CN117110272A - 一种拉曼光谱传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种拉曼光谱传感器及其制备方法和应用，涉及分析检测领域。一种拉曼光谱传感器包括磁性纳米颗粒和分子印迹聚合物膜，分子印迹聚合物膜覆盖于磁性纳米颗粒的表面，分子印迹聚合物膜具有孔结构；分子印迹聚合物膜的印迹分子为肽。该传感器选择肽作为分子印迹的模板，为小分子量且具有较高的化学稳定性，能够被拉曼信号分子较好地捕获从而对待测蛋白进行初步快速检测。

Description

一种拉曼光谱传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分析检测领域，特别是涉及一种拉曼光谱传感器及其制备方法和应用。
背景技术
心血管疾病(CVD)是世界范围内常见的健康问题，根据世界卫生组织(WHO)的数据，预计到2030年将有2360万人死于CVD。这一数字几乎是2012年的两倍，占全球所有死亡人数的近50％。其中，冠心病作为一种常见的心脏病，是指冠状动脉狭窄、供血不足引起的心肌功能障碍或器质性病变，主要表现为心肌缺血或心肌梗死。在心血管研究领域，检测生物标志物水平是一种方便、高效、相对准确的检测技术。心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)是临床上应用最广泛的心肌损伤标志物之一，它有三个亚型，cTnI、cTnT和cTnC。与cTnT和cTnC相比，cTnI更具心肌细胞特异性，因为它不存在于任何其他骨骼肌细胞中，而仅存在于心肌细胞中。作为健康人的调节蛋白，cTnI水平极低且几乎检测不到。一旦心肌受损，cTnI释放到血液中，其水平迅速升高，达到50ng·mL-1。大量研究表明，cTnI因其发病早、敏感性高、特异性强、病程长而被视为诊断心肌梗死的“金标准”。
最近，已经开发了用于cTnI检测的各种分析技术，以提高精确度和灵敏度，包括增强化学发光免疫测定法(CLIA)、酶联免疫测定法、比色法、电化学和电化学发光。虽然这些技术表现出较高的选择性和灵敏度，但它们有不足，例如较长的检测时间、标记-抗体成本以及背景干扰。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种拉曼光谱传感器，该传感器选择肽作为分子印迹的模板，为小分子量且具有较高的化学稳定性，能够被拉曼信号分子较好地捕获从而对待测蛋白进行初步快速检测。
本发明提供了一种拉曼光谱传感器，包括磁性纳米颗粒和分子印迹聚合物膜，所述分子印迹聚合物膜覆盖于所述磁性纳米颗粒的表面，所述分子印迹聚合物膜具有孔结构；
所述分子印迹聚合物膜的印迹分子为肽。
目前常用检测蛋白，特别是cTnI含量的方法是抗原-抗体法，但耗时长，材料成本高，信号稳定性不足，且不能重复使用。分子印迹技术(MIT)作为一种高灵敏度、高选择性的分子识别分离富集技术，具有广阔的应用前景，且由于其识别小分子和金属离子的杰出能力而一直是备受关注的焦点，并且在过去的几十年中已成功地用于各种应用。但一直以来，对蛋白质这类生物大分子印迹材料的研究和开发并不顺利，其原因主要如下：首先，由于蛋白质分子的体积庞大，在分子印迹识别过程中会严重影响MIP的吸附效果，目标物通过印迹嵌入内部空穴，较大的体积也增加了材料的洗脱难度。而且，庞大的结构伴随着丰富各异的功能位点，导致与MIP的特异性结合能力降低。因此，前期研究中提出，一方面通过水解肽段降低印迹模板复杂性，另一方面采用表面印迹技术增强特异性识别能力且方便目标物脱附。同时，由于人体中部分蛋白(例如cTnI)含量低，因此采用分子印迹作为一种预富集的手段，而直接对大分子蛋白质印迹的，一方面需要昂贵的蛋白质作为原料，成本高；另一方面，由于蛋白质结构的复杂性，识别的特异性受到限制，且吸附效果不佳。因此，上述拉曼光谱传感器以肽作为印迹分子，通过酶解特征肽段，将对复杂的大分子蛋白的识别转化为相对较小的分子，极大地降低了印迹难度。
在其中一个实施例中，所述肽为心肌肌钙蛋白的水解肽；
所述分子印迹聚合物膜主要由印迹分子、功能单体、致孔剂、交联剂、引发剂通过表面印迹法制备得到。
在其中一个实施例中，所述肽的氨基酸序列如下所示：ALSGMEGRKKKFES(SEQ IDNO:1)；
所述磁性纳米颗粒为核-壳结构，所述磁性纳米颗粒的核包括四氧化三铁，所述磁性纳米颗粒的壳包括二氧化硅。
本发明人以Fe3O4为磁性核，具有孔结构的分子印迹聚合物膜为壳层，以心肌肌钙蛋白特异性序列的特征肽为印迹分子，采用表面印迹聚合法成功合成了上述拉曼光谱传感器。该传感器能够利用分子印迹聚合物的特殊孔结构，成功分离富集人血清中cTnI酶解产物的特征肽段，并能与拉曼信号分子CBBG定量结合进行拉曼检测。该拉曼光谱传感器采用磁性表面分子印迹特征肽段，避免了使用稀缺和昂贵的靶蛋白，相较于抗原-抗体策略，合成的材料便宜高效，能够实现重复使用。
本发明还提供了所述拉曼光谱传感器的制备方法，包括以下步骤：将磁性纳米颗粒进行改性，得到乙烯基修饰的磁性纳米颗粒；将印迹分子、致孔剂、功能单体混合，加入乙烯基修饰的磁性纳米颗粒，搅拌，加入交联剂、引发剂，进行聚合反应，磁性保留，洗脱印迹分子，即得。
上述制备方法合成的拉曼光谱传感器制备简单，成本低；能在检测过程中实现快速分离，提高检测效率；并且材料具有可重复性，这进一步降低了检测成本。
在其中一个实施例中，所述功能单体包括甲基丙烯酸和多巴胺中的至少1种，所述致孔剂包括乙腈、甲苯、聚苯乙烯和氯仿中的至少1种，所述交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-巯基丙酸和1-芘甲胺中的至少1种，所述引发剂包括2-甲基丙腈、α'-偶氮二异丁腈和2-溴代异丁酰溴中的至少1种。
上述α'-偶氮二异丁腈的英文缩写为AIBN。
在其中一个实施例中，所述印迹分子、所述致孔剂、所述功能单体、所述乙烯基修饰的磁性纳米颗粒、所述交联剂、所述引发剂的用量比为1mg:(90-110)mL:(1.5-2.5)×104μL:(8-12)g:(6.5-7.5)×104μL:(8-10)×103mg。
在其中一个实施例中，所述功能单体与所述交联剂的用量比为1:3.5；
所述磁性纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：采用共沉淀法制备得到前驱体，超声分散前驱体，搅拌，加入碱溶液和硅源，搅拌，磁性保留，得到磁性纳米颗粒；
所述改性包括以下步骤：将所述磁性纳米颗粒与碱溶液和硅烷偶联剂混合，搅拌。
本发明还提供了一种蛋白的检测方法，包括以下步骤：将待测样本、还原剂、缓冲液混合，孵育，加入水解剂，孵育，加入所述拉曼光谱传感器，超声孵育，除杂，加入拉曼信号分子，进行偶联反应，磁性分离，采用拉曼光谱进行检测。
本发明人在研究中发现，拉曼光谱在等离子体纳米结构中的分子特异性和高灵敏度，允许同时对固体和液体样品进行多次测量，样品要求低，制备简单，并且拉曼光谱分析法相较于其他光谱分析具有更低的检出限，这对于实际样品中痕量目标物的检测具有重要意义，更适合于复杂的临床实际环境。因此，本发明人提出上述蛋白的检测方法，该方法基于分子印迹技术，具有较低的检出限，能够对含量较低的蛋白也实现较好的检测效果，且有希望用于生化标志物的即时定量分析，且该方法中使用的拉曼光谱传感器灵活和便携，允许简单的操作以适应新技术，如光纤和微流体，能够为心肌损伤疾病的防治提供一个更加灵敏的传感平台。
在其中一个实施例中，所述蛋白为心肌肌钙蛋白，所述还原剂包括二硫苏糖醇，所述缓冲液包括磷酸缓冲液，所述水解剂包括甲酸，所述拉曼信号分子包括考马斯亮蓝，所述拉曼光谱的波长为532nm。
在其中一个实施例中，所述考马斯亮蓝为考马斯亮蓝G-250。
心肌肌钙蛋白作为一种大分子蛋白质，分子量大，结构复杂，稳定性差，这种特性导致蛋白质分子相较于有机物小分子来说检测难度大。而相较于常见的蛋白质，作为健康人的调节蛋白，心肌肌钙蛋白中的cTnI水平极低且几乎检测不到。一旦心肌受损，cTnI释放到血液中，其水平迅速升高，达到50ng·mL-1，因此对于痕量cTnI的检测是非常有必要的。同时，考马斯亮蓝(CBB)是一种经过广泛研究的蛋白质染色剂，显示其特异性靶向具有碱性侧链的氨基酸。作为拉曼信号分子，CBBG具有良好的化学稳定性，可以较好地解决拉曼峰混乱的问题，掩盖了分子印迹后目标的特征峰。能够对心肌肌钙蛋白，尤其是较低含量的cTnI，实现较好的检测效果，在蛋白的初步快速检测具有重要的实际应用价值。因此，本发明人提出以检测限更低的拉曼光谱法为基础，同时采用考马斯亮蓝作为拉曼信号分子构建上述检测方法，在检测过程中，基于特异性适体-靶蛋白结合，cTnI被分离，富集在样品中，并定量偶联到拉曼信号分子考马斯亮蓝G-250(CBBG)用于检测。
在其中一个实施例中，所述超声孵育的时间为50-70min，所述偶联反应的温度为25-27℃，所述偶联反应的时间为8-12min。
上述超声孵育为常温孵育，温度一般不超过40℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种拉曼光谱传感器及其制备方法和应用，该传感器选择肽作为分子印迹的模板，为小分子量且具有较高的化学稳定性，能够被拉曼信号分子较好地捕获从而对待测蛋白进行初步快速检测。
附图说明
图1为实施例2中拉曼光谱传感器的制备工艺流程图，其中(a)为聚合在乙烯基修饰的磁性颗粒表面的分子印迹聚合物，(b)为cTnI蛋白水解位点和肽模板示意图，(c)为用于拉曼光谱的分子印迹提取的蛋白水解样品；
图2为实施例3中各颗粒的SEM图像，其中(a)为裸Fe3O4，(b)、(c)为Fe3O4@SiO2，(d)为MNIPs，(e)、(f)为MMIPs；
图3为实施例3中各颗粒的TEM图像，其中(a)为Fe3O4@SiO2，(b)、(c)为MMIP；
图4为实施例3中各颗粒的结构表征结果图，其中A为FT-IR光谱，a为Fe3O4、b为Fe3O4@SiO2、c为Fe3O4@SiO2-V、d为MNIPs、e为MNIPs；B为XRD图谱，曲线由上至下分别为Fe3O4、Fe3O4@SiO2、MMIPs；C为VSM曲线，a为Fe3O4、b为Fe3O4@SiO2、c为MMIPs；D为磁场下MMIPs在乙醇中的分离-再分散行为；
图5为实施例3中BET曲线图，其中A为Fe3O4@SiO2；B为MNIPs和MMIPs颗粒，
图6为实施例3中结合性能的结果图，其中A为MMIPs和MNIPs的吸附动力学曲线，B为MMIPs和MNIPs的等温吸附平衡曲线，C为MMIPs的重复性，D为MMIPs的选择性，E为1610cm-1处的标准曲线；
图7为实施例2、对比例1、对比例2、对比例3制备得到的拉曼传感器的吸附性能结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
来源：
材料和试剂：
高效液相色谱(HPLC)级乙腈(ACN)和三氟乙酸(TFA)购自Shanghai MacklinBiochemical Co.，中国上海；FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、四乙氧基硅烷(TEOS)、胆固醇氧化酶(COX)、乙醇、甲醇、甲基丙烯酸(MAA)、丙-2-醇均购自上海麦克林生物化学有限公司，中国上海；氢氧化铵(28％)、2-甲基丙腈(AIBN)、甲酸、乙酸、乙腈(ACN)、牛白蛋白(BSA，pI＝4.7，MW＝66.4kDa)购自Aladdin Chemistry Co.，有限公司(中国上海)。合成的特征肽(ALSGMEGRKKKFES)(98％)、心肌肌钙蛋白(cTnI)、细胞色素C(CC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Sangon Biotech(Shanghai)Co.，有限公司(中国上海)。乙酰胆碱酯酶(AchE)、肌氨酸氧化酶(SOX)购自上海源叶生物技术有限公司(Shanghai Yuanye Bio-Technology Co.，有限公司(中国上海)。本文所用的无蛋白血清样本来自华南师范大学保健中心。所有其他化学品均为分析级试剂；所有溶液均用去离子水制备。
设备：
用扫描电子显微镜对所制备的纳米材料的形貌和微观结构进行了分析(SEM，ZEISS Gemini 500，TESCAN MIRA LMS，德国，捷克共和国)，透射电子显微镜(TEM，FEITecnai F20，荷兰)，激光共聚焦拉曼显微光谱(LabRAM HR Evolution，法国)，ShimadzuLC-20AD泵(京都，Japan)和Shimadzu SPD-M20 AUV-vis检测器，X射线衍射分析仪，(XRD，Bruker D8 Advance，法国)、Brunauer-Emmett-Teller(BET，ASAP 2460，美国)、振动样品磁力计(VSM，LakeShore 7404，美国)、热重分析(TG，Discovery TGA550，美国)、傅里叶变换红外(FTIR，Spectrum Two，德国)。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
制备磁性纳米颗粒。
一、前驱体的制备方法。
上述前驱体具体为Fe3O4磁性颗粒，采用共沉淀法制备得到。制备方法具体为：将3.027g FeCl3·6H2O和1.113g FeCl2·4H2O溶解在180mL去离子水中。然后，将溶液加热至50℃，并在强烈搅拌下加入12.5mL氨水。在50℃下保持30分钟后，将温度升高至90℃并保持30分钟。磁性吸附Fe3O4颗粒，乙醇洗涤数次，60℃干燥，得到。
二、磁性纳米颗粒的制备方法。
上述磁性纳米颗粒为Fe3O4@SiO2颗粒，制备方法具体为：用50mL异丙醇和10mL去离子水分散600mg Fe3O4颗粒，然后超声分散20分钟。然后在剧烈搅拌下，滴加10mL氨溶液(碱溶液，在本实施例中为质量分数25％～28％的氨水溶液)和4mL四乙氧基硅烷(硅源，TEOS)，并在室温下以300rpm搅拌12小时。磁性保留Fe3O4@SiO2颗粒，用乙醇洗涤数次，并在50℃下干燥。
实施例2
一种拉曼光谱传感器及其制备方法。
一、将实施例1制备得到的磁性纳米颗粒进行改性，得到乙烯基改性的Fe3O4@SiO2(Fe3O4@SiO2-V)颗粒。
即将可聚合乙烯基端基接枝到Fe3O4@SiO2颗粒的表面上，具体方法为：将200mgFe3O4@SiO2颗粒分散在150mL乙醇中，然后超声分散20分钟。在剧烈搅拌下，滴加10mL氨溶液(碱溶液)和0.5mL乙烯基三甲氧基硅烷(VTMS，硅烷偶联剂)，并在室温下以300rpm搅拌12小时。将乙烯基改性的Fe3O4@SiO2颗粒磁性保留，用水和甲醇洗涤数次，并在45℃下干燥。
二、制备无印迹分子的Fe3O4@SiO2@NIP(MNIP)颗粒和拉曼光谱传感器Fe3O4@SiO2MIP(MMIP)。
1、制备拉曼光谱传感器Fe3O4@SiO2MIP(MMIP)。
制备工艺流程图如图1所示。测定心肌肌钙蛋白cTnI的特征肽的氨基酸序列为ALSGMEGRKKKFES(SEQ ID NO:1)，然后由Sangon Biotech合成，并将其作为印迹分子。用超纯水制备特征肽溶液(1.00mg mL-1)，并用乙腈(致孔剂)稀释为10.0mg L-1的印迹分子溶液。为了预反应，将5.00mL印迹分子溶液与100μL甲基丙烯酸(MAA，功能单体)混合1小时，得到预反应溶液。将0.050g Fe3O4@SiO2-V颗粒分散在具有30.0mL乙醇的100mL三颈烧瓶中，并将烧瓶超声处理30分钟。然后加入预反应溶液并在室温下以250rpm搅拌30分钟。然后将350μL乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，交联剂)和45mg 2-甲基丙腈(AIBN，引发剂)溶解在预反应溶液中，得到预聚合溶液。使用氮气流密封混合物并使其脱氧，将预聚合溶液在65℃下在N2气氛下连续搅拌24小时进行聚合反应。
离心后，分子印迹聚合物膜覆盖于磁性纳米颗粒的表面，得到磁性分子印迹聚合物，即含有印迹分子的拉曼光谱传感器(MMIPs)，磁性保留，用甲醇/乙酸(9：1，v：v)溶液洗涤MMIP数次，直至除去印迹分子，得到沉淀物，即拉曼光谱传感器Fe3O4@SiO2MIP(MMIP)，然后将沉淀物在60℃下干燥12小时。
2、无印迹分子的Fe3O4@SiO2@NIP(MNIP)颗粒。
与上述制备拉曼光谱传感器Fe3O4@SiO2MIP(MMIP)的方法基本相同，区别之处在于不添加印迹分子。
实施例3
一、MNIPs或MNIPs结合特性的测定。
在室温下，将3mg的MNIPs或MNIPs分别通过超声加入到含有不同浓度的印迹肽(0.00mg L-1-300mg L-1)的1.00ml超纯水溶液中不同的时间间隔(0-50分钟)。吸附后，使用液相色谱仪测定上清液中印迹肽的残留浓度。吸附容量(Q)计算如下：
其中c0和ct分别是印迹肽的初始浓度和平衡浓度；V(L)是初始溶液的体积，W(g)是吸附剂的重量。
随后，研究了MMIPs或MNIPs的选择性。将3.00mg的MMIPs/MNIPs分别加入100ng.mL-1cTnI，以及10.0μg.mL-1AchE、BSA、CC、SOX和COX等常见蛋白，室温超声处理60min。保留用于通过拉曼光谱进行测定。
二、样品的处理。
在本实施例中以无蛋白血清来模拟人体内心肌肌钙蛋白I所处的环境，将cTnI溶液与无蛋白血清混合制成样品进行检测，并进行了加标实验(空白加标回收)，验证拉曼光谱的准确性。具体操作如下。
先将不同浓度的cTnI溶液、200μL的0.3mol·L-1二硫苏糖醇溶液(还原剂，用于在酶解前还原蛋白中的二硫键，破坏蛋白结构来加强酶解效率)、无蛋白血清和PBS(缓冲液，用于稀释、稳定溶液)加入2mL EP管中，孵育1h。孵育后，加入100μL质量浓度80％甲酸水溶液(水解剂)。上述液体在37℃下孵育6h。孵育后，准确称量约3.00mg MMIPs，并将离心管在超声波仪中孵育60分钟。其次，在通过磁性分离用PBS除去游离模板肽后，加入考马斯亮蓝G-250(CBBG，拉曼信号分子，0.5mg·mL-1，1mL)并使其在室温下进行偶联反应10分钟。在磁性分离和用PBS洗涤后，得到分析物，将分析物干燥，置于硅片上。上述分析物通过拉曼光谱在532nm处平行测量三次。
三、结果分析。
1、实施例1、实施例2中的颗粒的表面表征。
通过SEM对实施例1中的前驱体、磁性纳米颗粒，实施例2中的Fe3O4@SiO2MIP(MMIP)、Fe3O4@SiO2@NIP(MNIP)进行表面表征，形态如图2所示。
裸露的Fe3O4颗粒是球形的，直径约20nm(图2a)。Fe3O4@SiO2为球形，直径约400nm，表面粗糙。据推测，存在未包裹在硅球中的Fe3O4颗粒(图2b、c)。与Fe3O4@SiO2相比，MNIPs的表面粗糙度(图2d)在约450nm的直径下较低，这可以推断在表面上形成了分子印迹层。图2e、f显示MMIP具有总体尺寸为约1.5μm的不规则球体。在更高的放大倍数下，球体的表面是不均匀的。
通过TEM进行表面表征，如图3所示，Fe3O4@SiO2颗粒的TEM图像示于图3a中。黑色区域是磁芯，灰色区域是壳，表明在二氧化硅层中形成磁芯。一些Fe3O4颗粒由于其大的比表面积和磁铁矿颗粒之间的磁偶极子相互作用而聚集成大颗粒，导致Fe3O4@SiO2颗粒的分散性差。如图3b、c所示，聚合后MMIP的表面具有更多的不均匀性，同时可以看到大量的Fe3O4@SiO2颗粒被封装在内部。
用红外光谱(FT-IR)进行结构表征，如图4所示。在图4A(a、b、c)中，对于裸Fe3O4NP以及对于Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-V，在585cm-1处观察到对应于Fe-O键振动的带。在TEOS水解后可以观察到，对应于Si-O-H和Si-O-Si键振动的谱带分别位于984cm-1和1080cm-1，表明SiO2壳层接枝到裸露的Fe3O4 NP上(图4.A(b))。如图4.A(c)所示，Fe3O4@SiO2的表面成功地通过双键接枝，如在1640cm-1处的C＝C伸缩峰所示。聚合后(图4.A(d-e))、C-H基团和C＝O基团是导致在2980cm-1和1740cm-1处出现新的振动带的原因，这表明MMIPs和MNIPs的制备是成功的。
进行X射线衍射以表征颗粒的晶体结构(图4.B)。在所有情况下，位于2θ＝30.2°、35.7°、43.3°、53.5°、57.0°和62.8°的六个特征峰分别对应于Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)处的特征衍射峰。(JCPDS卡：19-0629)。Fe3O4@SiO2和MMIPs的XRD表征结果与Fe3O4一致，表明改性过程没有影响磁铁矿核的晶体结构，改性后的颗粒保留了各自的晶体结构。
用VSM测试了Fe3O4、Fe3O4@SiO2、MMIPs的磁性能。样品在298K下的磁滞回线如图4C所示，Fe3O4磁性颗粒的饱和磁化强度约为65.42emu.g-1，表明在强磁场作用下，Fe3O4磁性颗粒能在5s内达到与水溶液完全分离的状态。包覆非磁性SiO2壳层后，由于非磁性层的屏蔽作用，饱和磁化强度降低。Fe3O4@SiO2颗粒的饱和磁化强度值约为19.02emu·g-1。与未掺杂的Fe3O4相比，MMIPs的饱和磁化强度降低到3.41emu·g-1。虽然饱和磁化强度降低，但在强磁性磁体作用下，在水溶液中能够快速实现完全分离。这些结果表明，合成的磁性颗粒有利于磁性分离和可重复使用。
Fe3O4@SiO2、MNIPs和MMIPs颗粒的氮吸附-脱附等温线和孔径分布显示于图5A和图5B。根据IUPAC，发现吸附-解吸等温线为IV型等温线(具有滞后回线的等温线)。与Fe3O4@SiO2的氮吸附-脱附等温线相比，MMIPs和MNIPs的氮吸附-脱附等温线的滞后回线在相对压力p/p0＝0.4处闭合，表明颗粒中存在较小的介孔。在洗脱模板后，在3.7nm处产生MMIPs印迹孔。
2、MMIPs或MNIPs粒子的结合性能。
(1)吸附动力学。
选择浓度为125mg L-1的印迹肽溶液来研究MMIPs和MNIPs的吸附动力学，结果如图6A所示。可以看出，MMIPs和MNIPs的吸附趋势相同，吸附曲线在25min前斜率较大，说明吸附初期传质阻力小，吸附速率快。25min～50min的吸附曲线斜率均接近于零，说明MMIPs和MNIPs在25min时达到饱和吸附，对印迹肽的吸附量将保持平衡。但MNIPs没有特殊的印迹孔，饱和吸附量远小于MMIPs。
(2)吸附等温线。
MMIPs或MNIPs的吸附容量随印迹肽初始浓度的变化如图6B所示。在测试过程中，印迹肽溶液的初始浓度在0.0-300mg L-1的范围内。在150mg.L-1时，MMIPs达到饱和吸附。根据式(1)，MMIPs的饱和吸附容量为48.9mg·g-1。MNIPs在200mg·L-1时达到饱和吸附，饱和吸附量为26.5mg·g-1。印迹因子是评价印迹材料选择性的重要指标之一。用于计算印迹因子IF的公式如下：
根据上式(2)计算得到印迹因子IF＝QMMIPs/QMNIPs＝1.85，证明MMIPs具有良好的选择性。
(3)MMIPs颗粒的可重复使用性。
MMIP的另一个重要特征是它们能够在再生后重复使用。经过5次连续吸附-脱附循环后，MMIPs仍能保持较高的吸附效率。第五次吸附效率下降到第一次吸附的75％(图6C)。换句话说，所制备的MMIPs可以在五个连续的吸附-脱附循环后使用，这显示了其可重复使用性和高稳定性。
(4)选择性。
为了验证MMIPs或MNIPs对多种常见蛋白质的选择性，选择乙酰胆碱酯酶(AchE)、牛血清白蛋白(BSA)、细胞色素C(CC)、肌氨酸氧化酶(SOX)和胆固醇氧化酶(COX)作为选择性实验的对象。将MMIPs加入到100ng·mL-1cTnI和10.0μg·mL-1其他5种常见蛋白的溶液中。在吸附和解吸之后，CBBG用于染色和拉曼测试。实验结果示于图6D中。MMIP对cTnI的酶促产物有最强的反应，对AchE、BSA、CC、SOX和COX的酶促产物几乎没有反应，而MNIP几乎没有反应。因此，MMIPs对目的蛋白具有良好的选择性，无明显的非特异性干扰。
(5)拉曼光谱标准曲线。
为了评价MMIPs检测cTnI的性能，在最佳条件下，制备了一系列不同浓度的模板肽(0.01，0.1，1，10，100ng·mL-1)标准溶液，通过拉曼光谱进行检测。如图6E所示，在1610cm-1处测量拉曼信号，并且特征峰的强度在0.01至100ng·mL-1范围内增加。相应地，线性拟合方程为I＝140.65log c+517.14，R2＝0.990。采用IUPAC提出的3σ/m标准估算方法的检出限，检出限为1.43pg·mL-1。
3、样品的处理。
为了验证MMIPs检测心肌肌钙蛋白cTnI的准确性，对实际样本进行了加标回收实验。因患者血清中的cTnI水平在5.00-50.0ng·mL-1浓度范围内，为模拟患者血样中cTnI水平，本实验的加标浓度分别为5.00、25.0和50.0ng·mL-1。由下表可见，将终浓度为5.00、25.0和50.0ng·mL-1的cTnI加入到无蛋白血清中，回收率在92.7％～111.2％之间，RSD(n＝3)约为2.51％～8.52％。该结果证明该方法对实际样本中cTnI的检测效果良好。
表1样品的加标实验结果(n＝3)。
4、与市售ELISA的比较。
MMIPs和商业ELISA之间的性能比较结果如上表所示，在本实施例中采用的市售ELISA试剂盒为人心肌肌钙蛋白I(cTn-I/TNNI3)ELISA试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Sangon Biotech(Shanghai)Co.Ltd，产品编号：D711127-0048。尽管各加标浓度的结果与市售ELISA不同，但无显著差异，证明加标回收率实验的可行性。与ELISA相比，MMIPs具有几个优点，包括耗时更少，所需成本更低，储存条件更简单。
综上所述，实施例1、实施例2基于快速磁分离、CBBG氨基酸染色和拉曼光谱技术，通过印迹心肌肌钙蛋白I蛋白水解肽构建了一种新的材料，可用于临床血清样本中cTnI的初步快速检测。该材料选择特征肽作为分子印迹的模板。在乙烯基修饰的磁性粒子存在下，以特征肽为模板，甲基丙烯酸为功能单体合成MMIPs。MMIPs具有良好的磁性和吸附性能，被考马斯亮蓝G-250特异性捕获后，在拉曼位移1610cm-1处出现特征吸收峰。1610cm-1处的拉曼信号强度在0.01～100ng·mL-1浓度范围内呈线性关系。血清中cTnI的回收率为92.7-111.2％，相对标准偏差为2.51％～8.52％。
MMIPs的优点是良好的热稳定性和化学稳定性，方便的吸附-解吸程序，合适的灵敏度和特异性，允许重复使用MMIPs超过5次。蛋白质水解成小的肽片段是解决大蛋白质表面印迹的最佳选择之一。通过改变模板分子结合蛋白质水解，可以制备针对其他疾病标志物的MMIPs，并结合拉曼光谱实现对其他蛋白质的快速检测。虽然在临床诊断中不能取代ELISA，但在医学实践中具有很大的研究价值。此外，增强拉曼信号以获得更好的灵敏度是未来临床医学应用的挑战之一。
对比例1
一种拉曼光谱传感器。
与实施例2的制备方法基本相同，区别之处在于功能单体与交联剂的用量比为1:4。
对比例2
一种拉曼光谱传感器。
与实施例2的制备方法基本相同，区别之处在于功能单体与交联剂的用量比为1:3。
对比例3
与实施例2的制备方法基本相同，区别之处在于功能单体与交联剂的用量比为1:2.5。
比较实施例2与对比例1、对比例2、对比例3的结果(如图7所示)，可发现实施例2的MMIPs具有更优的吸附性能。这是因为功能单体与交联剂的比例是影响分子印迹材料吸附能力的重要因素。如果交联剂的比例过高，会导致激烈的聚合，这将对分子印迹材料的孔径产生副作用。同时，印迹层过厚不利于分子印迹材料的特异性识别。然而，交联剂并不是越少越好。如果交联剂的量太低，将导致不能形成分子印迹聚合物。实验结果表明，当功能单体与交联剂的比例为1：3.5时，MMIPs具有较好的吸附性能。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种拉曼光谱传感器，其特征在于，包括磁性纳米颗粒和分子印迹聚合物膜，所述分子印迹聚合物膜覆盖于所述磁性纳米颗粒的表面，所述分子印迹聚合物膜具有孔结构；
所述分子印迹聚合物膜的印迹分子为肽。
2.根据权利要求1所述的拉曼光谱传感器，其特征在于，所述肽为心肌肌钙蛋白的水解肽；
所述分子印迹聚合物膜主要由印迹分子、功能单体、致孔剂、交联剂、引发剂通过表面印迹法制备得到。
3.根据权利要求1所述的拉曼光谱传感器，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如下所示：ALSGMEGRKKKFES(SEQ ID NO:1)；
所述磁性纳米颗粒为核-壳结构，所述磁性纳米颗粒的核包括四氧化三铁，所述磁性纳米颗粒的壳包括二氧化硅。
4.权利要求1-3中任一项所述的拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将磁性纳米颗粒进行改性，得到乙烯基修饰的磁性纳米颗粒；将印迹分子、致孔剂、功能单体混合，加入乙烯基修饰的磁性纳米颗粒，搅拌，加入交联剂、引发剂，进行聚合反应，磁性保留，洗脱印迹分子，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体包括甲基丙烯酸和多巴胺中的至少1种，所述致孔剂包括乙腈、甲苯、聚苯乙烯和氯仿中的至少1种，所述交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-巯基丙酸和1-芘甲胺中的至少1种，所述引发剂包括2-甲基丙腈、α'-偶氮二异丁腈和2-溴代异丁酰溴中的至少1种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述印迹分子、所述致孔剂、所述功能单体、所述乙烯基修饰的磁性纳米颗粒、所述交联剂、所述引发剂的用量比为1mg:(90-110)mL:(1.5-2.5)×104μL:(8-12)g:(6.5-7.5)×104μL:(8-10)×103mg。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体与所述交联剂的用量比为1:3.5；
所述磁性纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：采用共沉淀法制备得到前驱体，超声分散前驱体，搅拌，加入碱溶液和硅源，搅拌，磁性保留，得到磁性纳米颗粒；
所述改性包括以下步骤：将所述磁性纳米颗粒与碱溶液和硅烷偶联剂混合，搅拌。
8.一种蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样本、还原剂、缓冲液混合，孵育，加入水解剂，孵育，加入权利要求1-3中任一项所述的拉曼光谱传感器，超声孵育，除杂，加入拉曼信号分子，进行偶联反应，磁性分离，采用拉曼光谱进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白为心肌肌钙蛋白，所述还原剂包括二硫苏糖醇，所述缓冲液包括磷酸缓冲液，所述水解剂包括甲酸，所述拉曼信号分子包括考马斯亮蓝，所述拉曼光谱的波长为532nm。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述超声孵育的时间为50-70min，所述偶联反应的温度为25-27℃，所述偶联反应的时间为8-12min。
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