS-CoV-2和普通感冒冠状病毒存在交叉反应(Mateus等人,2020)。针对交叉反应性T细胞的详细分子和结构基础了解得不多，但当前的免疫识别的范例预测在SARS-CoV-2和普通感冒冠状病毒共有的MHC I类限制性T细胞表位(长度为8-13个氨基酸的连续序列)内对高度保守的氨基酸序列的需要。SARS-CoV-2氨基酸序列与已知常见人冠状病毒的同源区域的比对显示，在推定的T细胞表位中，仅显示有限的高氨基酸同一性区域。然而，交叉反应性需要来自异源病毒的表位之间具有相当的氨基酸同一性的观点是基于免疫识别的克隆选择理论，所述理论假设个别淋巴细胞对单一抗原具有特异性，一种克隆对一种特异性，并且需要交叉反应表位之间的接近的氨基酸同一性。若干科学家对此理论提出了质疑，并提出了T细胞免疫识别理论，所述理论假设T细胞识别多种特异性，一种克隆对数百万种特异性(Mason,1998；Wilson等人,2004；Kersh和Allen,1996；Sewell,2012)。所述理论基于数学考虑，即人体中仅有1012个T细胞并且在人幼稚T细胞池中有<108个不同的T细胞受体，而可以结合MHC分子的20种氨基酸的可能肽的理论极限是非常大的(>1015)并且在考虑含有翻译后修饰的肽时，可能更大。这种T细胞交叉反应性的理论带来了治疗和预防高致病性冠状病毒的新方法。同时诱导T细胞对高致病性冠状病毒和对一种或多种遗传相关的常见人冠状病毒(大多数个体先前暴露过，并且因此具有记忆T细胞)的应答，将生成两类细胞免疫，即治疗性和预防性。所述策略将召回交叉反应的部分或完全保护性记忆T细胞，并诱导对高致病性冠状病毒具有特异性的幼稚T细胞。这两类T细胞应答的双重作用将是治疗性的(通过快速控制和消灭宿主中的急性高致病性冠状病毒感染、预防严重的症状和死亡)同时是预防性的(通过提供针对未来高致病性冠状病毒感染的长期保护)。
本发明进一步涉及诱导对致病性和普通感冒冠状病毒的溶细胞T淋巴细胞(CD8+)应答(即MHC I类限制性T细胞应答)的组合物和方法。
本发明涉及由多离子乳头瘤病毒病毒样颗粒(VLP)组成的抗原的递送平台，其中两侧为半胱氨酸残基的、连续的、带负电荷的氨基酸被插入在乳头瘤病毒L1蛋白的HI环中。
本发明进一步涉及与VLP配对的抗原，其包含具有N末端或C末端氨基酸的融合肽/蛋白，由之前和/或之后是半胱氨酸残基的、连续的、带正电荷的氨基酸组成，下文命名为TAG。本发明进一步涉及具有C末端蛋白水解加工序列(AAYY)以增强MHC I类表位的呈递的TAG。
在具体实施方案中，本发明涉及来源于致病性冠状病毒和通常在人类群体中传播的遗传上最密切相关的人冠状病毒的抗原。本发明进一步涉及基于病毒感染的细胞中病毒蛋白表达的丰度、蛋白中预测的MHC I类限制性T细胞表位的密度和位置以及确定针对特定病毒蛋白的溶细胞性T细胞的实证研究，针对溶细胞性T细胞应答的诱导选择抗原。本发明进一步涉及选择以下抗原，所述抗原包含两个单独且不同类别的靶标，所述靶标分别来源于病毒结构蛋白和病毒非结构蛋白。由于病毒感染的细胞中表达的第一种蛋白是非结构病毒蛋白，因此靶向这些蛋白在病毒感染的最早阶段提供有效的细胞免疫应答。本发明进一步涉及基于上述标准和额外标准选择常见非致病性人冠状病毒的抗原，额外标准是抗原涵盖与致病性冠状病毒的对应病毒蛋白共享至少40％同一性的病毒蛋白区域。在VLP-抗原组合物的具体实施方案中，抗原是长度为25-30个氨基酸的短肽、长度为约45-55个氨基酸的延伸肽、长度为约110-140个氨基酸的短蛋白或靶抗原的全长氨基酸序列。
在一具体实施方案中，致病性冠状病毒是SARS-CoV-2，并且遗传相关的人冠状病毒是OC43和HKU1。在一具体实施方案中，SARS-CoV-2的抗原来源于以下病毒结构蛋白：膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、ORF3a、ORF7a和刺突(S)包膜蛋白的S2区，并且非结构蛋白的抗原来源于nsp6、nsp7和nsp12。在一具体实施方案中，OC43和HKU1的结构蛋白的抗原来源于M和N蛋白以及S蛋白的S2区，并且非结构蛋白的抗原来源于OC43以及来自相同病毒蛋白的HKU1相对于OC43的可变区的nsp3、nsp4、nsp6、nsp7和nsp12蛋白。
本发明还涉及制备与冠状病毒抗原配对的多离子乳头瘤病毒VLP的方法。本发明进一步涉及通过静脉内、肌肉内或真皮内途径递送VLP-抗原组合物的方法。在一具体实施方案中，VLP-抗原组合物鼻内或通过吸入递送，以刺激肺和鼻咽组织驻留记忆T细胞并生成细胞毒性T淋巴细胞，其优先运输至呼吸道中的部位。
附图说明
图1显示牛乳头瘤病毒(BPV)1型L1蛋白与密切相关的BPV分离株NY8385的L1蛋白的比对：HI环是aa344-357。
图2显示OC43和SARS-CoV-2的M蛋白的比对。
图3显示OC43和HKU1的M蛋白的比对。
图4A和4B显示OC43和SARS-CoV-2的N蛋白的抗原区的比对。
图5A、5B和5C显示OC43和HKU1的N蛋白的抗原区的比对。
图6A和6B显示在S2区内OC43和SARS-CoV-2的S蛋白的抗原区的比对。
图7显示在可变抗原区内HKU1和OC43的S蛋白的比对。
图8A、图8B和图8C显示OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp3蛋白的抗原区的比对。
图9A、图9B和图9C显示OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp4蛋白的抗原区的比对。
图10A和10B显示OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp6蛋白的抗原区的比对。
图11显示OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp7蛋白的抗原区的比对。
图12显示1型牛乳头瘤病毒衣壳蛋白L1的序列。
图13A显示OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp12蛋白的第一组抗原区的比对。
图13B显示OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp12蛋白的第二组抗原区的比对。
图13C显示了OC43的ORF1ab与SARS-CoV-2nsp12蛋白的第三组抗原区的比对。
具体实施方式
本发明提供涉及基因工程化的乳头瘤病毒L1病毒样颗粒(VLP)的组合物和方法，所述颗粒包含在L1蛋白的HI环中的带负电荷的氨基酸序列和半胱氨酸残基，下文称为多离子VLP。本发明还涉及来自任何乳头瘤病毒物种的L1蛋白，包括人、牛、马、鼠、绵羊、猪、鹿、犬、猫或兔。在一个实施方案中，L1乳头瘤病毒蛋白来自牛乳头瘤病毒1型(BPV1)(图12)。
在具体实施方案中，基因工程化的BPV1 L1蛋白的HI环包含4至10个连续的、带负电荷的氨基酸，其两侧为在N末端或C末端或两个末端的半胱氨酸残基。BPV1 L1的HI环在此处被定义为氨基酸位置344至357，跨度为14个氨基酸，并且顶端被定义为位置349处的脯氨酸(P)残基(图1)。本发明的VLP的带负电荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸或两者。在各种实施方案中，长度为5至12个氨基酸(4-10个连续的、带负电荷的氨基酸和一或两个侧接半胱氨酸残基)的氨基酸序列可以插入在HI环中，并且不替代或者替代一个或一个或多个天然氨基酸。在具体的示例性实施方案中，插入在HI环中的氨基酸序列的长度为9个残基，其包含8个带负电荷的氨基酸，谷氨酸、或天冬氨酸、或交替的天冬氨酸和谷氨酸，以及C末端或N末端半胱氨酸残基，并且替代牛乳头瘤病毒L1蛋白HI环的位置347-355处的9个天然氨基酸(表1，插入物1-4)。在其他具体的示例性实施方案中，插入在HI环中的氨基酸序列的长度为5、6、7、8、10或11个氨基酸，其分别包含4、5、6、7、9或10个谷氨酸和C末端半胱氨酸残基。相应的插入物分别替代牛乳头瘤病毒L1蛋白HI环的位置347-351、347-352、347-353、347-354、346-355或345-355处的同等数量的天然氨基酸(表1插入物5-10)。在一具体的示例性实施方案中，插入在HI环中的氨基酸序列的长度为9个残基，包含8个带负电荷的谷氨酸以及C末端和N末端半胱氨酸残基，并且替代牛乳头瘤病毒L1蛋白HI环的位置346-355处的10个天然氨基酸(表1，插入物11)。在其他各种实施方案中，带负电荷的氨基酸和半胱氨酸可以插入在HI环中并且替代比包含插入物的数量更少的天然氨基酸。在具体的示例性实施方案中，包含8个谷氨酸和C末端半胱氨酸残基的9氨基酸序列替代分别在牛乳头瘤病毒L1蛋白HI环的位置348-354、或348-352、或348-350处的7、5或3个天然氨基酸(表1，插入物12-14)。在其他各种实施方案中，带负电荷的氨基酸和半胱氨酸可以插入在HI环中并且替代比包含插入物的数量多至多2个天然氨基酸。在具体的示例性实施方案中，包含8个谷氨酸和C末端半胱氨酸残基的9氨基酸序列替代牛乳头瘤病毒L1蛋白HI环的位置346-356处的11个天然氨基酸(表1，插入物15)。在各种实施方案中，插入在HI环中的谷氨酸-半胱氨酸氨基酸序列可以替代环的推定顶端处的脯氨酸，或者可以插入在脯氨酸残基与紧邻的C末端亮氨酸残基之间，而不去除任何天然氨基酸。在一些实施方案中，替代脯氨酸或位于脯氨酸与亮氨酸残基之间的插入氨基酸可以在甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸(GSSG)接头氨基酸序列两侧。在具体的示例性实施方案中，插入在HI环中的氨基酸序列包含8个谷氨酸和C末端半胱氨酸残基，两侧有或没有GSSG氨基酸，并且替代位置349处的脯氨酸或位于牛乳头瘤病毒L1蛋白HI环的氨基酸位置349与350氨基酸之间(表1，插入物16-19)。
本发明进一步涉及连接至VLP的抗原，其包含具有N末端或C末端氨基酸的融合肽/蛋白，由之前和/或之后是半胱氨酸残基的4-10个连续的、带正电荷的氨基酸组成，下文命名为TAG。TAG通过VLP上的半胱氨酸残基与TAG中的半胱氨酸残基之间的静电相互作用和氧化还原反应的组合作用，使抗原附接至多离子乳头瘤病毒VLP。本发明进一步涉及具有C末端蛋白水解加工序列(AAYY)以增强MHC I类表位的呈递的TAG。当TAG附加至抗原的C末端时，蛋白水解加工序列(AAYY)被放置在肽/蛋白抗原的N末端。
在具体的示例性实施方案中，TAG包含带正电荷的氨基酸的组，精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)，并且序列的长度为8个氨基酸(表2，Tag-1、Tag-2、Tag-3)。在其他具体的示例性实施方案中，TAG包含重复基序RKHRKHRK，长度为8个氨基酸(表2，TAG-4)。在其他具体的示例性实施方案中，TAG包含4、5、6或7个连续的精氨酸，之后是半胱氨酸残基的氨基酸序列(表2，TAG-5、TAG-6、TAG-7和TAG-8)或者9或10个精氨酸，之后是半胱氨酸残基的氨基酸序列(表2，TAG-9和TAG-10)。在其他具体的示例性实施方案中，TAG由8个带正电荷的精氨酸组成，之前是半胱氨酸残基，或者在N末端和C末端两侧有半胱氨酸残基(表2，TAG-11和TAG-12)。
本发明进一步涉及多离子乳头瘤病毒VLP和具有TAG序列的靶抗原的组合物，以用于诱导溶细胞(MHC I类限制性)T细胞应答的目的。在具体的实施方案中，本发明涉及连接至多离子VLP的冠状病毒抗原，以用于诱导对普通感冒冠状病毒和致病性冠状病毒的溶细胞性T细胞应答的目的。
病毒的整个蛋白质组可以是T细胞应答的靶标。然而，结构蛋白是抗原特异性T细胞应答的特别有效的靶标，因为它们是受感染的细胞中表达最丰富的病毒蛋白，因此实现向MHC分子的有效呈递。对冠状病毒的细胞免疫应答的实证研究也支持结构蛋白作为细胞免疫应答的主要靶标的重要性(综述于Liu等人,2017中)。溶细胞性T细胞应答针对MHC I类限制性T细胞表位。这些表位的长度最常见为9个氨基酸，并且长度的范围可以是8-13个氨基酸。人和其他哺乳动物中的MHC I类等位基因的遗传异质性使得病毒蛋白内有许多可能的表位。为了涵盖所有可能的表位，抗原需要是靶蛋白的全长氨基酸序列或者一起包含整个氨基酸序列的抗原较短片段的集合。连接至多离子VLP的抗原片段的优选长度是经由替代抗原呈递途径诱导T细胞应答的表位呈递效率的经验函数。此外，制造考量可能影响抗原长度的优选选择。
针对诱导对SARS-CoV-2的细胞毒性T细胞应答的多离子乳头瘤病毒VLP物质组合物的优选实施方案包含来自膜(M)、核衣壳(N)、刺突(S)的S2区、ORF3a和ORF7a结构蛋白以及nsp6、nsp7和nsp12非结构蛋白。
M蛋白的长度为222个氨基酸，并且抗原区跨越aa6-221。N蛋白的长度为419个氨基酸。基于针对MHC I类限制性T细胞表位的实证研究和预测算法，抗原区为aa51-369。刺突(S)蛋白的长度为1270个氨基酸，并且包含两个区域，含有受体结合结构域(aa330-583)的S1(aa1-661)和S2(aa662-1270)。T细胞表位在S蛋白中广泛分布。S1区包含大部分病毒颗粒表面暴露的氨基酸，并且是体液免疫应答(包括中和抗体)的主要靶标。优选将所述区域排除在旨在诱导细胞免疫的疫苗之外，以避免非预期地诱导具有可能有害作用的抗体应答，诸如诱导介导抗体依赖性增强(ADE)的抗体。ORF3a的长度为275个氨基酸。实证研究支持选择ORF3a为T细胞应答的靶抗原。预测算法(MHC-NP：预测由MHC自然加工的肽，由SébastienGiguère、Alexandre Drouin、Alexandre Lacoste、Mario Marchand、Jacques Corbeil和Laviolette开发；http://tools.iedb.org/mhcnp/)显示与N末端相比，C末端对于5个代表性等位基因的推定MHC I类限制性表位的密度更高(67个跨越C末端171个氨基酸相对于20个跨越104个N末端氨基酸)。实证研究支持选择ORF7a(121个氨基酸的蛋白质)作为溶细胞性T细胞应答的靶标。SARS-CoV-2的ORF1ab是7096个氨基酸的多蛋白。多蛋白在病毒感染的细胞内被蛋白水解加工，产生多种非结构蛋白，它们在病毒生命周期中发挥不同的功能。这些蛋白质在病毒感染的细胞中以低丰度存在，并且因此不是细胞免疫反应的主要靶标，但最近的研究显示，可以在SARS-CoV-2感染的患者血液中以及还在从COVID19之前时期的一些健康血液供体的血液中检测到对若干nsp蛋白的溶细胞性T细胞应答(Grifoni等人,2020；Le等人,2020)。因为这些蛋白质首先在受感染的细胞中表达，所以它们是溶细胞性T细胞的有吸引力的靶标。快速杀伤这些病毒感染的细胞可以防止细胞产生感染性病毒。就抗原特异性T细胞的频率和应答受试者的百分比而言，CD8+T细胞应答的主要靶标是nsp6、nsp7和nsp12蛋白。
连接至多离子VLP的抗原的氨基酸长度的范围可以是从8-14个氨基酸的确定表位或更长的氨基酸序列到病毒蛋白抗原区的全长氨基酸序列或若干种病毒蛋白的融合物。在示例性实施方案中，抗原是长度为约25-30个氨基酸的短肽、长度为约45-55个氨基酸的延伸肽、长度为约110-140个氨基酸的短蛋白或靶向的病毒蛋白的抗原区的全长氨基酸序列。对于比抗原区的全长氨基酸序列短的抗原片段，具体的实施方案包括包含靶病毒蛋白的抗原区的所有氨基酸的抗原的集合。SARS-CoV-2的M蛋白的抗原，体现为短肽、延长肽、短蛋白或抗原区的整个氨基酸序列，示出于表3。SARS-CoV-2的N蛋白的可比抗原示出于表4。SARS-CoV-2的S2、ORF3a和ORF7a结构蛋白的可比设计抗原示出于表5-7。非结构蛋白nsp6和nsp7的抗原示出于表8，并且nsp12蛋白的抗原示出于表9和10。短肽和延伸肽重叠了10个氨基酸，并且短蛋白质抗原重叠了11个氨基酸。在最终制剂中，肽、蛋白质或全长抗原具有TAG，如上所述。
针对刺激通过先前暴露于普通感冒冠状病毒诱导的记忆T细胞的多离子乳头瘤病毒VLP物质组合物的优选实施方案包括来源于结构蛋白和非结构蛋白的抗原。T细胞识别的多重特异性理论未在分子水平上定义T细胞交叉反应性的结构基础。我们在本文中将含有交叉反应性T细胞表位的病毒蛋白或病毒蛋白的子区域定义为在普通感冒冠状病毒和特定致病性冠状病毒的同源氨基酸序列中平均氨基酸同一性>40％的蛋白质。
在具体的实施方案中，常见的冠状病毒是OC43和HKU1，并且用于诱导交叉反应性T细胞应答的抗原来自M、N和S2结构蛋白以及nsp3、nsp4、nsp6、nsp7和nsp12非结构蛋白。在OC43和HKU1的氨基酸序列在靶抗原的同源氨基酸中共享平均>40-80％同一性的情况下，仅将OC43的氨基酸序列用作靶抗原。在其他具体的实施方案中，HKU1的氨基酸序列是抗原。
OC43的M蛋白的长度为230aa，并且在区域aa14-226内与SARS-CoV-2的M蛋白共享40.8％的总体同一性(图2)。OC43 M蛋白与HKU1的比对显示没有显著的变异区域(氨基酸同一性<80％)(图3)。OC43的N蛋白的长度为448aa，并且与SARS-CoV-2的N蛋白平均共享36％氨基酸同一性。在排除不与OC43 N蛋白的氨基酸对齐的aa221-224之后，OC43的aa99-400抗原区，排除非比对的区域aa266-269、aa341-349和aa382-387，与SARS-CoV-2的N蛋白的同源区域共享43.5％同一性(图4A)。OC43 N蛋白在位置aa64-88处的N末端氨基酸与SARS-CoV-2的N的对应区域共享52％同一性(图4B)。OC43 N蛋白与HKU1的比对显示在两个病毒氨基酸序列之间氨基酸同一性水平低(范围为33％-50％)的3个抗原区。(图5A、5B和5C)。OC43的S蛋白为1353个氨基酸并且由2个子区域S1和S2构成。S1从aa 1-789延伸，并且在aa70-552之间的比对区域中显示与SARS-CoV-2的S1区域较低的氨基酸同一性(24％)。相比之下，病毒的S2区域包含两个抗原区，aa898-1153和aa1228-1302，它们分别共享平均52.72％和51.3％氨基酸同一性(图6)。HKU1的同源区域与OC43的aa898-1153的比对显示总体同一性为83.5％，没有高变异区域，而在aa1228-1303之间的OC43的抗原区与HKU1的同源S2区域共享70.7％同一性(图7)。
在示例性实施方案中，抗原是长度为约25-30个氨基酸的短肽、长度为约45-55个氨基酸的延伸肽、长度为约110-140个氨基酸的短蛋白或靶向的病毒蛋白的抗原区的全长氨基酸序列。对于比抗原区的全长氨基酸序列短的抗原片段，具体的实施方案包括包含靶病毒蛋白的抗原区的所有氨基酸的抗原的集合。OC43的M蛋白和HKU1的可变区的抗原，体现为短肽、延长肽、短蛋白或抗原区的整个氨基酸序列，示出于表11。OC43的N蛋白和HKU1的可变区的可比抗原示出于表12，并且OC43的S2蛋白和HKU1的可变区的抗原示出于表13。短肽和延伸肽重叠了10个氨基酸，并且短蛋白质抗原重叠了11个氨基酸。在最终制剂中，肽、蛋白质或全长氨基酸序列包含TAG，如上所述。
OC43冠状病毒的ORF1ab编码7095个氨基酸的多蛋白。多蛋白在病毒感染的细胞内被蛋白水解加工，产生多种非结构蛋白，它们在病毒生命周期中发挥不同的功能。就抗原特异性T细胞的频率和应答受试者的百分比而言，CD8+T细胞应答的主要靶标是nsp3、nsp4、nsp6、nsp7和nsp12蛋白。从这些非结构蛋白中选择抗原还基于普通感冒病毒和SARS-CoV-2的氨基酸序列之间平均>40％同一性的额外考量。
nsp3蛋白的长度为1,945个氨基酸。SARS-CoV-2和OC43 nsp3氨基酸序列之间的总体同一性为26％。然而，384个氨基酸的C末端区域共享39％同一性，并且在其中含有3个连续氨基酸区域，其中OC43的氨基酸序列与SARS-CoV-2的同源氨基酸序列之间的同一性为52.8％、41％和43.6％(图8A-C)。nsp 4蛋白的长度为500个氨基酸；SARS-CoV-2和OC43的nsp4蛋白共享42％氨基酸同一性。nsp4蛋白的中部或C末端中的三个子区域的长度分别为45、133和50个氨基酸，分别在SARS-CoV-2和OC43的同源氨基酸序列之间共享53.3％、47.4％和72％氨基酸同一性(图9A-C)。nsp6蛋白的长度为290个氨基酸，并且SARS-CoV-2和OC43的同源氨基酸序列共享30.5％同一性。C末端84个氨基酸共享54.8％同一性，并且N末端的31个氨基酸区域共享41.9％同一性(图10A-B)。nsp7蛋白的长度为83个氨基酸，并且SARS-CoV-2和OC43 nsp7的氨基酸序列共享46％同一性。排除SARS-CoV-2的C末端13个氨基酸，SARS-CoV-2和OC43 nsp7蛋白的氨基酸同一性为55.2％(图11)。nsp12蛋白的长度为932个氨基酸。对SARS-CoV-2感染患者中的抗原特异性细胞免疫应答的实证研究找出了蛋白质的aa 125-375和aa 520-920所涵盖的区域中大多数T细胞表位的位置(Grifoni等人,2021)。OC43 ORF1ab内的两个氨基酸序列与SARS-CoV-2 nsp12蛋白的aa125-275片段内的对应氨基酸共享61.5％和67％同一性(图13A-B)，并且OC43 ORF1ab的341aa与SARS-CoV-2nsp12蛋白的aa520-920片段内的对应氨基酸共享76.8％同一性(图13C)。OC43和HKU1的非结构蛋白共享约90％同一性，并且没有延伸的氨基酸变异区域(同一性<80％)。
在示例性实施方案中，抗原是长度为约25-30个氨基酸的短肽、长度为约45-55个氨基酸的延伸肽、长度为约110-140个氨基酸的短蛋白或靶向的病毒蛋白的抗原区的全长氨基酸序列。对于比抗原区的全长氨基酸序列短的抗原片段，具体的实施方案包括包含靶病毒蛋白的抗原区的所有氨基酸的抗原的集合。nsp3和nsp4蛋白的抗原，体现为短肽、延长肽、短蛋白或抗原区的整个氨基酸序列，示出于表14。OC43的nsp6和nsp7蛋白的可比设计抗原示出于表15，并且nsp12的可比设计抗原示出于表16和17。短肽和延伸肽重叠了10个氨基酸，并且短蛋白质抗原重叠了11个氨基酸。在最终制剂中，肽、蛋白质或全长氨基酸序列包含TAG，如上所述。
实施例
实施例1：具有基因工程化BPV L1基因的重组杆状病毒的生成
通过基于PCR的基因合成人工工程化了具有Kozak共有序列和在每个末端处的独特的限制位点(EcoR1/Not1)的BPV L1的整个开放阅读框(ORF)，并且将其克隆在pUC18载体中。使用果蝇优选的密码子对整个ORF进行密码子修饰，以实现在昆虫细胞中的有效表达。ORF含有具有天冬氨酸或谷氨酸残基和半胱氨酸残基的肽的插入，并且所述肽被插入到HI环中，如表1中所述，并且命名为插入物-1至插入物-19。
在pORB杆状病毒转移载体的EcoR1/Not1位点之间亚克隆修饰的BPV L1基因。如制造商所建议，使用优选的可商购获得的转染试剂，在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9细胞中将转移载体与线性杆状病毒DNA共转染。转染后五天，通过大规模感染sf9细胞来进一步扩增回收的重组杆状病毒。用2×106个粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five)细胞进行小规模感染以确认修饰的L1蛋白的表达，这些细胞在6孔盘中生长并且用杆状病毒储备液的连续稀释液感染。感染后72小时，在500μl RIPA缓冲液中裂解细胞，并且对澄清后的裂解液进行SDS-PAGE分析，以检测预期分子量55kDa的蛋白质的过表达。
实施例2：从重组杆状病毒产生多离子VLP
对于VLP的产生，用预先确定量的在500ml TNM-FH/10％FBS中的高滴度虫子杆状病毒储备液感染在转瓶中生长的大约2×109个粉纹夜蛾(High Five)细胞。在27℃下孵育96h之后，收获细胞，并且通过在2,000rpm下离心(Sorvall FH18/250转子)5min进行收集。将细胞沉淀物重新悬浮于含有蛋白酶抑制剂(Roche Complete ULTRA，1片/10ml)的提取缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5，1M NaCl，0.1mM CaCl2，50μm FeCl2)中，并且进行5次在37℃下解冻并在-80℃乙醇浴中冷冻的循环。将裂解液在8000rpm下旋转1h以去除杆状病毒颗粒。用等体积的Vertrel DF(Fisher Scientific)提取澄清后的裂解液，持续10min。将水层加载到40％蔗糖垫上，并在SW32Ti转子中以32,000rpm离心1.5h。将蔗糖沉淀物重新悬浮于20mM磷酸盐pH 8.0、0.5M NaCl、5mM MgCl2中，并且将其在37℃下与250U/ml Salt ActiveNuclease(Arcticzymes)一起孵育30min。在20mM磷酸盐pH 6.5、0.5M NaCl中渗析之后，将VLP溶液调整为0.01％Tween 80、0.05％羧甲基纤维素、50μM FeCl2，并且在4℃下储存。通过SDS-PAGE凝胶分析评估纯度，并且通过Bradford染料法和uv光谱法测量蛋白质浓度。为了促进VLP的直接可视化，将稀释颗粒的等分试样放置在300目formvar/碳涂覆的铜网格上，用2％磷钨酸(pH＝7.0)负染色，并且通过透射电子显微镜(TEM)检查。表1的具有插入物的嵌合VLP显示产生直径约50nm的衣壳样结构，具有斑驳的外观，与较小衣壳粒样结构的形成一致，并且类似于天然HPV 1型VLP。
实施例3：抗原与多离子VLP的缀合
对于与VLP缀合，将肽以5mg/ml溶解于蒸馏水中(如果它们不溶于水，则以5mg/ml溶解于DMSO中)。将以优选浓度2.5mg/ml(但如果在缓冲液中溶解度较小则更低)的肽用10mM Bond-breaker TCEP溶液(Thermo Fisher Scientific)在50℃下还原20min。在20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5，0.15M NaCl中渗析之后，在存在4mM谷胱甘肽二硫化物(GSSG)和0.8mM还原型谷胱甘肽(GSH)的情况下，将VLP蛋白(1mg/ml)和肽以肽:L1蛋白摩尔比4:1至16:1(基于溶解度特征)混合，并且在37℃下孵育过夜。为了去除未反应的肽，使用截止值为100万kDa的渗析管，将反应物针对20mM磷酸盐pH 6.5、0.5M NaCl进行渗析。将VLP-肽溶液调整为0.01％Tween 80、0.05％羧甲基纤维素、0.5mM GSSG和0.05mM GSH，等分并且在-20℃下储存。通过SDS-PAGE分析和根据已知量的肽的标准曲线的对样品-胎谱带密度的内推确定与VLP结合的肽的量。在BioRad ChemiDocXR成像仪中扫描凝胶，并且用NIH ImageJ软件分析图像。
实施例4：HI环中具有各种插入物的VLP的示例性实施方案诱导溶细胞CD8+T细胞 应答的能力
将用在L1蛋白中的各种示例性插入物生成的VLP(表1)经由TAG连接至编码在C57BL/6小鼠的遗传背景中识别的MHC I类限制性表位的代表性肽。如下所述，通过真皮内途径免疫小鼠。如下所述测量免疫应答。用连接至代表性抗原的不同插入插入物配制的VLP显示诱导可比频率的抗原特异性、干扰素-γ分泌CD8+T细胞(通过t检验比较，平均应答无显著差异)溶细胞性T细胞应答。
实施例5：通过TAG的示例性实施方案连接至抗原的VLP诱导溶细胞CD8+T细胞应答 的能力
编码在C57BL/6小鼠的遗传背景中识别的MHC I类限制性表位的代表性肽用表2中列出的TAG进行化学合成，纯度>90％。将具有TAG-1至TAG-4以及TAG-11和TAG-12的肽连接至具有插入物-1的多离子VLP。将具有TAG5-10的肽分别连接至具有插入物5-10的VLP。如下所述，通过真皮内途径免疫小鼠。如下所述测量免疫应答。连接至用不同TAG配制的代表性抗原的VLP显示诱导可比频率的抗原特异性、干扰素-γ分泌CD8+T细胞(通过t检验比较，平均应答无显著差异)。
实施例6：用多离子VLP的免疫以及对抗原特异性CD8+T细胞应答的检测
用5-50ug每种VLP-肽，通过真皮内注射进行施用，将6-8周龄C57BL/6J小鼠免疫三次，间隔1周。作为对照，C57BL/6J小鼠用未标记(无肽)的VLP蛋白免疫。用针对表3-12中所述的不同SARS-CoV-2和OC43抗原的延伸肽的集合配制VLP-肽免疫原。对于真皮内免疫，将VLP/抗原疫苗以单次或分次剂量注射到剃毛小鼠背部的皮肤中。
为了提供免疫测定的样品，在最后一剂疫苗之后10-14天处死小鼠并解剖脾。在37℃、5％CO2下，在存在布雷菲德菌素A(10μg/ml)的情况下，用1ug/ml重叠肽池刺激脾细胞(或来自肺组织的CD3+细胞的悬浮液)，所述肽的长度为11个氨基酸(重叠了8个氨基酸)，跨越靶抗原的全长氨基酸序列。将细胞用Zombie greenTMfixable viability染料染色，用固定缓冲液处理，并在Cytolast中储存。将细胞用透化缓冲液透化，并且用Brilliant VioletBVTM510缀合的抗小鼠CD3克隆17A2、PerCPCy5.5缀合的抗小鼠CD8α克隆53-6.7和PE缀合的抗小鼠IFNγ克隆XMG1.2染色。试剂购自商业来源。在LSR-II或可比的流式细胞仪上进行流式细胞术，并且使用FACSDiva软件或FlowJo软件分析数据。根据前向和侧向散射参数进行设门以选择淋巴细胞和单峰。排除死细胞之后，在门控的淋巴细胞的CD3/CD8点图上确定CD8+T淋巴细胞，并且在门控的CD8+T细胞的CD8/IFNγ点图上确定干扰素-γ(IFNγ)分泌细胞。分析了最少30,000个CD8+T细胞。SARS-CoV-2的M、N、S2、ORF3a、ORF7a、nsp6、nsp7和nsp12抗原的VLP-肽免疫原以及OC43的M、N、S2、nsp6、nsp7和nsp12抗原的免疫原显示诱导可检测的抗原特异性、干扰素-γ分泌CD8+T细胞。
实施例7：多离子VLP SARS-CoV-2疫苗在挑战模型中保护小鼠免受SARS-CoV-2疾 病的能力
小鼠品系：使用CRISPR/Cas9敲入技术生成稳定的人源化血管紧张素转化酶-II(ACE2)小鼠，以在C57BL/6小鼠品系中用人ACE2替代内源性小鼠ACE2(mACE2)，将所述小鼠用于SARS-CoV-2挑战(Sun等人,2020)。
小鼠免疫：将在HI环中具有示例性插入物的VLP用具有针对具体插入物的示例性且适当的TAG的示例性延伸肽的集合配制。多离子VLP疫苗用SARS-CoV-2抗原的M、N、S2、ORF3a、ORF7a、nsp6、nsp7和/或nsp12 SARS-CoV-2抗原配制。肽选自表3-10中的列表，SEQID以延伸、-E1、-E2、-E3等结尾。肽的精确数量将取决于如表中所述的抗原。优选的插入物是牛乳头瘤病毒1型的L1蛋白的HI环中氨基酸位置347至355处的E8C氨基酸序列，替代了天然氨基酸(插入物-1，表1)，并且优选的TAG是CRRRRRRRRCAAYY(TAG-1，在表2中)。如通过其他实验所告知，还测试了针对一种或多种SARS-CoV-2抗原的其他插入物和TAG与肽的集合的组合。如上所述生成VLP/抗原构建体。通过真皮内途径、鼻内/肺途径或同时两种途径免疫小鼠。对于真皮内免疫，将VLP/抗原疫苗以单次或分次剂量注射到剃毛小鼠背部的皮肤中。对于鼻/肺免疫，将VLP/抗原构建体逐滴施用(10μl)到轻度麻醉的小鼠的鼻子中。在麻醉小鼠中，鼻内施用的疫苗也被小鼠吸入，并且因此被递送至肺和鼻咽组织。
小鼠挑战：对于鼻内感染，用以精密蒸发罐递送的异氟烷麻醉老年(30周龄)hACE2小鼠，然后鼻内感染4X 105pfu SARSCoV-2。然后每天将小鼠称重并监测，并且在感染后第6天处死，以进行血清收集和组织处理。收集脾和肺组织以用于分析病毒RNA载量、组织病理学和细胞免疫应答的测量。
病毒RNA载量的测量：根据方案用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN)提取肺组织中的病毒RNA。通过靶向SARS-CoV-2的S基因的RT-qPCR进行病毒RNA定量。使用One StepPrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara)，以下列引物和探针进行RT-qPCR：CoV-F3、CoV-R3和CoV-P3(Sun等人,2020)。
抗原特异性CD8+T细胞应答：如上所述测量脾细胞和从肺匀浆回收的CD3+T细胞的CD8+T细胞应答。
SARS-CoV-2多离子VLP疫苗显示诱导脾细胞中和肺组织的CD3+T细胞中可检测到的抗原特异性CD8+T细胞对每种靶抗原(M、NS2、ORF3a和ORF7a)的应答。还显示，与模拟接种疫苗的小鼠相比，接种疫苗的小鼠的病毒RNA载量显著降低并且肺部病理减少。疫苗还显示减少肺中病毒RNA的表达。值得注意的是，预期这些疫苗不提供灭菌免疫力。
实施例8：多离子VLP SARS-CoV-2疫苗在挑战模型中保护Syrian仓鼠免受SARS- CoV-2感染的能力
动物物种：Syrian仓鼠对SARS-CoV-2感染高度敏感，使其成为评估疫苗的保护功效的最合适的小动物模型(Rosenke等人,2020；Chan等人2020)。6-8周龄的Syrian仓鼠(金仓鼠)购自Jackson Laboratories。
仓鼠免疫：将在HI环中具有示例性插入物的VLP用具有针对具体插入物的示例性且适当的TAG的示例性延伸肽的集合配制。多离子VLP疫苗用M、N、S2、ORF3a、ORF7a、nsp6、nsp7和/或nsp12 SARS-CoV-2抗原配制。肽选自表3-10中的列表，SEQ ID以延伸、-E1、-E2、-E3等结尾。肽的精确数量将取决于如表中所述的抗原，并且可能包括具有-E扩展名称的所有或更少的抗原。优选的插入物是牛乳头瘤病毒1型的L1蛋白的HI环中氨基酸位置347至355处的E8C氨基酸序列，替代了天然氨基酸(插入物-1，表1)，并且优选的TAG是CRRRRRRRRCAAYY(TAG-1，在表2中)。如通过其他实验所告知，还测试了针对一种或多种SARS-CoV-2抗原的其他插入物和TAG与肽的集合的组合。如上所述生成VLP/抗原构建体。通过真皮内途径、鼻内途径或两种途径单独或组合地免疫仓鼠。如上所述进行真皮内免疫。对于鼻免疫，将VLP/抗原构建体逐滴施用(10μl)到轻度麻醉的小鼠的鼻子中。
仓鼠挑战：为了模拟自然感染途径，将接种疫苗的动物和对照(接触者)通过共同饲养在同一个笼子中来暴露于先前感染的动物(索引)。对于索引动物的鼻内感染，用以精密蒸发罐递送的异氟烷麻醉仓鼠，然后鼻内感染100组织培养剂量50(TCID50)的SARSCoV-2病毒。获得来自CDC的SARS-CoV-2分离株nCoV-WA1-2020(MN985325.1)或合适的替代分离株，并且在Vero E6细胞中繁殖。通过滴定在VeroE6细胞中的病毒储备液确定TCID50剂量。每天针对疾病的临床征象，对感染的仓鼠以及共同饲养的接种疫苗和对照幼稚仓鼠进行称重和监测。为了通过RT-qPCR监测感染，通过在两个鼻孔中用150ul PBS/0.3％BSA滴注然后收集，每天从轻度麻醉的幼稚接触(接种疫苗和对照)动物和索引(先前感染的)动物收集鼻洗液，持续10天。
病毒RNA载量的测量：根据方案用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN)提取肺组织中的病毒RNA。通过靶向SARS-CoV-2的S基因的RT-qPCR进行病毒RNA定量。使用One StepPrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara)，以下列引物和探针进行RT-qPCR：CoV-F3、CoV-R3和CoV-P3(Sun等人,2020)。
在暴露于受感染的索引仓鼠之后，与模拟疫苗接种的小鼠相比，SARS-CoV-2多离子VLP接种疫苗的仓鼠显示在鼻洗液中具有显著减少的病毒RNA载量。
表
表1.HI环中代表性带负电荷的氨基酸-半胱氨酸序列
表2.代表性TAG序列
Seq ID TAG命名 氨基酸序列1
TAG-1 polyR8 RRRRRRRRC
TAG-2 PolyK8 KKKKKKKKC
TAG-3 PolyH8 HHHHHHHHC
TAG-4 MixedRKH8 RKHRKHRKC
TAG-5 PolyR4 RRRRC
TAG-6 PolyR5 RRRRRC
TAG-7 PolyR6 RRRRRRC
TAG-8 PolyR7 RRRRRRRC
TAG-9 PolyR9 RRRRRRRRRC
TAG-10 PolyR10 RRRRRRRRRRC
TAG-11 NH-末端C CRRRRRRRR
TAG-12 Dual C CRRRRRRRRC
1所有TAG氨基酸序列均包含C末端AAYY蛋白水解加工序列。
表3.M结构蛋白的SARS-CoV-2抗原。
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组NC-06577.2和参考M蛋白序列YP_009724393.1。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表4.N结构蛋白的SARS-CoV-2抗原
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组NC-06577.2和参考N蛋白序列YP_009724397.2。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表5.S2结构蛋白的SARS-CoV-2抗原。
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组NC-06577.2和参考峰值蛋白序列YP_009724390.1。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表6.ORF3a结构蛋白的SARS-CoV-2抗原
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组NC-06577.2和参考ORF3a蛋白序列YP_009724391.1。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表7.ORF7a结构蛋白的SARS-CoV-2抗原
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组NC-06577.2和参考ORF7a蛋白序列YP_009724395.1
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表8.nsp6和nsp7非结构蛋白的SARS-CoV-2抗原
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组(NC-06577.2)以及参考nsp6蛋白(YP_009725302.1)和nsp7蛋白(YP_009725303.1)。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表9.nsp12-1非结构蛋白片段的SARS-CoV-2抗原
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组(NC-06577.2)和参考nsp12蛋白(YP_009725307.1)。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表10.nsp12-2非结构蛋白片段的SARS-CoV-2抗原
1aa位置基于SARS-CoV-2参考基因组(NC-06577.2)和参考nsp12蛋白(YP_009725307.1)。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
表11.M结构蛋白的OC43和HKU1抗原
1aa positions based on OC43 reference M protein sequences,YP_009555244.1,and HKU1 reference M protein sequence,YP_173241.1.
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
/指示天然氨基酸序列中的断开
//指示OC43氨基酸序列与HKU1氨基酸序列之间的断开。
表12.N结构蛋白的OC43和HKU1抗原
1aa位置基于OC43参考N蛋白序列YP_009555245.1和HKU1参考N蛋白序列YP_173242.1。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
/指示天然氨基酸序列中的断开
//指示OC43氨基酸序列与HKU1氨基酸序列之间的断开。
表13.S2结构蛋白的OC43和HKU1 S2抗原
1aa位置基于OC43参考刺突蛋白序列YP_009555241.1和HKU1参考刺突蛋白序列YP_173238.1。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
/指示天然氨基酸序列中的断开
//指示OC43氨基酸序列与HKU1氨基酸序列之间的断开
表14.非结构蛋白nsp3和nsp4的OC43抗原
1aa位置基于OC43参考ORF1ab蛋白序列YP_009555238.1
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
/指示天然氨基酸序列中的断开
表15.非结构蛋白nsp6和nsp7的OC43抗原
1aa位置基于OC43参考ORF1ab蛋白序列YP_009555238.1
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
/指示天然氨基酸序列中的断开
表16.与SARS-CoV-2的nsp12-1非结构蛋白片段同源的OC43抗原
1aa位置基于OC43参考ORF1ab蛋白(YP_009555238.1)。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
/指示天然氨基酸序列中的断开
表17.与SARS-CoV-2的nsp12-2非结构蛋白片段同源的OC43抗原
1aa位置基于OC43参考ORF1ab蛋白(YP_009555238.1)。
2为了与多离子VLPS缀合，肽/蛋白质抗原具有N末端TAG和AAYY蛋白水解加工序列。
参考文献列表
Braun,J.,Loyal,L.,Frentsch,M.,Wendisch,D.,Georg,P.,Kurth,F.,Hippenstiel,S.,Dingeldey,M.,Kruse,B.,Fauchere,F.,Baysal,E.,Mangold,M.,Henze,L.,Lauster,R.,Mall,M.A.,Beyer,K.,Rohmel,J.,Voigt,S.,Schmitz,J.,Miltenyi,S.,Demuth,I.,Muller,M.A.,Hocke,A.,Witzenrath,M.,Suttorp,N.,Kern,F.,Reimer,U.,Wenschuh,H.,Drosten,C.,Corman,V.M.,Giesecke-Thiel,C.,Sander,L.E.,and Thiel,A.(2020).SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients with COVID-19.Nature.
Chan,J.,Zhang,A.J.,Yuan,S.,Poon,V.,Chan,C.,Lee,A.,Chan,W.M.,Fan,Z.,Tsoi,H-W.,Wen,L.,Liang,R.,Cao,J.,Chen,Y.,Tang,K.,Luo,C.,Cai,J-P.,Kok,K-H.,Chu,H.,Chan,K-H.,Sridhar,S.,Chen,Z.Chen,H.,To,K.K-W.,Yu en,K-Y.(2020).Simulation of the Clinical and Pathological Manifestations of CoronavirusDisease 2019(COVID-19)in a Golden Syrian Hamster Model:Implications forDisease Pathogenesis and Transmissibility.Clin Infect Dis.71:2428-2446.
Chen,Y.,Liu,Q.,and Guo,D.(2020).Emerging coronaviruses:Genomestructure,replication,and pathogenesis.J Med.Virol.
Grifoni,A.,Weiskopf,D.,Ramirez,S.I.,Mateus,J.,Dan,J.M.,Moderbacher,C.R.,Rawlings,S.A.,Sutherland,A.,Premkumar,L.,Jadi,R.S.,Marrama,D.,de Silva,A.M.,Frazier,A.,Carlin,A.F.,Greenbaum,J.A.,Peters,B.,Krammer,F.,Smith,D.M.,Crotty,S.,and Sette,A.(2020).Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2Coronavirus in Humans with COVID-19Disease and Unexposed Individuals.Cell181,1489-1501.
Grifoni,A.,Sidney,J.,Vita,R.,Peters,B.,Crotty,S.,Weiskopt,D.,andSette,A.(2021).SARS-CoV-2 human T cell epitopes:Adaptive immune responseagainst COVID-19.Cell Host&Microbe 29,1076-1092.
Kersh,G.J.and Allen,P.M.(1996).Structural basis for T cellrecognition of altered peptide ligands:a single T cell receptor canproductively recognize a large continuum of related ligands.J Exp Med.184,1259-1268.
Le,B.N.,Tan,A.T.,Kunasegaran,K.,Tham,C.Y.L.,Hafezi,M.,Chia,A.,Chng,M.H.Y.,Lin,M.,Tan,N.,Linster,M.,Chia,W.N.,Chen,M.I.,Wang,L.F.,Ooi,E.E.,Kalimuddin,S.,Tambyah,P.A.,Low,J.G.,Tan,Y.J.,and Bertoletti,A.(2020).SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS,and uninfectedcontrols.Nature 584,457-462.
Liu,W.J.,Zhao,M.,Liu,K.,Xu,K.,Wong,G.,Tan,W.,and Gao,G.F.(2017).T-cell immunity of SARS-CoV:Implications for vaccine development against MERS-CoV.Antiviral Res.137,82-92.
Mason,D.(1998).A very high level of crossreactivity is an essentialfeature of the T-cell receptor.Immunol.Today 19,395-404.
Mateus,J.,Grifoni,A.,Tarke,A.,Sidney,J.,Ramirez,S.I.,Dan,J.M.,Burger,Z.C.,Rawlings,S.A.,Smith,D.M.,Phillips,E.,Mallal,S.,Lammers,M.,Rubiro,P.,Quiambao,L.,Sutherland,A.,Yu,E.D.,da Silva,A.R.,Greenbaum,J.,Frazier,A.,Markmann,A.J.,Premkumar,L.,de,S.A.,Peters,B.,Crotty,S.,Sette,A.,and Weiskopf,D.(2020).Selective and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes in unexposedhumans.Science.
Petrosillo,N.,Viceconte,G.,Ergonul,O.,Ippolito,G.,and Petersen,E.(2020).COVID-19,SARS and MERS:are they closely related？ClinMicrobiol.Infect.26,729-734.
Rosenke,K.,Meade-White,K.,Letko,M.,Clancy,C.,Hansen,F.,Liu,Y.,Okumura,A.,Tang-Huau,TL.,Li,R.,Saturday,G.,Feldmann,F.,Scott,D.,Wang,Z.,Munster,V.,Jarvis,M.A.,Feldmann,H.(2020).Defining the Syrian hamster as ahighly susceptible preclinical model for SARS-CoV-2 infection.Emerg MicrobesInfect.9:2673-2684.
Severance,E.G.,Bossis,I.,Dickerson,F.B.,Stallings,C.R.,Origoni,A.E.,Sullens,A.,Yolken,R.H.,and Viscidi,R.P.(2008).Development of a nucleocapsid-based human coronavirus immunoassay and estimates of individuals exposed tocoronavirus in a U.S.metropolitan population.Clin Vaccine Immunol.15,1805-1810.
Sewell,A.K.(2012).Why must T cells be cross-reactive？Nat.Rev.Immunol.12,669-677.
Sun,S.H.,Chen,Q.,Gu,H.J.,Yang,G.,Wang,Y.X.,Huang,X.Y.,Liu,S.S.,Zhang,N.N.,Li,X.F.,Xiong,R.,Guo,Y.,Deng,Y.Q.,Huang,W.J.,Liu,Q.,Liu,Q.M.,Shen,Y.L.,Zhou,Y.,Yang,X.,Zhao,T.Y.,Fan,C.F.,Zhou,Y.S.,Qin,C.F.,and Wang,Y.C.(2020).AMouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis.Cell Host.Microbe 28,124-133.
Weiskopf,D.,Schmitz,K.S.,Raadsen,M.P.,Grifoni,A.,Okba,N.M.A.,Endeman,H.,van den Akker,J.P.C.,Molenkamp,R.,Koopmans,M.P.G.,van Gorp,E.C.M.,Haagmans,B.L.,de Swart,R.L.,Sette,A.,and de Vries,R.D.(2020).Phenotype andkinetics of SARS-CoV-2-specific T cells in COVID-19 patients with acuterespiratory distress syndrome.Sci.Immunol.5.
Wilson,D.B.,Wilson,D.H.,Schroder,K.,Pinilla,C.,Blondelle,S.,Houghten,R.A.,and Garcia,K.C.(2004).Specificity and degeneracy of Tcells.Mol.Immunol.40,1047-1055.

Claims (45)

1.一种组合物，所述组合物包含：(a)包含L1蛋白的嵌合乳头瘤病毒病毒样颗粒(VLP)，所述嵌合乳头瘤病毒病毒样颗粒具有插入到所述L1蛋白的HI环中的氨基酸插入物；和(b)冠状病毒抗原。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述氨基酸插入物包含带负电荷的氨基酸和末端半胱氨酸残基的连续序列。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述带负电荷的氨基酸选自由谷氨酸、天冬氨酸及其组合组成的组。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述氨基酸插入物包含4-10个带负电荷的氨基酸以及在C末端、N末端或两个末端的半胱氨酸残基。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述氨基酸插入物选自表1中确定的插入物。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述氨基酸插入物插入到所述L1蛋白的HI环中的位置344与357之间的位置处。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述氨基酸插入物替代位置344与357之间的一个或多个天然残基。
8.如权利要求6所述的组合物，其中所述氨基酸插入物替代表1中确定的天然氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原选自由以下组成的组：OC43抗原、HKU1抗原、229E抗原、NL63抗原、SARS-CoV-1抗原、MERS抗原、SARS-CoV-2抗原及其融合物。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含来自OC43、HKU1、229E、NL63、SARS-CoV-1、MERS和/或SARS-CoV-2冠状病毒的一种或多种蛋白质。
11.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含选自由以下组成的组的病毒结构蛋白：来自OC43、HKU1、229E、NL63、SARS-CoV-1、MERS和/或SARS-CoV-2冠状病毒的膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)以及刺突(S)包膜蛋白的S2区。
12.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含选自由SARS-CoV-1或SARS-CoV-2冠状病毒的ORF3a和ORF7a蛋白组成的组的病毒结构蛋白。
13.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含选自由来自OC43、HKU1、229E、NL63、SARS-CoV-1、MERS和/或SARS-CoV-2冠状病毒的nsp3、nsp4、nsp6、nsp7和nsp12蛋白组成的组的病毒非结构蛋白。
14.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含SARS-CoV-2的病毒结构蛋白，所述病毒结构蛋白选自由膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、刺突(S)包膜蛋白的S2区、ORF3a和ORF7a组成的组。
15.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒结构蛋白抗原选自表3-表7中的一个或多个氨基酸序列。
16.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含来源于SARS-CoV-2的nsp6、nsp7和/或nsp12蛋白的病毒非结构蛋白。
17.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒非结构蛋白抗原选自表8-表10中的一个或多个氨基酸序列。
18.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43和/或HKU1冠状病毒的一种或多种病毒结构蛋白，所述病毒结构蛋白选自由膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和刺突(S)包膜蛋白的S2区组成的组。
19.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43冠状病毒的一种或多种病毒非结构蛋白，所述病毒非结构蛋白选自由nsp3、nsp4、nsp6、nsp7和/或nsp12蛋白组成的组。
20.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43冠状病毒和/或HKU1冠状病毒的一种或多种病毒蛋白，其中所述一种或多种病毒蛋白包含与SARS-CoV-1冠状病毒、MERS冠状病毒和/或SARS-CoV-2冠状病毒的氨基酸序列的40％或更高的同一性。
21.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43冠状病毒和/或HKU1冠状病毒的一种或多种病毒蛋白，其中所述一种或多种病毒蛋白包含与SARS-CoV-1冠状病毒、MERS冠状病毒和/或SARS-CoV-2冠状病毒的氨基酸序列的50％或更高的同一性。
22.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43冠状病毒和/或HKU1冠状病毒的一种或多种病毒蛋白，其中所述一种或多种病毒蛋白包含与SARS-CoV-1冠状病毒、MERS冠状病毒和/或SARS-CoV-2冠状病毒的氨基酸序列的60％或更高的同一性。
23.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43冠状病毒和/或HKY1冠状病毒的一种或多种病毒蛋白，其中所述一种或多种病毒蛋白包含与SARS-CoV-1冠状病毒、MERS冠状病毒和/或SARS-CoV-2冠状病毒的氨基酸序列的70％或更高的同一性。
24.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含OC43冠状病毒和/或HKU1冠状病毒的一种或多种病毒蛋白，其中所述一种或多种病毒蛋白包含与SARS-CoV-1冠状病毒、MERS冠状病毒和/或SARS-CoV-2冠状病毒的氨基酸序列的80％或更高的同一性。
25.如权利要求9所述的组合物，其中所述OC43和/或HKU1冠状病毒结构蛋白抗原选自表11-表13中的一个或多个氨基酸序列。
26.如权利要求9所述的组合物，其中所述OC43冠状病毒非结构抗原选自表14-表17中的一个或多个氨基酸序列。
27.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含一组多肽，所述多肽一起含有病毒蛋白的抗原区的整个氨基酸序列。
28.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含第一抗原和第二抗原，所述第一抗原选自OC43和/或HKU1冠状病毒的结构蛋白和非结构蛋白和肽，并且所述第二抗原选自SARS-CoV-2冠状病毒的结构蛋白和非结构蛋白和肽。
29.如权利要求9所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包含第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原，所述第一抗原选自OC43和/或HKU1冠状病毒的结构蛋白和肽，所述第二抗原选自OC43的非结构蛋白和肽，所述第三抗原选自SARS-CoV-2冠状病毒的结构蛋白和肽，并且所述第四抗原选自SARS-CoV-2的非结构蛋白和肽。
30.如权利要求1所述的组合物，其还包含在第一末端连接至所述氨基酸插入物并且在第二末端连接至所述冠状病毒抗原的TAG序列。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述TAG序列通过二硫键连接至所述嵌合乳头瘤病毒并且通过肽键连接至所述冠状病毒抗原。
32.如权利要求30所述的组合物，其中所述TAG序列包含C末端蛋白水解加工序列AAYY。
33.如权利要求30所述的组合物，其中所述TAG序列包含4-10个带正电荷的氨基酸和末端半胱氨酸残基的序列。
34.如权利要求30所述的组合物，其中所述TAG序列包含表2中确定的氨基酸序列。
35.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物有效刺激哺乳动物中的细胞毒性T细胞应答。
36.一种刺激哺乳动物中的对冠状病毒的细胞毒性T细胞应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用如权利要求1-35中任一项所述的组合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述组合物包含选自由OC43抗原、HKU1抗原、229E抗原、NL63抗原及其组合组成的组的冠状病毒抗原。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2中的一种或多种。
39.一种刺激哺乳动物中的对两种或更多种冠状病毒的细胞毒性T细胞应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述冠状病毒抗原包括来自所述两种或更多种冠状病毒中的每一种的至少一种抗原。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述组合物包含第一冠状病毒抗原、第二冠状病毒抗原、第三冠状病毒抗原和第四冠状病毒抗原，所述第一冠状病毒抗原选自由OC43、HKU1、229E和NL63的结构蛋白和肽组成的组，所述第二冠状病毒抗原选自由OC43、HKU1、229E和NL63的非结构蛋白和肽组成的组，所述第三冠状病毒抗原选自由SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2的结构蛋白和肽组成的组，并且所述第四冠状病毒抗原选自由SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2的非结构蛋白和肽组成的组。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞应答包括交叉反应性记忆T细胞的刺激，其中所述交叉反应性记忆T细胞通过施用所述第一冠状病毒抗原和第二冠状病毒抗原来刺激，并且对感染SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2之一的细胞具有细胞毒性。
42.一种用于刺激对冠状病毒的治疗性免疫和保护性免疫两者的方法，其包括向受试者施用如权利要求1-35中任一项所述的组合物。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述组合物包含第一冠状病毒抗原、第二冠状病毒抗原、第三冠状病毒抗原和第四冠状病毒抗原，所述第一冠状病毒抗原选自由OC43、HKU1、229E和/NL63的结构蛋白或肽组成的组，所述第二冠状病毒抗原选自由OC43、HKU1、229E和NL63的非结构蛋白或肽组成的组，所述第三冠状病毒抗原选自由SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2的结构蛋白和肽组成的组，并且所述第四冠状病毒抗原选自由SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2的非结构蛋白和肽组成的组。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞应答包括交叉反应性记忆T细胞的刺激，其中所述交叉反应性记忆T细胞通过施用所述第一和第二冠状病毒抗原来刺激，并且对感染SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2之一的细胞具有细胞毒性。
45.一种用于刺激哺乳动物中的预先存在的交叉反应性记忆T细胞的方法，其包括向所述哺乳动物施用如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述预先存在的交叉反应性记忆T细胞响应于OC43、HKU1、229E和NL63之一的感染而被诱导，并且其中所述交叉反应性记忆T细胞对感染SARS-CoV-1、MERS和SARS-CoV-2之一的细胞具有细胞毒性。
CN202280009729.8A 2021-01-14 2022-01-14 针对高致病性冠状病毒的溶细胞性t细胞免疫疗法 Pending CN117157310A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163137402P 2021-01-14 2021-01-14
US63/137,402 2021-01-14
PCT/US2022/012434 WO2022155417A2 (en) 2021-01-14 2022-01-14 Cytolytic t cell immunotherapy for highly pathogenic coronaviruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117157310A true CN117157310A (zh) 2023-12-01

Family

ID=82447540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280009729.8A Pending CN117157310A (zh) 2021-01-14 2022-01-14 针对高致病性冠状病毒的溶细胞性t细胞免疫疗法

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4277657A2 (zh)
JP (1) JP2024502837A (zh)
KR (1) KR20230131871A (zh)
CN (1) CN117157310A (zh)
AU (1) AU2022208375A1 (zh)
CA (1) CA3204663A1 (zh)
IL (1) IL304175A (zh)
MX (1) MX2023008242A (zh)
WO (1) WO2022155417A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980099A (zh) * 2021-03-29 2022-01-28 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 新冠病毒的n抗原特定表位及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9580474B2 (en) * 2010-09-08 2017-02-28 The Johns Hopkins University Polyionic papilloma virus-like particle (VLP) vaccines
MX2017002803A (es) * 2014-09-03 2017-06-09 Intervet Int Bv Coronavirus bovino atenuado y vacunas relacionadas.
US11130787B2 (en) * 2020-06-11 2021-09-28 MBF Therapeutics, Inc. Alphaherpesvirus glycoprotein d-encoding nucleic acid constructs and methods

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980099A (zh) * 2021-03-29 2022-01-28 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 新冠病毒的n抗原特定表位及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP4277657A2 (en) 2023-11-22
CA3204663A1 (en) 2022-07-21
KR20230131871A (ko) 2023-09-14
MX2023008242A (es) 2023-07-26
AU2022208375A1 (en) 2023-07-13
WO2022155417A3 (en) 2022-08-25
JP2024502837A (ja) 2024-01-23
WO2022155417A2 (en) 2022-07-21
IL304175A (en) 2023-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021184560A1 (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
KR102126398B1 (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 (prrs)의 효과적인 제어를 위한 합성 펩티드-기반 마커 백신 및 진단 시스템
JP2021182922A (ja) Ｂ型肝炎ウイルスに対するワクチン
JP2559384B2 (ja) ウイルスワクチン
RU2519210C2 (ru) Вакцины, содержащие генетические варианты парвовируса собак
Palmer et al. Protection of rabbits against cutaneous papillomavirus infection using recombinant tobacco mosaic virus containing L2 capsid epitopes
Blome et al. A decade of research into classical swine fever marker vaccine CP7_E2alf (Suvaxyn® CSF Marker): A review of vaccine properties
JP2003180385A (ja) コロナウイルスに対するワクチン接種用組成物および方法
CN102497880A (zh) 新的人乳头状瘤病毒(hpv)蛋白构建体及其在预防hpv疾病中的用途
CN111671890A (zh) 一种新型冠状病毒疫苗及其应用
Lewicki et al. CTL escape viral variants: II. Biologic activity in vivo
JPH08501931A (ja) コロナウイルスに対するワクチン接種用組成物および方法
US20200164060A1 (en) Herpes simplex virus vaccine epitopes specifically recognized by tissue resident memory t cells
Cao et al. A single vaccine protects against SARS-CoV-2 and influenza virus in mice
Kim et al. Application of attenuated coxsackievirus B3 as a viral vector system for vaccines and gene therapy
Beddingfield et al. Effective prophylaxis of COVID-19 in rhesus macaques using a combination of two parenterally-administered SARS-CoV-2 neutralizing antibodies
AU2021290231A1 (en) Arthrogenic alphavirus vaccine
CN117157310A (zh) 针对高致病性冠状病毒的溶细胞性t细胞免疫疗法
AU2022208375A9 (en) Cytolytic t cell immunotherapy for highly pathogenic coronaviruses
Liu et al. Route of administration of chimeric BPV1 VLP determines the character of the induced immune responses
Sun et al. Comparison of the protective efficacy of recombinant adenoviruses against classical swine fever
Harbour et al. Cellular and humoral immune responses in mice immunized with vaccinia virus expressing the SARS-CoV-2 spike protein
WO2023089071A1 (en) Vaccine with improved immunogenicity against mutant coronaviruses
Choi et al. Guinea pig cytomegalovirus protective T cell antigen GP83 is a functional pp65 homolog for innate immune evasion and pentamer-dependent virus tropism
Yi et al. Recombinant bivalent vaccine against foot-and-mouth disease virus serotype O/A infection in guinea pig

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination