CN117120464A - 包含具有增加的表达的突变细胞内结构域的嵌合共刺激蛋白 - Google Patents

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CN117120464A
CN117120464A CN202280018700.6A CN202280018700A CN117120464A CN 117120464 A CN117120464 A CN 117120464A CN 202280018700 A CN202280018700 A CN 202280018700A CN 117120464 A CN117120464 A CN 117120464A
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Abstract

本申请涉及功能最优化的细胞内共刺激结构域，任选与细胞内在免疫检查点抑制受体或免疫刺激受体或其部分组合，其可用于过继细胞治疗以治疗人疾病和病症。

Description

包含具有增加的表达的突变细胞内结构域的嵌合共刺激蛋白
与相关申请的相互参照
本申请要求2021年3月19日提交的美国临时申请No.63/163,171和2021年1月4日提交的美国临时申请No.63/133,494的优先权和权益，其各自的内容均特此整体引入作为参考。
背景技术
虽然过继细胞治疗在癌症治疗中显示出功效，但通过T细胞用于更好的扩充和持久性的基因工程可以进一步提高这些疗法的有效性。T细胞需要来自CD28家族和肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的功能性非重叠共刺激信号以及抗原触发的TCR信号传导以促进全面激活和持续增殖。在开发基因工程T细胞治疗时，需要引入嵌合T细胞共刺激分子，所述分子可以在T细胞与病理抗原接合时局部激活，以有效增加T细胞激活用于增加的治疗功效。目前，在CAR T细胞治疗中已广泛采用结合来自CD28家族或TNFR家族的蛋白的一个共刺激信号传导结构域的第二代嵌合共刺激分子。整合了一个共刺激信号传导结构域的嵌合抗原受体(CARs)通过激活和共刺激信号两者增加T细胞功能，从而导致增强的抗肿瘤效力和T细胞持久性。已知T细胞扩充的能力取决于结构设计，目前的第二代共刺激蛋白对于诱导持久肿瘤缓解可能不是最佳的。因此，存在开发组合来自CD28家族和TNFR家族成员的两个共刺激信号传导结构域的第三代嵌合分子以进一步增强T细胞治疗潜力的期望的努力，从而利用两个共刺激分子家族的非重叠功能。此外，这种第三代嵌合共刺激分子可以整合到TCR T疗法中，在所述TCR T疗法中，由于抗原激活外源表达的TCRs期间共刺激信号不足，T细胞激活仍然是次优的。然而，现有的重组DNA策略经常遭受组合两个共刺激信号传导结构域的嵌合蛋白的降低的细胞表面表达，从而阻止了嵌合蛋白功能潜力的实现。本申请处理这种需要。
本申请公开了第三代嵌合T细胞共刺激分子，其结合了来自CD28和TNFR家族的两个信号传导结构域，并且以比对于增强的T细胞功能所已常规报道的显著提高的水平表达，以及制备共刺激分子的方法。
发明内容
本文提供了新的嵌合共刺激细胞内结构域。本文提供的嵌合共刺激细胞内结构域包含：(a)基于CD28家族蛋白的细胞内信号传导结构域的第一信号传导结构域；和(b)至少第二信号传导结构域，其包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述基于CD28家族蛋白的细胞内信号传导结构域的第一信号传导结构域选自CD28蛋白、ICOS蛋白或其组合。在一些实施方案中，所述至少第二信号传导结构域基于选自CD137(4-1BB)和CD134(OX-40)的TNFR家族蛋白的细胞内信号传导结构域的突变体。
本文提供的嵌合共刺激细胞内结构域包含：(a)基于CD28蛋白、ICOS蛋白或其组合的细胞内信号传导结构域的第一信号传导结构域；和(b)至少第二信号传导结构域，其包含突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。在一些实施方案中，突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域包含CD137或CD134细胞内结构域的近膜部分中的一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。在不受理论束缚的情况下，在一些实施方案中，近膜部分中的一个或多个氨基酸可以是与CD137或CD134蛋白的泛素化和降解有关的泛素化位点。
本文还公开了供新过继细胞治疗之用的功能最优化的细胞内共刺激结构域，任选与细胞内在免疫检查点抑制受体或免疫刺激受体或其部分组合，开发用于治疗人疾病和病症，包括血液学肿瘤和实体瘤。本文还公开了供与T细胞受体(TCR)例如内源性TCR或靶向肿瘤相关抗原的亲和力增强的TCR组合之用的功能最优化的细胞内共刺激结构域。任选地，细胞内共刺激结构域与第二组分(例如，细胞表面受体或其部分)组合使用，所述第二组分指导免疫细胞迁移以结合靶组织或细胞或诱导免疫细胞的激活和/或增殖，例如PD-1转换受体(基于PD-1的共刺激分子)，其可以增加肿瘤例如表达PD-L1/PD-L2的肿瘤中的T细胞功能性。本文还公开了以细胞内在方式利用PD-1检查点阻断的疗法，其同时将自身免疫副作用减至最小并提供增加的命中肿瘤(on-tumor)功能性。本申请公开了基于T细胞共同受体或嵌合抗原受体(CARs)的重组T细胞共刺激受体(RTCRs)，其包含本申请的功能最优化的细胞内共刺激结构域。本申请还公开了包含功能最优化的细胞内共刺激结构域和PD-1细胞外结构域(即，PD-1转换受体或基于PD-1的共刺激分子)的T细胞共同受体。本申请还公开了基于CD19和B细胞成熟Ag(BCMA)的CARs，其包含促进CD19和BCMA结合介导的T细胞活化、增殖和肿瘤杀伤的功能最优化的细胞内共刺激结构域。本申请中公开的RTCRs可用于检查点靶的评价、安全性筛选以及用于开发临床前动物模型以评价本申请的功能最优化的细胞内共刺激结构域与任何TCRs或CARs的组合的有效性。还开发了具有有效TCRs的额外的细胞内在免疫检查点抑制剂。
本发明提供了重组T细胞共刺激受体(RTCR)，其包含：(a)细胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)包含第一和至少第二信号转导结构域的嵌合细胞内结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域是不相同的；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
本发明提供了重组T细胞共刺激受体(RTCR)，其包含：(a)细胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)包含第一和至少第二信号转导结构域的嵌合细胞内结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域是不相同的；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。
本公开内容还提供了编码本文公开的RTCR的核酸。本公开内容还提供了包含本文公开的核酸的载体。本公开内容还提供了包含本文公开的核酸或载体的细胞。
本公开内容还提供了修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰降低或消除TCR的表达或活性水平；和(b)本文公开的重组T细胞共刺激受体(RTCR)。
本公开内容还提供了包含本文所公开的RTCR的组合物。本公开内容还提供了包含编码本文公开的RTCR的核酸的组合物。本公开内容还提供了包含载体的组合物，所述载体包含本文公开的核酸。本公开内容还提供了包含本文公开的细胞的组合物。本公开内容还提供了包含本文公开的修饰的T细胞的组合物。
本公开内容还提供了包含细胞群体的组合物，其中所述群体包含许多细胞，所述细胞包含编码本文公开的RTCR的核酸或包含编码本文公开的RTCR的核酸的载体。本公开内容还提供了包含细胞群体的组合物，其中所述群体包含许多本文公开的修饰的T细胞。
本公开内容提供了产生许多修饰的T细胞的方法，其中所述方法包括：a)提供本文公开的许多原代T细胞；b)提供包含本文公开的RTCR、编码本文公开的RTCR的核酸或包含编码本文公开的RTCR的核酸的载体的组合物；和c)将(b)的组合物引入(a)的许多原代T细胞中，以在许多修饰的T细胞内稳定表达RTCR的条件下产生许多修饰的T细胞。在一些实施方案中，本文公开的产生许多修饰的T细胞的方法进一步包括修饰编码内源T细胞受体(TCR)的内源序列的步骤，其中所述修饰降低或消除所述内源TCR的表达或活性水平。在一些实施方案中，本文公开的产生许多修饰的T细胞的方法进一步包括修饰内源序列的步骤，其中所述修饰降低或消除主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)的表达或活性水平。在一些实施方案中，本文公开的产生许多修饰的T细胞的方法进一步包括：d)在合适的细胞培养基中维持所述许多修饰的T细胞；和e)或者i)将所述许多修饰的T细胞在合适的细胞冷冻介质中深低温保藏；或者ii)使所述许多修饰的T细胞为施用于患有疾病或病症的主体做准备。
本公开内容还提供了治疗疾病或病症的方法，包括向有需要的主体施用治疗有效数目的包含编码本文公开的RTCR的核酸或包含编码本文公开的RTCR的核酸的载体的细胞、治疗有效数目的任意一种本文公开的修饰的T细胞、治疗有效量的任意一种本文公开的组合物或治疗有效数目的通过本文公开的方法产生的许多修饰的T细胞。
本公开内容还提供了嵌合共刺激胞内蛋白(CIP)，其包含第一和至少第二信号转导结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
本公开内容还提供了嵌合共刺激胞内蛋白(CIP)，其包含第一和至少第二信号转导结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。
在整个说明书中，术语“包含(comprising)”或变化形式例如“包括(comprises)”或“含有(comprise)”将被理解为暗示包括陈述的元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组，但不排除任何其他元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤的组。
在整个说明书中，术语“信号结构域”、“信号传导结构域”和“信号转导结构域”可互换使用，除非上下文另外指示。
虽然已经连同其详细描述一起描述了本公开内容，但是前面的描述意图是举例说明而不是限制本公开内容的范围，所述范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和公开或未公开的美国专利申请均引入作为参考。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均特此引入作为参考。本文引用的由检索号指示的Genbank和NCBI提交内容均特此引入作为参考。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献均特此引入作为参考。
附图说明
图1描绘了本申请的T细胞共刺激分子中使用的TNF受体超家族成员的细胞内尾部的比对。近膜多碱性区域(poly-basic regions)用斜体表示。潜在的PI3K结合位点为粗体且加下划线。TRAF1/2结合基序：主要基序Px(Q/E)E和次要基序Px(Q/E)x，加下划线。潜在的泛素化位点以粗体显示。
图2A-2B描绘了第二代和第三代共刺激分子的模块设计。图2A描绘了表示信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的共刺激分子的模块设计。图2B描绘了第一信号转导结构域的结构和序列：ICOS、CD28和插入了一部分CD28结构域的ICOS细胞内结构域。显示了具有特异性结合功能的ICOS和CD28细胞内结构域的区域和已知结合配偶体。共刺激分子和细胞内结构域的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图3描绘了本申请的细胞外效应结构域和细胞内信号传导结构域的组合。
图4A-4B描绘了4-1BB信号传导结构域的N-末端部分(包括多碱性结构域和赖氨酸残基)的缺失拯救了共刺激分子的表达。图4A描绘了用所示构建体慢病毒转导后T-淋巴细胞表面上人PD1和huEGFRt的表达。图4B描绘了表达huEGFRt的细胞上归一化的PD1表面表达，所述细胞表达不同的共刺激分子，所述共刺激分子具有包含野生型或截短的4-1BB结构域或OX-40结构域的基于ICOS或CD28的嵌合细胞内结构域，如所示的。嵌合细胞内结构域的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图5A-5D描绘了表达具有包含野生型或截短的4-1BB或OX-40结构域的基于ICOS的嵌合细胞内结构域的不同共刺激分子的T细胞的细胞因子产生和增殖。图5A-5C描绘了抗体介导的共刺激分子的交联增加了体外T细胞细胞因子生产。在用平板结合的抗-PD1[2μg/mL]和指示量的平板结合的抗-CD3对用指示的构建体转导的T细胞进行18小时刺激后，通过基于珠的多重测定在培养物上清液中测量IL-2(图5A)、TNF(图5B)和IFNγ(图5C)。x-轴表示不同的共刺激分子，且y-轴表示以吸光度单位(A.U.)表示的产生的细胞因子的量。图5D描绘了用指示的平板结合的抗体刺激96小时的T细胞的增殖。嵌合细胞内结构域的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图6A-6C描绘了共刺激分子的PD-L1接合增加了体外T细胞细胞因子的产生。图6A描绘了用指示的构建体转导的T细胞的18小时刺激后通过基于珠的多重测定在培养物上清液中测量的IL-2(上图)、IFNγ(中图)和TNF(下图)。x-轴表示抗-CD3抗体的量(μg/ml)，且y-轴表示作为对照的百分比的细胞因子产生。图6B-6C描绘了用分别包含CD28细胞内结构域(图6B，上图、中图和下图)和ICOS细胞内结构域(图6C，上图、中图和下图)的指示的共刺激分子转导并在有表达HLA-A2(左图)或HLA-A2和PD-L1(右图)的K562细胞的情况下用指示浓度的可溶性抗-CD3抗体刺激的T细胞的IL-2(上图)、IFNγ(中图)和TNF(下图)产生。x-轴表示抗CD3抗体的量(μg/ml)，且y-轴表示作为对照的百分比的细胞因子产生。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图7A-7C描绘了共刺激分子的PD-L1接合增加了体外T细胞的细胞毒性和增殖。如图6中那样，将如所示的表达PD-1构建体的T细胞和K562细胞混合并刺激。图7A和7B描绘了在有表达HLA-A2(左图)或HLA-A2和PD-L1(右图)的K562细胞的情况下用指示的浓度的可溶性抗-CD3抗体刺激96小时后，通过流式细胞术评价的剩余K562细胞的数目(上图)和T细胞的数目(下图)。图7C描绘了与表达HLA-A2(用“X”表示)或HLA-A2和PD-L1(用“*”表示)的K562细胞和0.3μg/ml抗-CD3共培养的表达各种PD1构建体的T细胞的增殖，如通过如x-轴上所示的Cell Trace violet稀释物中的移动所测量的。图7D是描绘在有逐渐增加的量的抗-CD3抗体(μg/ml)的情况下用表达共刺激分子的T细胞刺激后96小时后通过流式细胞术评价的靶细胞(K562)数目剩余的图，如所示的。图7E是描绘在有逐渐增加的量的抗-CD3抗体(μg/ml)的情况下用表达共刺激分子的T细胞刺激后96小时后通过流式细胞术评价的T细胞数目的图，如所示的。x-轴表示CD3抗体的量(μg/ml)，且y-轴表示细胞数目。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图8描绘了共刺激分子的接合增加了体外T细胞增殖。T细胞在具有2μg/mL抗-PD1和所述浓度的抗-CD3[mg/mL](由“*”表示)或仅抗-CD3(由“X”表示)的平板结合的抗体上刺激96小时，如y-轴上所示的，以及如通过如x-轴上所示的结晶紫示踪中的移动所测量的表达各种PD1构建体的T细胞的增殖。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图9A-9C描绘了多碱性和赖氨酸残基的突变对结合了ICOS和4-1BB信号传导结构域的共刺激分子的表达或功能的影响。图9A是一系列流式细胞术图，其描绘了表达野生型PD1受体(由“*”表示)或不同的基于PD1的共刺激分子(由“X”表示)的T-细胞的增殖，如在每个图的顶部的标记所示的。表达内源性PD-1的T-细胞用作对照(无标记的线)。图9B是描绘来自图9A中的FACS图的PD-1表达(表示为自内源水平起的倍数增加)的图。图9C是描绘当用指示的浓度的抗-CD3(x-轴)刺激时响应于K562细胞(顶行)和K562-PDL1表达细胞(中行)的表达如所示的不同共刺激分子的T细胞的细胞因子产生(IL-2，左图；IFNγ，中图；和TNF，右图)(y-轴)的图。底行的图中描绘了响应于K562细胞和K562-PDL1表达细胞的T细胞之间细胞因子产生水平之间的差异。图9D是描绘当用指示的浓度的抗-CD3(x-轴)刺激时，与K562细胞(左图)或表达PD-L1的K562细胞(中图)一起培养后96小时的T细胞的增殖的图。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图10A-10D描绘了结合了ICOS和OX-40信号传导结构域的共刺激分子的表达和功能。图10A是一系列流式细胞术图，其描绘了表达野生型PD1受体(由“*”表示)或不同的PD1-转换受体(基于PD1的共刺激分子)(由“X”表示)的T-细胞的增殖，如在每个图的顶部的标记所示的。表达内源性PD-1的T-细胞用作对照(无标记)。图10B是描绘来自图10A中的FACS图的PD-1表达(内源表达的倍数)的图。图10C是描绘当用指示的浓度的抗-CD3(x-轴)刺激时响应于K562细胞(顶行)和K562-PDL1表达细胞(中行)的表达如所示的不同共刺激分子的T细胞的细胞因子产生(IL-2，左图；IFNγ，中图；和TNF，右图)(y-轴)的图。底行的图中描绘了响应于K562细胞和K562-PDL1表达细胞的T细胞之间细胞因子产生水平之间的差异。图10D是描绘当用指示的浓度的抗-CD3(x-轴)刺激时，与K562细胞(左图)或表达PD-L1的K562细胞(中图)一起培养后96小时的T细胞增殖的图。最右图中描绘了靶细胞上有或没有PD-L1的情况下T细胞增殖之间的差异。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图11A-11B描绘了共刺激分子的接合增加了T细胞与PD-L1表达细胞的缀合。图11A描绘了CFSE-标记的T细胞与CTV-标记的K562靶的30分钟缀合的流式细胞术门控策略。图11B描绘了来自图11A中所示并且相对于对照缀合归一化的两个实验的结果的定量。具有和不具有信号肽的共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图12A-12C描绘了共刺激分子与PD-L1表达细胞接合时T细胞增殖和功能的增加。图12A是流式细胞术图，其描绘了慢病毒转染后72小时，当与K562细胞共培养时，具有(下部中图和右图)和没有(上部中图和右图)如所示的包含ICOS_4-1BB(截短的)信号传导结构域(PD-1_ICOS_BBt)的共刺激分子构建体的表达野生型HLA-A2/NY-ESO-1特异性TCRs或如所示的突变型NY-ESO TCR的T细胞中PD-1和TCRβ链的表面表达。图12B是描绘当以如x-轴所示的T细胞：A375细胞比与表达HLA-A2和抗原的A375-肿瘤细胞共培养时如所示的表达基于NY-ESO-1/PD1的共刺激分子组合的T细胞的IL-2(上图)和IFNγ(下图)产生的图。图12C是描绘由具有/没有如所示的包含ICOS_4-1BB(截短的)信号传导结构域(PD-1_ICOS_BBt)的共刺激分子构建体的情况下如所示的表达指示的野生型NY-ESO TCR或突变型、高亲和力(HA)NY-ESO TCR的T细胞对A375细胞的剂量依赖性杀伤的图。x-轴描绘剂量(T细胞：A375细胞比)和总输入A375细胞存活的百分比。具有和不具有信号肽的共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图13A-13B描绘了第三代尾部的突变增加了转导的原代T细胞上CD-19CAR受体的表面表达。图13A描绘了CD-19Fc与未转导的T细胞(用x标记)或用指示的构建体转导的T细胞(用*标记)结合的直方图。图13B描绘了相对于FMC63scFV_BB_Z归一化的图13A中所示的直方图的MFI测量结果。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图14A-14C描绘了修饰的第三代尾部增加细胞因子产生和肿瘤杀伤。显示了CAR-转导的原代T细胞对CD19-阳性细胞的体外杀伤。图14A描绘了与表达基于CD28的(左图)和基于ICOS的(右图)第二代和第三代受体的CAR-T细胞共培养96小时后，B细胞系(Nalm6细胞)的残余细胞数目。图14B描绘了与表达基于CD28的(左图)和基于ICOS的(右图)第二代和第三代受体的CAR-T细胞共培养96小时后，B细胞系(Raji细胞)的残余细胞数目。y-轴描绘了对应于x-轴上所示的T细胞与CD19-阳性细胞的比率的剩余CD19-阳性细胞的数目。图14C描绘了由表达第二代和第三代基于CD28的受体(左图)和基于ICOS的受体(右图)的T细胞响应于以如x-轴所示的T细胞：靶细胞比与CD19-阳性B细胞温育18小时的如y-轴所示的18小时-IFNγ产生。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图15A-15E描绘了与原始第三代信号传导结构域相比，修饰的第三代信号传导结构域增加体外CD19-CAR功能。图15A是描绘在如x-轴上所示的用Nalm6 B细胞重复刺激期间表达下述的T-细胞的累积T细胞数目(指示T细胞增殖)(y-轴)的图：a)基于CD28的第二代和第三代受体(左图)：和b)基于ICOS的第二代和第三代受体(右图)，如所示的。图15B是描绘在如x-轴上所示的用RAJI B细胞重复刺激期间表达下述的T-细胞的累积T细胞数目(指示T细胞增殖)(y-轴)的图：a)基于CD28的第二代和第三代受体(左图)：和b)基于ICOS的第二代和第三代受体(右图)，如所示的。图15C是描绘在如x-轴上所示的用Nalm6 B细胞重复刺激期间表达下述的T-细胞的累积靶细胞(Nalm6)数目(指示靶细胞杀伤)(y-轴)的图：a)基于CD28的第二代和第三代受体(左图)：和b)基于ICOS的第二代和第三代受体(右图)，如所示的。图15D是描绘在如x-轴上所示的用Raji B细胞重复刺激期间表达下述的T-细胞的累积靶细胞(Raji)数目(指示靶细胞杀伤)(y-轴)的图：a)基于CD28的第二代和第三代受体(左图)：和b)基于ICOS的第二代和第三代受体(右图)，如所示的。图15E是一系列流式细胞术图，其描绘了在时间零或在用RAJI B细胞靶进行5次连续刺激之后如所示的CAR-T细胞上的Tim3和PD-1表达。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
图16A-16E描绘了与原始第三代序列相比，修饰的第三代信号传导结构域增加体外BCMA-CAR功能。图16A描绘了BCMA-Fc与未转导的T细胞(由“X”表示)或用包含如所示的基于CD28和基于ICOS的第二代和第三代共刺激分子的指示的BCMACAR-T受体转导的T细胞(由“*”表示)结合的流式细胞术直方图。图16B是描绘来自图16A中的FACS图的转导的T细胞的BCMA-Fc结合(MFI)(x-轴)的图。图16C是一组描绘在用RPMI-8226多发性骨髓瘤靶细胞重复刺激期间表达下述的T-细胞的累积T细胞数目(指示T细胞增殖)(y-轴)的图：a)基于CD28的第二代和第三代受体(左图)：和b)基于ICOS的第二代和第三代受体(右图)，如所示的。图16D是描绘在如x-轴上所示的用RPMI-8226多发性骨髓瘤靶细胞重复刺激期间表达下述的T-细胞的累积靶细胞(RPMI-8226细胞)数目(指示靶细胞杀伤)(y-轴)的图：a)基于CD28的第二代和第三代受体(左图)：和b)基于ICOS的第二代和第三代受体(右图)，如所示的。图16E是一组描绘用包含如所示的基于CD28的或基于ICOS的共刺激分子的指示的BCMACAR构建体转导的CAR-T细胞以x-轴上所示的指示的效应物-靶比值温育18小时的细胞因子产生(IL-2，左图，TNF，中图和IFNγ，右图)(y-轴)的图。共刺激分子的氨基酸/核酸序列为如所示的。
具体实施方式
本文提供了新的嵌合共刺激细胞内结构域。本文提供的嵌合共刺激细胞内结构域包含：(a)基于CD28家族蛋白的细胞内信号传导结构域的第一信号传导结构域；和(b)至少第二信号传导结构域，其包含TNFR家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
CD28家族蛋白具有单个细胞外免疫球蛋白V-样(IgV)结构域，继之以短的细胞质尾。CD28家族蛋白的成员包括CD28、CD28H、诱导型共刺激物(ICOS)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4、CD152)、程序性死亡-1(program death-1)(PD-1)以及B-和T-淋巴细胞衰减子(BTLA)。CD28、CD28H和ICOS是T细胞上表达的共刺激蛋白，其促进T细胞的活化、高水平细胞因子/趋化因子表达、对凋亡的抗性和增殖。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白包括TNFR1(肿瘤坏死因子受体1/TNFRSF1A)、TNFR2(肿瘤坏死因子受体2/TNFRSF1B)、淋巴毒素β受体/TNFRSF3、OX40/TNFRSF4、CD40/TNFRSF5、Fas/TNFRSF6、诱杀型受体3/TNFRSF6B、CD27/TNFRSF7、CD30/TNFRSF8、4-1BB/TNFRSF9、DR4(死亡受体4/TNFRSF10A)、DR5(死亡受体5/TNFRSF10B)、诱杀型受体1/TNFRSF10C、诱杀型受体2/TNFRSF10D、RANK(NF-κB的受体激活物/TNFRSF11A)、OPG(护骨蛋白/TNFRSF11B)、DR3(死亡受体3/TNFRSF25)、TWEAK受体/TNFRSF12A、TACI/TNFRSF13B、BAFF-R(BAFF受体/TNFRSF13C)、HVEM(疱疹病毒进入介质(herpes virus entrymediator)/TNFRSF14)、神经生长因子受体/TNFRSF16、BCMA(B细胞成熟抗原/TNFRSF17、GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体/TNFRSF18)、TAJ(毒性和JNK诱导物/TNFRSF19)、RELT/TNFRSF19L、DR6(死亡受体6/TNFRSF21)、TNFRSF22、TNFRSF23、外胚层发育异常蛋白A2同种型受体/TNFRS27和外胚层发育异常蛋白1-无汗性受体。肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)配体和TNF受体超家族(TNFRSF)受体之间的相互作用提供了控制免疫细胞的存活、增殖、分化和效应子功能的共刺激信号。取决于TNFRSF成员诱导的特定细胞内信号，它们可分类为三组——含死亡结构域(DD)的受体、诱杀型受体和TNF受体相关因子(TRAF)结合受体。一些TNFRSFs，例如TNFR-1、Fas、DR3、DR4、DR5和DR6，含有其自己的DDs和/或与其他含有细胞质DD的衔接分子相互作用。一些其他TNFRSFs，如TNFR-2、CD27、CD30、CD40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、Fn1、淋巴毒素β受体(LTβR)、OX40、NF-κB的受体激活物(RANK)和XEDAR，缺乏DD，并含有具有四到六个氨基酸的称为TRAF相互作用基序(TIMs)的基序，其募集TRAF蛋白。TRAP蛋白是衔接分子，其激活多个下游信号传导途径，例如帮助细胞存活、增殖和细胞因子产生的NF-κB、詹纳斯激酶(JNK)、ERK、p38MAPK和PI3K。在一些实施方案中，基于CD28家族蛋白的细胞内信号传导结构域的第一信号传导结构域选自CD28蛋白、ICOS蛋白或其组合。在一些实施方案中，所述至少第二信号传导结构域基于TNFR家族蛋白的细胞内信号传导结构域的突变体，所述TNFR家族蛋白选自CD137(4-1BB)和CD134(OX-40)。
本文提供了基于本申请的第三代共刺激结构域的新嵌合共刺激细胞内结构域。减少的表面表达是开发用于治疗目的的嵌合共刺激蛋白中的主要障碍。本公开内容提供了通过本申请的第三代共刺激结构域中的突变产生的新嵌合共刺激细胞内结构域，其与目前的在诱导共刺激中有效的第二代和第三代嵌合受体相比既高度表达又高度有功能。本文提供的嵌合共刺激细胞内结构域包含：(a)第一信号传导结构域，其基于CD28蛋白、ICOS蛋白或其组合的细胞内信号传导结构域；和(b)至少第二信号传导结构域，其为突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。在一些实施方案中，突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域包含CD137或CD134细胞内结构域的近膜部分中的一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。在一些实施方案中，近膜部分中的一个或多个氨基酸是与CD137或CD134蛋白的泛素化和降解有关的泛素化位点。在一些实施方案中，突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域包含CD137或CD134细胞内结构域的近膜部分中的一个或多个赖氨酸残基的取代或缺失。在一些实施方案中，赖氨酸残基是与CD137或CD134蛋白的泛素化和降解有关的泛素化位点。在一些实施方案中，本文提供的嵌合共刺激细胞内结构域进一步包含第三信号传导结构域。在一些实施方案中，第三信号传导结构域可以基于CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的新共刺激细胞内结构域可以与任何已知的共刺激蛋白、细胞内在免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体、抗体或其部分、配体或其受体、细胞因子或其受体、趋化因子或其受体或补体受体的细胞外结构域组合或符合读框地融合，以形成功能性重组T细胞共刺激受体(RTCR)。在一些实施方案中，RTCR可以与另一种T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体或共刺激蛋白组合在细胞中表达。包含本文公开的新共刺激细胞内结构域的RTCR，当在T细胞中与TCR共表达时，与第二代共刺激受体相比，显著增加RTCR的细胞表面表达，和/或T细胞的细胞增殖、活化、持久性、细胞因子产生和/或效应子功能。
本申请中描述了靶向共享且安全的肿瘤相关抗原并包含能够经受抑制性肿瘤微环境的T细胞耗尽的细胞内在抑制剂的高度有效的过继细胞治疗。本文公开了表达PD-1的细胞外结构域和功能最优化的嵌合细胞内共刺激结构域的示例性嵌合分子。产生表达本公开内容的嵌合分子的修饰的T细胞以显示嵌合分子在增强T细胞刺激、活化和增殖中的功效。两种分子都在相同T细胞上表达，从而产生TCR-T产物，其对表达关联MHC/肽复合物和高水平PD-L1//PD-L2两者的肿瘤细胞稳健地做出反应。
为了举例证明，通过与靶向肿瘤相关或特异性抗原的T细胞受体组合的第三代嵌合PD-1受体的共表达，开发了T细胞耗尽的细胞内在抑制剂，以增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的功效。本文公开的第三代嵌合受体可以与任何内源性或修饰的T细胞受体以及嵌合人工受体(CARs)组合使用。本文的结果表明，本文公开的第三代共刺激分子产生具有高生理亲合力和持续增殖潜力的T细胞，同时取消PD-1的负信号传导，而在富含PD-L1的环境中递送共刺激信号。新的共刺激分子可以与肿瘤相关抗原(TAA)特异性TCR共表达，并用于靶向PD-L1/PD-L2和TAA表达肿瘤。这证实TCR激活和共刺激分子之间的协同效应显著增加治疗窗，并产生了潜在更有效的用于临床研究的候选物。在下面描述的公开内容中，系统地最优化了第三代嵌合蛋白的设计，以进一步在体外证实改善的抗癌有效性，并研究体内抗肿瘤功效。
产生了将PD-1的细胞外结构域与单独的或各种组合的CD28、ICOS、CD134和CD137的细胞内结构域结合的共刺激分子。通过将关键突变/缺失并入嵌合受体的信号传导结构域内，集中于CD28和TNF-受体家族信号传导结构域之间的接点，将这些序列针对表面表达和功能性进行了最优化。这些受体的功能性是使用可溶性和平板结合的抗体刺激与表达PD-L1的K562靶细胞或A375肿瘤细胞的组合基于表面表达、体外信号传导、体外T细胞缀合、细胞因子产生、增殖和细胞毒性进行测试的。
本文的公开内容提供了一种方法，其中TCR-T产物共表达与重组TAA-特异性TCR或内源TCR一起的嵌合共刺激分子。所述方法允许在同时拮抗检查点抑制和向转输的T细胞产物递送共刺激信号的情况下靶向肿瘤相关抗原。所述方法不仅导致大大改进的产物，而且有助于开发用于额外的TCR-T产物的通用功能加强平台。
阻碍组合了两个结构域的第三代CARs的临床采用的关键技术挑战是嵌合蛋白在细胞表面的异常低表达以及相关的减弱的功能性(Zhao，2015；Guedan，2018)。这在共刺激分子中同样适用，其中CD28和CD137信号传导结构域的组合导致表达不良且非功能性受体(Ankri，2013)。本文公开了一种基于ICOS/CD137信号传导结构域并针对表面表达进行了最优化的转换受体/共刺激分子，其比起过去使用单独CD28信号传导结构域的试验来是显著的改进，从而介导了增加的效应子功能和过继转移的细胞的持久性两者。本文描述的结果表明，本文公开的第三代共刺激分子产生具有高生理亲合力和持续增殖潜力的T细胞，同时取消PD-1的负信号传导，而在富含PD-L1的环境中递送共刺激信号。本文公开的新的转换受体/共刺激分子可以与内源TCR或TAA特异性TCR共表达，并用于靶向PD-L1/PD-L2表达肿瘤。这证实TCR激活和共刺激分子之间的协同效应显著增加潜在更有效的用于临床研究的候选物的治疗窗。
肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原允许在相对最小的非肿瘤靶向(off-tumor,on-target)副作用的风险的情况下对肿瘤的免疫靶向。肿瘤细胞可以上调这些抗原，其然后可以被人免疫应答或ACT靶向。本文的公开内容将显示出对基于CD28的受体的较好功能性的基于第三代CARs的共刺激分子与新的亲和力增强的靶向TAAs的TCR组合，以产生抵抗TME的抑制功能的TCR-T产物。
本公开内容提供了重组T细胞共刺激受体(RTCR)，其包含：(a)细胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)嵌合细胞内结构域，其包含第一和至少第二信号转导结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，TNFR家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域是突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域中的任一种。
本公开内容提供了重组T细胞共刺激受体(RTCR)，其包含：(a)细胞外结构域；(b)跨膜结构域；和(c)嵌合细胞内结构域，其包含第一和至少第二信号转导结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。
除非另外指出，否则术语“共刺激分子(co-stimulatory molecule)”、“共刺激分子(costimulatory molecule)”、“共刺激分子(co stimulatory molecule)”、“共刺激蛋白(co-stimulatory protein)”、“共刺激蛋白(costimulatory protein)”、“共刺激蛋白(costimulatory protein)”、“共刺激受体(co-stimulatory receptor)”、“共刺激受体(costimulatory receptor)”、“共刺激受体(co stimulatory receptor)”和“转换受体”可互换地使用，以指包含本申请的新嵌合共刺激细胞内结构域的重组T细胞共刺激受体(RTCRs)。这些术语可以与诸如“重组T细胞”、“重组”、“嵌合T细胞”和“嵌合”的术语组合使用，以指本申请的RTCRs。
如本文所述的，本公开内容的“重组T细胞共刺激受体”或“转换受体”是通过将细胞外结构域可操作地连接至本公开内容的细胞内嵌合细胞内蛋白产生的“共刺激分子”、“共刺激受体”或“共刺激蛋白”。
如本文所述的“CD137”是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，且也称为4-1BB、CD137、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)和淋巴细胞活化诱导的(ILA)。如本文所述的，术语“CD137”、“4-1BB”、“4-1BB wt”、“4-1BB野生型”、“BB”、“BB wt”和“BB野生型”可自始至终互换使用，例如，当描述本申请的构建体或共刺激分子时，除非另外指出。
在一些实施方案中，CD137细胞内结构域可以来自哺乳动物CD137。在一些实施方案中，哺乳动物CD137可以是人CD137、小鼠CD137、大鼠CD137或猴CD137。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域可以来自人CD137或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：U03397、AAA62478、NP_001552、Q07011、AAH06196和XP_006710681的人CD137氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域可以来自小鼠CD137或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_001070977.1、NP_001070976.1、NP_035742.1、NP_033430.1、P20334.1、XP_011248530.1、XP_011248530.1、ABI30213.1、BAE32724.1和AAH28507.1的小鼠CD137氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域可以来自大鼠CD137或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_852049.1、NP_001020944.1、BAD99404.1、XP_008762504.1、XP_006239534.1、EDL81196.1、AAH97483.1、EHB16663.1、EHB16663.1、KFO38282.1、XP_010618177.1、XP_029414155.1、XP_029414154.1、XP_021099219.1和XP_012888584.1的大鼠CD137氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域可以来自猴CD137或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：ABY47575.1、ABI30212.1、ABY47577.1、ABY47576.1和ABY47578.1的猴CD137氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的CD137细胞内结构域包含从本文所述的人CD137蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置214开始至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的CD137细胞内结构域包含从本文所述的小鼠CD137蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置215开始至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的突变型CD137细胞内结构域来自如本文所述的CD137蛋白中的任一种，其包含一个或多个突变，其中所述突变可以是CD137蛋白的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的添加/插入、缺失/截短或取代/置换。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD137细胞内结构域是如本文所述的CD137细胞内结构域序列中的任一种，其包含一个或多个突变，其中所述突变可以是CD137细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的添加/插入、缺失/截短或取代/置换。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD137细胞内结构域是如本文所述的CD137细胞内结构域，其包含可以作为泛素化的靶的CD137细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的缺失或取代。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD137细胞内结构域是如本文所述的CD137蛋白，其包含可以作为泛素化的靶的CD137细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或多个赖氨酸残基的缺失或取代。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD137细胞内结构域是如本文所述的CD137蛋白，其包含可以作为泛素化的靶的CD137细胞内结构域的氨基酸序列内的一个、两个、三个或四个赖氨酸残基的缺失或取代。在一些实施方案中，可被缺失或取代的本文所述的CD137细胞内结构域的氨基酸序列内的赖氨酸残基位于CD137细胞内结构域的氨基酸位置214、218、219和/或225。
在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域可以是截短的CD137细胞内结构域。如本文所述的截短的CD137细胞内结构域可以是本文所述的CD137蛋白中的任一种，其中不止一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、二十五个、五十个、一百个、两百个或更多个氨基酸的连续序列段被从如本文所述的CD137蛋白的N-末端缺失。如本文所述的截短的CD137细胞内结构域可以是本文所述的CD137细胞内结构域序列中的任一种，其中不止一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连续序列段被从如本文所述的CD137细胞内结构域的N-末端缺失。在一些实施方案中，从CD137细胞内结构域的N-末端缺失的氨基酸包括CD137细胞内结构域的一个或多个近端多碱性氨基酸。
在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域可以是截短的CD137细胞内结构域。在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含根据本公开内容的CD137细胞内结构域的氨基酸位置13至氨基酸位置42的氨基酸序列。在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的缺失。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
如本文所述的截短的CD137细胞内结构域自始至终可互换地称为“截短的CD137”、“CD137t”、“截短的4-1BB”、“4-1BBt”、“截短的BB”或“BBt”，例如，当描述本申请的构建体或共刺激分子时，除非另外指出。在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的1、2、3或4个赖氨酸残基的缺失。在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个赖氨酸突变。在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域在选自本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、5、6和12的氨基酸位置处包含一个或多个赖氨酸突变。在一些实施方案中，一个或多个赖氨酸突变是赖氨酸至丙氨酸的突变。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸突变。在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域在选自本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2、3、4、5和6的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。在一些实施方案中，本公开内容的包含一个或多个近端碱性氨基酸突变的突变型CD137细胞内结构域进一步包含在本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。在一些实施方案中，赖氨酸突变是赖氨酸至丙氨酸的突变。在一些实施方案中，CD137细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
如本文所述的“CD134”是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，并且也称为OX-40、ACT35、IMD16、TXGP1L和肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)。如本文所述的，术语“CD134”、“OX-40”、“OX40”、“OX-40野生型”、“OX-40wt”、“OX40野生型”、“OX40 wt”、“40”、“40野生型”和“40wt”可自始至终互换使用，例如，当描述本申请的构建体或共刺激分子时，除非另外指出。
在一些实施方案中，CD134细胞内结构域可以来自哺乳动物CD134。在一些实施方案中，哺乳动物CD134可以是人CD134、小鼠CD134、大鼠CD134或猴CD134。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域可以来自人CD134或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_003318、AAI05071、AAI05073、XP_016857721.1、XP_016857720.1、XP_011540377.1、XP_011540379.1、XP_011540378.1、XP_011540376.1、P43489.1、NP_001284491.1、NP_003317.1、EAW56278.1和CAB96543.1的人CD134氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域可以来自小鼠CD134或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_035789.1、AAI39267.1、AAI39240.1、NP_033478.1、XP_006538787.3、P47741.1、EDL15067.1、CAA79772.1、CAA59476.1、XP_021017102.2和XP_021056714.1的小鼠CD134氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域可以来自大鼠CD134或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_035789.1、NP_037181.1、P15725.1、EDL81353.1、CAB96543.1和CAA34897.1的大鼠CD134氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域可以来自猴CD134或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：XP_010375483.1、XP_001090870.1、XP_021523144.1、XP_017750744.1、XP_003939714.1、XP_026313229.1、XP_026313228.1、XP_003890998.2、XP_025242473.1、XP_011768627.1、XP_005545179.1、XP_011886513.1、XP_011886512.1、XP_011857387.1和XP_011811769.1的猴CD134氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的CD134细胞内结构域包含从本文所述的人CD134蛋白的任一种的氨基酸序列的氨基酸位置241开始至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的CD134细胞内结构域包含从本文所述的小鼠CD134蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置236开始至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的突变型CD134细胞内结构域来自如本文所述的CD134蛋白中的任一种，其包含一个或多个突变，其中所述突变可以是CD134蛋白的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的添加/插入、缺失/截短或取代/置换。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD134细胞内结构域是如本文所述的CD134细胞内结构域序列中的任一种，其包含一个或多个突变，其中所述突变可以是CD134细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的添加/插入、缺失/截短或取代/置换。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD134细胞内结构域是如本文所述的CD134细胞内结构域，其包含可以作为泛素化的靶的CD134细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的缺失或取代。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD134细胞内结构域是如本文所述的CD134蛋白，其包含可以作为泛素化的靶的CD134细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或多个赖氨酸残基的缺失或取代。在一些实施方案中，本文所述的突变型CD134细胞内结构域是如本文所述的CD134蛋白，其包含可以作为泛素化的靶的CD134细胞内结构域的氨基酸序列内的一个或两个赖氨酸残基的缺失或取代。在一些实施方案中，可被缺失或取代的本文所述的CD134细胞内结构域的氨基酸序列内的赖氨酸残基位于CD134细胞内结构域的氨基酸位置252和/或276。
在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域可以是截短的CD134细胞内结构域。如本文所述的截短的CD134细胞内结构域可以是本文所述的CD134蛋白中的任一种，其中不止一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、二十五个、五十个、一百个、两百个或更多个氨基酸的连续序列段被从如本文所述的CD137蛋白的N-末端缺失。如本文所述的截短的CD134细胞内结构域可以是本文所述的CD134细胞内结构域序列中的任一种，其中不止一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的连续序列段被从如本文所述的CD134细胞内结构域的N-末端缺失。在一些实施方案中，从CD134细胞内结构域的N-末端缺失的氨基酸包括CD134细胞内结构域的一个或多个近端多碱性氨基酸。
在一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含根据本公开内容的CD134细胞内结构域的氨基酸位置15至氨基酸位置37的氨基酸序列。在一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。在一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的缺失。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
如本文所述的截短的CD134细胞内结构域称为“截短的CD134”、“CD134t”、“截短的OX-40”、“截短的OX40”、“OX-40t”、“OX40t”和“40t”，自始至终可互换地使用，例如，当描述本申请的构建体或共刺激分子时，除非另外指出。
在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的赖氨酸残基的缺失。在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含在本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12的赖氨酸突变。在一些实施方案中，赖氨酸突变是赖氨酸至丙氨酸的突变。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸突变。在一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域在选自本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2和5的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。在一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域进一步包含在本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。在一些实施方案中，CD134细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
表1.RTCR的第二信号转导结构域(CD137/4-1BB和CD134/OX-40细胞内信号传导结构域)的氨基酸序列。
近膜多碱性区域用斜体表示。潜在的PI3K结合位点为粗体且加下划线。TRAF1/2结合基序：主要基序Px(Q/E)E和次要基序Px(Q/E)x，加下划线进行突出。潜在的泛素化位点以粗体显示。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含衍生自CD28家族的蛋白的第一信号转导结构域。在一些实施方案中，第一信号转导结构域衍生自CD28、CD28H、ICOS或其组合中的任一个。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含衍生自ICOS蛋白的第一信号转导结构域。
如本文所述的“ICOS蛋白”是诱导型T细胞共刺激蛋白，也称为AILIM、CD278、CCLP、CRP-1、H4、Ly115和CVID1。在一些实施方案中，ICOS细胞内结构域可以来自哺乳动物ICOS。在一些实施方案中，哺乳动物ICOS可以是人ICOS、小鼠ICOS、大鼠ICOS或猴ICOS。在一些实施方案中，ICOS细胞内结构域可以来自人ICOS或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：AAH28006.1、NP_036224.1、AIC51287.1、AIC60036.1、NP_036224.1、Q9Y6W8.1、EAW70357.1、EAW70356.1、EAW70355.1、AAL40934.1、AAL40933.1、CAC06612.1、AAX93073.1、AAM00909.1、AAH28210.1和CAD59742.1的人ICOS氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ICOS细胞内结构域可以来自小鼠ICOS或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_059508.2、Q9WVS0.2、EDL00161.1、CAM13242.1、CAM13241.1、CAB71153.1、AAG48732.1、AAH34852.1、XP_006496203.1、XP_006496202.1、XP_006496201.1、ACX50464.1、ACX50463.1、AAH28006.1、XP_021052880.1、XP_029334968.1和XP_021030282.1的小鼠ICOS氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ICOS细胞内结构域可以来自大鼠ICOS或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_072132.1、Q9R1T7.1、XP_008765358.1、XP_006245100.1、XP_006245099.1、EDL98922.1、EDL98921.1、XP_038940099.1、XP_032755449.1、XP_017457364.1、XP_006256324.1、XP_006256323.1、XP_006256322.1、XP_029425757.1、XP_029425757.1、XP_021119236.1、XP_012929934.1、XP_012867370.1和XP_012867363.1的大鼠ICOS氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ICOS细胞内结构域可以来自猴ICOS或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：XP_007964137.1、NP_001253918.1、XP_010350939.1、XP_012301785.1、XP_012301784.1、XP_017739861.1、XP_010334714.1、XP_003925677.1、AFH29328.1、XP_008997520.1、XP_023075107.1、XP_023075099.1、XP_021779593.1、XP_003907887.1、XP_025260988.1、XP_025260987.1、XP_025260986.1、XP_011716287.1、XP_011716285.1、XP_005574075.1、XP_011903009.1、XP_011805288.1、XP_011805287.1、XP_011847867.1、XP_011847866.1、XP_017392362.1、XP_033086489.1、XP_032134414.1、XP_032134413.1和XP_017802331.1的猴ICOS氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置133至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的氨基酸序列的位于氨基酸位置133的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置133至位于C-末端最后一个氨基酸的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的氨基酸序列的位于氨基酸位置133的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置至位于C-末端最后一个氨基酸的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS(28)细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置133至氨基酸位置183的ICOS结构域氨基酸序列的部分和从氨基酸位置184至C-末端最后一个氨基酸的ICOS结构域氨基酸序列的部分。在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS(28)细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的位于氨基酸位置133的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置至氨基酸位置183的ICOS结构域氨基酸序列的部分。在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS(28)细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的氨基酸位置133至位于氨基酸位置183的C-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置的ICOS结构域氨基酸序列的部分。在一些实施方案中，如本文所述的人ICOS(28)细胞内结构域包含从本文所述的人ICOS蛋白的位于氨基酸位置133的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置至位于氨基酸位置183的C-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的氨基酸位置的ICOS结构域氨基酸序列的部分。
也称为Tp44的“CD28蛋白”是幼稚T细胞上的组成型表达的CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体，且对T细胞活化很重要。在一些实施方案中，CD28细胞内结构域可以来自哺乳动物CD28。在一些实施方案中，哺乳动物CD28可以是人CD28、小鼠CD28、大鼠CD28或猴CD28。在一些实施方案中，CD28细胞内结构域可以来自人CD28或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：P10747.1、NP_001230007.1、NP_001230006.1、NP_006130.1、EAW70350.1、EAW70349.1、EAW70348.1、EAW70347.1、AIC48451.1、CAC29237.1、AAA51945.1、AAA51944.1、AAL40931.1、AAF33794.1、AAF33793.1、AAF33792.1、XP_011510499.1、XP_011510497.1、XP_011510496.1、AAI12086.1、AAH93698.1、ABK41938.1、AAY24123.1、CAD57003.1和AAA60581的人CD28氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD28细胞内结构域可以来自小鼠CD28或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：AAA37396.1、NP_031668.3、P31041.2、AAH64058.1、EDL00156.1、CAM13249.1、XP_036012281.1、XP_021054806.1、XP_021027481.1、XP_036015651.1和XP_030104805的小鼠CD28氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD28细胞内结构域可以来自大鼠CD28或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：CAA39003.1、NP_037253.2、P31042.1、XP_008765300.1、EDL98926.1、XP_032755445.1、XP_034354910.1、XP_019061859.2、XP_008844474.1、XP_004851403.1和XP_012865504.1的大鼠CD28氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD28细胞内结构域可以来自猴CD28或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：ABH06891.1、ABH08508.1、ABH06892.1、ABH08509.1、ABQ09493.1、NP_001274262.1、NP_001036106.2、ABG77998.1、ABG77997.1和XP_014966207.1的猴CD28氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。
“CD28H蛋白”，也称为CD28同源物、含有跨膜和免疫球蛋白结构域的蛋白2，通过与B7H7结合而在T细胞中具有共刺激活性。CD28H最初被描述为与细胞-细胞相互作用、细胞迁移以及上皮细胞和内皮细胞的血管发生有关的分子(7,8)。CD28H具有单个细胞外免疫球蛋白结构域，继之以跨膜结构域和110个氨基酸长的细胞质区域。在一些实施方案中，CD28细胞内结构域可以来自哺乳动物CD28H。在一些实施方案中，哺乳动物CD28可以是人CD28H、小鼠CD28H、大鼠CD28H或猴CD28H。在一些实施方案中，CD28H细胞内结构域可以来自人CD28H或其同种型或变体，其包含与根据GenBank检索号：NP_001295161.1、NP_001162597.1、Q96BF3.2、XP_024307127.1和XP_016881773.1的人CD28H氨基酸序列中的任一个相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的人CD28细胞内结构域包含从本文所述的人CD28蛋白的氨基酸序列的氨基酸位置145至C-末端最后一个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的人CD28细胞内结构域的部分可包含从本文所述的人CD28蛋白的氨基酸序列的约氨基酸位置195至约氨基酸位置212的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的人CD28细胞内结构域的部分可包含从本文所述的人CD28蛋白的氨基酸序列的位于氨基酸位置195的N-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个氨基酸的氨基酸位置至位于氨基酸位置220的C-末端一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个氨基酸的氨基酸位置的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衍生自ICOS的第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自ICOS的第一信号转导结构域包含与SEQ ID NO:9具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含第一信号转导结构域，所述第一信号转导结构域包含与根据SEQ ID NO：9的ICOS蛋白(ICOS(28)结构域)组合的CD28细胞内结构域的部分。在一些实施方案中，ICOS(28)结构域包含插入到根据SEQ ID NO:9的ICOS蛋白的PI-3K结合位点的N-末端的CD28细胞内结构域的部分。在一些实施方案中，ICOS(28)结构域包含插入根据SEQ ID NO：9的ICOS蛋白的PI-3K结合位点的N-末端1、2、3、4或5个氨基酸位置处的CD28的部分。在一些实施方案中，ICOS(28)结构域包含插入根据SEQ ID NO:9的ICOS蛋白的PI-3K结合位点的C-末端的CD28的部分。在一些实施方案中，ICOS(28)结构域包含插入根据SEQ ID NO:9的ICOS蛋白的PI-3K结合位点的C-末端1、2、3、4或5个氨基酸位置处的CD28的部分。
在一些实施方案中，CD28的部分在根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白中的氨基酸位置48之前的任何氨基酸位置处插入。在一些实施方案中，CD28的部分在根据SEQID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白中的氨基酸位置1和氨基酸位置48之间的任何氨基酸位置处插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置47和氨基酸位置48之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置46和氨基酸位置47之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置45和氨基酸位置46之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置44和氨基酸位置45之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置43和氨基酸位置44之间插入。
在一些实施方案中，CD28的部分在根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白中的氨基酸位置51之后的任何位置处插入。在一些实施方案中，CD28的部分在根据SEQ IDNO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白中的氨基酸位置51和氨基酸位置67之间的任何氨基酸位置处插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置51和氨基酸位置52之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置53和氨基酸位置54之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置54和氨基酸位置55之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置56和氨基酸位置57之间插入。在一些实施方案中，CD28的部分在具有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的ICOS蛋白的氨基酸位置57和氨基酸位置58之间插入。
在一些实施方案中，本文公开的ICOS(28)结构域的CD28的部分包含根据SEQ IDNO:10的CD28信号传导结构域的根据氨基酸位置51至氨基酸位置68的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的ICOS(28)结构域的CD28部分包含根据SEQ ID NO:10的全长CD28信号传导结构域的根据氨基酸位置51至氨基酸位置76的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的ICOS(28)结构域的CD28部分包含根据SEQ ID NO:10的CD28信号传导结构域的根据氨基酸位置45至氨基酸位置68的氨基酸序列。在一些实施方案中，插入ICOS(28)结构域内的CD28的部分包含PRRP基序。在一些实施方案中，插入ICOS(28)结构域内的CD28的部分包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，插入ICOS(28)结构域内的CD28的部分包含与SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ICOS(28)结构域包含根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，ICOS(28)包含与SEQ ID NO:12具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含衍生自CD28的第一信号转导结构域。在一些实施方案中，衍生自CD28的第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自CD28的第一信号转导结构域包含与SEQ ID NO:10具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
如本文所述的衍生自CD28的信号转导结构域被称为“CD28”或“28”，自始至终可互换。
表2第7
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:13具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NOs：14-17中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NOs：14-17中任一项具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:14具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQID NO:15具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:16具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NOs：120-129中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NOs：120-129中任一项具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:120具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:121的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:121具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:122的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:122具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:123的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:123具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:124的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:124具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:125的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:125具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:126的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ IDNO:126具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:127具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:128具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域包含与SEQ ID NO:129具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
表3.RTCR的嵌合细胞内结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域进一步包含第三信号转导结构域。在一些实施方案中，第三信号转导结构域衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域中的任一种。在一些实施方案中，CD3信号传导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域进一步包含衍生自CD3ζ蛋白的第三信号转导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是根据SEQ IDNO:18的氨基酸序列的CD3ζ蛋白。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与根据SEQ ID NO:18具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ。
人CD3ζ全长(CD3Z全长)(SEQ ID NO:18)
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQ IDNOs:45、46、47和48中任一项的氨基酸序列的CD3信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:45具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQID NO:46的氨基酸序列的截短的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:46具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列的截短的CD3ε。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:47具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD3ε。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是CD3ε和截短的CD3ζ结构域的组合(CD3ζε结构域)。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CD3ζε。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:48具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζε。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是突变型CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是截短的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:49的氨基酸序列的截短的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:49具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD2信号传导结构域。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:50具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域进一步包含第四信号转导结构域。在一些实施方案中，第四信号转导结构域衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合中的任一种，其中所述第三和第四信号转导结构域转导域不相同。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQ IDNOs:45、46、47和48中任一项的氨基酸序列的CD3信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:45具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQID NO:46的氨基酸序列的截短的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:46具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD3ζ。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列的截短的CD3ε。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:47具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD3ε。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是CD3ε和截短的CD3ζ结构域的组合(CD3ζε结构域)。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CD3ζε。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:48具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζε。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是突变型CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是截短的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:49的氨基酸序列的截短的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:49具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD2信号传导结构域。
在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合细胞内结构域的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:50具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。
术语T细胞、T-细胞、t细胞、t-细胞和T淋巴细胞在本公开内容中可以互换使用。
在一些实施方案中，细胞外结构域包含结合靶以诱导免疫细胞的活化和/或增殖的蛋白或其部分。在一些实施方案中，细胞外结构域包含以下任一种：a)T细胞受体(TCR)复合物的组分；b)嵌合抗原受体(CAR)的组分；c)T细胞共同受体的组分，其中所述T细胞共同受体是T细胞共刺激蛋白或T细胞抑制蛋白；d)与细胞表面受体或其组分结合的配体；e)细胞因子受体的组分，e)趋化因子受体的组分；g)整联蛋白受体的组分；h)内皮细胞表面蛋白受体的组分或其片段；i)神经元导向蛋白受体的组分；和f)补体受体的成分。在一些实施方案中，T细胞共同受体或CAR的组分是PD1、CD28、CD2、OX-40、ICOS、CTLA-4、CD28、CD3、CD4、CD8、CD40L、Lag-3、Tim-3或TIGIT或其组合的组分。在一些实施方案中，T细胞共同受体或CAR的配体或组分结合CD19、B细胞成熟Ag(BCMA)、PD-L1、PD-L2、IL-10、增殖诱导配体(APRIL)、BAFF、OX-40L、ICOS-L、B7-1、B7-2、CD40、CD58、CD59、柄蛋白、CD155或CD112或其组合。在一些实施方案中，细胞因子受体结合IL-10、IL-27、TGF-β、IL-12、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ或IFN-α/β或其组合。在一些实施方案中，补体受体的组分是单一C3aR、C5aR、CD46/MCP、CD55、CD97或DAF或其组合的组分。
在一些实施方案中，细胞外结构域包含以下任一种的组分的氨基酸序列：a)趋化因子受体；b)细胞因子受体；c)细胞表面受体的配体；d)整联蛋白受体，e)细胞黏着分子或其受体；f)内皮细胞表面蛋白受体或其片段；g)补体受体；和h)神经元导向蛋白受体。在一些实施方案中，细胞外结构域包含上皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGFR)、趋化因子受体(CCR)4、CCR5、CCR7、CCR10、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、白细胞特异性β2整联蛋白(αLβ2、αMβ2、αXβ2、αDβ2)、β7整联蛋白(a4β7和αEβ7)、胞外基质(ECM)结合β1整联蛋白(α1-α6β1)、L-选择蛋白或唾液酸路易斯抗原(sialyl Lewisx)中任一种的组分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域是蛋白、肽、糖蛋白、抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体或其片段是Fab片段、F(ab)2片段、双抗体、纳米抗体(nanobody)、sdAb、Fv、VHH片段或单链Fv片段。
在一些实施方案中，细胞外结构域包含两个或更多个用于靶向两个或更多个不相同的靶抗原的结合位点。在一些实施方案中，细胞外结构域包含两个或更多个用于靶向靶抗原上的两个或更多个不相同的位点的结合位点。在一些实施方案中，细胞外结构域包含双特异性抗体的两个抗原结合结构域或片段。在一些实施方案中，细胞外结构域包含双特异性抗体的F(ab)2片段。在一些实施方案中，细胞外结构域包含多特异性抗体的两个或更多个抗原结合结构域或片段。
在一些实施方案中，细胞外结构域结合靶，所述靶是肿瘤抗原、病原体相关蛋白或与疾病或病症有关的抗原，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或病症、传染病、炎性疾病、肾疾病或病症、肺疾病或病症、肝疾病或病症、心血管疾病或病症、神经变性病症或病症或代谢病症或病症。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤分泌的抗原(TSA)或非常规抗原(unconventional antigen)(UCA)中的任一种。在一些实施方案中，TAA是癌症种系抗原(CGA)、人类内源性反转录病毒(HERVs)、组织分化抗原(TDA)和超表达的肿瘤抗原中的任一种。在一些实施方案中，TSA衍生自嵌合单核苷酸变异(mSNVs)、插入-缺失突变(INDELs)、基因融合和病毒癌蛋白中的任一种。在一些实施方案中，UCA衍生自基因组的非编码区或基因组的编码区。在一些实施方案中，UCA衍生自异常转录、翻译或翻译后修饰。
在一些实施方案中，TAA与实体瘤或癌症或血液学癌症有关。在一些实施方案中，TAA与实体瘤或癌症有关，选自表现为实体瘤、导致实体瘤或与实体瘤有关的肉瘤、癌或淋巴瘤。
在一些实施方案中，TAA与肉瘤有关，所述肉瘤是软组织肉瘤或骨肉瘤(骨肉瘤)。在一些实施方案中，TAA与选自下述的肉瘤有关：囊状横纹肌肉瘤(vesicularrhabdomyosarcoma)、囊状软组织肉瘤(vesicular soft tissue sarcoma)、成釉细胞瘤、血管肉瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、亮组织肉瘤(bright tissue sarcoma)、去分化脂肉瘤、结缔组织的增生性小圆细胞肿瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、上皮样纤维肉瘤、上皮样血管内皮瘤、上皮样肉瘤；敏感性成神经细胞瘤(成感觉神经细胞瘤)、尤因肉瘤、肾外横纹肌肉瘤、骨外黏液性软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、血管外皮细胞瘤、婴儿纤维肉瘤、炎性成肌纤维细胞瘤(inflammatory myofibroblastoma)、卡波西肉瘤、骨平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、恶性间质瘤、恶性周边神经鞘肿瘤、间质性软骨肉瘤、黏液样脂肪肉瘤、黏液样炎性成纤维细胞肉瘤、具有血管周上皮样细胞分化的多发性肿瘤、骨肉瘤、骨膜外骨肉瘤、具有血管周上皮细胞分化的肿瘤、骨膜骨肉瘤、多形性脂肪肉瘤、多形性横纹肌肉瘤、PNET/骨外尤因瘤、横纹肌肉瘤、小细胞骨肉瘤、单纤维样肌瘤(single fibroids)、滑膜肉瘤或毛细血管扩张型骨肉瘤。
在一些实施方案中，TAA与选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、原位导管癌(DCIS)、浸润性导管癌或腺癌的癌有关。在一些实施方案中，TAA与选自腺鳞状癌、退行性癌、大细胞癌、结肠直肠癌、胰癌、鼻咽癌或小细胞癌的癌有关。
在一些实施方案中，TAA与选自下述的实体瘤或癌症有关：肛门癌、阑尾癌；胆管癌(即，胆道癌)、乳腺癌、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、结肠息肉、不明原发性癌症(unidentified primary cancer)(cup)、食道癌、眼癌、输卵管癌(tubalcancer)、肾癌、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。
在一些实施方案中，乳腺癌是浸润性乳腺导管癌(invasive breast ductcancer)、导管原位癌、浸润性小叶癌或原位小叶癌。在一些实施方案中，胰癌是腺癌或胰岛细胞癌。在一些实施方案中，结肠直肠癌是腺癌。在一些实施方案中，结肠息肉与家族性腺瘤性息肉病有关。在一些实施方案中，膀胱癌是移行细胞膀胱癌、鳞状细胞膀胱癌或腺癌。在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，非小细胞肺癌是腺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌。在一些实施方案中，非小细胞肺癌是大细胞肺癌。一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌。在一些实施方案中，前列腺癌是腺癌或小细胞癌。在一些实施方案中，卵巢癌是上皮性卵巢癌。在一些实施方案中，胆管癌是近端胆管癌或远端胆管癌。
在一些实施方案中，TAA与选自白血病、骨髓瘤或淋巴瘤的血液学癌症的任何一种有关。在一些实施方案中，TAA与选自急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性淋巴细胞白血病，B细胞、T细胞或FAB ALL，急性髓性白血病(AML)，急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病(APL)，混合谱系白血病(mixed-lineage leukemia)(MLL)或骨髓增生异常综合征(MDS)的白血病有关。
在一些实施方案中，TAA与骨髓瘤有关，所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，TAA与选自多发性骨髓瘤的超二倍体(HMM)或非超二倍体或亚二倍体亚型的多发性骨髓瘤有有关。在一些实施方案中，TAA与选自轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、无症状型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)(SMM)、免疫球蛋白D(IgD)骨髓瘤或免疫球蛋白E(IgE)骨髓瘤的多发性骨髓瘤有关。
在一些实施方案中，TAA与淋巴瘤有关，所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，TAA与非霍奇金淋巴瘤有关。在一些实施方案中，TAA与选自小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡中心细胞淋巴瘤(Follicle center cell lymphoma)、伯基特淋巴瘤、伯基特样淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或边缘区B-细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤有关。在一些实施方案中，TAA与淋巴瘤有关，所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，TAA与选自结节硬化经典霍奇金淋巴瘤、富含淋巴细胞的经典霍奇金淋巴瘤或淋巴细胞耗尽的经典霍奇金淋巴瘤的霍奇金淋巴瘤有关。
在一些实施方案中，TAA与癌症有关，所述癌症是以下任一种：急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性淋巴细胞白血病，B细胞、T细胞或FAB ALL，急性髓性白血病(AML)，急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(MDS)，霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，结肠直肠癌，胰癌，鼻咽癌，恶性组织细胞增生症，副肿瘤综合征/恶性肿瘤高钙血症(hypercalcemia of malignancy)，膀胱癌，乳腺癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，头癌，颈癌，遗传性非息肉性癌，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰癌，前列腺癌，肾细胞癌，睾丸癌，腺癌，肉瘤，恶性黑色素瘤和血管瘤。
在一些实施方案中，细胞外结构域结合选自下述的TAA：激肽释放酶4、乳头瘤病毒结合因子(PBF)、黑色素瘤优先表达抗原(FRAME)、肾母细胞瘤-I(WTI)、羟类固醇脱氢酶样I(HSDLI)、间皮素(mesothelin)、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌胚抗原(CEA)、p53、人表皮生长因子受体2/神经受体酪氨酸激酶(neuro receptor tyrosine kinase)(Her2/Neu)、癌相关上皮细胞黏着分子(EpCAM)、卵巢和子宫癌抗原(CAI25)、叶酸受体a、精子蛋白17、肿瘤相关差异表达基因-12(TADG-12)、黏蛋白-16(MUC-16)、LI细胞黏着分子(LICAM)、甘露聚糖-MUC-1、人类内源性反转录病毒K(HERV-K-MEL)、北九州(Kita-kyushu)肺癌抗原-I(KK-LC-1)、人癌/睾丸抗原(KM-HN-1)、癌睾丸抗原(LAGE-I)、黑色素瘤抗原-Al(MAGE-Al)、精子表面透明带结合蛋白(Spl 7)、滑膜肉瘤、X断裂点4(SSX-4)、瞬时轴突糖蛋白(Transientaxonal glycoprotein)-1(TAG-I)、瞬时轴突糖蛋白-2(TAG-2)、Enabled同源物(ENAH)、乳腺珠蛋白(mammoglobin)-A、NY-BR-I、乳腺癌抗原、(BAGE-1)、B黑色素瘤抗原、黑色素瘤抗原-Al(MAGE-Al)、黑色素瘤抗原-A2(MAGE-A2)、黏蛋白k、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX-2)、紫杉醇抗性相关基因-3(TRAG-3)、禽类髓细胞瘤病病毒癌基因(c-myc)、细胞周期蛋白B1、黏蛋白I(MUC I)、p62、存活蛋白、淋巴细胞共同抗原(CD45)、DickkopfWNT信号传导途径抑制剂I(DKKI)、端粒末端转移酶、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)、G250、肠羧酸酯酶、甲胎蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、胱天蛋白酶5(CASP-5)、细胞色素C氧化酶装配因子I同源物(COA-1)、0-连接的β-N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)、骨肉瘤扩增的9、内质网凝集素(OS-9)、转化生长因子β受体2(TGF-βRII)、鼠白血病糖蛋白70(gp70)、降钙素相关多肽α(CALCA)、程序性细胞死亡1配体1(CD274)、小鼠双微体2同源物(mdm-2)、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、苹果酸酶1(MEI)、核转录因子Y亚基C(NFYC)、G抗原1,3(GAGE-1,3)、黑色素瘤抗原-A6(MAGE-A6)、癌睾丸抗原XAGE-lb、前列腺六跨膜上皮抗原1(STEAPl)、PAP、前列腺特异性抗原(PSA)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、热休克蛋白hsp70-2、黑色素瘤抗原-A9(MAGE-A9)、Arg-特异性ADP-核糖基转移酶家族C(ARTCl)、B-Raf原癌基因(B-RAF)、丝氨酸/苏氨酸激酶、β-联蛋白、细胞分裂周期27同源物(Cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、酪蛋白激酶1α1(CSNKlAl)、纤连蛋白1(FNl)、生长停滞特异性(Gruwih Anest Specific)7(GAS7)、糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)、HAUS Augmin样复合物亚基3(HAUS3)、LDLR-岩藻糖基转移酶、T细胞识别的黑色素瘤抗原2(MART2)、肌肉生长抑制素(MSTN)、黑色素瘤相关抗原(突变的)1(MUM-1-2-3)、聚腺苷酸聚合酶γ(neo-PAP)、肌球蛋白I类、蛋白磷酸酶1调节亚基3B(PPP1R3B)、过氧化物氧还蛋白-5(PRDX5)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶κ(PTPRK)、转化蛋白N-Ras(N-ras)、成视网膜细胞瘤相关因子600(RBAF600)、sirtuin-2(SIRT2)、SNRPDl、丙糖磷酸异构酶、眼白化病1型蛋白(OAl)、成员RAS癌基因家族(RAB38)、酪氨酸酶相关蛋白1-2(TRP-1-2)、黑色素瘤抗原Gp75(gp75)、酪氨酸酶、Melan-A(MART-1)、糖蛋白100黑色素瘤抗原(gplOO)、N-乙酰葡糖胺转移酶V基因(GnTVf)、淋巴细胞抗原6复合基因座K(LY6K)、黑色素瘤抗原-AlO(MAGE-AlO)、黑色素瘤抗原-Al2(MAGE-Al2)、黑色素瘤抗原-C2(MAGE-C2)、黑色素瘤抗原NA88-A、紫杉醇抗性相关蛋白3(TRAG-3)、BDZ结合激酶(pbk)、胱天蛋白酶8(CASP-8)、肉瘤抗原1(SAGE)、断裂点簇区-埃布尔森癌基因(BCR-ABL)、白血病中的融合蛋白、dek-can、含有延伸因子Tu GTP结合结构域的2(EFTUD2)、ETS变体基因6/急性髓性白血病融合蛋白(ETV6-AML1)、FMS-样酪氨酸激酶-3内部串联重复(FLT3-ITD)、细胞周期蛋白-Al、含有纤连蛋白III型结构域的3B(FDNC3B)、早幼粒细胞白血病/视黄酸受体α融合蛋白(pml-RARα)、黑色素瘤抗原-Cl(MAGE-Cl)、膜蛋白可变剪接的同种型(D393-CD20)、黑色素瘤抗原-A4(MAGE-A4)或黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)。
在一些实施方案中，所述自身免疫性状况或病症是1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、乳糜泻、干燥综合征、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、斑秃、血管炎和颞动脉炎中的任一种。在一些实施方案中，与身免疫性状况或病症有关的肿瘤相关抗原(TAA)衍生自羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、Imogen-38、胰岛素、胰岛素瘤抗原-2和2β、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α-烯醇化酶、水通道蛋白-4、β-抑制蛋白、髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、S100-β、瓜氨酸化蛋白(Citrullinated protein)、胶原II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白、双链DNA、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂-β-2糖蛋白I复合物、聚ADP核糖聚合酶和U-1小核糖核蛋白复合物的Sm抗原中的任一种。
在一些实施方案中，病原体相关抗原是来自细菌、真菌或寄生物蛋白或其片段的抗原。在一些实施方案中，病原体相关抗原与HIV感染、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、依波拉病毒感染、登革热、黄热病、李斯特菌病、结核病、霍乱、疟疾、利什曼病或锥虫感染或它们的组合有关。
在一些实施方案中，神经变性病症或状况是阿尔茨海默病(AD)和其他痴呆、帕金森病(PD)和PD-相关病症、普利昂病、运动神经元病(MND)、亨廷顿病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)中的任一种。在一些实施方案中，与神经变性病症或状况有关的抗原是淀粉状蛋白β(Ab)、tau、α-突触核蛋白(α-syn)、mHTT或朊病毒PrPsc或其组合中的任一种。
在一些实施方案中，细胞外结构域以1fM至100μM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以1pM至100μM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以1pM至10pM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以10pM至50pM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以10pM至100pM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以100pM至500pM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以500pM至1nM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以1nM至10nM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以10nM至100nM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以100nM至500nM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以500nM至1μM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以1μM至10μM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以1μM至5μM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以5μM至7.5μM的结合亲和力结合靶。在一些实施方案中，细胞外结构域以7.5μM至10μM的结合亲和力结合靶。
在一些实施方案中，细胞外结构域在N-末端包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽可以衍生自表面表达蛋白或分泌蛋白。在一些实施方案中，信号肽可以衍生自前促乳素、HIV前-Env、HCV多蛋白、CB病毒多蛋白、瘟病毒多蛋白、前钙网蛋白、前-VSV-G、HLA I类组织相容性抗原或PD-1信号肽(PD-1SP)、白细胞介素12(IL12)、GM-CSF或CD8α链(CD8a)。在一些实施方案中，信号肽是PD-1信号肽(PD-1SP)。在一些实施方案中，信号肽是HLA I类组织相容性抗原或其部分。在一些实施方案中，细胞外结构域衍生自PD1。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NOs：19-21中任一项的氨基酸序列的位置1至163的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列的位置1至163的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NO:20的氨基酸序列的位置1至163的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列的位置1至163的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NOs：22-23中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含与SEQ IDNO：23具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
表4.RTCR的PD1细胞外结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NOs：24-44和130-132中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：24具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：25具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：26具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：27具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：28具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：29具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：30的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：30具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR的细胞外结构域包含根据SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR的细胞外结构域包含与SEQ ID NO：31具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：32的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：32具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：33具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：34的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：34具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：35具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：36具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：37具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：38具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：39具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：40具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：41的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：41具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：42的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：42具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：43的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：43具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：44的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：44具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：130的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：130具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：131的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：131具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含根据SEQ ID NO：132的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR包含与SEQ ID NO：132具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
表5.基于PD1的重组T细胞共刺激受体(RTCR)的氨基酸序列。
表6：RTCR的第三和第四信号传导结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域衍生自CD19结合蛋白。在一些实施方案中，CD19结合蛋白是CD19结合嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，细胞外结构域包含根据SEQID NO：51的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含与SEQ ID NO：51具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NOs：52-69中任一项的氨基序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：52具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：53具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：54的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：54具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：55具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：56的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：56具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：57的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：57具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：58的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：58具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：59具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：60的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：60具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：61具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：62中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：62具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：63具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：64具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：65的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：65具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：66的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：66具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：67的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：67具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：68的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：68具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：69的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：69具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
表7：与基于CD19 CAR的RTCR相关的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域包含铰链区。在一些实施方案中，铰链区衍生自CD8、PD-1、CD28、ICOS或IgG。在一些实施方案中，本文公开的RTCR的跨膜结构域衍生自CD8、PD1、CD28、ICOS或IgG。
本公开内容还提供了编码本文公开的RTCR的核酸。在一些实施方案中，编码本文公开的RTCR的核酸是根据SEQ ID NO：75-86和92-110的。在一些实施方案中，本文公开的核酸包含编码嵌合细胞内结构域的核酸序列。在一些实施方案中，本文公开的RTCR用于在T细胞中表达，其中所述T细胞共表达内源共刺激分子CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L或其组合中的至少一种。
本公开内容还提供了包含本文公开的核酸的载体。在一些实施方案中，本文公开的载体是病毒载体、质粒、黏粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或转座子/转座酶系统中的任一种。在一些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。
本公开内容还提供了包含本文公开的核酸或载体的细胞。在一些实施方案中，本文公开的细胞是修饰的T细胞。在一些实施方案中，修饰的T细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，修饰的T细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，修饰的T细胞是幼稚T细胞、早期记忆T细胞、干细胞样T细胞、干记忆T细胞(stem memory T cell)(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)和调节T细胞(Treg)中的任何一种。
在一些实施方案中，细胞外结构域是B细胞成熟Ag(BCMA)结合蛋白。在一些实施方案中，BCMA结合蛋白是BCMA特异性T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，BCMA结合蛋白是BCMA特异性嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQID NOs：137-146中任一项的氨基酸序列：。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：137的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：137具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：138的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：138具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：139的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：139具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：140的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：140具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：141的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：141具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：142的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：142具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：143的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：143具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：144的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：144具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：145的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：145具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQ ID NO：146的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO：146具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域是B细胞成熟Ag(BCMA)结合蛋白。在一些实施方案中，BCMA结合蛋白是BCMA特异性T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，BCMA结合蛋白是BCMA特异性嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，BCMA结合嵌合抗原受体包含根据SEQID NOs：141、142、145和146中任一项的氨基酸序列。
表8：BCMA特异性嵌合抗原受体(CAR)和基于BCMA特异性CAR的RTCR的氨基酸序列。
表9：RTCRs的细胞内信号传导结构域、细胞外结构域和RTCRs的核酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的细胞进一步包含编码人工抗原受体、治疗用多肽、免疫细胞调节蛋白或其组合的序列。在一些实施方案中，人工抗原受体包括嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，人工抗原受体包括重组T细胞受体(rTCR)。在一些实施方案中，人工抗原受体包括增强亲和力TCR。在一些实施方案中，人工抗原受体结合肿瘤相关抗原(TAA)、病原体相关蛋白或与疾病或病症有关的抗原，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或病症、传染病、炎性疾病、肾疾病或病症、肺疾病或病症、肝疾病或病症、神经变性病症或病症或代谢病症或病症。
在一些实施方案中，人工抗原受体结合与实体瘤或血液学癌症有关的TAA。在一些实施方案中，人工抗原受体结合与选自下述任一种的癌症有关的TAA：白血病，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性淋巴细胞白血病，B细胞、T细胞或FAB ALL，急性髓性白血病(AML)，急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(MDS)，淋巴瘤，霍奇金病，恶性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，卡波西肉瘤，结肠直肠癌，胰癌，鼻咽癌，恶性组织细胞增生症，副肿瘤综合征/恶性肿瘤高钙血症，实体瘤，膀胱癌，乳腺癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，头癌，颈癌，遗传性非息肉性癌，霍奇金淋巴瘤，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰癌，前列腺癌，肾细胞癌，睾丸癌，腺癌，肉瘤，恶性黑色素瘤和血管瘤。
在一些实施方案中，人工抗原受体结合选自下述的TAA：激肽释放酶4、乳头瘤病毒结合因子(PBF)、黑色素瘤优先表达抗原(FRAME)、肾母细胞瘤-I(WTI)、羟类固醇脱氢酶样I(HSDLI)、间皮素、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌胚抗原(CEA)、p53、人表皮生长因子受体2/神经受体酪氨酸激酶(Her2/Neu)、癌相关上皮细胞黏着分子(EpCAM)、卵巢和子宫癌抗原(CAI25)、叶酸受体a、精子蛋白17、肿瘤相关差异表达基因-12(TADG-12)、黏蛋白-16(MUC-16)、LI细胞黏着分子(LICAM)、甘露聚糖-MUC-1、人类内源性反转录病毒K(HERV-K-MEL)、北九州肺癌抗原-I(KK-LC-1)、人癌/睾丸抗原(KM-HN-1)、癌睾丸抗原(LAGE-I)、黑色素瘤抗原-Al(MAGE-Al)、精子表面透明带结合蛋白(Spl 7)、滑膜肉瘤、X断裂点4(SSX-4)、瞬时轴突糖蛋白-1(TAG-I)、瞬时轴突糖蛋白-2(TAG-2)、Enabled同源物(ENAH)、乳腺珠蛋白-A、NY-BR-I、乳腺癌抗原、(BAGE-1)、B黑色素瘤抗原、黑色素瘤抗原-Al(MAGE-Al)、黑色素瘤抗原-A2(MAGE-A2)、黏蛋白k、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX-2)、紫杉醇抗性相关基因-3(TRAG-3)、禽类髓细胞瘤病病毒癌基因(c-myc)、细胞周期蛋白B1、黏蛋白I(MUC I)、p62、存活蛋白、淋巴细胞共同抗原(CD45)、DickkopfWNT信号传导途径抑制剂I(DKKI)、端粒末端转移酶、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)、G250、肠羧酸酯酶、甲胎蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、胱天蛋白酶5(CASP-5)、细胞色素C氧化酶装配因子I同源物(COA-1)、0-连接的β-N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)、骨肉瘤扩增的9、内质网凝集素(OS-9)、转化生长因子β受体2(TGF-βRII)、鼠白血病糖蛋白70(gp70)、降钙素相关多肽α(CALCA)、程序性细胞死亡1配体1(CD274)、小鼠双微体2同源物(mdm-2)、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、苹果酸酶1(MEI)、核转录因子Y亚基C(NFYC)、G抗原1,3(GAGE-1,3)、黑色素瘤抗原-A6(MAGE-A6)、癌睾丸抗原XAGE-lb、前列腺六跨膜上皮抗原1(STEAPl)、PAP、前列腺特异性抗原(PSA)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、热休克蛋白hsp70-2、黑色素瘤抗原-A9(MAGE-A9)、Arg-特异性ADP-核糖基转移酶家族C(ARTCl)、B-Raf原癌基因(B-RAF)、丝氨酸/苏氨酸激酶、β-联蛋白、细胞分裂周期27同源物(Cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、酪蛋白激酶1α1(CSNKlAl)、纤连蛋白1(FNl)、生长停滞特异性(Gruwih AnestSpecific)7(GAS7)、糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)、HAUS Augmin样复合物亚基3(HAUS3)、LDLR-岩藻糖基转移酶、T细胞识别的黑色素瘤抗原2(MART2)、肌肉生长抑制素(MSTN)、黑色素瘤相关抗原(突变的)1(MUM-1-2-3)、聚腺苷酸聚合酶γ(neo-PAP)、肌球蛋白I类、蛋白磷酸酶1调节亚基3B(PPP1R3B)、过氧化物氧还蛋白-5(PRDX5)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶κ(PTPRK)、转化蛋白N-Ras(N-ras)、成视网膜细胞瘤相关因子600(RBAF600)、sirtuin-2(SIRT2)、SNRPDl、丙糖磷酸异构酶、眼白化病1型蛋白(OAl)、成员RAS癌基因家族(RAB38)、酪氨酸酶相关蛋白1-2(TRP-1-2)、黑色素瘤抗原Gp75(gp75)、酪氨酸酶、Melan-A(MART-1)、糖蛋白100黑色素瘤抗原(gplOO)、N-乙酰葡糖胺转移酶V基因(GnTVf)、淋巴细胞抗原6复合基因座K(LY6K)、黑色素瘤抗原-AlO(MAGE-AlO)、黑色素瘤抗原-Al2(MAGE-Al2)、黑色素瘤抗原-C2(MAGE-C2)、黑色素瘤抗原NA88-A、紫杉醇抗性相关蛋白3(TRAG-3)、BDZ结合激酶(pbk)、胱天蛋白酶8(CASP-8)、肉瘤抗原1(SAGE)、断裂点簇区-埃布尔森癌基因(BCR-ABL)、白血病中的融合蛋白、dek-can、含有延伸因子Tu GTP结合结构域的2(EFTUD2)、ETS变体基因6/急性髓性白血病融合蛋白(ETV6-AML1)、FMS-样酪氨酸激酶-3内部串联重复(FLT3-ITD)、细胞周期蛋白-Al、含有纤连蛋白III型结构域的3B(FDNC3B)、早幼粒细胞白血病/视黄酸受体α融合蛋白(pml-RARα)、黑色素瘤抗原-Cl(MAGE-Cl)、膜蛋白可变剪接的同种型(D393-CD20)、黑色素瘤抗原-A4(MAGE-A4)和黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)。
在一些实施方案中，人工抗原受体结合与选自1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)或多发性硬化(MS)中的任一种的自身免疫性状况或病症有关的抗原。在一些实施方案中，人工抗原受体结合选自下述任一种的与身免疫性状况或病症有关的抗原：羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、Imogen-38、胰岛素、胰岛素瘤抗原-2和2β、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α-烯醇化酶、水通道蛋白-4、β-抑制蛋白、髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、S100-β、瓜氨酸化蛋白、胶原II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白、双链DNA、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂-β-2糖蛋白I复合物、聚ADP核糖聚合酶、U-1小核糖核蛋白复合物的Sm抗原。
在一些实施方案中，人工抗原受体结合来自细菌、真菌或寄生物蛋白或其片段的病原体相关抗原。在一些实施方案中，人工抗原受体结合与HIV感染、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、依波拉病毒感染、登革热、黄热病、李斯特菌病、结核病、霍乱、疟疾、利什曼病或锥虫感染或它们的组合有关的抗原。
在一些实施方案中，人工抗原受体结合与选自下述的神经变性病症或状况有关的抗原：阿尔茨海默病(AD)和其他痴呆、帕金森病(PD)和PD-相关病症、普利昂病、运动神经元病(MND)、亨廷顿病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)。在一些实施方案中，与神经变性病症或状况有关的抗原是淀粉状蛋白β(Ab)、tau、α-突触核蛋白(α-syn)、mHTT或朊病毒PrPsc或其组合中的任一种。
在一些实施方案中，治疗用多肽是细胞因子、细胞因子受体、趋化因子、趋化因子受体、免疫原性多肽或结合另一细胞表面上的靶的细胞表面蛋白。在一些实施方案中，免疫细胞调节蛋白是细胞因子、趋化因子、转录因子、蛋白激酶、蛋白酶、细胞信号传导途径的组分或衔接蛋白。
在一些实施方案中，本文公开的细胞表达本文公开的RTCR。在一些实施方案中，本文公开的细胞稳定或瞬时表达本文公开的RTCR。在一些实施方案中，本文公开的细胞稳定表达本文公开的RTCR。在一些实施方案中，本文公开的细胞瞬时表达本文公开的RTCR。
在一些实施方案中，本文公开的细胞共表达内源共刺激分子CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L或其组合中的至少一种。
本公开内容还提供了修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰降低或消除TCR的表达或活性水平，或；和(b)本文公开的重组T细胞共刺激受体(RTCR)。在一些实施方案中，使用核酸修饰系统进行对编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰。在一些实施方案中，核酸修饰系统是CRISPR/Cas蛋白、转录激活物样效应核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和内切核酸酶中的一种或多种。在一些实施方案中，通过非同源末端连接修复来进行编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰。在一些实施方案中，非同源末端连接修复由通过物理手段、病毒载体或非病毒载体引入细胞中的锌指核酸酶产生。在一些实施方案中，非同源末端连接修复由通过物理手段、病毒载体或非病毒载体引入细胞中的TALE核酸酶产生。在一些实施方案中，编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰降低或消除TCR的α链的表达水平。在一些实施方案中，编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰降低或消除TCR的β链的表达水平。在一些实施方案中，编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰降低或消除α链和β链TCRα链两者的表达水平。
在一些实施方案中，本文公开的修饰的T细胞共表达内源共刺激分子CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L或其组合中的至少一种。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对编码主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)组分的内源序列的修饰，其中所述修饰降低或消除MHC-I的表达或活性水平。在一些实施方案中，修饰降低或消除β2-巨球蛋白的表达或活性。
本公开内容还提供了包含本文公开的RTCR的组合物。本公开内容还提供了包含编码本文公开的RTCR的核酸的组合物。本公开内容还提供了包含载体的组合物，所述载体包含本文公开的核酸。本公开内容还提供了包含本文公开的细胞的组合物。本公开内容还提供了包含本文公开的修饰的T细胞的组合物。
本公开内容还提供了包含细胞群体的组合物，其中所述群体包含多个包含编码本文公开的RTCR的核酸或包含编码本文公开的RTCR的核酸的载体的细胞。本公开内容还提供了包含细胞群体的组合物，其中所述群体包含多个本文公开的修饰的T细胞。
本公开内容还提供了产生许多修饰的T细胞的方法，其中所述方法包括：a)提供本文公开的许多原代T细胞；b)提供包含本文公开的RTCR、编码本文公开的RTCR的核酸或包含编码本文公开的RTCR的核酸的载体的组合物；和c)将(b)的组合物引入(a)的许多原代T细胞中，以在许多修饰的T细胞内稳定表达RTCR的条件下产生许多修饰的T细胞。在一些实施方案中，本文公开的产生许多修饰的T细胞的方法进一步包括修饰编码内源T细胞受体(TCR)的内源序列的步骤，其中所述修饰降低或消除所述内源TCR的表达或活性水平。在一些实施方案中，本文公开的产生许多修饰的T细胞的方法进一步包括修饰内源序列的步骤，其中所述修饰降低或消除主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)的表达或活性水平。
在一些实施方案中，修饰编码T细胞受体(TCR)的内源序列是使用核酸修饰系统进行的。在一些实施方案中，降低或消除表达或活性水平的对内源序列的修饰是使用核酸修饰系统进行的。在一些实施方案中，核酸修饰系统是CRISPR/Cas蛋白、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和内切核酸酶中的一种或多种。在一些实施方案中，修饰内源序列是通过非同源末端连接修复来进行的。在一些实施方案中，非同源末端连接修复由通过物理手段、病毒载体或非病毒载体引入细胞中的锌指核酸酶产生。在一些实施方案中，非同源末端连接修复由通过物理手段、病毒载体或非病毒载体引入细胞中的TALE核酸酶产生。在一些实施方案中，修饰编码T细胞受体(TCR)的内源序列降低或消除TCR的α链的表达水平。在一些实施方案中，修饰编码T细胞受体(TCR)的内源序列降低或消除TCR的β链的表达水平。在一些实施方案中，修饰编码T细胞受体(TCR)的内源序列降低或消除α链和β链TCRα链两者的表达水平。
在一些实施方案中，修饰内源序列降低或消除主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)的表达或活性水平，其中修饰内源序列降低或消除MHC-I的表达或活性水平。在一些实施方案中，修饰内源序列降低或消除β2-巨球蛋白的表达或活性。
在一些实施方案中，本文公开的产生许多修饰的T细胞的方法进一步包括：d)在合适的细胞培养基中维持或扩充所述许多修饰的T细胞；和e)或者i)将所述许多修饰的T细胞在合适的细胞冷冻介质中深低温保藏；或者ii)使所述许多修饰的T细胞为施用于患有疾病或病症的主体做准备。
计划施用给主体的包含本公开内容的细胞或修饰的T细胞以及通过本公开内容的方法产生的许多修饰的T细胞的组合物可能需要满足一个或多个“发布标准(releasecriteria)”，所述标准表明所述组合物对于配制为药物产品和/或对主体的施用是安全且有效的。发布标准可以包括要求本公开内容的组合物(例如，本公开内容的细胞或修饰的T细胞)包含特定百分比的在其细胞表面上表达本公开内容的RTCR的细胞或修饰的T细胞。扩充过程应当持续直到已满足特定标准(例如，达到本公开内容的细胞或修饰的T细胞的特定总数目或表达本公开内容的RTCR的细胞或修饰的T细胞总数目的特定百分比)为止。
某些标准发信号通知扩充过程应该结束的点。例如，一旦细胞达到300fL的细胞大小，就应该对细胞进行配制、再活化和深低温保藏(否则，达到超过所述阈值的大小的细胞可能开始死亡)。一旦细胞群体达到小于300fL的平均细胞大小就立即深低温保藏可能在解冻和培养时产生更好的细胞恢复，这是因为细胞在深低温保藏之前尚未达到完全静止状态(完全静止的大小为约180fL)。在扩充之前，本公开内容的T细胞可具有约180fL的细胞大小，但在扩充后3天可能不止使其细胞大小乘四至约900fL。在接下来的6-12天内，T细胞群体将缓慢减小细胞大小至在180fL完全静止。
用于制备用于配制的细胞群体的方法可以包括但不限于以下步骤：浓缩细胞群体的细胞、洗涤细胞和/或经由抗药性或针对特定表面表达的标记的磁珠分选来进一步选择细胞。制备用于配制的细胞群体的方法可进一步包括分选步骤以确保最终产品的安全性和纯度。例如，如果来自患者的肿瘤细胞已被用于刺激本公开内容的修饰的T细胞或已经被修饰以刺激正在制备用于配制的本公开内容的修饰的T细胞，则关键的是在最终产品中不包括来自患者的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本文公开的细胞或本文公开的修饰的T细胞在细胞表面上以与分别包含野生型CD137或野生型CD134细胞内结构域的共刺激分子的表达水平相比至少约2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X或20X的水平表达包含本文公开的突变型CD137或突变型CD134细胞内信号传导结构域的RTCR。
药物组合物或制剂
在一些实施方案中，本文公开的组合物和使用本文公开的方法产生的修饰的T细胞群体为药物制剂(或组合物)的形式。在一些实施方案中，本文公开的药物制剂包含药学上可接受的载体。本公开内容的药物制剂可以分配到袋中用于输注、深低温保藏和/或贮藏。
本公开内容的药物制剂可以使用标准规程和任选地可输注的深低温保藏介质来深低温保藏。例如，不含DMSO的深低温保藏剂(cryopreservant)(例如CryoSOfreeTM不含DMSO的深低温保藏介质)可用于减少冷冻相关的毒性。本公开内容的深低温保藏的药物制剂可被贮藏用于以后输注给患者。有效的治疗可能需要多次施用本公开内容的药物制剂，且因此，药物制剂可以包装成预先等分的“剂量”，其可以冷冻但单独地贮藏用于解冻各个剂量。
本公开内容的药物制剂可以于室温贮藏。有效的治疗可能需要多次施用本公开内容的药物制剂，且因此，药物制剂可以包装成预先等分的“剂量”，其可以在一起但单独地贮藏用于各个剂量的施用。
本公开内容的药物制剂可被存档用于后来再扩充和/或选择供在同种异体疗法的情况下给同一患者产生额外的剂量，所述患者可能需要在例如状况缓解和复发之后的将来的日期进行施用。
如上文所指出的，本公开内容提供了稳定的制剂，其优选地包含具有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液，以及含有防腐剂的保存的溶液和制剂以及适合于药学或兽医用途的多用途保存的制剂，其包含药学上可接受的制剂中的至少一种修饰的细胞。保存的制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选地选自在水性稀释剂中的至少一种酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化镁(例如，六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物。任何合适的浓度或混合物都可以使用，如本领域中所已知的，例如约0.0015％，或其中的任何范围、值或分数。非限制性实例包括，无防腐剂、约0.1-2％间甲酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、约0.1-3％苯甲醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、约0.001-0.5％硫柳汞(例如，0.005、0.01)、约0.001-2.0％酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上文所指出的，本公开内容提供了一种制品，其包括包装材料和至少一个小瓶，所述小瓶包含至少一种修饰的细胞与指定缓冲剂和/或防腐剂(任选地在水性稀释剂中)的溶液，其中所述包装材料包括标签，所述标签表明这种溶液可在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长的时间段内保存。
本公开内容的制品可用于在从立即一直到24个小时或更长的时间段内施用。因此，当前请求保护的制品为患者提供了显著的优点。本公开内容的制剂可以任选地安全地贮藏在约2℃至约40℃的温度并且保持蛋白的生物活性达延长的时间段，从而允许包装标签表明所述溶液可以在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的时间段内保存和/或使用。
本公开内容的产品包括包装材料。除了监管机构要求的信息外，包装材料还提供了产品可以使用的条件。
本公开内容还提供了治疗疾病或病症的方法，包括向有需要的主体施用治疗有效数目的包含编码本文公开的RTCR的核酸或包含编码本文公开的RTCR的核酸的载体的细胞、治疗有效数目的任意一种本文公开的修饰的T细胞、治疗有效量的任意一种本文公开的组合物或治疗有效数目的通过本文公开的方法产生的许多修饰的T细胞。
在一些实施方案中，主体是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人、灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物、马科动物和猪中的任一种。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、传染病、炎性疾病或状况、肾疾病或病症、肺疾病或病症、肝疾病或病症、心血管系统疾病或病症、神经变性病症或状况或代谢病症或状况中的任一种。在一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液学癌症。在一些实施方案中，传染病由细菌、病毒、真菌、原生动物或寄生物引起。在一些实施方案中，神经变性病症或状况是阿尔茨海默病(AD)和其他痴呆、帕金森病(PD)和PD-相关病症、普利昂病、运动神经元病(MND)、亨廷顿病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)中的任一种。
本公开内容提供了嵌合共刺激细胞内蛋白(CIP)，其包含第一和至少第二信号转导结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
本公开内容还提供了嵌合共刺激细胞内蛋白(CIP)，其包含第一和至少第二信号转导结构域，其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且其中所述至少第二信号转导结构域包含突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，TNFR家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域是突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域的任一种。在一些实施方案中，CIP进一步包含跨膜结构域。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域是截短的CD137细胞内结构域。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含根据本公开内容的CD137细胞内结构域的氨基酸位置13至氨基酸位置42的氨基酸序列。在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，本公开内容的CD137细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD137细胞内结构域包含根据SEQ IDNO:3的氨基酸序列。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的1、2、3或4个赖氨酸残基的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个赖氨酸突变。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域在选自本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、5、6和12的氨基酸位置处包含一个或多个赖氨酸突变。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域包含从本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸突变。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域在选自本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2、3、4、5和6的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD137细胞内结构域进一步包含在本公开内容的CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域是截短的CD134细胞内结构域。在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含根据本公开内容的CD134细胞内结构域的氨基酸位置15至氨基酸位置37的氨基酸序列。在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的缺失。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，截短的CD134细胞内结构域包含根据SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的赖氨酸残基的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含在本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12的赖氨酸突变。
在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含从本公开内容的CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域包含从CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸突变。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域在选自CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2和5的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。在本文公开的CIP的一些实施方案中，突变型CD134细胞内结构域进一步包含在CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。
在一些实施方案中，本文公开的CIP包含衍生自CD28家族的蛋白的第一信号转导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP包含衍生自CD28、CD28H、ICOS或其组合中的任一个的第一信号转导结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP包含衍生自ICOS的第一信号转导结构域。在一些实施方案中，衍生自ICOS的第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的CIP包含第一信号转导结构域，其包含与根据SEQID NO:9的ICOS结构域组合的CD28细胞内结构域的部分。在本文公开的CIP的一些实施方案中，第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NOs:12或109中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的CIP包含衍生自CD28的第一信号转导结构域。在本文公开的CIP的一些实施方案中，衍生自CD28的第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NO:10的氨基序列。在本文公开的CIP的一些实施方案中，衍生自CD28的第一信号转导结构域包含根据SEQ IDNOs:121-122中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，CIP包含根据SEQ ID NOs：14-17中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的CIP进一步包含第三信号转导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP进一步包含衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合中的任一种的第三信号转导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的CD3信号传导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。在一些实施方案中，本文公开的CIP的CD3信号传导结构域是包含根据SEQ ID NOs:18、45、46、47和48中任一个的氨基酸序列的CD3结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含具有根据SEQID NO:18的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与根据SEQ ID NO:18具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含具有根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与根据SEQ ID NO:45具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含具有根据SEQ ID NO:46的氨基酸序列的截短的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与根据SEQID NO:46具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CD3ε结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:47具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ε结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是CD3ε和截短的CD3ζ结构域的组合(CD3ζε结构域)。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CD3ζε结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:48具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζε结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是突变型CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，突变型CD2信号传导结构域是截短的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:49具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD2信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:50具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP进一步包含第四信号转导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP进一步包含衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合中的任一种的第四信号转导结构域，其中所述第三和第四信号转导结构域不相同。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NOs:18、45、46、47和48中任一个的氨基酸序列的CD3结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含具有根据SEQID NO:18的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与根据SEQ ID NO:18具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含具有根据SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与根据SEQ ID NO:45具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含具有根据SEQ ID NO:46的氨基酸序列的截短的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第三信号转导结构域，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与根据SEQID NO:46具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的截短的CD3ζ结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CD3ε结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:47具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ε结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是CD3ε和截短的CD3ζ结构域的组合(CD3ζε结构域)。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CD3ζε结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:48具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD3ζε结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是突变型CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，突变型CD2信号传导结构域是截短的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含根据SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CD2信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:49具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的CD2信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。在一些实施方案中，本文公开的CIP的第四信号转导结构域是包含与SEQ ID NO:50具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的IL-2RB蛋白信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文公开的CIP用于在T细胞中表达，其中所述T细胞共表达内源共刺激分子CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L或其组合中的至少一种。
在一些实施方案中，本文公开的CIP与T细胞受体(TCR)在T细胞中共表达。在一些实施方案中，TCR是内源TCR。在一些实施方案中，TCR是人工TCR。在一些实施方案中，人工TCR是亲和力增强的TCR。在一些实施方案中，CIP当与TCR在T细胞中共表达时提供第二激活信号用于诱导T细胞的活化和增殖，其中第一激活信号由通过TCR的抗原结合提供。
在一些实施方案中，本文公开的CIP作为靶的人工受体的组分在T细胞中表达。在一些实施方案中，人工受体是嵌合抗原受体(CAR)、配体或其组分的受体、抗体或其片段。在一些实施方案中，本文公开的CIP作为CAR的组分被表达。在一些实施方案中，本文公开的CIP为抗体或其片段的组分被表达。在一些实施方案中，抗体或其片段是Fab片段、F(ab)2片段、双抗体、纳米抗体、sdAb、Fv、VHH片段或单链Fv片段。在一些实施方案中，如本文所公开的，作为人工受体的组分在T细胞中表达的CIP在通过人工受体的靶结合时诱导T细胞的活化和增殖。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”可以被理解为在陈述的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在一些实施方案中，“约”或“大约”可以被理解为在陈述的值的5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在一些实施方案中，“约”或“大约”可以被理解为在陈述的值的2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在一些实施方案中，“约”或“大约”可以被理解为在陈述的值的1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
提供以下实施例以更好地举例说明本公开内容并且不被解释为限制本公开内容的范围。就所提到的具体材料而言，其仅是为了举例说明起见并且不意图限制本公开内容。本领域技术人员可以在不运用创造性能力且不脱离本公开内容的范围的情况下开发等同的手段或反应物。
实施例
材料和方法
培养基和细胞系
DMEM补加了Penn/Strep/谷氨酰胺、20mM HEPES、10μg/mL庆大霉素和10％FBS以制备完全DMEM。RPMI补加了Penn/Strep/谷氨酰胺、20mM HEPES、10μg/mL庆大霉素、10％FBS和50uM 2-ME以制备完全RPMI。T细胞生长培养基通过向完全RPMI补加50ng/ml IL2、10ng/mlIL7和10ng/mL IL15(Peprotech)来制备。X-Vivo15补加了1％人血清、20mM HEPES、Penn/Strep/谷氨酰胺和10μg/mL庆大霉素以制备细胞因子培养基。人PBMCs购自iSpecimen，并在完全RPMI中培养。293FT购自Invitrogen。K562和A375细胞购自ATCC并在完全DMEM中培养。
质粒和克隆
含有驱动截短的人EGFR受体(huEGFRt)的PGK启动子继之以驱动GFP的MSCV启动子以及随后的WPRE序列的慢病毒质粒从载体制造者(builder)订购。共刺激分子继之以P2A序列作为单个基因块订购(Invitrogen)，并使用NEB制造者(builder)基于同源性的重组将其与huEGFRt序列符合读框地放置。CAR和TCR序列由3个基因块片段(Invitrogen)构建，并在GFP切除后使用NEB制造者克隆到MSCV启动子下游。PD-L1_P2A和HLA-A2分别与huEGFRt符合读框地克隆并代替GFP。
P2A氨基酸序列(SEQ ID NO：111)
人EGFRt氨基酸序列(其他名称：huEGFRt(AA112))(SEQ ID NO：112)
HLA-A2信号肽(SEQ ID NO：113)
huGMCSF信号肽，氨基酸序列(SEQ ID NO：119)
P2A核酸序列(SEQ ID NO：114)
人EGFRt核酸序列(SEQ ID NO:115)
HLA-A2信号肽核酸序列(SEQ ID NO：116)
CD8a信号肽核酸序列(SEQ ID NO：148)
CD8a铰链(SEQ ID NO：149)
huGMCSF信号肽，核酸序列(SEQ ID NO：150)
慢病毒生产和Retronectin平板的制备VSV假型慢病毒在6孔平板中产生。简而言之，293FT分别在0.9x106或1.4x106个细胞/孔的前一天晚上或当天接种。一旦细胞已贴壁并达到至少80％汇合，就根据制造商的规程使用lipofectamine 3000(Invitrogen)转染慢病毒质粒、包装载体(psPAX2)和VSV-G包膜表达质粒(PMD2.G)的混合物。18小时后，用3mL新鲜DMEM替换培养基。更换培养基后48小时收获病毒上清液并以1500RPM离心(spun down)以去除293FT细胞/碎片。在PBS-/-中以20μg/孔将Retronectin在24孔非组织培养处理的平板上于37℃包被2小时或于4℃包被过夜。去除Retronectin并在添加慢病毒SN(2mL)前用PBS洗涤一次。然后将平板于32℃以1500G旋转90分钟，以将病毒颗粒浓缩到retronectin上。紧接在转导原代T细胞或肿瘤细胞之前去除慢病毒SN。另一方面，利用800G的旋转感染(spinfection)用8ug/mL的1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)于32℃转导T细胞2小时。
T细胞培养、转导和分离
人PBMCs在完全RPMI中具有CD3/28微珠(microbeads)(Invitrogen)的T细胞生长培养基中激活(100ul珠/50x106 PBMCs)。激活后48小时，将激活的PBMCs转移至慢病毒包被的Retronectin平板48小时，然后转移至含有新鲜T细胞生长培养基的6孔平板。培养另外24小时后，通过流式细胞术测定细胞转导并基于huEGFRt表达富集转导的细胞。为了基于EGFR表达分离细胞，收集T细胞培养物并除去活化珠。然后将细胞在MACS缓冲液中以1:100抗-EGFR-APC抗体于4℃染色30分钟。然后洗涤细胞并将其与抗-APC微珠(Miltenyi)于4℃温育15-30分钟。然后通过离心除去未结合的微珠，并通过在mini-macs柱上的正选择分离huEGFRt细胞。将细胞从mini-MACS柱中洗脱并放回T细胞生长培养基中的培养物中，并在2周内用于实验。为了产生稳定的细胞系，如同原代T细胞一样收集并转导细胞。EGFR选择进行两次，相隔两周。
T细胞刺激
在用平板结合的抗体刺激T细胞的情况下，用指示量的在PBS-/-中的抗人CD3抗体(HIT3a-Biolegend)于37℃包被maxisorp平底平板(Invitrogen)2小时。使用前将平板在基础RPMI中洗涤两次。对于K562刺激，收集K562细胞并重悬浮于细胞因子培养基中，并等分到U-形底平板中。类似地，A375细胞在添加T细胞之前1天平板接种于96孔平底平板中的DMEM中。在添加关联T细胞之前更换培养基。EGFR+选择后，将T细胞收集、计数并以适当的浓度重悬浮于细胞因子培养基中，并分配至带有抗体或APC的孔中。对于K562实验，于37℃的K562/T细胞相互作用1-2小时后，以指示的剂量添加抗-CD3(HIT3a/Biolegend)。在要跟踪T细胞增殖的情况下，在添加到刺激平板之前，根据Biolegend的规程用紫罗兰色跟踪染料(Violet Tracking Dye)(CTV)标记T细胞。刺激后18-36小时收集上清液以评估细胞因子分泌和增殖/T细胞杀伤在刺激96小时后进行评估。
细胞因子多重测定
收集T细胞上清液后，利用用于人Th或Th1细胞因子的Legendplex多分析物流式测定试剂盒(Multi-Analyte Flow Assay Kit)(Biolegend)测量细胞因子。遵循制造商的规程，但有以下例外：使用75uL T细胞SN以测量细胞因子，且每孔使用2uL每种试剂。通过流式细胞术测量分泌的细胞因子，并将值相对于对照组的最大响应归一化，以组合和分析多个实验并关于实验和供体之间的变异性进行归一化。
缀合测定
为了评估T细胞与靶细胞的缀合，根据制造商的规程，用CFSE(Biolegend)标记T细胞，并用CTV标记K562_HLA-A2或K562_HLA-A2_PD-L1细胞。将T细胞和APCs以1:2的比例混合并在1.5mL eppendorf管中短暂离心以促进缀合。将细胞沉淀于37℃温育30分钟，且然后通过用p200和切断的(cut-off)移液管尖重复移液(20x)轻轻重悬浮细胞沉淀并立即通过流式细胞术进行评估。
流式细胞术
收集细胞并在MACS缓冲液(PBS-/-、1％FBS、1mM EDTA)中洗涤，然后在含有相关抗体的MACS缓冲液中染色。抗-EGFR-APC、抗小鼠TCRβ-FITC、抗人PD1-PE、抗-CD3APC-Cy7、抗-CD8 PE-Cy7均购自biolegend。添加抗体后，细胞于4℃染色30-60分钟。为了检测CD-19CAR表达，将细胞与1μg/mL的MACS缓冲液中的CD-19Fc重组蛋白于室温温育30分钟。然后洗涤细胞并将其以1:100稀度与抗人FC抗体一起温育。然后将细胞在MACS缓冲液中洗涤3X，并在Acea NovoCyte流式细胞仪上进行分析。以恒定体积收集细胞，从而允许获得准确的细胞计数。
实施例1：包含嵌合细胞内信号传导结构域的共刺激分子的设计本文的公开内容提供了包含细胞内信号传导结构域的共刺激分子的设计，所述细胞内信号传导结构域包含或衍生自如图1所描绘的CD137/4-1BB或CD134/OX-40受体。对细胞质尾部的CD137家族的序列的检查(图1)显示了共同的近膜多碱性结构域以及几个可充当泛素化位点的赖氨酸残基，以及用来在受体连接后激活NF-kB信号传导途径的TRAF结合结构域。在不受理论束缚的情况下，保守的赖氨酸残基可以起泛素化位点的作用，所述泛素化位点可以控制CD134/CD137的泛素化和降解，并且潜在的CD28/ICOS-CD137 CAR或CD28/ICOS-CD134 CAR受体中CD137或CD134细胞质尾部的破坏的位置分别可以通过多碱性结构域或保守的赖氨酸残基影响所得到的分子的定位或半衰期。产生了ICOS/CD28细胞内结构域和缺乏多碱性序列和保守的赖氨酸残基的CD137或OX-40细胞质结构域以及它们的野生型(WT)对应物的新融合结构域(图2A和2B)。也包括负责Lck和Vav3结合以可能增强刺激的CD28的细胞质结构域的一部分。使用PD-1的细胞外结构域，从而通过省略细胞内尾部产生显性失活(DN)形式，或产生将把负调节信号改变为正调节信号的抑制转换受体，从而提供细胞内在的PD-1封闭。本文描述的细胞质尾部，即，细胞内共刺激结构域，可以通过使用其他感兴趣的信号传导蛋白的细胞质尾部扩充，以产生新的CAR受体或不同的抑制转换受体，或表达其他免疫调谐细胞外结构域，如图3中所详述的。
实施例2：检查点共刺激分子的生成和体外功能性的测试
本文的公开内容提供了共刺激分子的设计以及它们对高亲和力TCR的功能的影响的确认。本文描述的共刺激分子如图2A和2B中所描绘的进行设计。在所有重组受体中，PD1信号肽(SP)被换为来自HLA-A2的信号肽，这增加了受体的表面表达。作为对照，包括PD1-WT和截短的缺少含有ITIM的细胞内尾部(TLs)的PD-1。含有CD28或ICOS的跨膜和细胞内结构域的两个第二代受体被作为第二代对照受体包括进来。此外，产生了十五个第三代受体，其含有连接至TNF-受体超家族成员的细胞内信号传导结构域的衍生自ICOS和/或CD28的跨膜和细胞内结构域。第一个含有野生型CD137/4-1BB的细胞内结构域(HLA A2-SP_PD1_ICOS_BB:SEQ ID NO:26)，而第二个和第三个含有CD137/4-1BB结构域或CD134/OX-40细胞内结构域，其中并入了关键突变以增加表面表达(分别为HLA A2-SP_PD1_ICOS_BBt:SEQ ID NO:27和HLA A2-SP_PD1_ICOS_OX40t:SEQ ID NO:28)。本文所述的进一步的第三代受体含有嵌合细胞内结构域，其包含插入ICOS细胞内结构域内的CD28细胞内结构域的一部分，其进一步连接至突变的CD137(ICOS4BBt)或突变的CD134/OX40(ICOS-OX40t)结构域(HLA A2-SP_PD1_ICOS(28)_BBt:SEQ ID NO:29和HLA A2-SP_PD1_ICOS(28)_OX40t:SEQ ID NO:30)。如本文所述产生了另外两个第三代受体，其含有与突变的CD137(28_BBt)或突变的CD134/OX40(28_OX40t)结构域连接的CD28细胞内结构域(HLA A2-SP_PD1_28_BBt:SEQ ID NO:131和HLA A2-SP_PD_28_OX40t:SEQ ID NO:132)(图2A)。这些载体被克隆到慢病毒载体中，并通过自切割肽与截短的huEGFR受体(huEGFRt)融合，用于跟踪转导的细胞和磁选择。当这些受体通过慢病毒转导至原代T细胞中表达时，每种受体的表达显著高于内源性PD-1水平(图4A)。虽然第二代共刺激分子表达良好，但CD137(4-1BB)细胞内结构域的包括导致重组受体的表面表达的显著降低。本文的公开内容表明，维持TRAF-结合结构域的突变的细胞内结构域的包括拯救了这些最优化的第三代受体的表面表达。huEGFRt和共刺激分子的表面表达显示了与非截短的形式(ICOS_BBwt)相比，截短的CD137(4-1BB)设计(ICOS_BBt)的增加的表达。CD134(OX-40)的细胞质结构域中的类似突变也导致共刺激分子的高表面表达(图4B)。
转导后，基于huEGFRt的表达分离T细胞，至>90％纯度，并用于再刺激(restimulation)实验。本文公开的结果证实，在体外，共刺激分子的接合增强了T细胞细胞因子的产生和增殖，尤其是在较低剂量的抗-CD3抗体(图5A-5D)。为了产生更加生理化的系统，单独的HLA-A2或HLA-A2与PD-L1一起在K562细胞上超表达，并与共刺激受体转导的T细胞和指示剂量的抗-CD3一起温育。与K562:PD-L1细胞温育减少了分泌的细胞因子的量，尤其是与超表达PD1_WT的T细胞(图6A)。虽然PD1_TLs或PD1_ICOS_BBwt的表达几乎不影响IL-2、TNF或TFNγ的分泌，但在有表达PD-L1的K562细胞的情况下，PD1_28或PD1_ICOS的表达将效应细胞因子分泌比起GFP对照来增加到3-4倍。值得注意的是，PD1_ICOS_BBt和PD1_ICOS_OX40t共刺激分子两者进一步改善了所述效果，从而在有PD-L1的情况下将效应细胞因子分泌比起PD1_ICOS表达细胞来增加到2至3倍(图6C)。PD1_28、PD1_28_BBt和PD1_28_OX40t的表达导致类似的效应细胞因子分泌(图6B)。在没有PD-L1或抗-CD3的情况下，没有一个构建体是组成型活性的，并且对细胞因子分泌具有最小的影响，从而表明PD-1和抗原两者对起始T细胞应答的必要性。与细胞因子数据一致，表达a)PD1_28、PD1_28_BBt和PD1_28_OX40t(图7A，下图，和图7C)和b)PD1_ICOS_BBt和PD1:ICOS_OX40t(图7B，下图，和图7C)的T细胞响应于表达PD-L1的K562细胞增殖最佳，并且最能够杀伤表达PD-L1的K562细胞(图7A-7B，上图)。与细胞因子数据一致，表达PD1_ICOS_BBt和PD1_ICOS_OX40t的T细胞响应于表达PD-L1的K562细胞增殖最佳并且最能够杀伤表达PD-L1的K562细胞(图7C-7E)。此外，所述应答需要抗-CD3和PD-L1的表达两者。当在用抗-CD3和抗-PD1包被的96-孔平板上刺激细胞时，共刺激分子显示出共刺激能力，这是因为它们的表达增加了T细胞增殖(图8)。
就共刺激分子的表面表达(图9A-9B)、响应于用抗-CD3抗体刺激的效应细胞因子产生(图9C)以及响应于用表达PD-L1的靶细胞刺激的T细胞增殖(图9D)而论，具有多碱性和赖氨酸残基的突变的受体的作用小于PD1_ICOS_BBt共刺激分子。就共刺激分子的表面表达(图10A-10B)、响应于用抗-CD3抗体刺激的效应细胞因子产生(图10C)以及响应于用表达PD-L1的靶细胞刺激的T细胞增殖(图10D)而论，PD1_ICOS_OX40t受体(具有截短的OX40细胞内结构域)具有与野生型PD1_ICOS_OX40wt受体(包含野生型OX40细胞内结构域)类似的效果。
进一步地，基于ICOS的共刺激分子在基于流式的缀合测定(flow-basedconjugation assay)中促进T细胞：PD-L1表达(PD-L1+)靶细胞相互作用，从而提示这些受体在扫描关联抗原时促进延长的T细胞-APC相互作用，当扫描TME中的低丰度抗原时有用的性质(图11A-11B)。
本文的公开内容表明，基于本文公开的修饰的第三代细胞内信号传导结构域的共刺激分子在响应PD-L1+靶细胞时增强T细胞效应子功能方面优于目前现存的PD1_28共刺激分子。这包括增加的T细胞增殖、细胞因子分泌和靶细胞杀伤。本文公开的第三代细胞内信号传导结构域可以成功地与靶向TAAs的TCR-T疗法组合。
实施例3：体外临床前研究
本文描述的是表达具体HLA-A2/NY-ESO特异性TCRs和共刺激分子的T细胞，所述共刺激分子包含ICOS和突变的CD137信号传导结构域，其与单独表达具体HLA-A2/NY-ESO特异性TCRs的T细胞相比，增加共刺激分子在T细胞表面上的表达(图12A)、效应细胞因子产生(图12B)和表达NY-ESO的靶细胞的杀伤(图12C)。
本文描述的是包含本文公开的修饰的第三代细胞内信号传导结构域的CD-19CAR构建体。本文所述的具有第三代细胞内信号传导构建体的CD-19(FMC63scFV)CARs包括包含如下细胞内嵌合结构域的构建体：CD28-CD137-CD3ζ(28_BBwt_z)、CD28-CD137突变体-CD3ζ(28_BBt_z)、CD28-CD134突变体-CD3ζ(28_OX40t_Z)、ICOS-CD137-CD3ζ(ICOS_BB_z)、ICOS-CD137突变体-CD3ζ(ICOS_BBt_z)和ICOS-CD134突变体-CD3ζ(ICOS_OX40t_z)。同样，提供了具有第三代细胞内信号传导构建体的CD-19CARs，其中一部分CD28插入ICOS结构域内：ICOS(28)-CD137-CD3ζ(ICOS(28)_BBwt_z)、ICOS(28)-CD137突变体-CD3ζ(ICOS(28)_BBt_z)和ICOS(28)-CD134突变体-CD3ζ(ICOS(28)_OX40t_z)。包含CD137-CD3ζ(BBwt_z)、CD28-CD3ζ(28_z)和ICOS-CD3ζ(ICOS_z)的第二代构建体用作对照。与本文描述的使用PD-1第三代细胞内信号传导构建体的研究类似，具有CD137和CD134突变体结构域的CD19 CAR构建体与相应的具有野生型CD137和CD134结构域的构建体(分别为28_BBwt_z和ICOS_BBwt_z)相比显示更高的表达(图13A-13B)。本文所述的体外研究显示通过用第3代基于CD28和基于ICOS的CD19 CARs转导的原代T细胞的增加的CD19表达细胞(CD19+)的杀伤(图14A-14B和图15C-15D)、增加的效应细胞因子产生(图14C，右图)和增加的T细胞增殖和持久性(图15A-15B和15E)。
本公开内容还显示，包含突变的CD134/CD137信号传导结构域的基于CD28的受体和包含突变的CD134/CD137信号传导结构域的基于ICOS的受体的表达增加了BCMA特异性T细胞(BCMACAR T细胞)与靶抗原(BCMA-Fc)的结合(图16A-16B)。同样，本公开内容显示包含突变的CD134/CD137信号传导结构域的基于CD28的受体和包含突变的CD134/CD137信号传导结构域的基于ICOS的受体的表达增加增殖和效应细胞因子产生(图16C和16E)以及响应于表达BCMA的骨髓瘤细胞系通过BCMA特异性T细胞的靶细胞杀伤(图16D)。

Claims (159)

1.重组T细胞共刺激受体(RTCR)，其包含：
(a)细胞外结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)嵌合细胞内结构域，其包含第一和至少第二信号转导结构域，
其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且
其中所述至少第二信号转导结构域包含突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。
2.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域是截短的CD137细胞内结构域。
3.根据权利要求2的RTCR，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含根据所述CD137细胞内结构域的氨基酸位置13至氨基酸位置42的氨基酸序列。
4.根据权利要求2的RTCR，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。
5.根据权利要求2的RTCR，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失。
6.根据权利要求2的RTCR，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
7.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的1、2、3或4个赖氨酸残基的缺失。
8.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个赖氨酸突变。
9.根据权利要求8的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域在选自所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、5、6和12的氨基酸位置处包含一个或多个赖氨酸突变。
10.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。
11.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸突变。
12.根据权利要求11的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域在选自所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2、3、4、5和6的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。
13.根据权利要求12的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域进一步包含在所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。
14.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD134细胞内结构域是截短的CD134细胞内结构域。
15.根据权利要求14的RTCR，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含根据所述CD134细胞内结构域的氨基酸位置15至氨基酸位置37的氨基酸序列。
16.根据权利要求14的RTCR，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。
17.根据权利要求14的RTCR，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的缺失。
18.根据权利要求14的RTCR，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
19.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的赖氨酸残基的缺失。
20.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含在所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12的赖氨酸突变。
21.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。
22.根据权利要求1的RTCR，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸突变。
23.根据权利要求22的RTCR，其中所述突变型CD134细胞内结构域在选自所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2和5的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。
24.根据权利要求23的RTCR，其中所述突变型CD137细胞内结构域进一步包含在所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。
25.根据权利要求1-24中任一项的RTCR，其中所述嵌合细胞内结构域包含衍生自CD28家族的蛋白的第一信号转导结构域。
26.根据权利要求25的RTCR，其中所述第一信号转导结构域衍生自CD28、CD28H、ICOS或其组合。
27.根据权利要求26的RTCR，其中所述第一信号转导结构域衍生自ICOS。
28.根据权利要求19的RTCR，其中所述衍生自ICOS的第一信号转导结构域包含根据SEQID NO:9的氨基酸序列。
29.根据权利要求1-24中任一项的RTCR，其中所述嵌合细胞内结构域包含第一信号转导结构域，所述第一信号转导结构域包含与根据SEQ ID NO：9的ICOS结构域组合的CD28细胞内结构域的部分。
30.根据权利要求29的RTCR，其中所述第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NOs:12和109中任一个的氨基酸序列。
31.根据权利要求1-24中任一项的RTCR，其中所述嵌合细胞内结构域包含衍生自CD28的第一信号转导结构域。
32.根据权利要求31的RTCR，其中所述衍生自CD28的第一信号转导结构域包含根据SEQID NO:10的氨基酸序列。
33.根据权利要求31-32中任一项的RTCR，其中所述第一信号转导结构域包含根据SEQID NOs:121-122中任一个的氨基酸序列。
34.根据权利要求1-30中任一项的RTCR，其中所述嵌合细胞内结构域包含根据SEQ IDNOs:14-17中任一个的氨基酸序列。
35.根据权利要求1-34中任一项的RTCR，其中所述嵌合细胞内结构域进一步包含第三信号转导结构域。
36.根据权利要求35的RTCR，其中所述第三信号转导结构域衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合。
37.根据权利要求36的RTCR，其中所述CD3信号传导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。
38.根据权利要求37的RTCR，其中所述CD3信号传导结构域包含根据SEQ ID NOs:18、45、46、47和48中任一个的氨基酸序列。
39.根据权利要求36的RTCR，其中所述CD2信号传导结构域是突变型CD2信号传导结构域。
40.根据权利要求39的RTCR，其中所述突变型CD2信号传导结构域是截短的CD2信号传导结构域。
41.根据权利要求39-40中任一项的RTCR，其中所述CD2信号传导结构域包含根据SEQID NO:49的氨基酸序列。
42.根据权利要求36的RTCR，其中所述IL-2RB蛋白信号传导结构域包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列。
43.根据权利要求1-42中任一项的RTCR，其中所述嵌合细胞内结构域进一步包含第四信号转导结构域。
44.根据权利要求43的RTCR，其中所述第四信号转导结构域衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合，其中所述第三和第四信号转导结构域转导域不相同。
45.根据权利要求44的RTCR，其中所述CD3信号传导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。
46.根据权利要求45的RTCR，其中所述CD3信号传导结构域包含根据SEQ ID NOs:18、45、46、47和48中任一个的氨基酸序列。
47.根据权利要求44的RTCR，其中所述CD2信号传导结构域是突变型CD2信号传导结构域。
48.根据权利要求47的RTCR，其中所述突变型CD2信号传导结构域是截短的CD2信号传导结构域。
49.根据权利要求47-48中任一项的RTCR，其中所述CD2信号传导结构域包含根据SEQID NO:49的氨基酸序列。
50.根据权利要求44的RTCR，其中所述IL-2RB蛋白信号传导结构域包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列。
51.根据权利要求1-50中任一项的RTCR，其中所述细胞外结构域包含诱导免疫细胞的活化和/或增殖的蛋白或其部分。
52.根据权利要求51的RTCR，其中所述细胞外结构域包含以下任一种：
a)T细胞受体(TCR)复合物的组分；
b)嵌合抗原受体(CAR)的组分；
c)T细胞共同受体的组分，其中所述T细胞共同受体是T细胞共刺激蛋白或T细胞抑制蛋白；
d)与细胞表面受体或其组分结合的配体；
e)细胞因子受体的组分，
f)趋化因子受体的组分；
g)整联蛋白受体的组分；
h)内皮细胞表面蛋白受体的组分或其片段；
i)神经元导向蛋白受体的组分；和
j)补体受体的成分。
53.根据权利要求52的RTCR，其中所述T细胞共同受体或CAR的组分是PD1、CD28、CD2、OX-40、ICOS、CTLA-4、CD28、CD3、CD4、CD8、CD40L、Lag-3、Tim-3或TIGIT或其组合的组分。
54.根据权利要求52的RTCR，其中所述T细胞共同受体或CAR的组分结合CD19、B细胞成熟Ag(BCMA)、PD-L1、PD-L2、IL-10、增殖诱导配体(APRIL)、BAFF、OX-40L、ICOS-L、B7-1、B7-2、CD40、CD58、CD59、柄蛋白、CD155或CD112或其组合。
55.根据权利要求52的RTCR，其中所述细胞因子受体结合IL-10、IL-27、TGF-β、IL-12、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ或IFN-α/β或其组合。
56.根据权利要求52的RTCR，其中所述补体受体的组分是C3aR、C5aR、CD46/MCP、CD55、CD97或DAF或其组合的组分。
57.根据权利要求52的RTCR，其中所述细胞外结构域包含上皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、趋化因子受体(CCR)4、CCR5、CCR7、CCR10、导蛋白-1受体、脑信号蛋白受体、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、白细胞特异性β2整联蛋白(αLβ2、αMβ2、αXβ2或αDβ2)、β7整联蛋白(a4β7或αEβ7)、胞外基质(ECM)结合β1整联蛋白(α1-α6β1)、L-选择蛋白或唾液酸路易斯抗原的组分的氨基酸序列。
58.根据权利要求51-54中任一项的RTCR，其中所述细胞外结构域是多肽、糖蛋白或抗体或其片段。
59.根据权利要求58的RTCR，其中所述抗体或其片段是Fab片段、F(ab)2片段、双抗体、纳米抗体、sdAb、Fv、VHH片段或单链Fv片段。
60.根据权利要求51-54和58-59中任一项的RTCR，其中所述细胞外结构域结合靶，所述靶选自肿瘤抗原，病原体相关蛋白和与自身免疫性状况或病症、炎性状况或病症、代谢状况或病症或神经变性状况或病症有关的抗原。
61.根据权利要求60的RTCR，其中所述肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤分泌的抗原(TSA)或非常规抗原(UCA)。
62.根据权利要求51-61中任一项的RTCR，其中所述细胞外结构域以1fM至100μM的结合亲和力结合靶。
63.根据权利要求62的RTCR，其中所述细胞外结构域以1μM至10μM的结合亲和力结合靶。
64.根据权利要求1-63中任一项的RTCR，其中所述细胞外结构域在N-末端包含信号肽，其中所述信号肽衍生自表面或分泌蛋白。
65.根据权利要求64的RTCR，其中所述信号肽是PD-1信号肽(PD-1SP)。
66.根据权利要求64的RTCR，其中所述信号肽是HLAI类组织相容性抗原或其部分。
67.根据权利要求1-66中任一项的RTCR，其中所述细胞外结构域包含铰链区。
68.根据权利要求68的RTCR，其中所述铰链区衍生自CD8、PD-1、CD28、ICOS或IgG。
69.根据权利要求1-68中任一项的RTCR，其中所述跨膜结构域衍生自CD8、PD1、CD28、COS或IgG。
70.根据权利要求1-69中任一项的RTCR，其中所述RTCR用于在T细胞中表达，其中所述T细胞共表达选自CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L和其组合的内源共刺激分子的至少一种。
71.编码根据权利要求1-70中任一项的RTCR的核酸。
72.包含根据权利要求71的核酸的载体。
73.包含根据权利要求71的核酸或根据权利要求72的载体的细胞。
74.根据权利要求73的细胞，其中所述细胞是修饰的T细胞。
75.根据权利要求73的细胞，其中所述细胞是修饰的天然杀伤T细胞(NK-T细胞)。
76.根据权利要求74的细胞，其中所述修饰的T细胞是同种异体T细胞。
77.根据权利要求74的细胞，其中所述修饰的T细胞是自体T细胞。
78.根据权利要求74的细胞，其中所述修饰的T细胞是幼稚T细胞、早期记忆T细胞、干细胞样T细胞、干记忆T细胞(TSCM)、中枢记忆T细胞(TCM)或调节T细胞(Treg)。
79.根据权利要求73-78中任一项的细胞，其中所述细胞进一步包含编码人工抗原受体、治疗用多肽或免疫细胞调节蛋白或其组合的序列。
80.根据权利要求79的细胞，其中所述人工抗原受体包括嵌合抗原受体(CAR)。
81.根据权利要求73-80中任一项的细胞，其中所述细胞瞬时或稳定表达根据权利要求1-70中任一项的RTCR。
82.根据权利要求73-81中任一项的细胞，其中所述细胞与所述RTCR一起共表达选自CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L和其组合的内源共刺激分子的至少一种或多种。
83.修饰的T淋巴细胞(T细胞)，其包含：
(a)编码T细胞受体(TCR)的内源序列的修饰，其中所述修饰降低或消除TCR的表达或活性水平；和
(b)根据权利要求1-70中任一项的重组T细胞共刺激受体(RTCR)。
84.根据权利要求83的修饰的T细胞，其进一步包含对编码主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)组分的内源序列的修饰，其中所述修饰降低或消除MHC-I的表达或活性水平。
85.根据权利要求83-84中任一项的修饰的T细胞，其中所述修饰的T细胞与所述RTCR一起共表达内源共刺激分子CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L或其组合中的至少一种。
86.包含根据权利要求1-70中任一项的RTCR的组合物。
87.包含根据权利要求71的核酸的组合物。
88.包含根据权利要求72的载体的组合物。
89.包含根据权利要求73-82中任一项的细胞的组合物。
90.包含根据权利要求83-85中任一项的修饰的T细胞的组合物。
91.包含细胞群体的组合物，其中所述群体包含多个根据权利要求73-82中任一项的细胞，或其中所述群体包含多个根据权利要求83-85中任一项的修饰的T细胞。
92.产生许多修饰的T细胞的方法，其中所述方法包括：
a)提供许多原代T细胞；
b)提供包含根据权利要求1-70中任一项的RTCR、根据权利要求71的核酸或根据权利要求72的载体的组合物；和
c)将(b)的组合物引入(a)的许多原代T细胞中，以在许多修饰的T细胞内稳定表达RTCR的条件下产生许多修饰的T细胞。
93.根据权利要求92的方法，其中所述方法进一步包括修饰编码内源T细胞受体(TCR)的内源序列的步骤，其中所述修饰降低或消除所述内源TCR的表达或活性水平。
94.根据权利要求92-93中任一项的方法，其中所述方法进一步包括修饰所述许多原代T细胞的内源序列的步骤，其中所述修饰降低或消除主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)的表达或活性水平。
95.根据权利要求92-94中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：
d)在合适的细胞培养基中维持或扩充所述许多修饰的T细胞；和
e)或者：
i)将所述许多修饰的T细胞在合适的细胞冷冻介质中深低温保藏；或者
ii)使所述许多修饰的T细胞为施用于有需要的主体做准备。
96.治疗疾病或病症的方法，包括向有需要的主体施用治疗有效数目的根据权利要求73-82中任一项的细胞、治疗有效数目的根据权利要求83-85中任一项的修饰的T细胞、治疗有效量的根据权利要求86-91中任一项的组合物或治疗有效数目的通过根据权利要求92-95中任一项的方法产生的许多修饰的T细胞。
97.根据权利要求96的方法，其中所述主体是哺乳动物。
98.根据权利要求97的方法，其中所述哺乳动物是人。
99.根据权利要求96-98中任一项的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或病症、传染病、炎性疾病、肾疾病或病症、肺疾病或病症、肝疾病或病症、心血管系统疾病或病症、神经变性疾病或病症或代谢疾病或病症。
100.根据权利要求99的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液学癌症。
101.根据权利要求100的方法，其中所述实体癌症是肉瘤、癌或黑色素瘤。
102.根据权利要求100的方法，其中所述血液学癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
103.根据权利要求99的方法，其中所述癌症选自急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性淋巴细胞白血病，B细胞、T细胞或FAB ALL，急性髓性白血病(AML)，急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(MDS)，霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，结肠直肠癌，胰癌，鼻咽癌，恶性组织细胞增生症，副肿瘤综合征/恶性肿瘤高钙血症，膀胱癌，乳腺癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，头癌，颈癌，遗传性非息肉性癌，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰癌，前列腺癌，肾细胞癌，睾丸癌，腺癌，肉瘤，恶性黑色素瘤和血管瘤。
104.根据权利要求99的方法，其中所述传染病由细菌、病毒、真菌、原生动物或寄生物引起。
105.根据权利要求99的方法，其中所述神经变性病症是阿尔茨海默病(AD)和其他痴呆、帕金森病(PD)和PD-相关病症、普利昂病、运动神经元病(MND)、亨廷顿病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)。
106.根据权利要求99的方法，其中所述炎性疾病是系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病或多发性硬化。
107.嵌合共刺激细胞内蛋白(CIP)，其包含第一和至少第二信号转导结构域，
其中所述第一和至少第二信号转导结构域不相同；并且
其中所述至少第二信号转导结构域包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域。
108.根据权利要求107的CIP，其中所述TNFR家族蛋白的突变型细胞内信号传导结构域是突变型CD137(4-1BB)细胞内结构域或突变型CD134(OX-40)细胞内结构域。
109.根据权利要求107-108中任一项的CIP，其中所述CIP进一步包含跨膜结构域。
110.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域是截短的CD137细胞内结构域。
111.根据权利要求110的CIP，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含根据所述CD137细胞内结构域的氨基酸位置13至氨基酸位置42的氨基酸序列。
112.根据权利要求110的CIP，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。
113.根据权利要求110的CIP，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失。
114.根据权利要求110的CIP，其中所述截短的CD137细胞内结构域包含根据SEQ IDNO:3的氨基酸序列。
115.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的1、2、3或4个赖氨酸残基的缺失。
116.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个赖氨酸突变。
117.根据权利要求116的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域在选自所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、5、6和12的氨基酸位置处包含一个或多个赖氨酸突变。
118.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。
119.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域包含从所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置12的一个或多个近端碱性氨基酸突变。
120.根据权利要求119的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域在选自所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2、3、4、5和6的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。
121.根据权利要求120的CIP，其中所述突变型CD137细胞内结构域进一步包含在所述CD137细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。
122.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域是截短的CD134细胞内结构域。
123.根据权利要求122的CIP，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含根据所述CD134细胞内结构域的氨基酸位置15至氨基酸位置37的氨基酸序列。
124.根据权利要求122的CIP，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的连续序列段的缺失。
125.根据权利要求122的CIP，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或更多个氨基酸的缺失。
126.根据权利要求122的CIP，其中所述截短的CD134细胞内结构域包含根据SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
127.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的赖氨酸残基的缺失。
128.根据权利要求127的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含在所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12的赖氨酸突变。
129.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸的缺失。
130.根据权利要求108的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域包含从所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1至氨基酸位置14的一个或多个近端碱性氨基酸突变。
131.根据权利要求130的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域在选自所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置1、2和5的氨基酸位置处包含一个或多个近端碱性氨基酸突变。
132.根据权利要求131的CIP，其中所述突变型CD134细胞内结构域进一步包含在所述CD134细胞内结构域的N-末端的氨基酸位置12处的赖氨酸突变。
133.根据权利要求107-132中任一项的CIP，其中所述嵌合细胞内结构域包含衍生自CD28家族的蛋白的第一信号转导结构域。
134.根据权利要求133的CIP，其中所述第一信号转导结构域衍生自CD28、CD28H、ICOS或其组合。
135.根据权利要求134的CIP，其中所述第一信号转导结构域衍生自ICOS。
136.根据权利要求135的CIP，其中所述衍生自ICOS的第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
137.根据权利要求107-134中任一项的CIP，其中所述嵌合细胞内结构域包含第一信号转导结构域，其包含与根据SEQ ID NO:9的ICOS结构域组合的CD28细胞内结构域的部分。
138.根据权利要求137的CIP，其中所述第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NOs:12或109中任一个的氨基酸序列。
139.根据权利要求107-134中任一项的CIP，其中所述第一信号转导结构域衍生自CD28。
140.根据权利要求139的CIP，其中所述衍生自CD28的第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NO:10的氨基序列。
141.根据权利要求139-140中任一项的CIP，其中所述第一信号转导结构域包含根据SEQ ID NOs:121-122中任一个的氨基酸序列。
142.根据权利要求107-138中任一项的CIP，其中所述CIP包含根据SEQ ID NOs：14-17中任一个的氨基酸序列。
143.根据权利要求107-142中任一项的CIP，其中所述CIP进一步包含第三信号转导结构域。
144.根据权利要求143的CIP，其中所述第三信号转导结构域衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合。
145.根据权利要求144的CIP，其中所述CD3信号传导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。
146.根据权利要求145的CIP，其中所述CD3信号传导结构域包含根据SEQ ID NOs:18、45、46、47和48中任一个的氨基酸序列。
147.根据权利要求144的CIP，其中所述CD2信号传导结构域是突变型CD2信号传导结构域。
148.根据权利要求147的CIP，其中所述突变型CD2信号传导结构域是截短的CD2信号传导结构域。
149.根据权利要求147-148中任一项的CIP，其中所述CD2信号传导结构域包含根据SEQID NO:49的氨基酸序列。
150.根据权利要求144的CIP，其中所述IL-2RB蛋白信号传导结构域包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列。
151.根据权利要求107-150中任一项的CIP，其中所述嵌合细胞内结构域进一步包含第四信号转导结构域。
152.根据权利要求135的CIP，其中所述第四信号转导结构域衍生自CD3信号传导结构域、CD2信号传导结构域或白细胞介素2受体结合(IL-2RB)蛋白信号传导结构域或其组合，其中所述第三和第四信号转导结构域不相同。
153.根据权利要求152的CIP，其中所述CD3信号传导结构域衍生自CD3ζ或CD3ε结构域或其组合。
154.根据权利要求153的CIP，其中所述CD3信号传导结构域包含根据SEQ ID NOs:18、45、46、47和48中任一个的氨基酸序列。
155.根据权利要求152的CIP，其中所述CD2信号传导结构域是突变型CD2信号传导结构域。
156.根据权利要求155的CIP，其中所述突变型CD2信号传导结构域是截短的CD2信号传导结构域。
157.根据权利要求155-156中任一项的CIP，其中所述CD2信号传导结构域包含根据SEQID NO:49的氨基酸序列。
158.根据权利要求152的CIP，其中所述IL-2RB蛋白信号传导结构域包含根据SEQ IDNO:50的氨基酸序列。
159.根据权利要求107-158中任一项的CIP，其中所述CIP用于在T细胞中表达，其中所述T细胞共表达选自CD28、CD2、OX-40、ICOS、CD28、CD3、CD4、CD8和CD40L和其组合的内源共刺激分子的至少一种。
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