CN117122685A - Rage抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途 - Google Patents

Rage抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途 Download PDF

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CN117122685A
CN117122685A CN202310857312.3A CN202310857312A CN117122685A CN 117122685 A CN117122685 A CN 117122685A CN 202310857312 A CN202310857312 A CN 202310857312A CN 117122685 A CN117122685 A CN 117122685A
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何英姿
李华伟
乔湘云
唐冬梅
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Eye and ENT Hospital of Fudan University
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途。本发明发现使用RAGE抑制剂能够在体外保护毛细胞免受顺铂诱导的损伤，能够抑制高迁移族蛋白B1‑晚期糖基化终产物受体(HMGB1‑RAGE)信号通路的激活；通过体内注射RAGE抑制剂，发现能降低ABR听阈和增加耳蜗毛细胞存活数量，综合说明RAGE抑制剂对顺铂诱导的感音神经性听力损伤有保护作用，为治疗感音神经性听力损伤提供了新的途径，具有重要的临床应用价值。

Description

RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途。
背景技术
感音神经性聋是人类最常见的感官或功能致残性疾病之一，常见的致聋因素包括耳毒性药物、噪声、老年、遗传、代谢、自身免疫性疾病等。这些损伤会产生氧化应激，导致炎症反应和感觉细胞损伤以及听觉敏感度下降。顺铂是一种代表性的具有耳毒性副作用的抗肿瘤药物。顺铂诱导的耳毒性损伤平均发生率为62％，会导致双侧进行性不可逆的感音神经性听力损伤，常表现为听觉脑干反应(Auditory brainstem response，ABR)的阈值下降，听觉毛细胞主要是外毛细胞的丢失和螺旋神经节神经元变性等。然而，目前尚未找到一种具有可行性且无副作用的方法治疗顺铂诱导的听力损伤。因此，找到一种有效可行且无副作用的新疗法具有重要的临床意义。
近年来，顺铂引起耳毒性的分子机制仍在研究中，并且消除顺铂耳毒性的耳保护策略仍在探索中。目前针对顺铂的损伤机制，耳保护策略主要涉及抗氧化机制、抗炎机制、抗凋亡机制、自噬的调节机制以及抗铁死亡等。虽在临床前工作中有很多疗法已经得到验证，但只有少数在临床上显示出一定的保护作用。因此，探索新的耳保护药物仍尤为重要。
晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)是第一个被证明可以结合高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein 1，HMGB1)的模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)。HMGB1是一种标志性的损伤相关分子模式(Damage-associated molecular pattern，DAMP)，在被受损细胞释放至细胞外后可以充当DAMP信号，结合PRR并诱导无菌性炎症反应。FPS-ZM1是一种特异性的RAGE抑制剂，能够抑制DAMPs与RAGE结合，进而抑制后续的炎症反应的激活。RAGE的异常上调，参与许多至关重要的细胞过程，如炎症、凋亡和自噬等，还与许多人类疾病(如糖尿病、心血管疾病、骨关节炎、癌症和神经系统疾病等)的发展过程密切相关。而FPS-ZM1已被验证能够通过血脑屏障，对大脑内部的非外源性损伤引起的炎症反应有明显的抑制效果。因此，阻断RAGE已成为有希望的治疗策略。
但目前关于RAGE抑制剂对听力损伤的保护作用还未有报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途，以期解决现有技术中存在的问题。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。
本发明的第一方面保护RAGE作为靶点在体外筛选预防和/或治疗听力损伤的产品中的应用。
本发明的第二方面保护RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途。
优选的，所述RAGE抑制剂是指能抑制RAGE基因的转录或翻译，或能特异性抑制RAGE蛋白的表达或活性的分子。
更优选的，所述RAGE抑制剂为核酸分子、抗体、小分子化合物。
进一步优选的，所述核酸分子选自siRNA、shRNA。
进一步优选的，所述小分子化合物选自FPS-ZM1和阿齐瑞格中的一种或两种。
优选的，所述听力损伤为感音神经性听力损伤。
更优选的，所述感音神经性听力损伤为耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病和肿瘤中至少一项导致的听力损伤。
优选的，所述听力损伤为HMGB1-RAGE信号通路激活。
优选的，所述听力损伤为炎症反应激活。
优选的，所述听力损伤为氧化应激水平升高。
优选的，所述听力损伤为ABR阈值升高。
优选的，所述听力损伤为耳蜗毛细胞凋亡。
优选的，所述听力损伤为耳蜗毛细胞突触数量降低。
优选的，所述听力损伤为耳蜗毛细胞数量降低。
优选的，所述预防或治疗听力损伤的产品具有如下1)-7)项中至少一项的功能：
1)抑制HMGB1-RAGE信号通路激活；
2)抑制炎症因子表达；
3)抑制氧化应激水平升高；
4)降低ABR阈值；
5)抑制耳蜗毛细胞凋亡；
6)提高耳蜗毛细胞突触数量；
7)提高耳蜗毛细胞数量。
优选的，所述RAGE抑制剂单独使用或与其他药物联合使用。
更优选的，所述RAGE抑制剂与药学上可接受的辅料组成药物组合物。
进一步优选的，所述药学上可接受的辅料选自载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂中的一种或多种。
进一步优选的，所述药物组合物选自溶液剂、注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、气雾剂、粉雾剂、片剂、胶囊剂和颗粒剂中的一种或多种。
本发明的第三方面保护一种筛选预防和/或治疗听力损伤的药物的方法，所述方法包括：以RAGE为药物靶点，寻找能够抑制或阻断RAGE的表达和/或功能的物质作为候选药物。
优选的，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中RAGE的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以临床常见的感音神经性聋为研究模型，寻找一个新的治疗感音神经性听力损伤的靶点，即通过抑制HMGB1-RAGE信号通路，实现保护耳蜗毛细胞的目的。本研究也通过使用对抗耳蜗内无菌性炎症及抑制耳蜗炎症因子的表达这一治疗方案为日后耳蜗损伤后毛细胞保护的药物治疗提供科学理论依据。
附图说明
图1显示为本申请的成年鼠体内耳蜗毛细胞顺铂损伤模型构建的示意图。
图2显示为本申请的RAGE抑制剂(FPS-ZM1)对新生鼠耳蜗毛细胞顺铂损伤后的保护作用示意图。A：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色，Myosin 7a(绿色)标记存活的耳蜗毛细胞，DAPI(蓝色)标记细胞核。B-D对A中不同分组的顶、中、底圈的存活毛细胞计数和统计结果。ns表示与对照组没有明显差别，**P<0.01,****P<0.0001，####P<0.0001，Scale bar＝20μm。
图3显示为本申请的RAGE抑制剂(FPS-ZM1)在成年鼠体内耳蜗毛细胞顺铂损伤中的保护作用。A：不同分组(对照组、顺铂组和FPS-ZM1+顺铂组)的成年鼠ABR检测结果。B：对照组、顺铂组和FPS-ZM1+顺铂组的成年鼠耳蜗顶圈、中圈和底圈鬼笔环肽(绿色)染色，DAPI(蓝色)标记细胞核。C：不同组中根据毛细胞距蜗顶的距离进行计数的定量统计分析。D：对照组、顺铂损伤组和FPS-ZM1+顺铂组的顶圈、中圈和底圈CtBP2(红色)染色，标记前带状突触。E：不同组中每个内毛细胞中突触点计数的定量统计分析。ns表示与对照组没有明显差别，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。Scale bar＝20μm。
图4显示为本申请的RAGE抑制剂(FPS-ZM1)抑制顺铂损伤后耳蜗毛细胞中的HMGB1-RAGE信号通路及炎症因子表达水平升高的示意图。A：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色，Myosin 7a(绿色)标记存活的耳蜗毛细胞，HMGB1(红色)标记HMGB1阳性细胞，DAPI(蓝色)标记细胞核。B：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色，Parvalbumin(绿色)标记存活的耳蜗毛细胞，RAGE(红色)标记HMGB1阳性细胞，DAPI(蓝色)标记细胞核。C-D对A-B中不同分组的中圈的HMGB1-Myosin 7a双阳性细胞和Parvalbumin-RAGE双阳性细胞计数和统计结果。ns表示与对照组没有明显差别，****P<0.0001，####P<0.0001，Scale bar＝20μm。E：使用Western blot检测HMGB1、RAGE蛋白在不同分组(对照组、顺铂组、FPS-ZM1+顺铂组)中的表达情况。F：对E中各蛋白的表达量进行灰度值定量分析。ns表示与对照组没有明显差别，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05，##P<0.01。G：使用qPCR检测对不同组(对照组、顺铂组和FPS-ZM1+顺铂组)中的Hmgb1、Rage、Nf-κb、Il-1β和Tnf-α的表达情况进行的统计分析。**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，#P<0.05，###P<0.001，####P<0.0001。
图5显示为本申请的RAGE抑制剂(FPS-ZM1)抑制顺铂损伤后耳蜗毛细胞中的活性氧过度积累的示意图。A：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色，Myosin 7a(绿色)标记存活的耳蜗毛细胞，MitoSOX Red(红色)标记线粒体内活性氧，DAPI(蓝色)标记细胞核。Scale bar＝20μm。B：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的HEI-OC1细胞免疫荧光染色，CellROX Green(绿色)标记细胞内活性氧，Hoechst(蓝色)标记细胞核，Scale bar＝10μm。C：对A中MitoSOX Red-Myosin7a双阳性细胞的计数和统计结果。ns表示与对照组没有明显差别，*P<0.05，****P<0.0001，####P<0.0001。D：不同组对HEI-OC1细胞进行CellROX Green染色的流式细胞术的标志性图片。E：对D中细胞的荧光强度统计图。ns表示与对照组没有明显差别，****P<0.0001，####P<0.0001。
图6显示为本申请的RAGE抑制剂(FPS-ZM1)抑制顺铂损伤后耳蜗毛细胞中的细胞凋亡的示意图。A：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色，Parvalbumin(绿色)标记存活的耳蜗毛细胞，Cleaved Caspase-3(红色)标记细胞凋亡，DAPI(蓝色)标记细胞核。B：不同分组(对照组，顺铂组，FPS-ZM1+顺铂组)的新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色，Myosin 7a(绿色)标记存活的耳蜗毛细胞，TUNEL(红色)标记细胞凋亡，DAPI(蓝色)标记细胞核。C-D：对A-B中不同分组的中圈的TUNEL-Myosin7a双阳性细胞和Parvalbumin-Cleaved Caspase-3双阳性细胞计数和统计结果。ns表示与对照组没有明显差别，***P<0.001，****P<0.0001，####P<0.0001，Scale bar＝20μm。E：使用Westernblot检测Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白在不同分组(对照组、顺铂组、FPS-ZM1+顺铂组)中的表达情况。ns表示与对照组没有明显差别，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001，##P<0.01，###P<0.001。F：对E中各蛋白的表达量进行灰度值定量分析。G：使用Annexin V-FITC/PI通过流式细胞术对HEI-OC1细胞进行染色以检测细胞凋亡。H：对G中凋亡细胞(第2、3象限)的比例进行统计分析。ns表示与对照组没有明显差别，****P<0.0001，####P<0.0001。
具体实施方式
本发明首次发现了晚期糖基化终产物受体抑制剂(RAGE抑制剂)能抑制HMGB1或RAGE的表达或功能，从而抑制HMGB1-RAGE信号通路的激活，同时能抑制炎症因子的表达和氧化应激水平，此外还能抑制毛细胞的凋亡，进而减弱ABR阈值的升高，实现保护耳蜗毛细胞的目的从而降低听力损伤和保护听力，为开发针对感音神经性听力损伤的药物提供了的借鉴。
本申请的目的之一在于提供RAGE作为药物靶点在体外筛选预防和/或治疗听力损伤的产品中的应用。
本申请所述用途中，所述产品以RAGE作为药物靶点。
本申请所述用途中，所述产品能够抑制或阻断RAGE或HMGB1的表达和/或功能。
本申请所述用途中，所述产品包括药物、保健品和食品。
所述RAGE作为药物靶点在制备体外筛选预防和/或治疗听力损伤的产品具体是指：将RAGE基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制RAGE基因表达的药物作为预防或治疗听力损伤的备选产品。如FPS-ZM1和阿齐瑞格即是以RAGE基因为作用对象筛选获得的，可用作具有预防或治疗听力损伤的备选产品。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将RAGE基因作为作用对象。
所述治疗听力损伤的产品为能够特异性抑制RAGE基因的转录或翻译，或能够特异性抑制RAGE蛋白的表达或活性的分子，从而降低耳蜗毛细胞中RAGE基因的表达水平，达到抑制HMGB1-RAGE信号通路激活、抑制炎症因子表达、抑制氧化应激水平升高、抑制耳蜗毛细胞凋亡、提高耳蜗毛细胞突触数量、提高耳蜗毛细胞数量从而达到提高ABR阈值，最终治疗听力损伤。
本申请的目的之二在于提供RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途。
本申请所述用途中，所述产品包括药物、保健品和食品。
本申请所述用途中，所述RAGE抑制剂通常包括可以抑制RAGE基因的转录或翻译，或能特异性抑制RAGE蛋白的表达或活性的分子，从而降低耳蜗毛细胞中RAGE基因的表达水平，达到促进耳蜗毛细胞和突触数量增加的目的，最终预防或治疗听力损伤。例如，RAGE抑制剂可以部分抑制，即降低RAGE的表达和/或功能，也可为完全抑制，即基本上完全消除RAGE的表达和/或其功能。例如，RAGE抑制剂可以是核酸分子、抗体或化合物等。所述核酸分子可以选自干扰RNA、反义寡核苷酸、用于敲除或敲减RAGE表达的物质。在本申请一具体实施例中，RAGE抑制剂可以是化合物，例如RAGE抑制剂选自FPS-ZM1和阿齐瑞格(Azeliragon，CAS号为603148-36-3)。所述FPS-ZM1的CAS号为945714-67-0，分子式为C20H22ClNO，结构式如下：
本申请所述用途中，所述听力损伤为感音神经性听力损伤。所述感音神经性听力损伤为耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病和肿瘤中至少一项导致的听力损伤。优选的，为耳毒性药物导致的听力损伤。更优选的，所述耳毒性药物选自氨基糖甙类药物、大环内酯类药物、抗癌药物、水杨酸类解热镇痛药物和抗疟药中的一种或几种，例如所述氨基糖甙类药物包括但不限于链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、小诺霉素；所述大环内酯类药物包括但不限于红霉素、罗红霉素；所述抗癌药物包括但不限于长春新碱、2-硝基咪唑、顺氯氨铂；所述水杨酸类解热镇痛药物包括但不限于阿司匹林；抗疟药物包括但不限于奎宁、氯奎。较佳地为顺氯氨铂。
本申请所述用途中，所述听力损伤为如下1)-7)项中的至少一项：
1)抑制HMGB1-RAGE信号通路激活；
2)炎症反应激活；
3)氧化应激水平升高；
4)ABR阈值增加；
5)耳蜗毛细胞凋亡；
6)耳蜗毛细胞突触数量降低；
7)耳蜗毛细胞数量降低。
本申请所述用途中，所述预防或治疗听力损伤的产品具有如下1)-7)项中至少一项的功能：
1)抑制HMGB1-RAGE信号通路的激活；
2)抑制炎症因子的产生；
3)降低ABR阈值；
4)抑制ROS积累；
5)抑制耳蜗毛细胞凋亡；
6)提高耳蜗毛细胞突触数量；
7)提高耳蜗毛细胞数量。
本申请所述用途中，通过新生鼠耳蜗基底膜培养和HEI-OC1细胞系培养发现，顺铂损伤后能够促进耳蜗毛细胞释放HMGB1和RAGE，并使细胞内HMGB1和RAGE表达增加，而RAGE抑制剂能够抑制HMGB1和RAGE的转录，以及抑制顺铂损伤后HMGB1和RAGE蛋白的表达，从而抑制HMGB1-RAGE信号通路的激活。
本申请所述用途中，所述炎症反应激活包括炎症因子被激活从而表达和释放，所述炎症因子包括IL-1β、TNF-α和NF-κB。本申请通过HEI-OC1细胞系培养发现，使用RAGE抑制剂后能抑制炎症因子IL-1β、TNF-α和NF-κB的表达。
本申请所述用途中，所述氧化应激水平升高是指ROS水平升高。耳蜗是代谢旺盛组织，能产生活性氧(ROS)，正常情况下线粒体代谢产生的ROS极易被机体内部抗氧化机制清除，但过量的自由基会导致生物膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，破坏生物膜完整性并使通透性增加，进而使细胞崩解破裂、死亡。本申请采用MitoSOX Red和CellROX Green分别评估线粒体内和细胞内ROS水平。结果发现，与顺铂单独处理相比，FPS-ZM1预处理能明显减少MitoSOX Red/Myosin 7a双标记细胞的数量。同时，用CellROX Green染色结果发现，顺铂处理使荧光强度向右偏移，而FPS-ZM1预处理会使峰值较顺铂组偏向左侧。上述结果表明，RAGE抑制剂能抑制ROS过度积累。
本申请所述用途中，本申请发现，在成年鼠听力毛细胞损伤模型实验中，顺铂组的ABR阈值增加，而用FPS-ZM1+顺铂组的ABR阈值较顺铂组降低，表明FPS-ZM1能降低ABR阈值，防止顺铂引起的听力损伤。
本申请所述用途中，所述耳蜗毛细胞凋亡是指Caspase-3依赖性的耳蜗毛细胞凋亡。发生听力损伤时，通常可以表现为内耳毛细胞死亡或发生凋亡、失去纤毛结构等形态学改变等症状；还可以表现为高表达凋亡相关蛋白，例如Cleaved Caspase-3、Bcl-2、BAX。本申请Cleaved Caspase-3/Parvalbumin和TUNEL/Myosin 7a发现，FPS-ZM1预处理能减少顺铂诱导的Cleaved Caspase-3/Parvalbumin双阳性细胞和TUNEL/Myosin 7a双阳性细胞数量的增加。细胞凋亡时细胞膜还会发生破损外翻，采用Annexin V-FITC标记细胞膜内侧，配合PI检测细胞核内物质来判断细胞凋亡的程度。本申请发现FPS-ZM1能够明显抑制顺铂诱导的凋亡细胞率增加。同时通过蛋白质免疫印迹法检测的几种凋亡相关蛋白的表达，与顺铂组相比，FPS-ZM1+顺铂组中Cleaved Caspase-3和BAX的蛋白表达下调，而Bcl-2表达上调。上述结果表明，FPS-ZM1能抑制顺铂诱导的Caspase-3依赖性的细胞凋亡。综合表明，RAGE抑制剂能抑制细胞凋亡。
本申请所述用途中，所述耳蜗毛细胞数量或存活率降低。本申请通过对新生鼠耳蜗基底膜Myosin 7a染色发现，FPS-ZM1会显著提高顺铂导致的底圈、中圈和顶圈的毛细胞数量降低和存活率降低的情况，表明RAGE抑制剂能提高耳蜗毛细胞数量或存活率。
本申请所述用途中，所述耳蜗毛细胞突触数量降低。本申请通过对成年鼠耳蜗内毛细胞CtBP2染色发现，FPS-ZM1会显著提高顺铂导致的单个内毛细胞中带状突触数量降低的情况，表明RAGE抑制剂能提高耳蜗毛细胞带状突触数量。
本申请所述用途中，所述RAGE抑制剂单独使用或与其他药物联合使用。也即RAGE抑制剂可以作为产品的唯一有效成分或有效成分之一。
本申请所述用途中，所述RAGE抑制剂与药学上可接受的辅料组成药物组合物。所述药学上可接受的辅料是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。所述药学上可接受的辅料应当与所述RAGE抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低RAGE抑制剂的效果。
本申请所述用途中，所述药学上可接受的辅料选自载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂中的一种或多种。可作为药学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本申请所述用途中，所述药物组合物为溶液剂、注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、气雾剂、粉雾剂、片剂、胶囊剂和颗粒剂中的一种或多种。上述各种剂型的药物组合物均可以按照药学领域的常规方法制备。优选为注射剂。
本申请所述用途中，所述药物组合物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。优选地，通过腹腔给药。所述药物组合物还可与其他治疗手段结合使用，所述其他手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗。
本申请的目的之二在于提供一种体外筛选预防和/或治疗听力损伤的药物的方法，所述方法包括：以RAGE为药物靶点，寻找能够抑制或阻断RAGE的表达和/或功能的物质作为候选药物。
进一步地，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中RAGE的含量。所述细胞可以来自哺乳动物。
试验者可以通过检测共培养后RAGE的含量判定药物是否是具有治疗意义的药物。通常来说，与对照组相比，可以使得RAGE的含量分别降低了50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的药物，可以判定为具有治疗意义的药物。
进一步地，所述药物能够降低细胞中RAGE至少50％，则判定为具有治疗意义的药物。
本申请中，用于预防或治疗听力损伤时，需要将有效剂量的所述产品施用于对象中。采用该方法，听力损伤现象被抑制、缓解。对象为进行预防和/或治疗的生物体，包括哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本申请中，治疗指在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本申请中，预防是指通过施用本申请所述的产品来抑制症状或者延缓特定症状的所有行为。
本申请中，有效剂量是指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
本申请使用HEI-OC1细胞系为基础，构建毛细胞损伤以及保护研究的细胞系模型；同时以C57BL/6小鼠为基础，构建了新生鼠耳蜗基底膜毛细胞损伤体外模型和成年鼠耳蜗毛细胞体内损伤模型。通过体外HEI-OC1细胞系和新生鼠耳蜗基底膜培养，验证了使用RAGE抑制剂(FPS-ZM1)能够在体外保护内、外毛细胞免受顺铂诱导的损伤，能够抑制高迁移率族蛋白B1-晚期糖基化终产物受体(HMGB1-RAGE)信号通路的激活；通过在成年鼠全身腹腔注射RAGE抑制剂(FPS-ZM1)，发现ABR听阈降低和耳蜗外毛细胞存活数量增多，验证了其在成年鼠体内的保护作用。以上都表明了，RAGE抑制剂能降低听力损伤，起到保护听力的作用，具体适用于感音神经性听力损伤，特别适用于顺铂诱导的感音神经性听力损伤。本申请为治疗听力损伤提供了新的途径，具有重要的临床应用价值。
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本本发明采用的实验动物和材料如下：
本研究采用的C57BL/6小鼠购自上海杰斯捷实验动物有限公司。
ABR检测采用复旦大学附属眼耳鼻喉科医院中心实验室Tucker DavisTechnology(TDT)System III设备检测(Tucker Davies Technologies,Gainesville,FL,USA)。
蛋白提取试剂盒购于德国QIAGEN公司；Annexin V-FITC/PI双染色细胞凋亡检测试剂盒购于BD Biosciences，TUNEL检测试剂盒购于Roche Holding。
顺铂购自Sigma-Aldrich公司。
FPS-ZM1购于MedChemExpress(MCE)公司；Myosin 7a抗体购自ProteusBiosciences，Parvalbumin抗体购自Abcam，HMGB1抗体购自Abcam，RAGE抗体购自Abcam，Cleaved Caspase-3抗体购于Cell Signaling Technology公司；rhodamine-phalloidin购于Invitrogen公司；Bcl-2抗体购于Cell Signaling Technology公司；Bax抗体购于CellSignaling Technology公司，C-terminal binding protein(CtBP2)购于BD TransductionLaboratories。
实施例1RAGE抑制剂对小鼠顺铂耳毒性的研究
本实施例中，进行RAGE抑制剂对新生鼠耳蜗基底膜和成年鼠耳蜗毛细胞的研究，包括如下：
1、小鼠模型的构建
1.1、新生鼠耳蜗基底膜毛细胞体外损伤模型
顺铂损伤模型为研究毛细胞损伤与保护的常见模型之一。顺铂损伤24小时，撤顺铂损伤，然后继续培养72小时，取出培养的耳蜗基底膜，就能得到顺铂诱导的毛细胞体外损伤模型。
具体如下：将出生后2天(P2)的C57BL/6幼鼠用眼科剪刀剪断头处死，并置于75％酒精中消毒。沿枕骨大孔将小鼠头部一分为二，用剪刀剔除多余的脑组织并将颞骨部分剪断，放于0.01M PBS中。于显微镜下观察并去除蜗壳和耳蜗外侧壁，沿蜗轴分离螺旋韧带，得到完整的耳蜗基底膜，并随后将其置于盖玻片上。随后将其置于冰上放置5分钟，使基底膜贴壁。待耳蜗基底膜贴壁后，每个孔中加入100μL含N2/B27和氨苄西林的DMEM/F12培养基，并放置于5％ CO2和37℃培养24小时，然后采用顺铂损伤24小时，撤顺铂，继续培养72小时，就能得到顺铂诱导的新生鼠耳蜗基底毛细胞体外损伤模型。
FPS-ZM1实验组药物储存液：将FPS-ZM1以20mM的浓度溶解于DMSO中。
培养24h后的耳蜗基底膜贴壁分为3组：对照组、顺铂组和FPS-ZM1+顺铂组进行顺铂损伤。
对照组：加入含N2/B27和氨苄西林的DMEM/F12培养基培养98h。
顺铂组：在顺铂组中加入30μM顺铂培养24h，撤去顺铂损伤，然后继续培养72小时。
FPS-ZM1+顺铂组：加入混有FPS-ZM1实验组药物(FPS-ZM1，实验浓度为40μm)储存液的培养基2小时后，再加入30μM顺铂共培养24小时，撤顺铂损伤，然后继续培养72小时，取出培养的耳蜗基底膜就能得到顺铂诱导的新生鼠耳蜗基底膜毛细胞体外损伤模型。
对新生鼠耳蜗基底膜进行Myosin 7a固定染色以考察毛细胞，为了更好地观察和计数，本发明将耳蜗基底膜分成底圈、中圈、顶圈。
1.2、成年鼠毛细胞体内损伤模型
选用6周左右(约42天)的成年C57BL/6小鼠共18只，常规喂养淡水和饲料。将C57BL/6小鼠分为对照组、顺铂组、FPS-ZM1+顺铂组，每组6只小鼠。每组小鼠于顺铂处理前一日起进行常规水化处理(腹腔注射1ml生理盐水，每日2次)。
单纯生理盐水处理的小鼠作为对照组。
FPS-ZM1药物及顺铂给药流程，在第42天和第49天均进行药物处理一次(见图1)：
1)将FPS-ZM1实验组药物储存液进行稀释，然后以20mg/kg体重通过腹腔注射入FPS-ZM1+顺铂组的小鼠体内；顺铂组不做处理。稀释采用的液体组成为：10％ DMSO、40％PEG300、5％ Tween-80和45％生理盐水。
2)FPS-ZM1药物腹腔注射2小时后，将稀释好的顺铂(5mg/kg体重)分别注射入顺铂组和FPS-ZM1+顺铂组的小鼠体内。
3)注射顺铂1小时后，顺铂组、FPS-ZM1+顺铂组的小鼠分别通过腹腔注射呋塞米(200mg/kg体重)。
从第一次暴露于顺铂的14天后(即第56天)，测量ABR(听觉脑反应)的阈值变化，以评估听力损伤的程度。并在测ABR后断头处死小鼠，解剖成年鼠耳蜗。耳蜗毛细胞分为内毛细胞和外毛细胞。外毛细胞负责放大、调整和过滤声音，而内毛细胞将声音转化为电信号传送到大脑。通过鬼笔环肽(Phalloidin)固定染色考察耳蜗外毛细胞的损伤情况，通过CtBP2固定染色考察耳蜗内毛细胞的突触点数量。
2、染色方法
鬼笔环肽(Phalloidin)染色方法：
成年鼠耳蜗基底膜用鬼笔环肽(Alexa FluorTM488 Phalloidin，1:1000稀释；Invitrogen Molecular Probes，Eugene，OR，USA)染色30分钟，然后在黑暗中用DAPI染色10分钟。荧光成像后使用激光共聚焦显微镜Leica TCS SP8(Leica Microsystems)进行拍摄标志性图像，观察耳蜗毛细胞的F-肌动蛋白和细胞核。
C-末端结合蛋白2(CtBP2)染色方法：
(1)通透封闭：成年鼠耳蜗基底膜解剖好后，加入通透封闭液(含有10％驴血清的1％Triton-100×的0.01M PBS)，室温通透封闭2小时或4℃过夜。
(2)孵育一抗：去除24孔皿中的通透封闭液，加入已配置好的一抗并于4℃过夜。抗C-terminal binding protein(CtBP2,BD Transduction Laboratories,BD Biosciences)使用抗体稀释液(含有1％驴血清的1％Triton-100×的0.01M PBS)并按1：1000浓度进行稀释。
(3)漂洗一抗并孵育二抗：去除24孔皿中的一抗，加入0.01M PBS，并置于摇床上，重复3次，每次10分钟。去除24孔皿中的PBS，加入已配置好的二抗并放置于4℃过夜。二抗Alexa Flour cy3 anti-Rabbit(Invitrogen-Molecular Probes)使用抗体稀释液(含有1％驴血清的1％Triton-100×的0.01M PBS)并按1：1000浓度进行稀释。
(4)漂洗二抗并染色细胞核：去除24孔皿中的二抗，加入0.01M PBS，并置于摇床上，重复3次，每次10分钟。去除24孔皿中的PBS，加入1：1000稀释的DAPI(Sigma-Aldrich)室温避光孵育10分钟。
(5)漂洗样本并封片：0.01M PBS漂洗，重复3次，每次10分钟。在荧光显微镜下观察样本染色情况，确认无异常后，使用抗淬灭甘油(Fluoromount-GTM)封片。
(6)拍片：使用激光共聚焦显微镜Leica TCS SP8(Leica Microsystems)进行拍摄标志性图像。使用抗C-末端结合蛋白2(CtBP2)对内毛细胞的前带状突触进行免疫荧光标记，统计每个内毛细胞内阳性突触点的数目。
肌球蛋白7a(Myosin 7a)固定染色具体步骤如下：
(1)固定：先使用0.01M PBS洗去培养用4孔皿中的培养基，随后将4％PFA加入培养用4孔皿中室温固定30分钟。
(2)漂洗样本并通透封闭：去除4孔皿中的PFA，加入0.01M PBS，并置于摇床上，重复3次，每次10分钟。通透封闭：去除4孔皿中的PBS，加入通透封闭液(含有10％驴血清的1％Triton-100×的0.01M PBS)，室温通透封闭2小时或4℃过夜。
(3)孵育一抗：去除4孔皿中的通透封闭液，加入已配置好的一抗并于4℃过夜。抗Myosin 7a(Proteus Biosciences，25-6790)使用抗体稀释液(含有1％驴血清的1％Triton-100×的0.01M PBS)并按1：500浓度进行稀释。
(4)漂洗一抗并孵育二抗：去除4孔皿中的一抗，加入0.01M PBS，并置于摇床上，重复3次，每次10分钟。去除4孔皿中的PBS，加入已配置好的二抗并于4℃过夜。二抗AlexaFlour 488anti-Rabbit(Invitrogen-Molecular Probes)使用抗体稀释液(含有1％驴血清的1％Triton-100×的0.01M PBS)并按1：500浓度进行稀释。
(5)漂洗二抗并染色细胞核：去除4孔皿中的二抗，加入0.01M PBS，并置于摇床上，重复3次，每次10分钟。去除4孔皿中的PBS，加入1：1000稀释的DAPI(Sigma-Aldrich)室温避光孵育10分钟。
(6)漂洗样本并封片：0.01M PBS漂洗，重复3次，每次10分钟。在荧光显微镜下观察样本染色情况，确认无异常后，使用抗淬灭甘油(Fluoromount-GTM)封片。
(7)拍片：使用激光共聚焦显微镜Leica TCS SP8(Leica Microsystems)进行拍摄标志性图像。
听性脑干反应(ABR)检测，具体步骤如下：
(1)将麻药(氯胺酮(100mg/kg)+甲苯噻嗪(10mg/kg))腹腔注射入小鼠体内，待小鼠失去知觉后放入屏蔽室并插入电极。
(2)电极插入：记录电极：颅顶正中；参考电极：测试耳乳突；接地电极：小鼠后背皮下。
(3)系统操作：使用Tucker Davis Technology(TDT)System III系统和SigGen/Biosig软件(Tucker Davis Technology)诱发刺激并记录反应。参数：频率4、8、16、24和32kHz，扫描时长10ms，叠加1024次。
(4)测量阈值：测试声强从90dB SPL开始，以5dB SPL为单位逐步降低，直至无法测出反馈。记录每个频率最低能测出反馈的声强。
1.3、实验结果
1)新生鼠耳蜗基底膜Myosin 7a染色和毛细胞数量考察
体外培养的耳蜗基底膜分为三组：即对照组，FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组，免疫荧光染色结果见图2A-D。Myosin 7a是毛细胞的标记，图2A中呈绿色。
健康新生鼠耳蜗基底膜的顶圈、底圈和中圈均具有3排外毛细胞和1排内毛细胞，且内外毛细胞排列整齐，无缺失。
从图2中A可知，Myosin 7a/DAPI染色结果表明，顺铂处理24小时后，可见内、外毛细胞数量显著缺失，以顶圈为最严重，底圈次之；FPS-ZM1+顺铂组小鼠的底圈、中圈和顶圈的毛细胞数量明显多于顺铂组。
从图2中B-D可知，计数结果也表明，FPS-ZM1+顺铂组的底圈、中圈和顶圈的毛细胞存活情况明显高于顺铂组。
2)成年鼠听觉脑反应(ABR)阈值的考察
从图3中A可知，对照组在各个测试频率(4、8、16、24和32kHz)下的ABR阈值中，16kHz的阈值最低，其余频率的阈值较16kHz的阈值稍高；而顺铂组在各个测试频率基本成直线，且平均ABR阈值显著高于对照组，表明顺铂对成年鼠造成了严重的听力损失；而用FPS-ZM1预处理则降低了ABR阈值，说明FPS-ZM1的处理改变了顺铂诱导的ABR阈值升高的现象。
3)成年鼠耳蜗外毛细胞损伤的考察
用Phalloidin免疫荧光染色检测耳蜗外毛细胞的损伤情况，结果见图3中B和3中C。
从图3中B可知，Phalloidin染色结果表明，与顺铂组相比，FPS-ZM1+顺铂组的外毛细胞的损伤明显减少。
从图3中C可知，基于毛细胞距蜗顶的距离，FPS-ZM1+顺铂组的外毛细胞损伤率明显比顺铂组降低；表明FPS-ZM1能抑制顺铂引起的成年鼠耳蜗毛细胞损伤。
4)成年鼠耳蜗内毛细胞中突触点数量的考察
通过CtBP2免疫荧光染色观察耳蜗内毛细胞的突触数量，结果见图3D和3E。图中，虚线圈出的为代表性的单个内毛细胞中CtBP2阳性的带状突触。
从图3中E可知，与顺铂组相比，FPS-ZM1预处理后耳蜗中底圈、中圈和顶圈中的单个内毛细胞中CtBP2阳性突触点的平均数量明显升高，表明FPS-ZM1对带状突触具有显著的保护作用。
综合表明，抑制RAGE能防止顺铂引起的听力损伤。
实施例2RAGE抑制剂对HMGB1-RAGE信号通路及炎症因子表达水平的研究
本实施例中，考察RAGE抑制剂对HMGB1-RAGE信号通路和炎症因子的研究，包括如下：
2.1、实验模型
1)新生鼠耳蜗基底膜培养，见实例1。
2)HEI-OC1细胞系培养。
HEI-OC1细胞系是一个广泛使用的听觉耳蜗毛细胞细胞系，在33℃，5％CO2的高糖DMEM培养基(DMEM；Gibco BRL)，10％的胎牛血清(FBS；Gibco BRL)，无抗生素的条件下培养。用浓度为30μM的顺铂(Sigma-Aldrich)处理HEI-OC1细胞24小时来建立顺铂损伤的模型。
2.2、实验步骤
1)培养新生鼠耳蜗基底膜，并分为4组：对照组、FPS-ZM1组、FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组。不同组别经相应给药处理后，取出耳蜗基底膜并固定免疫荧光染色(Myosin 7a和Parvalbumin标记耳蜗毛细胞)。
2)HEI-OC1细胞系，分为3组：对照组、FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组。对HEI-OC1细胞提取蛋白和RNA，并对其采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)和qPCR检测。检测HMGB1和RAGE在不同组中的蛋白表达情况以及Hmgb1、Rage和炎症因子(Il-1β、Nf-κb和Tnf-α)的RNA表达情况。
2.3、实验结果
1)新生鼠耳蜗基底膜中HMGB1和RAGE表达的考察
分别采用Myosin 7a/HMGB1双标和Parvalbumin/RAGE双标免疫荧光染色检测新生鼠耳蜗基底膜上HMGB1和RAGE的表达情况，结果见图4中A-D。Myosin 7a是毛细胞的标记，在图4A中呈绿色，HMGB1在图4A中呈红色；Parvalbumin是毛细胞的标记，在图4B中呈绿色，RAGE在图4B中呈红色。
从图4中A-D可知，从染色和半定量分析结果表明，在新生鼠耳蜗基底膜上，顺铂损伤后能够促进耳蜗毛细胞释放HMGB1和RAGE并使细胞内HMGB1和RAGE表达显著增加，而使用RAGE抑制剂后能够减少耳蜗毛细胞内HMGB1和RAGE的表达，且FPS-ZM1+顺铂组的HMGB1和RAGE表达水平和对照组无显著差异(p＜0.05)。
2)HEI-OC1细胞中HMGB1和RAGE表达的考察
对不同组的HEI-OC1细胞提取HMGB1蛋白、RAGE蛋白并对其表达水平进行考察，结果见图4中E-F。
从图4中E和4F可知，顺铂能够促进细胞内HMGB1蛋白和RAGE蛋白的表达，而使用RAGE抑制剂后能够显著减少细胞内HMGB1和RAGE蛋白的表达。
3)HEI-OC1细胞中HMGB1、RAGE和炎症因子RNA表达的考察
对不同组的HEI-OC1细胞提取RNA，使用qPCR检测Hmgb1、Rage和炎症因子的RNA表达水平，结果见图4中G。炎症因子包括Il-1β、Nf-κb和Tnf-α。
从图4中G可知，顺铂能够促进细胞内HMGB1、RAGE的RNA表达，并能促进炎症细胞因子的产生和释放。而使用RAGE抑制剂后能够减少细胞内HMGB1和RAGE蛋白的RNA表达，并能抑制炎症细胞因子的表达。
实施例3RAGE抑制剂对耳蜗毛细胞活性氧水平的研究
本实施例中，考察RAGE抑制剂对耳蜗毛细胞活性氧水平的研究，包括如下：
3.1、实验模型
1)新生鼠耳蜗基底膜培养，见实例1。
2)HEI-OC1细胞系培养，见实例2。
3.2、实验步骤
1)培养新生鼠耳蜗基底膜，并分为4组：对照组、FPS-ZM1、FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组。
MitoSOX Red是一种透膜荧光染色剂，在线粒体氧化损伤条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的生成。
不同组经相应的给药处理后，MitoSOX Red和耳蜗基底膜培养基以1：1000的比例进行稀释。将含MitoSOX Red试剂的稀释液更换至各组培养皿中，并在37℃条件下避光孵育30分钟。取出新生鼠耳蜗基底膜，在固定和通透封闭后使用一抗(Myosin 7a，标记耳蜗毛细胞)进行免疫荧光染色(见实例1)。使用共聚焦Leica TCS SP8观察各组中MitoSOX Red和Myosin7a阳性细胞。
2)HEI-OC1细胞系分为4组：对照组、FPS-ZM1、FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组。
CellROX Green是一种检测活细胞氧化应激的新型荧光探针，在还原态时无荧光或呈微弱荧光，被活性氧物质氧化后发绿色荧光。
Hoechst是一种细胞渗透性苯并咪唑染料，与细胞中的DNA结合时，发出蓝色荧光，作为细胞核标记物用于研究细胞周期和区分凋亡细胞。
HEI-OC1细胞进行给药处理后，将CellROX Green试剂和细胞培养液以1：1000的比例进行稀释。将含CellROX Green试剂的稀释液更换至各组培养皿中，并在37℃条件下避光孵育30分钟。随后去除培养皿中的培养液，更换为含Hoechst的细胞培养液(Hoechst和细胞培养基以1：1000的比例稀释)，室温避光孵育10分钟，标记细胞核。随后使用共聚焦LeicaTCS SP8观察各组中Hoechst和CellROX Green阳性细胞。同时，使用流式细胞术分析不同组中的CellROX Green荧光强度，判断不同组细胞内的ROS水平。
3.3、实验结果
在顺铂诱导的毛细胞损伤机制中，ROS的过度积累是顺铂诱导耳蜗HCs损伤的关键。因此，本研究中使用MitoSOX Red评估线粒体内ROS水平，使用CellROX Green评估细胞内ROS水平。
1)新生鼠耳蜗基底膜的线粒体内ROS水平的考察
采用MitoSOX Red和Myosin 7a对新生鼠耳蜗基底膜进行免疫荧光染色，并统计阳性细胞的数量，以评估线粒体内ROS水平，结果见图5中A和5中C。MitoSOX Red染色呈红色。
从图5中A可知，对照组无MitoSOX Red阳性细胞，顺铂组出现更多的MitoSOX Red阳性细胞，而FPS-ZM1预处理显著降低了MitoSOX Red的荧光强度，表明阻断RAGE减少了顺铂诱导的ROS产生。
从图5中C可知，与顺铂单独处理相比，FPS-ZM1+顺铂明显减少了MitoSOX Red-Myosin7a双阳性细胞的数量，说明FPS-ZM1能抑制顺铂诱导的线粒体内ROS积累。
2)HEI-OC1细胞内ROS水平的考察
用CellROX Green和Hoechst对HEI-OC1细胞系进行染色，并对CellROX Green染色后的细胞进行流式细胞仪检测并对荧光强度统计，结果分别见图5中B和5中D-E。CellROXGreen染色呈绿色，Hoechst染色呈蓝色荧光。
从图5中B可知，顺铂组中的细胞呈现明显的绿色荧光，而FPS-ZM1+顺铂组中的绿色荧光明显降低。
从5中D和E可知，流式细胞术分析结果显示，顺铂处理使经CellROX Green染色后的毛细胞的绿色荧光强度的峰值向右移动，而FPS-ZM1预处理会使绿色荧光强度的峰值较顺铂组偏向左侧，且能使平均荧光强度较顺铂组显著降低(####P<0.0001)，说明FPS-ZM1能抑制顺铂诱导的细胞内ROS积累。
上述实验结果表明，FPS-ZM1可以抑制顺铂引起的ROS过度积累。
实施例4RAGE抑制剂对耳蜗毛细胞凋亡的研究
本实施例中，考察RAGE抑制剂对耳蜗毛细胞凋亡水平的研究，包括如下步骤。
4.1、实验模型
1)新生鼠耳蜗基底膜培养，见实例1。
2)HEI-OC1细胞系培养，见实例2。
4.2、实验步骤
培养新生鼠耳蜗基底膜，并分为4组：对照组、FPS-ZM1、FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组。
HEI-OC1细胞以1×106个细胞/孔的密度接种在六孔板中，分为4组，分别为：对照组、FPS-ZM1、FPS-ZM1+顺铂组和顺铂组。
1)采用TUNEL染色考察新生鼠耳蜗基底膜中毛细胞凋亡情况
细胞凋亡时会激活DNA内切酶，产生一些断裂的基因组DNA，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。
将培养后的耳蜗基底膜在37℃下用TUNEL检测试剂盒检中的TUNEL反应混合物避光孵育30分钟，然后采用Myosin 7a进行染色。使用共聚焦Leica TCS SP8观察各组中TUNEL和Myosin 7a染色情况，并统计双阳性毛细胞的数量。
2)采用Cleaved Caspase-3考察新生鼠耳蜗基底膜中毛细胞凋亡情况
将培养后的各组新生鼠耳蜗基底膜固定并用Parvalbumin和Cleaved Caspase-3进行双标记免疫荧光染色。使用共聚焦Leica TCS SP8观察各组中Cleaved Caspase-3和Parvalbumin染色情况，并统计双阳性毛细胞的数量。
3)采用Annexin V-FITC/PI染色考察HEI-OC1细胞的凋亡率
操作为：各组HEI-OC1细胞经药物作用24小时后，用胰酶消化细胞并不弃去上清液。将收集好的细胞用配置好的缓冲液(Binding buffer与ddH2O的比例为1：9)重悬，并根据不同分组分别加入5μl Annexin V-FITC和PI。随后将离心管放置于37℃避光条件下孵育20分钟并进行流式上机操作，统计凋亡细胞的比例。
4)采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)考察HEI-OC1细胞中凋亡相关蛋白的表达
具体操作为：各组HEI-OC1细胞提取蛋白，并进行蛋白质免疫印迹实验。通过检测不同组中凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3、Caspase-3、BAX、Bcl-2)的表达情况来检测细胞凋亡，并对各蛋白的表达量进行定量分析。
4.3、实验结果
1)新生鼠耳蜗基底膜的耳蜗毛细胞凋亡数量的考察
分别采用Cleaved Caspase-3和TUNEL染色来分析FPS-ZM1的抗凋亡作用。
采用Cleaved Caspase-3/Parvalbumin双染色研究FPS-ZM1的抗凋亡作用，结果见图6中A和C。
从6中A和C可知，露于顺铂后，新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色出现明显的Cleaved Caspase-3/Parvalbumin双阳性耳蜗毛细胞；而FPS-ZM1预处理的新生鼠耳蜗基底膜体外培养样本中Cleaved Caspase-3/Parvalbumin双阳性的耳蜗毛细胞数量与顺铂组相比明显减少。
采用TUNEL/Myosin 7a双染色研究FPS-ZM1的抗凋亡作用，结果见图6中B和D。
从6中B和D可知，暴露于顺铂后，新生鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色出现明显的TUNEL/Myosin 7a双阳性的耳蜗毛细胞；而FPS-ZM1预处理的耳蜗基底膜体外培养样本中TUNEL/Myosin 7a双阳性的耳蜗毛细胞数量与顺铂组相比明显减少。
综合可知，FPS-ZM1预处理能减少顺铂诱导的耳蜗毛细胞凋亡。
2)HEI-OC1细胞中凋亡相关蛋白表达的考察
通过蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达，结果见图6中E和F。
从图6中E和F可知，与单独使用顺铂相比，FPS-ZM1+顺铂组中Cleaved Caspase-3和BAX表达下调，而Bcl-2表达上调，表明FPS-ZM1可以抑制顺铂诱导的Caspase-3依赖性的细胞凋亡。
3)HEI-OC1细胞的凋亡细胞率的考察
通过Annexin V-FITC/PI双染色细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，结果见图6中G和H。
从图6中G可知，顺铂处理后，耳蜗毛细胞在第2象限的PI为18.3，在第3象限的PI为5.4，表明顺铂处理会导致毛细胞凋亡；而FPS-ZM1处理，第2象限的PI为6.32，第3象限的PI为3.38。
从6中H可知，与顺铂组相比，FPS-ZM1处理能显著降低凋亡细胞的比例(P<0.0001)，说明FPS-ZM1能够明显抑制顺铂诱导的凋亡细胞率增加。
综合这些结果表明，FPS-ZM1能抑制顺铂诱导的细胞凋亡。
从上述实验结果可知，RAGE抑制剂通过抑制HMGB1、RAGE的RNA表达从而抑制HMGB1蛋白、RAGE蛋白功能，进而能抑制HMGB1-RAGE信号通路的激活，同时能降低线粒体和细胞内ROS的产生，可有效防止顺铂诱导的毛细胞数量和存活的下降，此外，还能防止耳蜗毛细胞突触损伤，并抑制减弱听阈偏移，起到保护听力的作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.RAGE作为靶点在体外筛选预防和/或治疗听力损伤的产品中的应用。
2.RAGE抑制剂在制备预防或治疗听力损伤的产品中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述RAGE抑制剂是指能抑制RAGE基因的转录或翻译，或能特异性抑制RAGE蛋白的表达或活性的分子；
和/或，所述听力损伤为感音神经性听力损伤；优选的，所述感音神经性听力损伤为耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病和肿瘤中至少一项导致的听力损伤。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述听力损伤为如下1)-7)项中的至少一项：
1)HMGB1-RAGE信号通路激活；
2)炎症反应激活；
3)氧化应激水平升高；
4)ABR阈值升高；
5)耳蜗毛细胞凋亡；
6)耳蜗毛细胞突触数量降低；
7)耳蜗毛细胞数量或存活降低。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述预防或治疗听力损伤的产品包括如下1)-7)项中至少一项的功能：
1)抑制HMGB1-RAGE信号通路激活；
2)抑制炎症因子表达；
3)抑制氧化应激水平升高；
4)降低ABR阈值；
5)抑制耳蜗毛细胞凋亡；
6)提高耳蜗毛细胞突触数量；
7)提高耳蜗毛细胞数量。
6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述RAGE抑制剂单独使用或与其他药物联合使用。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述RAGE抑制剂与药学上可接受的辅料组成药物组合物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂中的一种或多种。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物组合物为溶液剂、注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、气雾剂、粉雾剂、片剂、胶囊剂和颗粒剂中的一种或多种。
10.一种筛选预防和/或治疗听力损伤的药物的方法，其特征在于，所述方法包括：以RAGE为药物靶点，寻找能够抑制或阻断RAGE的表达和/或功能的物质作为候选药物；优选的，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中RAGE的含量。
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