CN117137906A - 鸦胆子素a在制备治疗胰腺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，属于癌症药物技术领域。本发明实施例证实了鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，并且所述鸦胆子素A的用量为200mg/kg。本发明实施例证实鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用，鸦胆子素A对人胰腺癌细胞的诱导凋亡率显著高于对照组，鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有诱导凋亡的作用，并且鸦胆子素A(200mg/kg)给药后能够显著降低人胰腺癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制胰腺癌肿瘤的效果，可以在制备治疗胰腺癌药物中应用。

Description

鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用
技术领域
本发明属于癌症药物技术领域，尤其涉及鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
背景技术
胰腺癌(pancreatic cancer)是消化道常见恶性肿瘤之一，在肿瘤领域素有“癌症之王”的称号。据柳叶刀杂志记载，胰腺癌确诊后的五年生存率约10％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌临床症状隐匿且不典型，是诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。胰腺癌诊治困难主要在于其起病隐匿、转移迅速。因此，探索更有效的胰腺癌治疗方法，提高临床疗效的任务迫在眉睫。
关于鸦胆子素的应用很多，大部分为鸦胆子素D的相关专利，鸦胆子素A用于糖尿病肾病、骨代谢性疾病等。鸦胆子素A(bruceine A，BRA)又称鸦胆子苦素A，是从植物鸦胆子[Bruceinejavanica(Linnaeus)Merrill]果实中提取分离的苦木内酯类化合物。中医认为，鸦胆子味苦、性寒，有小毒，归肝经，有清热、解毒、截疟、止痢和腐蚀赘疵之功效。在我国南部地区，鸦胆子多用作抗疟药，临床常将鸦胆子油乳剂用于肺癌及肺癌脑转移、肝癌的辅助治疗，但关于鸦胆子中的单体成分鸦胆子素A是否具有抗肿瘤作用，目前尚无实验数据。
发明内容
本发明实施例提供了鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，旨在解决结直肠癌缺乏有效的天然产物药物治疗的问题，研究发现新的活性高、毒副作用小的治疗胰腺癌的药物。
本发明实施例是这样实现的：
本发明实施例的胰腺癌细胞实验结果显示：鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用；鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有诱导凋亡的作用；鸦胆子素A对人胰腺癌细胞的集落形成抑制作用。
本发明实施例的裸鼠皮下移植胰腺癌细胞系PATU8988T肿瘤模型的药效实验结果显示：鸦胆子素A(200mg/kg)给药后能够显著降低人胰腺肠癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制胰腺癌肿瘤的效果。
经过本发明实施例证实，鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
所述的鸦胆子素A的分子式：C26H34O11；分子量：522.5416，结构式如式I所示：
上述的鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，可单独给药或者联合治疗。
所述的联合治疗，包括放疗，化疗，手术治疗。
所述鸦胆子素A可以为任何药物治疗学上可接受的剂型。
所述鸦胆子素A可以为任何药物治疗学上可接受的剂量。优选的，所述鸦胆子素A的用量为200mg/kg。
本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：
1.鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用。
2.鸦胆子素A对人胰腺癌细胞的诱导凋亡率显著高于对照组，鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有诱导凋亡的作用。
3.鸦胆子素A(200mg/kg)给药后能够显著降低人胰腺癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制胰腺癌肿瘤的效果，可以在制备治疗胰腺癌药物中应用。
附图说明
图1为鸦胆子素A对人胰腺癌PanC1、MIAPaca-2和PATU8988T细胞的增殖抑制作用的细胞活性测定结果图。其中，结果图中的数据以“各作用浓度平均抑制率±标准偏差”表示。
图2为鸦胆子素A各剂量组处理PATU8988T细胞以后的凋亡率的结果图。
其中，数据以“平均值±标准偏差”表示；用单因素方差分析(one-wayANOVA)以及Dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各治疗组之间相对肿瘤体积显著性差异，P值小于0.05被认为具有显著性差异。
图3为鸦胆子素A各剂量组抑制胰腺癌细胞PATU8988T的增殖潜能的结果图。其中数据以“平均值±标准偏差”表示，用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及Dunnett'smultiple comparisons test检验比较对照组与各剂量组之间EdU标记率的显著性差异。P值小于0.05被认为具有显著性差异。
图4为人胰腺癌PATU8988T皮下移植肿瘤模型中各组肿瘤生长情况结果图。
其中，数据以“平均值±标准偏差”表示；用单因素方差分析(one-wayANOVA)以及Dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各治疗组之间相对肿瘤体积显著性差异，P值小于0.05被认为具有显著性差异。
图5为给药完成以后PATU8988T皮下移植肿瘤模型中各实验组肿瘤拍照结果图。
图6为鸦胆子素A完成裸鼠PATU8988T移植肿瘤给药后的瘤重结果图。其中，数据以“平均值±标准偏差”表示；用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及Dunnett's multiplecomparisons test检验比较溶媒对照组与鸦胆子素A给药组之间瘤重的显著性差异，P值小于0.05被认为具有显著性差异。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，胰腺癌的治疗缺乏天然产物药物的有效治疗，为了解决上述技术问题，本发明提出了一种鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
以下实施例所使用的实验材料如下：人胰腺癌细胞系PanC1、MIAPaca-2和PATU8988T由河南省工业微生物菌种工程技术研究中心提供；96孔板购自Costar公司(目录号：3599)；DMEM高糖培养基购自Gibco公司(目录号：C11995500BT)；胎牛血清购自Gibco公司(目录号：10270-106)；CCK-8试剂盒购自美仑生物(目录号：MA0218)；DMSO购自北京索莱宝科技有限公司(目录号：D8370)；鸦胆子素A(Bruceine A，BRA)购自湖北永阔科技有限公司(目录号JOT-11226，批次22061309),HPLC纯度98.73％，-20℃密封保存。
以下实施例所使用的实验仪器如下:
实验仪器:超净工作台(苏州净化型号BHC-1000IIA2)，CO2培养箱(Thermo型号:3111)，酶标仪(Thermo Multiscan MK3)。
实施例一：鸦胆子素A对人胰腺癌细胞生长的影响
实验方法:称量2mg，加入0.38mL DMSO溶解，配制成10mM/L溶液。使用CCK-8法评价鸦胆子素A对人胰腺癌细胞的生长抑制作用：将人胰腺癌细胞(PanC1、MIAPaca-2和PATU8988T)用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清+90％DMEM培养基)混匀制成浓度为2×104个/mL的细胞悬液。将96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔2×103个细胞)，然后置于37℃5％CO2培养箱中培养16小时；用完全培养基稀释药物至所需的不同梯度浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立溶媒(DMSO)对照组和无细胞培养液对照，再将96孔板置于37℃5％CO2培养箱中培养72小时。然后每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2小时，在λ＝450nm波长下用酶标仪检测每孔的吸光度即OD值，以各复孔的平均值减去无细胞培养液平均值作为该组细胞的OD值，与溶媒对照比较，计算药物处理后的细胞存活率。
结果如图1所示，鸦胆子素A对人胰腺癌PanC1、MIAPaca-2和PATU8988T细胞具有显著的生长抑制作用，其半数抑制浓度(IC50)均小于150nM/L，分别为134.0nM/L、133.4nM/L和53.1nM/L。
实施例二：鸦胆子素A对人胰腺癌细胞的凋亡诱导作用
供试品：所述鸦胆子素A溶液由实施例一中所述方法制备而成。
处理方法：将人胰腺癌细胞PATU8988T用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清+90％DMEM培养基)混匀制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，加入预先置有盖玻片的24孔板，每孔加入0.5mL细胞悬液,然后置于37℃5％CO2培养箱中培养16小时。设置溶剂对照组(DMSO)、BRA高剂量组(250nM/L)和BRA低剂量组(50nM/L)。药物处理细胞72h后，PBS洗涤1次，加入4％多聚甲醛固定细胞爬片，然后加入100μL TUNEL标记液标记凋亡细胞，避光孵育，使用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，每个细胞爬片在20×物镜视野下随机计数6个视野的TUNEL阳性细胞。
结果如图2所示，TUNEL实验结果表明，鸦胆子素A各剂量组(50nM/L和250nM/L)对PATU8988T细胞的凋亡率均显著高于溶媒(DMSO)对照组(BRA(50nM/L)vs.溶媒，P＝0.0305；BRA(250nM/L)vs.溶媒，P＝0.0005)。
实施例三：鸦胆子素A抑制人胰腺癌细胞的增殖潜能(EdU实验)
供试品：所述鸦胆子素A溶液由实施例一中所述方法制备而成。
处理方法：将人胰腺癌细胞PATU8988T用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清+90％DMEM培养基)混匀制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，加入预加盖玻片的24孔培养板，每孔加入0.5mL细胞悬液，然后置于37℃5％CO2培养箱中培养16小时。设置溶剂对照组(DMSO)、BRA高剂量组(250nM/L)和BRA低剂量组(50nM/L)。药物处理48h后，加入10μM/L的EdU溶液标记增殖细胞。PBS洗涤1次，加入4％多聚甲醛固定细胞爬片，然后加入EdU检测液避光孵育30分钟，使用含DAPI的防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察EdU标记情况，每个细胞爬片在20×物镜视野下随机计数4个视野的EdU阳性细胞。
结果如图3所示，EdU实验结果表明，与溶媒(DMSO)对照组比较，鸦胆子素A各剂量组(50nM/L和250nM/L)均显著抑制PATU8988T细胞的增殖潜能(BRA(50nM/L)vs.溶媒，P＝0.0003；BRA(250nM/L)vs.溶媒，P<0.0001)。
实施例四：裸鼠皮下移植胰腺癌细胞系PATU8988T肿瘤模型的药效实验
实验动物：BALB/c裸鼠，雌雄各半，4周龄，体重约17g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCX K(湘)2019-0004，动物合格证编号：430727231100076286。饲养环境：SPF级。
实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度20-26℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物；实验动物打耳标进行标记。
实验材料：鸦胆子素A(Bruceine A，BRA)购自湖北永阔科技有限公司(目录号JOT-11226，批次22061309)，HPLC纯度98.73％，-20℃密封保存。PEG300购自江苏省海安石油化工厂，PBS购自天津灏洋华科生物科技有限公司，DMSO购自北京索莱宝科技有限公司。
药物配制：称取鸦胆子素A粉末，溶解于溶媒溶液中(10％DMSO+30％PEG300+60％PBS)中。
实验方法：人胰腺癌PATU8988T细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养液(购自美国Gibco公司)中。收集指数生长期的PATU8988T细胞，PBS重悬至适合浓度(2×107/mL)细胞悬液用于裸鼠皮下肿瘤接种。裸鼠右侧腋下接种100μL细胞悬液(含2×106PATU8988T细胞)。待肿瘤生长至平均体积大约70mm3时，根据肿瘤大小随机分组，雌雄各半，分组当天给药，给药当天定义为第0天。裸鼠通过口服灌胃给药，给药体积为100μL/裸鼠。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤长径a和短径b。
表1.给药方案说明书
给药11天以后，人PATU8988T细胞皮下移植肿瘤模型中各组肿瘤生长变化的裸鼠拍照图如图4所示。
实验结果：给药期间无裸鼠死亡，可以耐受给药。分组给药的第12天，溶媒对照组瘤体积779.6±96.4mm3，结束试验，取瘤并称瘤重。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(a×b2)(其中a表示长径，b表示短径)。结束试验时，鸦胆子素A 200mg/kg给药组的平均瘤体积为341.9±87.6mm3，相较对照组有统计学上的显著性差异(P<0.0001)(见图4)；
在实验终点采集肿瘤样本并测量瘤重(g)，其结果与瘤体积测量结果一致。给药组和对照组瘤重见图5。与溶剂对照瘤重(0.656±0.094g)相比，鸦胆子素A 200mg/kg给药后的瘤重为0.283±0.091g，差异具有显著意义(P<0.0001)。结果表明，鸦胆子素A在胰腺癌移植肿瘤模型中具有良好的体内抗肿瘤活性。
本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：
1.鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用。
2.鸦胆子素A对人胰腺癌细胞的诱导凋亡率显著高于对照组，鸦胆子素A对人胰腺癌细胞具有诱导凋亡的作用。
3.鸦胆子素A(200mg/kg)给药后能够显著降低人胰腺癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制胰腺癌肿瘤的效果，可以在制备治疗胰腺癌药物中应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述的鸦胆子素A的结构式如式I所示：
3.根据权利要求1所述的鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于：可单独给药或者联合治疗。
4.根据权利要求3所述的鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述的联合治疗，包括放疗，化疗，手术治疗。
5.根据权利要求1所述的鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述鸦胆子素A可以为任何药物治疗学上可接受的剂型。
6.根据权利要求1所述的鸦胆子素A在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述鸦胆子素A可以为任何药物治疗学上可接受的剂量。
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