CN117122688B

CN117122688B - 作用于前脑兴奋性神经元的prrt2及其上调剂的应用

Info

Publication number: CN117122688B
Application number: CN202311118635.7A
Authority: CN
Inventors: 熊志奇; 陆斌; 吴雪妹; 何俊彦; 张静
Original assignee: Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology Chinese Academy of Sciences
Current assignee: Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2023-08-31
Filing date: 2023-08-31
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2043-08-31
Also published as: CN117122688A

Abstract

本发明提供了一种选择性作用于前脑兴奋性神经元的富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline‑rich transmembrane protein 2,PRRT2)的上调剂的用途，用于制备治疗或预防癫痫的药物。

Description

作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2及其上调剂的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2及其上调剂的应用。

背景技术

癫痫是较为典型的由兴奋-抑制失衡所致的中枢神经系统疾病，临床表现主要有惊厥、肌痉挛、强直性抽搐、失张力以及失神等，并伴有短暂的意识丧失，发作时患者脑电呈现癫痫样放电特征。癫痫发作具有突然性和反复发作的特性，这给患者的身体和心理健康以及正常社会活动造成了严重影响。癫痫的病因较为多样，目前已知的致病因素包括发育异常、遗传突变、颅脑损伤、脑血管疾病和炎症等。除了少部分自限性癫痫之外，大部分癫痫患者需要通过治疗实现对癫痫的控制。目前在临床使用的治疗方法主要包括药物治疗、手术切除局部病灶、生酮饮食、迷走神经刺激以及深部脑刺激等，其中超过三分之二的癫痫患者主要通过抗癫痫药物进行癫痫控制。尽管从上世纪50年代至今已陆续推出了针对不同靶点的30余款抗癫痫药物，形成了较为有效的临床治疗方案，但仍有约30％的难治性癫痫患者不能从这些药物或药物组合中获益。另外，对现有药物有良好响应的部分癫痫患者也依然面临长期用药期间药物不良反应以及癫痫无法完全控制的困扰。以上未能满足的医疗需求是新机制研究以及新疗法研发的重要驱动力。

神经网络的稳态平衡依赖于兴奋性和抑制型神经元相互协作，而癫痫主要表现为神经网络稳态失衡导致的大脑异常同步性兴奋。因此，理想的癫痫干预策略是通过药物或其它治疗手段选择性的降低兴奋性神经元活动或者提高抑制型神经元活动，以此纠正神经网络的异常兴奋并使其回归正常的稳态；同时，干预方案应尽量避免或减少对非癫痫相关神经网络的干扰，如运动、觉醒、认知和情感环路等，以此降低长期用药时的不良反应。

电压门控型钠离子通道(以下简称钠离子通道或Nav)是脑内神经元动作电位产生和脉冲传导所依赖的重要分子，是神经组织兴奋性的基础。在癫痫治疗领域，钠离子通道是抗癫痫药物的重要靶点。目前批准临床使用的抗癫痫药物中有超过四分之一的药物以此类通道为靶点，包括苯妥英钠(Sodium Phenytoin)、卡马西平(Carbamazepine)、奥卡西平(Oxcarbazepine)和拉考沙胺(Lacosamide)等。这些药物的作用机理是通过调节钠离子通道活性，降低神经网络的兴奋性，进而减少或阻止相关类型的癫痫发作。尽管钠离子通道为靶点的抗癫痫药物在癫痫治疗中已获得广泛应用，但其中枢不良反应(如头晕、嗜睡、共济失调和易怒等)仍未得到有效解决。

缺乏细胞类型选择性以及细胞状态选择性不佳是目前小分子抗癫痫药物产生中枢不良反应的主要原因。在中枢神经系统，电压门控型钠离子通道主要有四个亚型(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6)，它们分布于发育不同阶段的不同类型神经元内。例如，在与癫痫直接相关的前脑，Nav1.2和Nav1.6主要分布于以谷氨酸(Glutamate)为主要神经递质的兴奋性神经元，而Nav1.1则主要分布于以γ-氨基丁酸(GABA)为主要神经递质的抑制型中间神经元；在与运动调节相关的小脑皮层，Nav1.1、Nav1.2和Nav1.6分别或组合表达于GABA能中间神经元，颗粒细胞和浦肯野神经元。以钠离子通道为靶点的抗癫痫药物，由于其普遍缺乏钠离子通道成员间的选择性，在其进入中枢后会作用于非癫痫相关的神经细胞群，引起中枢不良反应。尤其值得关注的是，以钠离子通道为靶点的抗癫痫药物对前脑抑制型中间神经元的抑制，在一定程度上会降低大脑抑制性神经网络的功能，部分抵消抗癫痫药物对兴奋性神经网络的抑制功效，弱化其抗癫痫疗效，在某种情况下(如德拉韦综合征，Dravet syndrome)甚至还会恶化癫痫病情。

除了缺乏细胞类型选择性导致的不良反应，药物缺乏有效的细胞状态选择性也是其产生不良反应的重要原因。细胞状态选择性是指抗癫痫药物或治疗手段能够作用于癫痫发作时呈现异常兴奋状态的细胞，而不干扰非癫痫状态下同类细胞的正常功能。考虑到癫痫治疗往往需要长期使用药物，对细胞癫痫状态选择性不佳的药物，常会导致患者在日常用药期间(非癫痫状态)感到不适，影响他们的日常生活与工作，甚至导致患者用药中断而使癫痫复发。

因此，本领域亟需以钠离子通道为靶点，研发具有细胞类型选择性以及细胞状态选择性的药物，从而增强癫痫的干预效果并减少副作用，促进癫痫的精准化治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种选择性作用于前脑兴奋性神经元的富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2,PRRT2)的上调剂的用途，用于制备治疗或预防癫痫的药物。

在本发明的第一方面，提供一种选择性作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2的上调剂的用途，用于制备治疗或预防癫痫的药物。

在一种或多种实施方式中，所述上调为显著性的上调、促进、增加或提高；例如上调、促进、增加或提高10％、20％、30％或更高。

在一种或多种实施方式中，所述选择性作用于前脑兴奋性神经元包括：选择性作用于钠离子通道(较佳为Nav1.2和Nav1.6)慢失活，和/或选择性作用于细胞异常兴奋性。

在一种或多种实施方式中，所述治疗或预防癫痫包括：降低癫痫发作的次数、频率、水平和/或持续时间。

在一种或多种实施方式中，所述治疗或预防癫痫不影响受试者的日常行为。

在一种或多种实施方式中，通过小鼠行为学实验评估癫痫发作的次数、频率、水平和/或持续时间。较佳地，所述行为学实验包括脑电和行为观察。

在一种或多种实施方式中，通过小鼠行为学实验评估日常行为，所述行为学实验包括但不限于：旷场测试、转轮测试、社交行为测试。

在一种或多种实施方式中，所述用途的受试者包括：人、非人灵长类动物和啮齿类动物。

在一种或多种实施方式中，所述选择性作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2的上调剂为构建体、或该构建体形成的表达系统(例如病毒(感染)系统)；所述构建体包括：表达驱动系统，以及由该驱动系统驱动表达的PRRT2编码基因。

在一种或多种实施方式中，所述表达驱动系统包括单一、或组合形式的前脑兴奋性神经元特异性表达驱动系统。

在一种或多种实施方式中，所述前脑兴奋性神经元特异性表达驱动系统包括单一形式的前脑谷氨酸能神经元特异性启动子，包括(但不限于)：CaMKIIa启动子；单一形式的启动子用于直接驱动PRRT2的表达。

在一种或多种实施方式中，所述前脑兴奋性神经元特异性表达驱动系统包括组合形式的前脑谷氨酸能神经元特异性启动子，包括(但不限于)：用于驱动Cre重组酶表达的前脑兴奋性神经元特异性启动子(如Emx1启动子或CaMKIIa启动子)和用于驱动PRRT2表达的强效启动子(如但不限于beta-actin promoter(CAG)启动子)；组合形式的表达驱动系统用于兼顾前脑兴奋性神经元特异性和高效表达特性。

在一种或多种实施方式中，所述构建体包括依赖于Cre重组酶的操作性基因表达调控元件，如(但不限于)Double-floxed inverse orientation，DIO)；较佳地，所述用于DIO的元件为LoxP/Lox2272，利用基于LoxP和Lox2272的特定识别序列进行Cre重组酶依赖的PRRT2的表达。

在一种或多种实施方式中，所述构建体包括：构建体1，包括顺序连接的：启动子(如但不限于beta-actin promoter)，LoxP/Lox2272，PRRT2编码基因，LoxP/Lox2272；所述PRRT2编码基因反向连接于两对LoxP/Lox2272序列之间；构建体2：包括顺序连接的：前脑兴奋性神经元特异性表达启动子，Cre重组酶编码基因(如Emx1启动子驱动Cre重组酶编码基因的表达)。

在一种或多种实施方式中，通过前脑兴奋性神经元特异性表达启动子驱动Cre重组酶编码基因表达；Cre重组酶作用于LoxP/Lox2272，使得反向的PRRT2编码基因转变成正向连接，由其启动子驱动表达。

在一种或多种实施方式中，还可设置诱导表达系统(如但不限于Tet-on/off)以实现可调控的PRRT2表达的开闭。

在一种或多种实施方式中，所述的构建体包含在表达载体中或经基因编辑直接插入在干预对象基因组中；所述表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的病毒载体包括：腺相关病毒(AAV)载体，慢病毒载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体；更佳地，所述腺相关病毒载体包括：PHP.eB血清型AAV载体、Cap-B10血清型AAV载体；或所述基因编辑包括(但不限于)基于CRISPR-Cas(如Cas9)技术的基因编辑。

在一种或多种实施方式中，所述的PRRT2为斑马鱼来源的PRRT2，人源的PRRT2或鼠源的PRRT2；较佳地为斑马鱼来源的PRRT2。

在一种或多种实施方式中，所述PRRT2为：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4或6所示的蛋白；(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(d)(a)～(c)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列或分泌信号序列后形成的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种治疗或预防癫痫的构建体，包括：表达驱动系统，以及由该驱动系统驱动表达的PRRT2编码基因。

在一种或多种实施方式中，所述构建体包括操作性连接的：依赖于Cre重组酶的操作性基因表达调控元件，如(但不限于)Double-floxed inverse orientation，DIO)；较佳地，所述用于DIO的元件为LoxP/Lox2272，利用基于LoxP和Lox2272的特定识别序列进行Cre重组酶依赖的PRRT2的表达。

在一种或多种实施方式中，所述的构建体包含在表达载体中或经基因编辑直接插入在干预对象基因组中，所述表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的病毒载体包括：腺相关病毒(AAV)载体，慢病毒载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体；更佳地，所述腺相关病毒载体包括：PHP.eB血清型AAV载体、Cap-B10血清型AAV载体。

在一种或多种实施方式中，所述基因编辑包括(但不限于)基于CRISPR-Cas(如Cas9)技术的基因编辑。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防癫痫的表达系统，其为病毒系统，由所述的病毒载体包装获得。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防癫痫的药物或含有所述药物的药盒，所述药物含有所述的表达系统。

在本发明的另一方面，提供一种将有效量的PRRT2、或所述选择性作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2上调剂选择性递送至前脑兴奋性神经元的方法，包括使所述前脑兴奋神经元与包含有效量的PRRT2、或其上调剂的表达载体接触；较佳地，所述表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；更佳地，所述的病毒载体包括：腺相关病毒(AAV)载体，慢病毒载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体；更更佳地，所述腺相关病毒载体包括：PHP.eB血清型AAV载体、Cap-B10血清型AAV载体；较佳地，所述表达载体通过眶内注射(较佳为眶静脉注射)、颅内注射、鞘内(脊髓)注射、鞘内(大脑池)注射、脑内注射、心室内注射、直接注射到大脑中的癫痫病灶的方式进行递送。

在本发明的另一方面，提供一种选择性作用于钠离子通道慢失活，选择性作用于细胞异常兴奋性，和/或选择性作用于前脑兴奋性神经元的方法，包括给予受试者有效量的PRRT2、或其上调剂(较佳为过表达该PRRT2的表达载体)。

本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、小鼠Prrt2基因编码蛋白区域(CDS)序列。

图2、小鼠PRRT2蛋白氨基酸序列。

图3、EGFP对照质粒pCAG-empty-IRES-EGFP示意图。

图4、小鼠PRRT2过表达质粒pCAG-mouse PRRT2(HA)-IRES-EGFP示意图。

图5、人PRRT2基因编码蛋白区域(CDS)序列。

图6、人PRRT2蛋白氨基酸序列。

图7、人PRRT2过表达质粒pCAG-human PRRT2(HA)-IRES-EGFP示意图。

图8、斑马鱼Prrt2基因编码蛋白区域(CDS)序列。

图9、斑马鱼PRRT2蛋白氨基酸序列。

图10、斑马鱼PRRT2过表达质粒pCAG-zebra PRRT2(HA)-IRES-EGFP示意图。

图11、PRRT2过表达对Nav1.2钠离子通道进入快失活过程的影响。

(A)稳转Nav1.2的HEK293细胞钠通道电流记录示意图。

(B)上方为激活钠离子通道的电压钳制方案示意图。下方为代表性钠通道电流曲线。电压门控型钠通道Nav1.2在细胞被钳制到0mV时通道开放，钠离子内流形成内向钠电流。钠通道在短暂开放后快速失活，通道关闭，钠电流迅速衰减，如箭头所示。

(C)钠离子通道快失活导致钠电流衰减，衰减速度用时间常数tau进行表征。过表达PRRT2组钠电流衰减的时间常数与过表达EGFP对照组相比，未见显著差异(n.s.P>0.05)。mPRRT2：小鼠PRRT2。

图12、PRRT2过表达对Nav1.2钠离子通道从快失活恢复的影响。

(A)上方为检测钠离子通道从快失活恢复的电压钳制方案示意图。下方分别为对照组细胞第一次去极化时测得的钠电流示例，以及快失活的钠离子通道经历不同时长的超极化恢复期后测得的钠电流示例。

(B)钠离子通道从快失活状态恢复的过程。过表达mPRRT2组与过表达EGFP对照组相比，未见显著差异(n.s.P>0.05)。mPRRT2：小鼠PRRT2。

图13、PRRT2过表达对Nav1.2钠离子通道进入慢失活过程的影响。

(A)上方为检测钠离子通道进入慢失活状态的电压钳制方案示意图。下方分别为对照组细胞第一次去极化时测得的钠电流示例，以及钠离子通道经历不同时长的去极化后，间隔短暂超极化后测得的钠电流示例。

(B)钠离子通道进入慢失活状态的过程。与过表达EGFP的对照组相比，过表达mPRRT2组的钠离子通道在持续的去极化过程中更快的进入慢失活状态。两组间存在显著性差异(P<0.0001)。mPRRT2：小鼠PRRT2。

图14、PRRT2过表达对Nav1.2钠离子通道从慢失活恢复的影响。

(A)上方为检测钠离子通道从慢失活恢复的电压钳制方案示意图。下方分别为第一次去极化时测得的钠电流示例，以及慢失活的钠离子通道经历不同时长的超极化恢复期后测得的钠电流示例。

(B)钠离子通道从慢失活状态恢复的过程。与过表达EGFP的对照组相比，过表达mPRRT2组的钠离子通道从慢失活状态恢复的速度更慢。两组间存在显著差异(P<0.001)。

图15、斑马鱼PRRT2过表达对Nav1.2钠离子通道慢失活的影响。

(A)小鼠、人和斑马鱼PRRT2蛋白氨基酸序列比对。小鼠和人的PRRT2蛋白氨基酸序列一致性为77.46％，斑马鱼和小鼠的PRRT2蛋白氨基酸序列一致性为43.6％。序列中底部横线标注了PRRT2的C末端(包含跨膜段)。

(B)钠离子通道进入慢失活状态的过程。与过表达EGFP的对照组相比，过表达mPRRT2、hPRRT2和zPRRT2组的钠离子通道在持续的去极化过程中更快的进入慢失活状态，组间存在显著性差异(P<0.0001)。

(C)钠离子通道从慢失活状态恢复的过程。与过表达EGFP的对照组相比，过表达mPRRT2、hPRRT2和zPRRT2组的钠离子通道从慢失活状态恢复的速度更慢，组间存在显著差异(P<0.0001)。另外，过表达zPRRT2组的钠离子通道从慢失活状态恢复的速度显著慢于mPRRT2和hPRRT2组，组间存在显著差异(P<0.0001)。mPRRT2：小鼠PRRT2，hPRRT2：人PRRT2，zPRRT2：斑马鱼PRRT2。

图16、腺相关病毒过表达mCherry质粒pAAV-CAG-DIO-mCherry示意图。

图17、腺相关病毒过表达小鼠PRRT2质粒pAAV-CAG-DIO-mouse PRRT2-HA示意图。

图18、前脑兴奋性神经元过表达PRRT2。

(A)Emx1-cre小鼠眶静脉注射AAV-PHP.eB病毒示意图。

(B)在前脑兴奋性神经元中选择性过表达PRRT2示意图。PRRT2-OE：PRRT2over-expression。

(C)荧光免疫组化验证PRRT2在前脑兴奋性神经元的表达。

图19、前脑兴奋性神经元过表达PRRT2抑制惊厥剂诱导的癫痫发作。

(A)惊厥剂(戊四唑，PTZ，45mg/kg,腹腔注射)诱导小鼠癫痫行为代表性示例。

(B)与对照组相比，前脑兴奋性神经元过表达PRRT2显著降低了戊四唑诱导的小鼠癫痫发作级别，两组的发作级别存在显著性差异(P<0.0001)。PTZ：pentylenetetrazol；PRRT2-OE：PRRT2 over-expression。

图20、前脑兴奋性神经元过表达PRRT2抑制惊厥剂诱导的癫痫样脑电。

(A)小鼠脑电记录示意图。

(B)代表性脑电示例。戊四唑(PTZ)可以诱导小鼠大脑皮层出现癫痫样脑电信号；在前脑兴奋性神经元过表达PRRT2可以有效抑制戊四唑诱导的小鼠大脑皮层癫痫样放电事件。

图21、前脑兴奋性神经元过表达PRRT2不影响小鼠正常行为活动。

(A)在旷场测试中，两组小鼠的活动总距离相似，未检测到显著性差异(n.s.P>0.05)。

(B)在转轮测试中，两组小鼠在定速转轮上维持的时间相似，未检测到显著性差异(n.s.P>0.05)。该测试的时间上限为60秒。

(C)在社交行为测试中，两组动物均表现出与同伴小鼠的交流倾向，且两组动物间未检测到显著性差异(n.s.P>0.05)。Empty表示空盒组，Novel表示陌生小鼠组。

图22、前脑抑制型神经元过表达PRRT2易化惊厥剂诱导的癫痫发作。

(A)Nkx2.1-cre小鼠眶静脉注射AAV-PHP.eB病毒示意图。

(B)在前脑抑制型神经元中选择性过表达PRRT2示意图。

(C)荧光免疫组化验证PRRT2在前脑抑制型神经元的表达。标尺为1mm。

(D)阈下剂量的惊厥剂(戊四唑，PTZ，35mg/kg,腹腔注射)诱导Nkx2.1-cre小鼠癫痫行为的代表性示例；PTZ：pentylenetetrazol。

(E)与对照组相比，前脑抑制性神经元过表达PRRT2显著增强了阈下剂量戊四唑诱导的Nkx2.1-cre小鼠癫痫发作级别，两组的发作级别存在显著性差异(P<0.01)。PRRT2-OE：PRRT2 over-expression。

(F)小鼠脑电记录示意图。

(G)代表性脑电示例。阈下剂量的戊四唑无法诱导对照组小鼠大脑皮层出现癫痫样脑电信号；但是在前脑抑制性神经元过表达PRRT2组小鼠中，阈下剂量的戊四唑可以诱导小鼠大脑皮层癫痫样放电事件。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次发现PRRT2(富含脯氨酸的跨膜蛋白2，proline-rich transmembrane protein 2)基因编码的蛋白可以选择性作用于慢失活状态的钠离子通道，并通过增强钠离子通道的慢失活进而减少可激活钠离子通道的有效供给。进一步地，发明人通过在前脑兴奋性神经元中选择性过表达PRRT2蛋白，反馈式降低异常兴奋状态神经元的兴奋性，在小鼠癫痫模型中，实现了在不干扰日常行为的基础上有效抑制癫痫发作的目标。前脑兴奋性神经元特异性表达PRRT2是成功干预癫痫并减少副作用的关键。在前脑兴奋性神经元中表达PRRT2，同时具备细胞类型选择性和细胞状态选择性，在癫痫治疗领域具有良好应用前景。

PRRT2和钠离子通道

在本发明中，术语“PRRT2”包括具有SEQ ID NO:2(小鼠)、SEQ ID NO:4(人)、或SEQID NO:6(斑马鱼)的蛋白，也包括具有与PRRT2相同功能的序列的变异形式。

这些变异形式包括但并不限于：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PRRT2的活性片段和活性衍生物。

上述术语“PRRT2”还包括与上述SEQ ID NO:2、4或6所限定的多肽序列的同源性为80％或更高；较佳地同源性为85％或更高，如同源性90％，95％，98％或99％)的、且具有本发明中实施例中所涉及的PRRT2相同功能的蛋白也包括在本发明内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸或多肽之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

编码PRRT2或其变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。在一些实施方案中，编码PRRT2蛋白的多核苷酸序列(编码序列)是SEQID NO:1、3或5所示的多核苷酸序列。

本发明人的研究工作中，发现PRRT2(proline-rich transmembrane protein 2)基因编码的蛋白可以选择性作用于慢失活状态的钠离子通道，即，PRRT2过表达可以促进钠离子通道的慢失活，但对钠离子通道快失活影响不显著。PRRT2具有钠离子通道状态依赖性调控特征，通过增强钠离子通道的慢失活，减少持续去极化状态下细胞钠离子通道的有效供给。PRRT2的该特征有利于其在不影响细胞正常兴奋性活动的情况下，降低细胞的异常兴奋性，使其具有良好的细胞状态选择性。

基于此发现，发明人利用腺相关病毒作为基因递送载体，通过在前脑兴奋性神经元中选择性过表达PRRT2蛋白，反馈式降低异常兴奋状态神经元的兴奋性，通过小鼠癫痫模型的动物试验发现，选择性靶向PRRT2治疗可以在不干扰日常行为的基础上有效抑制癫痫发作。

本发明中，术语“电压门控型钠离子通道”、“钠离子通道”、“Nav”可互换使用。

作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2及其上调剂的应用

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种选择性作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2的上调剂的用途，用于制备治疗或预防癫痫的药物。

本发明所述的“受试者”包括但不限于：人、非人灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠)。

本领域技术人员知晓，“癫痫”发作可以分为不同水平，包括但不限于：强直-阵挛、强直、阵挛、肌阵挛、失神或失张力发作。在小鼠模型中，癫痫发作可以分为六级，分别是：一级：小鼠伏地不动，腹部贴地爬行；二级：突发性抽搐，行为突然停止，尾巴翘起；三级：肌肉阵挛，头部扭转，抬手抽搐；四级：强直-阵挛，倒地抽搐，疯跳疯跑；五级：倒地并发展至四肢强直性伸直；六级：死亡。

在一种或多种实施方式中，通过PRRT2的上调剂，选择性作用于前脑兴奋性神经元，可以将受试者所经历的癫痫发作的次数、频率、水平和/或持续时间降低约5％、约10％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。

所述“选择性作用”是相对的，例如，相对于非前脑兴奋性神经元，对前脑兴奋性神经元的作用增加约5％、约10％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。

所述“兴奋性神经元”是指可以释放神经递质例如谷氨酸的一种神经元，其可以导致连接的突触后神经元变得更可能被激发。所述“抑制性神经元”是指可以释放神经递质例如γ氨基丁酸的一种神经元，其可以导致连接的突触后神经元变得更不容易被激发。

如本发明所用，所述的PRRT2的上调剂包括了激动剂、促进剂、兴奋剂等，这些术语可互换使用。所述的PRRT2的上调剂是指任何可提高PRRT2的活性、增强PRRT2的稳定性、上调PRRT2的表达、增加PRRT2有效作用时间、或促进PRRT2基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调PRRT2有用的物质，从而可用于治疗或预防癫痫。

在一种或多种实施方式中，所述的PRRT2的上调剂包括(但不限于)：构建体、或该构建体形成的表达系统(例如病毒(感染)系统)；所述构建体包括：前脑兴奋性神经元特异性表达驱动系统，以及由该驱动系统驱动表达的PRRT2编码基因。通常，所述前脑兴奋性神经元特异性表达驱动系统包括前脑兴奋性神经元特异性表达启动子。作为本发明的优选方式，所述前脑兴奋性神经元特异性表达启动子包括：Emx1启动子和CaMKIIa启动子。

在一种或多种实施方式中，所述构建体包括：启动子，用于DIO的元件，PRRT2编码基因表达盒(较佳地，PRRT2编码基因反向连接)，前脑兴奋性神经元特异性表达启动子驱动的Cre重组酶编码基因；较佳地，所述用于DIO的元件为LoxP/Lox2272元件，利用基于LoxP和Lox2272的DIO调控方法进行cre重组酶依赖的PRRT2的表达。

作为本发明的优选方式，所述构建体包括：

构建体1，包括顺序连接的：启动子(如但不限于beta-actin promoter)，LoxP/Lox2272，PRRT2编码基因，LoxP/Lox2272；所述PRRT2编码基因反向连接；

构建体2：前脑兴奋性神经元特异性表达启动子，cre重组酶编码基因(如Emx1启动子驱动cre重组酶编码基因的表达)。

本发明中，PRRT2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生PRRT2。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PRRT2的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的病毒载体包括(但不限于)：腺相关病毒(AAV)载体，慢病毒载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体等。

本发明中，由于所述载体选择性作用于前脑兴奋性神经元，因此，所述载体具有良好血脑屏障穿透能力，例如能够穿透血脑屏障的载体占总载体的2％以上、5％以上、10％以上、20％以上、30％以上或更多。在本发明的一种或多种实施方式中，所述病毒载体为AAV载体。“AAV病毒体”或“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”或“AAV载体”是指包含至少一种AAV衣壳多肽和多核苷酸(例如PRRT2多核苷酸序列)的病毒颗粒。AAV载体通常根据衣壳多肽的名称(血清型)命名。所述AAV载体包括(但不限于)：PHP.eB血清型AAV载体、Cap-B10血清型AAV载体。

作为本发明的一种实施方式，可将编码PRRT2的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺相关病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述PRRT2的细胞中，使所述的细胞表达PRRT2。可通过将适量的所述细胞引入到受试者身体的适当部位，实现PRRT2的表达。作为本发明的优选方式，采用眶内注射(例如眶静脉注射)的方式给予所述载体，使其选择性作用于前脑兴奋性神经元，减少血脑屏障的影响。本领域技术人员已知，其他的给药方式也可以用于本发明，例如但不限于：颅内注射、鞘内(脊髓)注射、鞘内(大脑池)注射、脑内注射、心室内注射、直接注射到海马中的癫痫病灶、直接注射到颞叶中的癫痫病灶。

本发明人经过研究分析，选择PHP.eB血清型AAV病毒来作为PRRT2基因的递送载体，其具有良好血脑屏障穿透能力。考虑到基因递送载体正处于快速迭代和发展的时期，使用有助于将PRRT2基因高效递送至脑内神经元的载体(如Cap-B10血清型AAV病毒等)以及有助于将PRRT2基因高效递送至前脑兴奋性神经元的载体均可应用于该实验。

本发明中，过表达产生PRRT2后，可以使用本领域技术人员熟知的方法检测过表达PRRT2是否成功。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增PRRT2的引物；或特异性识别PRRT2的探针来确定PRRT2基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合PRRT2编码的蛋白的抗体或配体来确定PRRT2蛋白的表达情况，例如利用抗PRRT2抗体与PRRT2蛋白结合，然后使用带有检测信号(优选为荧光标签)的二抗与抗PRRT2抗体结合，通过检测信号的有无，或检测信号的强弱进行判断。

本发明还提供了一种治疗或预防癫痫的方法，包括选择性给予受试者前脑兴奋性神经元有效量的PRRT2、或其上调剂(如过表达该PRRT2的表达载体)。

术语“治疗”和“预防”通常指使用药物或方法来减少、消除或预防疾病的症状，并且包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指减缓所治疗的病症或病症的症状的进展、停止进展、逆转进展、或根除或改善症状。预防益处包括降低病症的风险、延缓病症的进展或降低病症发生的可能性。

在得知了所述的PRRT2的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的PRRT2或其上调剂给药于受试者。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可以通过一定的途径将携带PRRT2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达(较佳为过表达)活性的PRRT2；或者，也可以通过体内基因编辑的方式(如CRISPR-Cas9基因编辑方法)增强前脑兴奋性神经元内源PRRT2的表达，从而达到治疗或预防癫痫的目的。

术语“有效量”是指可以实现期望结果(例如预防或治疗结果)的量。本发明所述的PRRT2或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的PRRT2或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、实验材料

小鼠PRRT2质粒(Origene，#MR214094)。

人类PRRT2质粒(Origene，#RC202304)。

斑马鱼PRRT2质粒(实验室构建，克隆自成年斑马鱼脑组织cDNA库)。

pCAG2IG质粒(Addgene，#122292)。

Lipofectamine 3000转染试剂盒(ThermoFisher Scientific,#L3000001)。

Nav1.2稳转细胞株(北京爱思益普生物科技股份有限公司，#ICE-Nav1.2-HEK)。

二氧化碳恒温培养箱(ThermoFisher Scientific，#3111)。

膜片钳记录系统(HEKA，#EPC10)。

细胞外液：140mM NaCl,3.5mM KCl,1mM MgCl2,2mM CaCl2,10mM D-Glucose,1.25mM NaH2PO4,10mM HEPES(pH＝7.4NaOH调节)。

电极内液：50mM CsCl，10mM NaCl，10mM HEPES，20mM EGTA，60mM CsF，pH＝7.2(CsOH)。

AAV-CAG-DIO-mCherry质粒(图16)(中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心基因编辑平台提供)。

pAAV-CAG-DIO-mouse PRRT2-HA质粒(图17)(中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心基因编辑平台提供)。

抗PRRT2抗体(Wiiget Biotech，#Rp3246-a)。

抗HA抗体(ROAHAHA Roche，#11867423)。

本发明所使用的AAV病毒由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心基因编辑平台生产提供：

AAV-PHP.eB-CAG-DIO-mouse PRRT2-HA

AAV-PHP.eB-CAG-DIO-mCherry

戊四唑(Pentylenetetrazol，PTZ)(Sigma-Aldrich，#P6500-25G)

C57BL/6J小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

Emx1-cre小鼠,名称：B6.129S2-Emx1tm1(cre)Krj/J，来自Jackson Lab，货号：JAX货号#005628。

Nkx2.1-cre小鼠,名称：C57BL/6J-Tg(Nkx2-1-cre)2Sand/J，来自Jackson Lab，货号：JAX货号#008661

2、实验动物饲养

每笼饲养3-6只小鼠，小鼠可在笼内自由获取食物和水，饲养期间12小时光照/黑暗循环，22-23℃，湿度50-60％。

所有实验动物的操作和使用均符合中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心动物管理委员会对于实验动物操作和动物福利的要求。

3、眶静脉注射AAV病毒

取出-80摄氏度保存的AAV病毒，冰上融解。用预冷的无菌PBS稀释AAV病毒至注射用浓度(2×10¹²vg/mL,vg:AAV vector genomes)。注射前将AAV病毒溶液平衡至室温，用0.3mL体积胰岛素针吸取AAV病毒溶液50μL准备注射。

注射戊巴比妥钠溶液(90mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠。待小鼠麻醉后，手指固定小鼠头部，且避免按压小鼠动脉，撑开眼部皮肤充分暴露眼球。持胰岛素针从眼角处呈20°角插入，进入眼眶内部时避免伤及眼球。注射针针尖进入眼眶2mm深度到达眶静脉丛，缓慢注射50μL。注射结束后缓慢退针，拭去眼角多余液体和血液。在另一侧眶静脉进行相同的注射，两侧共计注射总滴度为2×10¹¹vg的AAV病毒。

注射完毕后将小鼠放回笼盒内，待其苏醒后送回饲养间。

病毒表达两周后进行电极植入手术，并在病毒表达三周后开展癫痫评价实验。

4、EEG/EMG电极植入及脑电记录

先用4％的异氟烷麻醉实验小鼠，然后将小鼠头部固定于立体定位仪适配器。在后续整个手术期间将异氟烷浓度调整为1.5％，使小鼠处于持续麻醉状态。另外，用金霉素眼膏保护小鼠眼部，避免干燥导致视网膜损伤。使用脱毛膏将小鼠头部毛发去除，沿中线切开头部皮肤，暴露颅骨表面。使用2％的过氧化氢溶液处理手术切口及颅骨表面，并刮除颅骨表面的结缔组织。用组织胶(Vetbond，3M Deutschland Gmbh)将暴露颅骨四周的皮肤进行固定，并再次清理颅骨表面的膜系。通过立体定位的方式标记电极植入位置，坐标AP-0.8mm，ML±1.1mm。待颅骨表面干燥后，用光固化自蚀粘合剂(3M ESPE Single Bounduniversal)覆盖颅骨表面，形成固化层。使用小型手持颅钻在植入位置标记处开孔，圆孔直径约为0.6mm。小心清理开孔处的骨屑，并保持大脑皮层表面的湿润，然后将两个无菌处理的ECoG记录电极(直径0.5mm)分别沿颅骨开孔处垂直插入大脑皮层0.35mm深度(以大脑皮层表面为参考)，用牙科水泥固定记录电极和电极接口部件。为了便于小鼠清醒状态的电生理记录，在小鼠头部靠近电极接口的位置用牙科水泥额外固定一片轻质的钛合金片(30mm×2mm×1mm)。用于记录肌电信号的两条金属丝电极从电极接口部件底部分别延伸到小鼠颈部，将1mm电极裸露端分别插入颈部两侧的肌肉层，固定后缝合颈部皮肤并消毒。小鼠手术后恢复一周。

进行清醒状态ECoG/EMG记录前，利用小鼠头部的金属片将小鼠固定于记录台，使小鼠适应此头部固定状态30分钟。ECoG和EMG信号经由差分放大器(Model3000，A-Msystem)放大100倍，然后分别经过波段滤波后(ECoG 1-300Hz，EMG 10-1000Hz)由数模转换器(Digidata 1332A，Molecular Devices)进行采集(1000Hz)和记录。

5、PTZ诱导癫痫小鼠模型

测试前用生理盐水配制3.5mg/mL(Nkx2.1-cre小鼠实验)或4.5mg/mL(Emx1-cre小鼠实验)的戊四唑溶液。根据小鼠体重，以35mg/kg或45mg/kg的剂量腹腔注射戊四唑，注射结束后立即将小鼠放入行为箱内进行视频记录，观察小鼠在给药后30分钟内的癫痫发作状况。

小鼠癫痫评级标准：

一级：小鼠伏地不动，腹部贴地爬行；

二级：突发性抽搐，行为突然停止，尾巴翘起；

三级：肌肉阵挛，头部扭转，抬手抽搐；

四级：强直-阵挛，倒地抽搐，疯跳疯跑；

五级：倒地并发展至四肢强直性伸直；

六级：死亡。

6、免疫组化检测PRRT2在脑内的表达

将小鼠用戊巴比妥钠深度麻醉后，经心脏灌注10mL常温磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗血液，然后灌注10mL 4℃的4％多聚甲醛溶液(polyformaldehyde，PFA)进行组织固定。解剖并取出小鼠脑组织，放入4％多聚甲醛溶液中后固定过夜。然后将脑组织放入含30％蔗糖的PBS中脱水2天，并在24小时后更换一次蔗糖溶液。脱水结束后，脑组织用冷冻切片机(CM1950,Leica)在-20℃进行矢状(sagittal)切片，厚度为25μm，脑片收集于PBS溶液中，4℃保存。利用抗PRRT2抗体进行常规免疫组化检测。

7、序列信息

(1)小鼠Prrt2基因(编码蛋白区域，CDS)序列(SEQ ID NO:1)：

ATGGCAGCCAGCAGCTCTCAGGTCTCTGAGATGAAGGGGGTGGAAGACAGTTCCAAAACCCAGACAGAAGGTCCCAGGCATTCTGAAGAAGGACTAGGTCCTGTCCAGGTTGTAGCAGAGATCCCAGACCAGCCAGAGGCCCTTCAGCCGGGCCCAGGCATCACTGCAGCCCCTGTGGACTCAGGGCCTAAGGCAGAGCTGGCACCAGAAACCACAGAGACCCCAGTTGAAACCCCAGAAACAGTCCAGGCCACAGACCTCAGTTTAAACCCAGAAGAAGGCTCCAAGGCCAGCCCCAGCCCCAGCCCCAGCGAGGCACGCCAAGAGCCAGCATCCAAACCAGATGTGAACAGAGAGACTGCAGCAGAGGAAGGGTCTGAGCCGCAGTCTACAGCCCCTCCTGAGCCAACCTCGGAGCCTGCTTTTCAGATAAACACCCAGTCAGACCCTCAGCCAACTTCCCAGCCTCCTCCTAAACCACCCCTTCAGGCAGAGCCCCCCACCCAAGAGGACCCTACCACAGAGGTCCTGACAGAAAGTACAGGGGAAAAACAAGAAAACGGAGCAGTGGTTCCCCTTCAGGCTGGTGACGGGGAAGAGGGCCCAGCCCCCCAACCTCACTCACCACCCTCAACTAAAACACCCCCAGCCAATGGGGCTCCCCCCCGTGTGCTGCAGAAACTCGTTGAGGAAGACAGAATAGGAAGGGCACACGGTGGGCATCCAGGATCTCCTCGAGGTAGCCTAAGCCGTCATCCCAGCTCCCAGCTGGCAGGGCCTGGGGTGGAAGGGGGCGAAGGCACCCAGAAACCTCGGGACTATATCATCCTTGCCATCCTGTCCTGCTTCTGCCCCATGTGGCCTGTCAACATTGTGGCCTTCGCTTATGCCGTCATGTCCCGGAACAGCCTGCAACAGGGGGACGTGGATGGGGCTCAACGTCTGGGCCGAGTAGCCAAGCTCTTAAGCATCGTGGCGCTGGTTGGGGGGGTCCTCATCATCATCGCCTCCTGCGTCATCAACTTAGGCGTGTATAAGTGA

(2)小鼠PRRT2蛋白氨基酸序列(346个氨基酸)(SEQ ID NO:2)：

MAASSSQVSEMKGVEDSSKTQTEGPRHSEEGLGPVQVVAEIPDQPEALQPGPGITAAPVDSGPKAELAPETTETPVETPETVQATDLSLNPEEGSKASPSPSPSEARQEPASKPDVNRETAAEEGSEPQSTAPPEPTSEPAFQINTQSDPQPTSQPPPKPPLQAEPPTQEDPTTEVLTESTGEKQENGAVVPLQAGDGEEGPAPQPHSPPSTKTPPANGAPPRVLQKLVEEDRIGRAHGGHPGSPRGSLSRHPSSQLAGPGVEGGEGTQKPRDYIILAILSCFCPMWPVNIVAFAYAVMSRNSLQQGDVDGAQRLGRVAKLLSIVALVGGVLIIIASCVINLGVYK

(3)人Prrt2基因(编码蛋白区域，CDS)序列(SEQ ID NO:3)：

ATGGCAGCCAGCAGCTCTGAGATCTCTGAGATGAAGGGGGTTGAGGAGAGTCCCAAGGTTCCAGGCGAAGGGCCTGGCCATTCTGAAGCTGAAACTGGCCCTCCCCAGGTCCTAGCAGGGGTACCAGACCAGCCAGAGGCCCCGCAGCCAGGTCCAAACACCACTGCGGCCCCTGTGGACTCAGGGCCCAAGGCTGGGCTGGCTCCAGAAACCACAGAGACCCCGGCTGGGGCCTCAGAAACAGCCCAGGCCACAGACCTCAGCTTAAGCCCAGGAGGGGAATCAAAGGCCAACTGCAGCCCCGAAGACCCATGCCAAGAAACAGTGTCCAAACCAGAAGTGAGCAAAGAGGCCACTGCAGACCAGGGGTCCAGGCTGGAGTCTGCAGCCCCACCTGAACCAGCCCCAGAGCCTGCTCCCCAACCAGACCCCCGGCCAGATTCCCAGCCTACCCCCAAGCCAGCCCTTCAACCAGAGCTCCCTACCCAGGAGGACCCCACCCCTGAGATTCTGTCTGAGAGTGTAGGGGAAAAGCAAGAGAATGGGGCAGTGGTGCCCCTGCAGGCTGGTGATGGGGAAGAGGGCCCAGCCCCTGAGCCTCACTCACCACCCTCAAAAAAATCCCCCCCAGCCAATGGGGCCCCCCCCCGAGTGCTGCAGCAGCTGGTTGAGGAGGATCGAATGAGAAGGGCACACAGTGGGCATCCAGGATCTCCCCGAGGTAGCCTGAGCCGCCACCCCAGCTCCCAGTTGGCAGGTCCTGGGGTGGAGGGGGGTGAAGGCACCCAGAAACCTCGGGACTACATCATCCTTGCCATCCTGTCCTGCTTCTGCCCCATGTGGCCTGTCAACATCGTGGCCTTCGCTTATGCTGTCATGTCCCGGAACAGCCTGCAGCAGGGGGACGTGGACGGGGCCCAGCGTCTGGGCCGGGTAGCCAAGCTCTTAAGCATCGTGGCGCTGGTGGGGGGAGTCCTCATCATCATCGCCTCCTGCGTCATCAACTTAGGCGTGTATAAGTGA

(4)人PRRT2蛋白氨基酸序列(340个氨基酸)(SEQ ID NO:4)：

MAASSSEISEMKGVEESPKVPGEGPGHSEAETGPPQVLAGVPDQPEAPQPGPNTTAAPVDSGPKAGLAPETTETPAGASETAQATDLSLSPGGESKANCSPEDPCQETVSKPEVSKEATADQGSRLESAAPPEPAPEPAPQPDPRPDSQPTPKPALQPELPTQEDPTPEILSESVGEKQENGAVVPLQAGDGEEGPAPEPHSPPSKKSPPANGAPPRVLQQLVEEDRMRRAHSGHPGSPRGSLSRHPSSQLAGPGVEGGEGTQKPRDYIILAILSCFCPMWPVNIVAFAYAVMSRNSLQQGDVDGAQRLGRVAKLLSIVALVGGVLIIIASCVINLGVYK

(5)斑马鱼Prrt2基因(编码蛋白区域，CDS)序列(SEQ ID NO:5)：

ATGGAAACAGAGTACCATCAGGCGTCTCTGGGCTCTCTGGTTTGCACCCAGGATGAGGAGCCGACAAGCTGCCAGATTCCTGGCCCTGTCACCTATCAGCCGGGGCCCGCAGCGTCAGACTCCTTCCCTTGCCTGCGACCCCTCACCTTCCCTCAGCAGCCCAAAGAGGAGGTCCGCTGCTCGGGAGAGGTCATCGTGATGGTCAAGGACAAAGCAGAGAGCGCTGATAAAATTTGCTCTTCCTCGAATGATGCCTTTTCCTCCAAACCCATCCTGTCGTCTCCCCCTCGCCGGCATCACTCTTTGCCCCACACACACCATCCACACGTGGGCCGCACTCGCATGGGCAGCCGCTCCAGCTCCATCGCCTACACAGCCTTCTCCCCACGGCCCTCCATCTCTCGCCACTCCAGCATCGCCACCAACCCACCGCTGGATCGCTCCAAACCCAAAGACTACCTCATCCTCGCCGTCATCGCCTGCTTCTGTCCCGTCTGGCCCATCAACATTGTGGGATTTGTTTACTCCATCATGTCGAGGAACAGTCTGGAGCAGGGGAACGTGGACGGAGCGAGGCGTTTGGGTCGAGTGGCTAAACTGCTGTCAGTGGTGTCGCTGGTGGGAGGAGCGGTCATCATCATCGCCTGCGCCGTCAATCTGTCCATTAATGTGAAGTCCTGA

(6)斑马鱼PRRT2蛋白氨基酸序列(226个氨基酸)(SEQ ID NO:6)：

METEYHQASLGSLVCTQDEEPTSCQIPGPVTYQPGPAASDSFPCLRPLTFPQQPKEEVRCSGEVIVMVKDKAESADKICSSSNDAFSSKPILSSPPRRHHSLPHTHHPHVGRTRMGSRSSSIAYTAFSPRPSISRHSSIATNPPLDRSKPKDYLILAVIACFCPVWPINIVGFVYSIMSRNSLEQGNVDGARRLGRVAKLLSVVSLVGGAVIIIACAVNLSINVKS

实施例1、验证过表达PRRT2对钠离子通道慢失活的作用

将小鼠PRRT2蛋白编码区cDNA序列(图1和图2)插入pCAG2IG质粒(即EGFP对照质粒，图3)的多克隆位点区，构建小鼠PRRT2过表达质粒pCAG-mouse PRRT2(HA)-IRES-EGFP(图4)。

以同样的方式，构建人源PRRT2过表达质粒pCAG-human PRRT2(HA)-IRES-EGFP(图5、图6和图7)。

以同样的方式，构建斑马鱼源PRRT2过表达质粒pCAG-zebra PRRT2(HA)-IRES-EGFP(图8、图9和图10)。

在稳转Nav1.2的HEK293细胞中，利用Lipo3000试剂转染PRRT2过表达质粒或对照质粒，37℃表达24小时后将细胞铺种至圆形玻片上，继续表达12小时。

钠通道电流的记录采用全细胞记录(whole-cell recording)的方式(图11A)。首先，用微电极拉制仪(P97，Sutter Instruments)将毛细玻璃管(BF150-86-10，SutterInstruments)拉制成记录电极。在倒置显微镜(MF53，Micro-shot)下操纵微电极操纵仪(MP225，Butter Instrument)将记录电极接触到细胞表面，给予负压抽吸，形成吉欧姆(GΩ)封接。形成吉欧姆封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻。所有电生理实验均在室温下进行。实验数据由EPC-10放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster(HEKA)软件中。

钠离子通道快失活状态的进入和恢复采用程序1：快失活(fast inactivation，图11B)和程序2：从快失活恢复(Recover from fast inactivation，图12A)进行测试。钠离子通道慢失活状态的进入和恢复分别采用程序3：进入慢失活(Entry in slowinactivation，图13A)和程序4：从慢失活恢复(Recover from slow inactivation，图14A)进行记录。

人PRRT2和斑马鱼PRRT2对钠离子通道慢失活作用的测试方案与上述小鼠PRRT2的测试方案类同，但在检测钠离子通道从慢失活恢复的过程中，发明人采用连续测试方案取代重复扫描测试法以改善细胞电生理记录的成功率。

在记录过程中，细胞的初始钳制电压为-120mV，此时钠离子通道处于关闭状态或称静息状态。当钳制电压从-120mV升至0mV时，细胞发生去极化，钠离子通道开放，细胞外钠离子迅速内流形成钠电流(图11B)。随后(约0.5-1ms)钠离子通道开始进入失活状态(快失活)，通道关闭，钠电流衰减(图11B和图11C)。钠离子通道在短暂的去极化时程内进入快失活状态，并可以在十至数十毫秒超极化过程中恢复至可激活的静息态(图12A和图12B)。

结果显示，小鼠PRRT2过表达对钠离子通道快失活的形成和从快失活恢复均无显著影响(图11-图12)。

除了快失活机制，钠离子通道还具有慢失活的特性。钠离子通道进入慢失活状态或从慢失活状态恢复都需要比快失活更长时间，通常为几百毫秒至数十秒。根据以上规律，在去极化过程结束后通过10毫秒的短暂超极化，可以使快失活状态的钠离子通道得到恢复，从而有效分离出钠离子通道的慢失活成分(图13A)。

结果显示，小鼠PRRT2过表达促进了钠离子通道在去极化过程中进入慢失活状态的速度(图13B)，并且延长了钠离子通道从慢失活恢复至可激活静息态的时间(图14A和图14B)。

人源PRRT2对钠离子通道慢失活的调控效果与小鼠PRRT2类似(图15A-图15C)。

PRRT2在较多的物种中具有保守性。令人意外的是，前期工作中，发明人针对多种多样的不同物种来源的PRRT2对钠离子通道慢失活作用过程中，发现斑马鱼来源的PRRT2对钠离子通道慢失活恢复的抑制作用(与小鼠和人源的PRRT2相比斑马鱼PRRT2过表达使得钠离子通道慢失活恢复时间更长，可以理解为对钠离子通道慢失活具有更强的作用)显著强于人来源和小鼠来源的PRRT2，图15C即为斑马鱼与人源以及小鼠PRRT2的比较结果。

综上所述，PRRT2过表达可以促进钠离子通道的慢失活，但对钠离子通道快失活影响不显著。因此，PRRT2具有钠离子通道状态依赖性调控特征，更倾向于减少持续去极化状态下细胞钠离子通道的有效供给。PRRT2的该特征使之在不影响细胞正常兴奋性活动的情况下，降低细胞的异常兴奋性，使其具有良好的细胞状态选择性。

实施例2、在前脑兴奋性神经元过表达PRRT2干预癫痫发作

为了检测PRRT2蛋白的表达和分布，发明人用抗PRRT2抗体和抗HA标签抗体对脑片样本进行了免疫荧光染色。抗PRRT2抗体用于检测包括内源性和过表达在内的PRRT2蛋白，而抗HA抗体仅能检测过表达的带有HA标签的PRRT2蛋白。

首先将脑片用PBS溶液漂洗三遍，每遍10分钟，然后用含0.3％ Triton X-100和5％牛血清蛋白(bovine serum protein，BSA；溶于PBS)的封闭液室温孵育1小时。封闭结束后进行一抗孵育，脑片样本在抗PRRT2抗体(1:500，rabbit)溶液中4℃孵育过夜。脑片用PBS溶液漂洗三遍，然后进行二抗孵育。脑片样本在荧光二抗(1:2000，donkey anti-rabbit-647nm，donkey anti-rat 488nm)和Hoechst(1:5000)溶液中室温孵育2小时。用PBS溶液漂洗三遍后将脑片贴附于载玻片，晾干后滴加含80％甘油的PBS溶液并封片。用荧光显微镜(VS-120，Olympus)在10倍物镜下进行观察和拍摄。

腺相关病毒(AAV)是最常用的在体内进行基因递送的载体。本实验选择PHP.eB血清型AAV病毒作为PRRT2基因的递送载体，实验中显示，其具有良好血脑屏障穿透能力、有助于PRRT2基因在脑内的表达。

PRRT2蛋白的过表达采用cre重组酶依赖的方式，通过在病毒表达载体中设置DIO系统(Loxp/Lox2272)来实现cre重组酶依赖的表达(图17，pAAV-CAG-DIO-mouse PRRT2-HA)。间接地依赖Emx1启动子(前脑兴奋性神经元特异性表达启动子)驱动的cre重组酶表达来实现在前脑兴奋性神经元内的PRRT2蛋白的特异性表达。

同时，由于实验动物为小鼠，本发明人运用特异性表达cre重组酶的小鼠品系(emx1-cre)，该品系的小鼠，cre重组酶的表达依赖Emx1启动子。

实验结果显示，在Emx1-cre小鼠中，眶静脉注射总量2×10¹¹vg的AAV-PHP.eB-CAG-DIO-mCherry病毒，可以实现mCherry荧光蛋白在前脑兴奋性神经元中的过表达。注射相同总量的AAV-PHP.eB-CAG-DIO-mouse PRRT2-HA病毒，则可观察到前脑兴奋性神经元中PRRT2蛋白的过表达(图18A-图18C)。

与对照组小鼠相比，过表达PRRT2组的小鼠在PTZ诱导的癫痫模型中表现出更强的抗癫痫能力(图19A)。

在基于癫痫行为等级的评价中，前脑兴奋性神经元过表达PRRT2组小鼠在腹腔注射PTZ(45mg/kg)之后，平均发作等级为1.4级，而对照组小鼠的平均发作等级为4级，两组间的癫痫发作等级存在非常显著的统计学差异(图19B)。

脑电记录的结果也显示，前脑兴奋性神经元过表达PRRT2组小鼠在注射PTZ之后癫痫样脑电信号明显弱于对照组小鼠(图20A和图20B)。

与对照组小鼠相比，兴奋性神经元过表达PRRT2的小鼠在旷场实验、转轮实验以及社交实验中均未表现出显著的行为异常(图21A-图21C)。

以同样的方式，在Emx1-cre小鼠中，眶静脉注射总量2×10¹¹vg的AAV-PHP.eB-CAG-DIO-mCherry病毒(对照)或AAV-PHP.eB-CAG-DIO-zebra PRRT2病毒。

结果如表1所示，令人意外地，前脑兴奋性神经元过表达斑马鱼PRRT2能够极为显著地抑制PTZ诱导的癫痫发作。斑马鱼来源的PRRT2呈现比其它物种来源显著更优的效果。

表1.前脑兴奋性神经元过表达斑马鱼PRRT2抑制惊厥剂诱导的癫痫发作

Emx1-cre小鼠	对照组	斑马鱼PRRT2过表达组
			癫痫发作级别	4级	1级

实施例3、非前脑兴奋性神经元中过表达PRRT2的影响

为了验证选择性表达PRRT2的重要性，发明人测试了在非前脑兴奋性神经元中过表达PRRT2，分析是否引发不良反应。

在Nkx2.1-cre小鼠中，cre重组酶的表达依赖Nkx2.1基因启动子，该启动子驱动cre重组酶选择性表达于前脑抑制性神经元(即γ氨基丁酸能神经元)。发明人利用Nkx2.1-cre小鼠，采用腺相关病毒递送的策略，眶静脉注射总量2×10¹¹vg的AAV-PHP.eB-CAG-DIO-mouse PRRT2-HA病毒，进行前脑抑制型神经元的PRRT2过表达(图22A和图22B)。

发明人发现，在NKX2.1-cre小鼠中，与对照组小鼠相比，抑制型神经元过表达PRRT2组的小鼠在PTZ诱导的癫痫模型中表现出癫痫易感(图22D和图22E)。抑制型神经元过表达PRRT2组小鼠在腹腔注射阈下剂量PTZ(35mg/kg)之后，癫痫发作等级高于对照组小鼠(图22D和图22E)。脑电记录的结果也显示，前脑抑制性神经元过表达PRRT2组小鼠在注射阈下剂量PTZ之后癫痫样脑电信号明显强于对照组小鼠(图22F和图22G)。

另外，本发明人在星型胶质细胞中选择性过表达PRRT2也观察到小鼠癫痫易感的现象。因此，在非前脑兴奋性神经元中过表达PRRT2导致不良反应的产生。

综上所述，在前脑兴奋性神经元中过表达PRRT2蛋白可以在不影响正常运动和社交行为的基础上有效增强小鼠的抗癫痫能力，并且该选择性表达策略避免了在前脑抑制型神经元中过表达PRRT2蛋白导致的癫痫易感。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种选择性作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2的上调剂的用途，用于制备治疗或预防癫痫的药物；所述选择性作用于前脑兴奋性神经元的PRRT2的上调剂为构建体或该构建体形成的表达系统；所述选择性作用于前脑兴奋性神经元为选择性作用于钠离子通道慢失活；所述的PRRT2为斑马鱼来源的PRRT2；

其中，所述构建体包括：

构建体1，包括顺序连接的：启动子，LoxP/Lox2272，PRRT2编码基因，LoxP/Lox2272；所述PRRT2编码基因反向连接于两对LoxP/Lox2272序列之间；

构建体2：包括顺序连接的：前脑兴奋性神经元特异性表达启动子，Cre重组酶编码基因。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗或预防癫痫包括：降低癫痫发作的次数、频率、水平和/或持续时间。

3.如权利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述的构建体包含在表达载体中或经基因编辑直接插入在干预对象基因组中；所述表达载体包括：病毒载体，非病毒载体。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的病毒载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体或逆转录病毒载体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述腺相关病毒载体包括：PHP.eB血清型AAV载体或Cap-B10血清型AAV载体。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述基因编辑包括基于CRISPR-Cas技术的基因编辑。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包含在药盒中。

8.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述表达载体通过眶内注射、鞘内注射、脑内注射或心室内注射的方式进行递送。

9.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述表达载体通过颅内注射的方式进行递送。

10.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述表达载体直接注射到大脑中的癫痫病灶。