CN117152014B - 针对多通道荧光显微镜的平场校正方法和装置 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法和装置，其中方法包括：获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，能够实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

Description

针对多通道荧光显微镜的平场校正方法和装置

技术领域

本申请涉及图像处理技术领域，尤其涉及一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法和装置。

背景技术

受到相机感光元件响应非均匀、照明系统非均匀、成像系统非均匀等因素的影响，显微镜所拍摄的图像呈现中心亮、边缘暗的非均匀性，图像的非均匀性将直接影响后续图像处理的精度，造成后续基于图像的研究结果偏差。针对该问题，现有技术通常通过引入平场校正技术以尽可能消除图像的非均匀性。

然而现有的平场校正方法仅是针对常规光学显微镜，对于多通道荧光显微镜，其与常规光学显微镜的显著区别在于各通道的拍摄条件(例如曝光时间)存在差异，因此，现有的平场校正方法并不适用于多通道荧光显微镜，同时，现有的平场校正方法并未对多个引入非均匀性的因素进行校正，也未考虑高频噪声和低频噪声校正策略的区别，更未考虑存储空间和运行时间的约束，导致校正效率低、校正效果差。

发明内容

本申请提供一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法和装置，以用于实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

本申请提供一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，包括：

获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；

基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；

基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述关联通道对应的高频校正系数集中包括多个校正系数组，各校正系数组与所述原始细胞图像的多个条形子区域一一对应，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的高频校正系数集，确定所述原始细胞图像中目标条形子区域对应的目标校正系数组；

基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正，具体包括：

确定所述目标校正系数组中的增益校正系数和偏置校正系数；

基于所述增益校正系数、偏置校正系数及所述目标条形子区域中各像素点的原始灰度值，确定所述目标条形子区域中各像素点的灰度校正值。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述关联通道对应的校正参照图像集中包括暗场图像、第一明场图像和第二明场图像，所述暗场图像、第一明场图像和第二明场图像是基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板进行拍摄得到的，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布；

基于所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布生成校正细胞图像。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布，具体包括：

基于预设的低频校正分区规则，将所述暗场图像、第一明场图像和高频校正细胞图像划分为多个方形子区域；

基于所述暗场图像和第一明场图像中各方形子区域的灰度平均值，确定所述高频校正细胞图像中各方形子区域的入射光强度。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定步骤包括：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，将所述潜在校正参照图像集和潜在高频校正系数集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定步骤包括：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，基于所述目标通道对标准荧光板的多个随机位点进行拍摄得到测试图像集，并基于所述关联通道对应的潜在高频校正系数集对所述测试图像集中的各测试图像进行高频校正得到高频校正测试图像集；

步骤S4，基于所述潜在校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像对所述高频校正测试图像集进行低频校正得到校正测试图像集；

步骤S5，判断所述校正测试图像集中各校正测试图像的灰度值是否均在预设范围内，若是，执行步骤S6，若否，重新拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像以得到更新的潜在校正参照图像集，并跳转执行步骤S2；

步骤S6，将当前的潜在高频校正系数集及潜在校正参照图像集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集，具体包括：

基于预设的高频校正分区规则分别将所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像划分为多个条形子区域；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集，确定所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像各条形子区域的平均灰度值，以及第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集。

根据本申请提供的一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集均是对对应明场图像中心点周围的多个关联位点进行拍摄得到的。

本申请还提供一种针对多通道荧光显微镜的平场校正装置，包括：

原始细胞图像获取模块，用于获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；

高频校正模块，用于基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；

低频校正模块，用于基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

本申请还提供一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述程序时实现如上述任一种所述针对多通道荧光显微镜的平场校正方法的步骤。

本申请还提供一种非暂态计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现如上述任一种所述针对多通道荧光显微镜的平场校正方法的步骤。

本申请提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法和装置，获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，能够实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

附图说明

为了更清楚地说明本申请或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法的流程示意图；

图2是本申请提供的多通道荧光显微镜的工作原理示意图；

图3是本申请提供的感光元件的响应曲线示意图；

图4是本申请提供的不同感光元件响应曲线的对比示意图；

图5是本申请提供的高频校正的原理示意图；

图6是本申请提供的多通道荧光显微镜成像系统的工作原理示意图；

图7是本申请提供的多通道荧光显微镜的照明光场示意图；

图8是本申请提供的高频校正的分区方式示意图；

图9是本申请提供的低频校正的分区方式示意图；

图10是本申请提供的关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定流程示意图；

图11是本申请提供的校正参照图像集中明场图像的拍摄方式示意图；

图12是本申请提供的平场校正前后的细胞图像对比示意图；

图13是本申请提供的平场校正前后的细胞图像灰度值分布情况的对比示意图；

图14是本申请提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正装置的结构示意图；

图15是本申请提供的电子设备的结构示意图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请中的附图，对本申请中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

图1为本申请提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法的流程示意图，如图1所示，该方法包括：

步骤110，获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道。

具体的，基于前述内容可知，显微镜所拍摄图像的非均匀性主要是由于相机感光元件响应非均匀、照明系统非均匀、成像系统非均匀这三个因素造成的，现有的平场校正方法并不适用于多通道荧光显微镜，同时，现有的平场校正方法并未对多个引入非均匀性的因素进行校正，也未考虑高频噪声和低频噪声校正策略的区别，更未考虑存储空间和运行时间的约束，导致校正效率低、校正效果差。针对该问题，本申请通过对多通道荧光显微镜的工作原理进行深入研究，提出了本申请实施例的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，以实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

图2是本申请提供的多通道荧光显微镜的工作原理示意图，其中，如图2所示，光源发出激发光，被二向镜反射到样本上，吸收激发光的荧光基团发出荧光入射到相机内，感光元件探测到入射光强度，将光信号转换成电信号，即像素灰度值。图中的Φ为被相机捕获到的入射光光照强度(即入射光强度)，m为拍摄的原始细胞图像灰度值，M为校正细胞图像灰度值。本申请实施例提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法旨在对原始细胞图像的灰度值进行校正。

图3是本申请提供的感光元件的响应曲线示意图，其中横坐标为被相机捕获到的入射光光照强度(即Φ)，纵坐标为拍摄的原始细胞图像灰度值(即m)。如图3所示，相机感光元件的响应曲线为“S”形的非线性函数，但在较小工作范围内可以近似看作直线，即一次函数，以此作为响应曲线可减小计算工作量和存储量。不同入射光强度区间内拟合的线性函数有所不同，因此对于多通道荧光显微镜的不同通道，其响应曲线应分别进行处理。

同时，相机的芯片由大量感光元件组成，每个感光元件对应一个像素，但由于工艺不足，每个感光元件的响应曲线也不一致，导致对于同一入射光光强而言，不同感光元件对应的像素灰度值不同。图4是本申请提供的不同感光元件响应曲线的对比示意图，如图4所示，同一相机不同感光元件的响应曲线存在明显差异，因此需对信号增益(Gain)和偏置(Offset)进行校正。图5是本申请提供的高频校正的原理示意图，如图5所示，为了避免相机感光元件响应非均匀导致的显微镜所拍摄图像的非均匀性，本申请实施例将通过高频校正将所有感光元件的响应曲线拟合为同一条曲线，从函数图像上来看，就是把高的曲线“压低”，把低的曲线“抬高”，具体的，响应曲线可以看做图像灰度值与入射光光照强度的线性函数：

m＝m(Φ)＝G·Φ+O；

其中，G表示信号增益，O表示信号偏置。

图6是本申请提供的多通道荧光显微镜成像系统的工作原理示意图，图7是本申请提供的多通道荧光显微镜的照明光场示意图，本申请通过研究发现，由于显微镜的成像系统和照明系统由多个光学透镜组成，这些透镜会引发球差、场曲等像差(如图6所示)，同时，显微镜的照明光场存在分布不均匀的现象(如图7所示)，也会造成图像分布不均匀。而相机感光元件响应的非均匀性主要引起高频噪声，需要进行高频校正(如前所述)，而成像系统、照明系统引起的光路非均匀性绝大部分是低频噪声，因此，本申请实施例进一步引入低频校正流程，通过高频校正和低频校正协同实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

更具体的，基于前述内容可知，由于多通道荧光显微镜不同通道的曝光时间和激发光强度量级不尽相同，导致入射光强度不在同一区间，对应的理想响应曲线存在差异，因此不同通道需要进行差异化校正，即需要为每个通道设计对应的高频校正和低频校正方案，基于此，能够最大限度保证平场校正的准确性。

但考虑到多通道荧光显微镜的通道众多，若为每个通道设计对应的高频校正和低频校正方案，将导致平场校正方案的推演过程效率过低，基于此，出于兼顾平场校正的效率和准确性的考虑，本申请实施例优选基于通道分组进行校正，即将入射光强度近似的通道分为一组，共用一套平场校正方案(包括对应的校正步骤及校正参数)。由于入射光强度难以测得，因此，本申请实施例以Dapi通道、Green通道、Red通道、Gold通道、Aqua通道和Dapi-low通道为例，先综合考虑曝光时间和激发光强度，以经验进行通道分组，后续再对各分组的校正结果进行验证，以判断该分组方式是否可行，基于验证结果确定最终的分组方式。在本申请实施例中，优选将上述6个通道分为三组，表1为各通道对应的曝光时间、激发光强度及分组情况：

表1各通道对应的曝光时间、激发光强度及分组情况

基于上述分组，同组通道可以采用相同的校正系数，无需重复计算，能够在保证校正准确性的基础上降低校正的工作量，进而提高平场校正的效率。可以理解的是，激发光强度和曝光时间并非固定值，其可以根据实际应用场景进行调整，相应的，上述分组方式也仅为示例，在实际应用过程中会根据应用场景进行分组调整，本申请实施例对此不作具体限定。

基于此，在多通道荧光显微镜的实际工作过程中，要对拍摄的图像(即原始细胞图像)进行校正，首先需要获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道，进而可以基于所述原始细胞图像的关联通道确定对应的高频校正系数集及校正参照图像集(详见后续实施例)。可以理解的是，所述原始细胞图像的关联通道即拍摄所述原始细胞图像所采用的通道。

步骤120，基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像。

具体的，基于前述内容可知，本申请实施例针对多通道荧光显微镜的平场校正方法包括高频校正和低频校正两个维度。本申请实施例会预先确定各通道/通道组对应的高频校正系数集，基于此，当获取了多通道荧光显微镜实际工作过程中拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道之后，即可基于关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像。

更具体的，所述关联通道对应的高频校正系数集中包括多个校正系数组，各校正系数组与所述原始细胞图像的多个条形子区域一一对应，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的高频校正系数集，确定所述原始细胞图像中目标条形子区域对应的目标校正系数组；

基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正。

所述基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正，具体包括：

确定所述目标校正系数组中的增益校正系数和偏置校正系数；

基于所述增益校正系数、偏置校正系数及所述目标条形子区域中各像素点的原始灰度值，确定所述目标条形子区域中各像素点的灰度校正值。

图8是本申请提供的高频校正的分区方式示意图，如图8所示，由于高像素分辨率的相机以像素为单位进行校正将需要在相机中存储大量校正系数，导致相机存储空间不足，同时还会导致进行校正时获取待校正图像对应的像素值(即灰度值)的效率过低，降低高频校正的效率。因此本申请实施例采用列级校正来实现高频校正，以减少存储空间的占用，同时提高像素值的获取效率。具体的，本申请实施例将图像分成宽为T₁的若干个条形(即矩形)子区域，记为A_n,n∈1,2,…,N，以所述条形子区域为最小单位进行校正，相应的，各条形子区域对应一个校正系数组。基于此，能够大幅降低校正系数所需的存储空间，同时，由于相机存储数据是以行或列为单位，因此，本申请实施例以条形子区域为最小单位进行校正能够与相机存储数据的方式相匹配，进而在校正时仅基于一个指针即可快速获取某一条形子区域的全部像素点对应的像素值，大大提高高频校正的效率。在此基础上，基于所述校正系数组中的增益校正系数和偏置校正系数，即可对条形子区域中各像素点的原始灰度值进行校正得到各像素点的灰度校正值。假设原始细胞图像大小为X×Y，(i,j)表示图像第i行第j列像素，i∈[0,X),j∈[0,Y)，则其具体的校正模型如下：

其中，表示第i行第j列像素的灰度校正值，m(i,j)表示第i行第j列像素的原始灰度值，g_n和o_n分别为条形子区域A_n对应的校正系数组中的增益校正系数和偏置校正系数。可以理解的是，T₁的大小可以根据实际需要进行调整，本申请实施例对此不作具体限定。还可以理解的是，图8所示的条形子区域为竖条形，在实际应用过程中其也可以为横条形，本申请实施例对此不作具体限定。

步骤130，基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

具体的，执行完高频校正之后，本申请实施例进一步基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。所述关联通道对应的校正参照图像集中包括暗场图像、第一明场图像和第二明场图像，所述暗场图像、第一明场图像和第二明场图像是基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板进行拍摄得到的，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布；

基于所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布生成校正细胞图像。

基于前述内容可以理解的是，所述关联通道所属通道组中可以仅包括一个通道(即所述关联通道，对应于一个通道作为一个通道组的情形)。所述关联通道所属通道组中也可以包括多个通道，对于该情形，由于所述关联通道所属通道组中各通道的入射光强度相近，因此，所述目标通道可以为所述目标通道组中的任一通道(当然也可以是所述关联通道)。值得注意的是，不同通道组对应的校正参照图像集不同，因此，在确定了关联通道所属通道组之后才能确定对应的校正参照图像集。对于关联通道所属通道组而言，其对应的校正参照图像集中的暗场图像、第一明场图像和第二明场图像分别记为m₀，m₁和m₂。

所述基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布，具体包括：

基于预设的低频校正分区规则，将所述暗场图像、第一明场图像和高频校正细胞图像划分为多个方形子区域；

基于所述暗场图像和第一明场图像中各方形子区域的灰度平均值，确定所述高频校正细胞图像中各方形子区域的入射光强度。

图9是本申请提供的低频校正的分区方式示意图，如图9所示，为提高低频校正的计算速度，本申请实施例将所述暗场图像、第一明场图像和高频校正细胞图像划分为多个对角线长为T₂的方形子区域，记作B_w,l，w∈1,2,…,W,l∈1,2,…,L。每个方形子区域内的像素组成一个超级像素，其灰度值为内部像素的灰度平均值：

其中，表示B_w,l区域内像素个数。基于此，与高频校正类似的，同样能够大幅降低低频校正的数据存储量和运算量。分区完成后的暗场图像、第一明场图像和高频校正细胞图像分别记为b₀、b₁和b_cell。平场校正最终期望得到的结果为细胞样本发射的真实入射光强度分布，记为Φ_target。标准荧光板分布均匀，其被相机捕获到的入射光也为均匀分布，所以第一明场图像入射光强记为常数Φ₁。低频校正过程如下：

b₀(w,l)＝G·0+O；

b₁(w,l)＝G·Φ₁+O；

b_cell(w,l)＝G·Φ_cell(w,l)+O；

整理上式得：

其中，Φ₁的取值难以测得，因此本申请实施例取经验值，其可根据成像效果进行调整。通过上述的入射光强度分布Φ_target即可得到细胞样本真实的相对亮度，然后将其反应到数字图像上即可生成校正细胞图像，记为M。基于此，通过上述高频校正和低频校正方式，本申请实施例即可实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正，同时实现可接受的存储占用和实时图像输出的功能。

同时，为了兼顾不同应用场景的需求，本申请实施例提出了两种不同的高频校正系数集及校正参照图像集的确定方式：

对于第一种方式，所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定步骤包括：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，将所述潜在校正参照图像集和潜在高频校正系数集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

可以理解的是，该方式能够以最快的速度确定关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集，进而最大限度提升平场校正的效率。但是通过该方式确定的高频校正系数集及校正参照图像集可能存在偏差，因此该方式适用于对平场校正效率要求较高，校正精度要求较低的场景。

对于第二种方式，其适用于对平场校正效率要求较低，校正精度要求较高的场景。为了最大限度保证校正结果的准确性，其设置了验证环节以保证高频校正系数集及校正参照图像集的准确性，具体的，图10是本申请提供的关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定流程示意图，其对应于第二种方式，如图10所示，所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定步骤包括：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，基于所述目标通道对标准荧光板的多个随机位点进行拍摄得到测试图像集，并基于所述关联通道对应的潜在高频校正系数集对所述测试图像集中的各测试图像进行高频校正得到高频校正测试图像集；

步骤S4，基于所述潜在校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像对所述高频校正测试图像集进行低频校正得到校正测试图像集；

步骤S5，判断所述校正测试图像集中各校正测试图像的灰度值是否均在预设范围内，若是，执行步骤S6，若否，重新拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像以得到更新的潜在校正参照图像集，并跳转执行步骤S2；

步骤S6，将当前的潜在高频校正系数集及潜在校正参照图像集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

基于上述内容可以理解的是，第一种方式和第二种方式的步骤S1和S2的操作流程相同，两种方式的区别在于第二种方式增加了后续的验证及调整的流程。

进一步的，所述基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集，具体包括：

基于预设的高频校正分区规则分别将所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像划分为多个条形子区域；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集，确定所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像各条形子区域的平均灰度值，以及第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集。

所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集均是对对应明场图像中心点周围的多个关联位点进行拍摄得到的。

值得注意的是，本申请通过研究发现，通过拍摄标准荧光板得到的校正参照图像也存在不均匀性，而校正参照图像的不均匀性将直接导致后续平场校正的准确性降低。因此，为增强校正参照图像的像素值准确度，无论对于上述第一种方式还是第二种方式，本申请实施例均优选采用多点拍摄的方法对校正参照图像的像素值进行修正。具体的，在基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集(即暗场图像、第一明场图像和第二明场图像)的同时，进一步基于对对应明场图像(即第一明场图像和第二明场图像)中心点周围的多个关联位点进行拍摄得到第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集。图11是本申请提供的校正参照图像集中明场图像的拍摄方式示意图，如图11所示，在明场图像中心点(即图中m)周围八个关联位点拍摄图像，记为m⁽ⁱ⁾,i＝1,2,…,8，得到包括该明场图像在内的共九张图像。以九张图像的灰度平均值作为该明场图像(即第一或第二明场图像)的像素值，计算方式如下：

其中，m₁和m₂为实际图像灰度分布，表现出不均匀性，但对于标准荧光板而言，其图像灰度值理论上应为均匀分布，即所有像素的灰度值相等，由于其处处相等所以像素值为一个常数。和则为理想情况下均匀分布的图像灰度值。基于此，即可基于校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像进行准确的高频校正过程。可以理解的是，图11仅作为示例，在实际应用过程中，所述关联位点的位置和数量可以根据需要进行调整，本申请实施例对此不作具体限定。同时，所述目标位点的位置也可以根据需要进行选择。所述基于预设的高频校正分区规则分别将所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像划分为多个条形子区域即基于与图8类似的方式划分，假设每个条形子区域的平均灰度值记为a_n。对m₁和m₂进行分区，各区域记为A_1,n和A_2,n，灰度值为a_1,n和a_2,n。高频校正的目的是使各感光元件对同样的入射光强度Φ产生同样的输出信号m，即因此高频校正系数的确定过程如下：

其中，表示A_n区域内像素个数。由上式可得到A_n区域的校正系数组为(g_n,o_n)，被记录在校正系数表里。以前述三个通道组为例，对应的校正系数表包括三组数据，记为：

上式中，第一行即对应于第一通道组的高频校正系数集，依此类推。基于此，即可快速准确确定所述关联通道对应的高频校正系数集。

对于第二种方式中的验证过程，所述随机位点的数量可以根据实际需要进行调整，本申请实施例对此不作具体限定。所述预设范围可以表示为 和T分别表示下限比例和上限比例，S为最大灰度值，其是根据图像的位数确定的，例如8位图像最大灰度值为255，二进制1111 1111＝十进制255，同理16位图像最大灰度值为65535。所述下限比例和所述上限比例在不同应用场景取不同值，本申请实施例优选为20％和80％。若所述校正测试图像集中各校正测试图像的灰度值均在预设范围内，则通过验证，否则重新拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像以得到更新的潜在校正参照图像集并计算潜在高频校正系数。此处需要注意的是，重新拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像时，需要更换拍摄位置(即目标点位)，并调节拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像对应的曝光时间。基于此，能够快速对潜在校正参照图像集进行更新，进而保证最终高频校正系数集及校正参照图像集的准确性及获取效率。同时值得注意的是，若基于验证结果确定分组不当，本申请实施例也可将各通道重新分组并重新校正，以最大限度保证高频校正系数集及校正参照图像集的准确性。

图12是本申请提供的平场校正前后的细胞图像对比示意图，其中，左侧为校正前的细胞图像，右侧为校正后的细胞图像；图13是本申请提供的平场校正前后的细胞图像灰度值分布情况的对比示意图，其中，左侧为校正前的细胞图像灰度值分布情况，右侧为校正后的细胞图像灰度值分布情况，结合图12-13可知，校正前图像灰度值分布分散，校正后灰度值分布集中，因此，本申请实施例提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法具有良好的平场校正功能。

本申请实施例提供的方法，获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，能够实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

下面对本申请提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正装置进行描述，下文描述的针对多通道荧光显微镜的平场校正装置与上文描述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法可相互对应参照。

基于上述任一实施例，图14为本申请提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正装置的结构示意图，如图14所示，该装置包括：

原始细胞图像获取模块210，用于获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；

高频校正模块220，用于基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；

低频校正模块230，用于基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

本申请实施例提供的装置，原始细胞图像获取模块210获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；高频校正模块220基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；低频校正模块230用于基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，能够实现多通道荧光显微镜图像的准确高效校正。

基于上述实施例，所述关联通道对应的高频校正系数集中包括多个校正系数组，各校正系数组与所述原始细胞图像的多个条形子区域一一对应，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的高频校正系数集，确定所述原始细胞图像中目标条形子区域对应的目标校正系数组；

基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正。

基于上述任一实施例，所述基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正，具体包括：

确定所述目标校正系数组中的增益校正系数和偏置校正系数；

基于所述增益校正系数、偏置校正系数及所述目标条形子区域中各像素点的原始灰度值，确定所述目标条形子区域中各像素点的灰度校正值。

基于上述任一实施例，所述关联通道对应的校正参照图像集中包括暗场图像、第一明场图像和第二明场图像，所述暗场图像、第一明场图像和第二明场图像是基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板进行拍摄得到的，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布；

基于所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布生成校正细胞图像。

基于上述任一实施例，所述基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布，具体包括：

基于预设的低频校正分区规则，将所述暗场图像、第一明场图像和高频校正细胞图像划分为多个方形子区域；

基于所述暗场图像和第一明场图像中各方形子区域的灰度平均值，确定所述高频校正细胞图像中各方形子区域的入射光强度。

基于上述任一实施例，所述装置还包括高频校正系数集及校正参照图像集确定模块，所述高频校正系数集及校正参照图像集确定模块具体用于执行以下操作：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，将所述潜在校正参照图像集和潜在高频校正系数集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

基于上述任一实施例，所述装置还包括高频校正系数集及校正参照图像集确定模块，所述高频校正系数集及校正参照图像集确定模块具体用于执行以下操作：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，基于所述目标通道对标准荧光板的多个随机位点进行拍摄得到测试图像集，并基于所述关联通道对应的潜在高频校正系数集对所述测试图像集中的各测试图像进行高频校正得到高频校正测试图像集；

步骤S4，基于所述潜在校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像对所述高频校正测试图像集进行低频校正得到校正测试图像集；

步骤S5，判断所述校正测试图像集中各校正测试图像的灰度值是否均在预设范围内，若是，执行步骤S6，若否，重新拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像以得到更新的潜在校正参照图像集，并跳转执行步骤S2；

步骤S6，将当前的潜在高频校正系数集及潜在校正参照图像集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

基于上述任一实施例，所述基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集，具体包括：

基于预设的高频校正分区规则分别将所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像划分为多个条形子区域；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集，确定所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像各条形子区域的平均灰度值，以及第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集。

基于上述任一实施例，所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集均是对对应明场图像中心点周围的多个关联位点进行拍摄得到的。

图15示例了一种电子设备的实体结构示意图，如图15所示，该电子设备可以包括：处理器310、通信接口320、存储器330和通信总线340，其中，处理器310，通信接口320，存储器330通过通信总线340完成相互间的通信。处理器310可以调用存储器330中的逻辑指令，以执行针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，该方法包括：获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

此外，上述的存储器330中的逻辑指令可以通过软件功能单元的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，可以存储在一个计算机可读取存储介质中。基于这样的理解，本申请的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分或者该技术方案的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质中，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本申请各个实施例所述方法的全部或部分步骤。而前述的存储介质包括：U盘、移动硬盘、只读存储器(ROM，Read-Only Memory)、随机存取存储器(RAM，Random Access Memory)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。

另一方面，本申请还提供一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机程序，计算机程序可存储在非暂态计算机可读存储介质上，所述计算机程序被处理器执行时，计算机能够执行上述各方法所提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，该方法包括：获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

又一方面，本申请还提供一种非暂态计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现以执行上述各方法提供的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，该方法包括：获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像。

以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。

通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员可以清楚地了解到各实施方式可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现，当然也可以通过硬件。基于这样的理解，上述技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在计算机可读存储介质中，如ROM/RAM、磁碟、光盘等，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行各个实施例或者实施例的某些部分所述的方法。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，包括：

获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；

基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；

基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像；

所述关联通道对应的高频校正系数集中包括多个校正系数组，各校正系数组与所述原始细胞图像的多个条形子区域一一对应，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的高频校正系数集，确定所述原始细胞图像中目标条形子区域对应的目标校正系数组；

基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正；

所述关联通道对应的校正参照图像集中包括暗场图像、第一明场图像和第二明场图像，所述暗场图像、第一明场图像和第二明场图像是基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板进行拍摄得到的，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布；

基于所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布生成校正细胞图像。

2.根据权利要求1所述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，所述基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正，具体包括：

确定所述目标校正系数组中的增益校正系数和偏置校正系数；

基于所述增益校正系数、偏置校正系数及所述目标条形子区域中各像素点的原始灰度值，确定所述目标条形子区域中各像素点的灰度校正值。

3.根据权利要求1所述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，所述基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布，具体包括：

基于预设的低频校正分区规则，将所述暗场图像、第一明场图像和高频校正细胞图像划分为多个方形子区域；

基于所述暗场图像和第一明场图像中各方形子区域的灰度平均值，确定所述高频校正细胞图像中各方形子区域的入射光强度。

4.根据权利要求3所述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定步骤包括：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，将所述潜在校正参照图像集和潜在高频校正系数集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

5.根据权利要求3所述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集的确定步骤包括：

步骤S1，基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板的目标位点进行拍摄得到潜在校正参照图像集；

步骤S2，基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集；

步骤S3，基于所述目标通道对标准荧光板的多个随机位点进行拍摄得到测试图像集，并基于所述关联通道对应的潜在高频校正系数集对所述测试图像集中的各测试图像进行高频校正得到高频校正测试图像集；

步骤S4，基于所述潜在校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像对所述高频校正测试图像集进行低频校正得到校正测试图像集；

步骤S5，判断所述校正测试图像集中各校正测试图像的灰度值是否均在预设范围内，若是，执行步骤S6，若否，重新拍摄暗场图像、第一明场图像和第二明场图像以得到更新的潜在校正参照图像集，并跳转执行步骤S2；

步骤S6，将当前的潜在高频校正系数集及潜在校正参照图像集分别作为所述关联通道对应的高频校正系数集及校正参照图像集。

6.根据权利要求4或5所述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，所述基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集，具体包括：

基于预设的高频校正分区规则分别将所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像划分为多个条形子区域；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集，确定所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值；

基于所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像各条形子区域的平均灰度值，以及第一明场图像和所述第二明场图像分别对应的理想灰度值，确定所述关联通道对应的潜在高频校正系数集。

7.根据权利要求6所述的针对多通道荧光显微镜的平场校正方法，其特征在于，所述潜在校正参照图像集中的第一明场图像和第二明场图像分别对应的关联图像集均是对对应明场图像中心点周围的多个关联位点进行拍摄得到的。

8.一种针对多通道荧光显微镜的平场校正装置，其特征在于，包括：

原始细胞图像获取模块，用于获取多通道荧光显微镜拍摄的原始细胞图像并确定所述原始细胞图像的关联通道；

高频校正模块，用于基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像；

低频校正模块，用于基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像；

所述关联通道对应的高频校正系数集中包括多个校正系数组，各校正系数组与所述原始细胞图像的多个条形子区域一一对应，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的高频校正系数集对所述原始细胞图像进行高频校正以得到高频校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的高频校正系数集，确定所述原始细胞图像中目标条形子区域对应的目标校正系数组；

基于所述目标校正系数组对所述目标条形子区域中各像素点的灰度值进行校正；

所述关联通道对应的校正参照图像集中包括暗场图像、第一明场图像和第二明场图像，所述暗场图像、第一明场图像和第二明场图像是基于所述关联通道所属通道组中的目标通道对标准荧光板进行拍摄得到的，相应的，所述基于预先确定的关联通道对应的校正参照图像集对所述高频校正细胞图像进行低频校正以得到校正细胞图像，具体包括：

基于所述关联通道对应的校正参照图像集中的暗场图像和第一明场图像，确定所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布；

基于所述高频校正细胞图像对应的入射光强度分布生成校正细胞图像。