CN117098772A - 包含多顺反子表达盒的重组载体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供包含多顺反子表达盒的载体，所述多顺反子表达盒包含编码TCRα链的多核苷酸、编码TCRβ链的多核苷酸和编码细胞因子的多核苷酸，其中所述多核苷酸由包含2A元件的多核苷酸序列分隔。
Description
技术领域
本公开涉及包含至少三个顺反子的多顺反子载体及其使用方法。
背景技术
在每个细胞群体中共表达多个基因对于广泛多种生物医学应用至关重要。多基因表达的标准策略是将转基因并入多个载体中并将每个载体引入细胞中。然而，多个载体的使用常常产生基本上异质的经工程化细胞群体，其中并非所有细胞都表达每种转基因或不以相似的程度表达每种转基因。这种异质性导致了几个问题，特别是对于治疗应用来说更是如此，包括例如所需的经工程化细胞表型在体内的持久性降低、制造复杂和纯化要求以及经工程化细胞产品的批次间变异性。
鉴于与使用多个载体在单细胞中共表达多个基因相关的问题，对于单一多顺反子载体的需求尚未得到满足，这些单一多顺反子载体不仅能够在单细胞中表达多个转基因，而且能够在整个细胞群体中以相似的程度表达一些或全部转基因，从而产生针对治疗用途进行优化的工程化细胞群体。
发明内容
本公开提供了包含多顺反子表达盒的重组载体，该多顺反子表达盒包含可操作地连接至多顺反子多核苷酸的转录调控元件。
本文提供了一种包含多顺反子表达盒的重组载体，其中该多顺反子表达盒包含可操作地连接至多顺反子多核苷酸的转录调控元件，该多顺反子多核苷酸包含：第一多核苷酸序列，其编码包含α链可变(Vα)区和α链恒定(Cα)区的T细胞受体(TCR)α链；第二多核苷酸序列，其包含第一2A元件；第三多核苷酸序列，其编码包含β链可变(Vβ)区和β链恒定(Cβ)区的TCRβ链；第四多核苷酸序列，其包含第二2A元件；以及第五多核苷酸序列，其编码包含IL-15或其功能片段或功能变体和IL-15Rα或其功能片段或功能变体的融合蛋白。
在一些实施例中，该第一2A元件和该第二2A元件中的任一者或两者独立地是P2A元件、T2A元件、F2A元件或E2A元件。
在一些实施例中，该第一2A元件是P2A元件。
在一些实施例中，该P2A元件包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码：SEQ IDNO:18或20的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:18或20的氨基酸序列。
在一些实施例中，该P2A元件包含与SEQ ID NO:19或21的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二2A元件是T2A元件。
在一些实施例中，该T2A元件包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码：SEQ IDNO:22或24的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列。
在一些实施例中，该T2A元件包含与SEQ ID NO:23或25的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列中的任一者或两者独立地编码弗林蛋白酶识别位点。
在一些实施例中，该弗林蛋白酶识别位点包含：SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列。
在一些实施例中，该弗林蛋白酶识别位点由SEQ ID NO:3或5的多核苷酸序列或者含有1、2或3个核苷酸修饰的SEQ ID NO:3或5的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，该第二多核苷酸序列包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第二多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:11的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四多核苷酸序列包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:12的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第四多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:13的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，IL-15或其功能片段或功能变体包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，IL-15或其功能片段或功能变体由与SEQ ID NO:77的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，IL-15Rα或其功能片段或功能变体包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该IL-15Rα或其功能片段或功能变体由与SEQ ID NO:79的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，该IL-15或其功能片段或功能变体经由肽接头可操作地连接至该IL-15Rα或其功能片段或功能变体。
在一些实施例中，该肽接头包含：SEQ ID NO:81的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在一些实施例中，该肽接头由与SEQ ID NO:82的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，该融合蛋白是膜结合的。
在一些实施例中，该融合蛋白包含与SEQ ID NO:70或73的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该融合蛋白由与SEQ ID NO:71或74的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，该Cα区包含与SEQ ID NO:40-49的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该Cα区由与SEQ ID NO:55、57或58的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，该Cβ区包含与SEQ ID NO:50-54或60的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该Cβ区由与SEQ ID NO:56或59的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；或者该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:230的多核苷酸序列；该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；或者该第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:232的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:180或210的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:181的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:230的多核苷酸序列；并且该第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:232的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:250或270的多核苷酸序列；并且该第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:252的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；或者该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:233的多核苷酸序列；该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；或者该第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:235的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:182或212的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:233的多核苷酸序列；并且该第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:235的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:253或273的多核苷酸序列；并且该第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:255的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第三多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:169的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；或者该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第九组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:230的多核苷酸序列；该第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:236的多核苷酸序列；该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；或者该第九组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:238的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第九组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:184或214的氨基酸序列的第九组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第九组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:238的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第九组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:258或278的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第三多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:167的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；或者该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:165的氨基酸序列的第十二组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:233的多核苷酸序列；该第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:239的多核苷酸序列；该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；或者该第十二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:241的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:165的氨基酸序列的第十二组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:185或215的氨基酸序列的第十二组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第十二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:241的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第十二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:261或281的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；或者该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:167的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:233的多核苷酸序列；该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；或者该第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:239的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:167的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:186的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:187或217的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；并且该第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:239的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:254的多核苷酸序列；并且该第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:259或279的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；或者该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:169的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:230的多核苷酸序列；该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；或者该第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:236的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:169的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:188的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:189或219的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；并且该第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:236的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:251的多核苷酸序列；并且该第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:256或276的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第一多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；或者该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:170的氨基酸序列的第十三组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；该第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:235的多核苷酸序列；该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；或者该第十三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:242的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:170的氨基酸序列的第十三组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:190的氨基酸序列的第十三组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第十三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:242的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第十三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:262的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第一多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；或者该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第十四组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；该第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:232的多核苷酸序列；该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；或者该第十四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:243的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第十四组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:191的氨基酸序列的第十四组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第十四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:243的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第十四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:263的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第五多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第一多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第三多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；或者该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:233的多核苷酸序列；或者该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:182或212的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:233的多核苷酸序列；并且该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:253或273的多核苷酸序列；该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第五多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第一多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第三多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；或者该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:230的多核苷酸序列；或者该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第一多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:180或210的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:230的多核苷酸序列；该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。在一些实施例中，该第一组合多核苷酸序列包含SEQID NO:250或270的多核苷酸序列；该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且该第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第五多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列、该第三多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列和该第一多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；或者该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；或者该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:188的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:251的多核苷酸序列；该第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：该第五多核苷酸序列、该第四多核苷酸序列、该第三多核苷酸序列、该第二多核苷酸序列和该第一多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；或者该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；或者该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第三多核苷酸序列和该第二多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:186的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列和该第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:254的多核苷酸序列；该第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且该第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
在一些实施例中，该多顺反子多核苷酸进一步包含：第六多核苷酸序列，其包含第三2A元件；以及第七多核苷酸序列，其包含标记蛋白。
在一些实施例中，该第三2A元件是P2A元件、T2A元件、F2A元件或E2A元件。
在一些实施例中，该标记蛋白包含：HER1的结构域III或其功能片段或功能变体；HER1的结构域IV的N末端部分；以及CD28的跨膜结构域或其功能片段或功能变体。
在一些实施例中，该HER1的结构域III或其功能片段或功能变体包含与SEQ IDNO:104的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该HER1的结构域IV的N末端部分包含SEQ ID NO:105的氨基酸1-40、1-39、1-38、1-37、1-36、1-35、1-34、1-33、1-32、1-31、1-30、1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11或1-10。
在一些实施例中，该HER1的结构域IV的N末端部分包含SEQ ID NO:105的氨基酸1-21。
在一些实施例中，该HER1的结构域IV的N末端部分包含：SEQ ID NO:106的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:106的氨基酸序列。
在一些实施例中，CD28的跨膜区包含：SEQ ID NO:107的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
在一些实施例中，该标记蛋白包含与SEQ ID NO:100、103或112的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该Vα区包含互补决定区1α(CDR1α)、CDR2α和CDR3α，其分别包含SEQ ID NO:1001+10n、1002+10n和1003+10n的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该Vβ区包含：CDR1β、CDR2β和CDR3β，其分别包含SEQ ID NO:2001+10n、2002+10n和2003+10n的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该Vα区包含：来自包含SEQ ID NO:1004+10n、1005+10n、1006+10n或1007+10n的氨基酸序列的Vα区的CDR1α、CDR2α和CDR3α，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该Vβ区包含：来自包含SEQ ID NO:2004+10n、2005+10n、2006+10n或2007+10n的氨基酸序列的Vβ区的CDR1β、CDR2β和CDR3β，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该Vα区包含与SEQ ID NO:1004+10n、1005+10n、1006+10n或1007+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该Vβ区包含与SEQ ID NO:2004+10n、2005+10n、2006+10n或2007+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该Vα区包含与SEQ ID NO:1004+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中该Vβ区包含与SEQ ID NO:2004+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数；其中该Vα区包含与SEQ ID NO:1005+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中该Vβ区包含与SEQ ID NO:2005+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数；其中该Vα区包含与SEQ ID NO:1006+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中该Vβ区包含与SEQ ID NO:2006+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数；或其中该Vα区包含与SEQ ID NO:1007+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中该Vβ区包含与SEQ ID NO:2007+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该TCRα链包含与SEQ ID NO:1008+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，该TCRα链包含与SEQ ID NO:1009+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
在一些实施例中，该TCRα链包含与SEQ ID NO:1010+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
在一些实施例中，该TCRβ链包含与SEQ ID NO:2008+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。在一些实施例中，n＝0。
在一些实施例中，该TCRβ链包含与SEQ ID NO:2009+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
在一些实施例中，该TCRβ链包含与SEQ ID NO:2010+10n的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
在一些实施例中，该转录调控元件包含启动子。
在一些实施例中，该启动子是人延伸因子1-α(hEF-1α)杂合启动子。
在一些实施例中，该启动子包含与SEQ ID NO:150的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，重组载体进一步包含位于该多顺反子表达盒的3'端处的polyA序列。
在一些实施例中，该polyA序列包含与SEQ ID NO:151的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，重组载体进一步包含左反向末端重复序列(ITR)和右ITR，其中该左ITR和该右ITR侧接该多顺反子表达盒。
在一些实施例中，重组载体按从5'至3'的顺序包含：该左ITR；该转录调控元件；该第一多核苷酸序列；该第二多核苷酸序列；该第三多核苷酸序列；该第四多核苷酸序列；该第五多核苷酸序列；和该右ITR。
在一些实施例中，该重组载体是非病毒载体。
在一些实施例中，该非病毒载体是质粒。
在一些实施例中，该重组载体是病毒载体。
在一些实施例中，该重组载体是多核苷酸。
本文还提供一种多核苷酸，其编码与选自由SEQ ID NO:161、163、164、165、167、169、170和171组成的组的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
本文还提供一种多核苷酸，其包含与选自由SEQ ID NO:232、235、236、238、239、241、242和243组成的组的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
本文还提供一种细胞群体，其包含本文提供的任何重组载体或本文提供的任何多核苷酸。
在一些实施例中，将该重组载体或该多核苷酸整合到该细胞群体的基因组中。
在一些实施例中，该细胞是免疫效应细胞。
在一些实施例中，该免疫效应细胞选自由以下项组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
在一些实施例中，该免疫效应细胞是T细胞。
在一些实施例中，T细胞选自由以下项组成的组：初始T细胞(CD4+或CD8+)；杀伤CD8+T细胞；细胞毒性CD4+T细胞；辅助CD4+T细胞；对应于Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、滤泡辅助性(Tfh)、调节性(Treg)谱系的CD4+T细胞；肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；以及记忆T细胞(中枢记忆、效应记忆、干细胞记忆、干细胞样记忆)。
在一些实施例中，细胞群体包含α/βT细胞、γ/δT细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。
在一些实施例中，细胞群体包含CD4+T细胞、CD8+T细胞，或CD4+T细胞和CD8+T细胞两者。
在一些实施例中，细胞是离体的。
在一些实施例中，细胞是人类的。
在一些实施例中，细胞群体是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％ CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+细胞。
在一些实施例中，细胞群体是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％ CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+细胞。
本文还提供一种包含多顺反子表达盒的细胞群体，该多顺反子表达盒包含：第一顺反子，其包含编码融合蛋白的多核苷酸序列，该融合蛋白包含IL-15或其功能片段或功能变体和IL-15Rα或其功能片段或功能变体；第二顺反子，其包含编码TCRβ链的多核苷酸序列，该TCRβ链包含Vβ区和Cβ区；以及第三顺反子，其包含编码TCRα链的多核苷酸序列，该TCRα链包含Vα区和Cα区，其中细胞群体是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％ CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+细胞。
本文还提供一种包含多顺反子表达盒的细胞群体，该多顺反子表达盒包含：第一顺反子，其包含编码融合蛋白的多核苷酸序列，该融合蛋白包含IL-15或其功能片段或功能变体和IL-15Rα或其功能片段或功能变体；第二顺反子，其包含编码TCRβ链的多核苷酸序列，该TCRβ链包含Vβ区和Cβ区；以及第三顺反子，其包含编码TCRα链的多核苷酸序列，该TCRα链包含Vα区和Cα区，其中细胞群体是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+细胞。
本文还提供一种产生工程化细胞群体的方法，其包括：将本文提供的任何重组载体以及DNA转座酶或编码DNA转座酶的多核苷酸引入至细胞群体中；以及在其中该转座酶将该多顺反子表达盒整合到细胞群体的基因组中的条件下培养细胞群体，从而产生工程化细胞群体。
在一些实施例中，该左ITR和该右ITR是选自由以下项组成的组的DNA转座子的ITR：睡美人(Sleeping Beauty)转座子、piggyBac转座子、TcBuster转座子和Tol2转座子。
在一些实施例中，DNA转座子是睡美人转座子。
在一些实施例中，转座酶是睡美人转座酶。
在一些实施例中，睡美人转座酶选自由以下项组成的组：SB11、SB10、SB100X、hSB110和hSB81。
在一些实施例中，睡美人转座酶是SB11。
在一些实施例中，SB11包含与SEQ ID NO:300的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，SB11由与SEQ ID NO:301的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，编码DNA转座酶的多核苷酸是DNA载体或RNA载体。
在一些实施例中，左ITR包含与SEQ ID NO:290或291的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；并且右ITR包含与SEQ ID NO:292、293或294的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施例中，使用电穿孔、超声处理、磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、或通过穿过微流体装置引起的机械变形、或胶体分散系统，将重组载体以及DNA转座酶或编码该DNA转座酶的多核苷酸引入到细胞群体。
在一些实施例中，使用电穿孔将重组载体以及DNA转座酶或编码该DNA转座酶的多核苷酸引入到细胞群体。
在一些实施例中，该方法在30天、25天、20天、15天、14天、10天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天之内完成。
在一些实施例中，其中该方法在少于30天、25天、20天、15天、14天、10天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天之内完成。
在一些实施例中，将细胞群体冻存并在引入重组载体以及DNA转座酶或编码该DNA转座酶的多核苷酸之前解冻。
在一些实施例中，在引入重组载体以及DNA转座酶或编码该DNA转座酶的多核苷酸之前，细胞群体是静置的。
在一些实施例中，在引入重组载体以及DNA转座酶或编码该DNA转座酶的多核苷酸之前，细胞群体是非静置的。
在一些实施例中，细胞群体包含扩增的人离体细胞。
在一些实施例中，细胞群体不是离体活化的。
在一些实施例中，细胞群体包含T细胞。
本文还提供一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文提供的任何细胞群体，从而治疗该癌症。
在一些实施例中，该癌症选自肺癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌、妇科癌症和卵巢癌。
本文还提供一种治疗有此需要的受试者的自身免疫性疾病或疾患的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文提供的任何细胞群体，从而治疗该自身免疫性疾病或疾患。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图说明了本公开的例示性实施例，并且与描述一起用于解释本公开的原理。
图1是从N末端(左)到C末端(右)显示的TCRα(A)、TCRβ(B)和mbIL15(15)的结构的一组示意图。
图2A是三顺反子盒APBT15、ATBP15、AP15TB、AT15PB、BPAT15、BTAP15、BP15TA和BT15PA的ORF的一组示意图。图2B是对照盒15、APB和BPA的ORF的一组示意图。
图3是描绘双转座和单转座方法的示意图，这些方法使用睡美人转座子/转座酶系统产生表达TCRα/TCRβ和mbIL15的T细胞。
图4是一组2参数流程图，其显示了第1组-第14组中的每组在电穿孔和过夜温育后评定的转基因共表达。
图5A是一组2参数流程图，其显示了第1组-第14组中的每组在过夜温育后CD3+细胞中的代表性TCR转基因表达。图5B提供来自三个供体的TCR表达数据，其表示为CD3+细胞中的mTCR+细胞％。
图6A-图6C显示第一期扩增后(第13天)的TCR和mbIL15表达。图6A提供来自第1组-第14组中的每组的代表性TCR和mbIL15表达数据。图6B提供来自三个供体的TCR表达数据，其表示为CD3+细胞中的mTCR+细胞％。图6C提供来自三个供体的TCR和mbIL15共表达数据，其表示为CD3+细胞中的TCR+mbIL15+细胞％。
图7A-图7B显示第一期扩增(第13天)后TCR+和TCR+mbIL15+细胞的总数。图7A提供来自三个供体的TCR表达数据，其表示为mTCR+T细胞的总数。图7B提供来自三个供体的TCR+mbIL15+T细胞的总数。
图8A-图8B显示第1组-第14组中的每组在电穿孔后(第1天；图8A)和第一期扩增后(第13天；图8B)的细胞存活率。
图9A-图9B显示在第一期扩增后(第13天)来自第1组-第14组中的每组的转座T细胞与野生型或突变型新抗原脉冲的T2细胞共培养过夜后，对活化标记物4-1BB的特异性诱导。数据表示为在新抗原肽的浓度增加时CD8+细胞中的4-1BB阳性细胞％。
图10显示第一期扩增后(第13天)来自第1组-第14组中的每组的转座CD3+T细胞中的磷酸化STAT5水平。包括同种型阴性对照和IL-15处理的阳性对照以进行比较。(dTp＝使用单独的mbIL15和TCR载体进行的双重转座)。
图11显示来自第2组-第14组中的每组的转座T细胞在扩增13天然后用CD3/CD28(ThermoFisher)活化9天后的细胞凋亡水平。
图12是一组示意图，其示出了从N末端(左)到C末端(右)显示的仅TCR和mbIL15TCR构建体的S型式和N型式之间的差异。
图13A-图13B显示(图13A)电穿孔后一天(第1天)和富集前第一阶段扩增之后(第11天(富集前))以及(图13B)富集后第一阶段扩增之后(第11天(富集后))和在第二阶段扩增结束时的CD3+细胞上的TCR表达。呈现了来自四个供体的数据。
图14A-图14B显示(图14A)电穿孔后一天(第1天)和富集前第一阶段扩增之后(第11天(富集前))以及富集后第一阶段扩增之后(第11天(富集后))和在第二阶段扩增结束时的CD3+T细胞上的TCR和mbIL15共表达。呈现了来自四个供体的数据。
图15是一组2参数流程图，其显示第二阶段扩增后CD3+细胞中的代表性TCR和mbIL15转基因表达。
图16A-图16B显示(图16A)在第一扩增期之后细胞和(图16B)在第二扩增期之后细胞的倍数扩增。呈现了来自四个供体的数据。
图17A-图17B显示(图17A)在第一扩增期后和(图17B)在第二扩增期后培养物中的TCR表达细胞的绝对计数。呈现了来自四个供体的数据。
图18显示用不同型式的编码TCR001的多顺反子质粒转座的CD3+T细胞中在第二期扩增后(第27天)的磷酸化STAT5水平。一些含有非半胱氨酸取代的TCR恒定区(N型式)，或前述任选地进一步经密码子优化(NU型式)。非转座(NT)＝NT(第2.1组)；BPA(第2.2组)；BPA-N(第2.3组)；AP15TB(第2.4组)；AP15TB-N(第2.5组)；AP15TB-NU(第2.6组)；BP15TA(第2.7组)；BP15TA-N(第2.8组)；和BP15TA-NU(第2.9组)。
图19A-图19B显示来自与新抗原脉冲的树突细胞共培养的转座T细胞的功能数据。图19A显示在第二期扩增后(第27天)来自第2.1组-第2.9组中的每组的转座T细胞与野生型或突变型新抗原肽脉冲的树突细胞共培养过夜后，对活化标记物4-1BB的特异性诱导。数据表示为在新抗原肽的浓度增加时CD8+细胞中的4-1BB阳性细胞％。图19B显示在第二期扩增后(第27天)来自第2.1组-第2.9组中的每组的转座T细胞与野生型或突变型新抗原脉冲的树突细胞共培养过夜后的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。
图20A-图20B显示来自第2.2组-第2.9组中的每组的转座细胞中长期细胞因子撤除(long-term cytokine withdrawal，LTWD)温育4周后的TCR表达和细胞存活。图20A显示用小鼠TCRβ抗体在CD3+门控群体上检测到的mTCR的表达，并且图20B显示细胞存活率，其作为相对于LTWD开始时的初始细胞输入数所回收的活细胞的百分比。
图21A-图21B显示在LTWD温育4周后来自第2.2组-第2.9组中的每组的转座T细胞与野生型或突变型新抗原(10μg/ml)脉冲的树突细胞共培养过夜后，对活化标记物4-1BB的特异性诱导。
图22A-图22B显示在LTWD温育4周后来自第2.2组-第2.9组中的每组的转座T细胞与野生型或突变型新抗原(10μg/ml)脉冲的树突细胞共培养过夜后的IFN-γ分泌。
图23A-图23C是一组饼图，其显示在用测试质粒转座的细胞(第2.2组-第2.9组)中在扩增后第11天(图23A)、扩增后第22天(图23B)以及LTWD培养4周后(图23C)，活CD3+T细胞记忆和效应子亚群的平均频率。
图24是一组2参数流程图，其显示表达TCR001+/-mbIL15(BPA-N、AP15TB-NU和BP15TA-NU)的第3.2组-第3.4组中的每组在过夜温育后(第1天)、第一期扩增后(第11天，富集前和富集后)和第二期扩增后(第22天)CD3+细胞中代表性TCR和mbIL15转基因共表达。
图25A-图25C显示用各种TCR+/-mbIL15转座的细胞(第3.1组-第3.30组)在第一扩增期(第1天对比第11天(富集前))期间的TCR+群体变化。每个图呈现来自单独TCR的数据；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图26A-图26C显示用各种TCR+/-mbIL15转座的细胞(第3.1组-第3.30组)在第二扩增期(第11天(富集后)对比第22天)期间的TCR+群体变化。每个图呈现来自单独TCR的数据；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图27A-图27C显示用各种TCR+/-mbIL15转座的细胞(第3.1组-第3.30组)在第一扩增期(第1天对比第11天(富集前))期间的TCR+/mbIL15+群体变化。每个图呈现来自单独TCR的数据；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图28A-图28C显示用各种TCR+/-mbIL15转座的细胞(第3.1组-第3.30组)在第二扩增期(第11天(富集后)对比第22天)期间的TCR+/mbIL15+群体变化。每个图呈现来自单独TCR的数据；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图29A-图29I显示在第二期扩增后(第27天)来自第3.1组-第3.30组中的每组的转座T细胞与野生型(WT)或突变型(Mut)新抗原脉冲的树突细胞共培养过夜后，对活化标记物4-1BB的特异性诱导。数据表示为在新抗原肽浓度增加时总CD3+、CD4+或CD8+T细胞中的4-1BB阳性细胞％。NT＝非转座；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图30A-图30I显示在第二期扩增后(第27天)来自第3.1组-第3.30组中的每组的转座T细胞与野生型(WT)或突变型(Mut)新抗原脉冲的树突细胞共培养过夜后的IFN-γ分泌。数据表示为在新抗原肽浓度增加时的IFN-γ水平(pg/mL)。NT＝非转座；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图31显示表达TCR001+/-mbIL15的T细胞对阴性对照(Mut+HLA-)肿瘤细胞系AU565和靶肿瘤细胞系TYK-nu(Mut+HLA+)的特异性裂解。NT＝非转座；仅TCR001＝BPA-N，具有mbIL15的TCR001＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图32A-图32B显示表达(图32A)TCR022+/-mbIL15或(图32B)TCR075+/-mbIL15的T细胞对肿瘤细胞系的特异性裂解。用适当的HLA表达质粒转染肿瘤细胞系，并且用野生型(WT)或突变型(Mut)肽进行脉冲并与T细胞共培养。NT＝非转座；仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图33显示长期细胞因子撤除(LTWD)后用各种TCR+/-mbIL15(第3.1组-第3.30组)转座的细胞的TCR+群体。仅TCR＝BPA-N，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图34A-图34C显示长期细胞因子撤除(LTWD)后用各种TCR+/-mbIL15(第3.1组-第3.30组)转座的细胞的细胞存活率。BPA-N(IL2)＝仅与IL2培养的TCR，NT＝非转座，BPA-N＝仅TCR，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图35A-图35I显示在长期细胞因子撤除(LTWD)后用各种TCR+/-mbIL15(第3.1组-第3.30组)转座的细胞与野生型或突变型新抗原脉冲的树突细胞共培养过夜后，对活化标记物4-1BB的特异性诱导。数据表示为CD3+、CD4+或CD8+T细胞的4-1BB+的％。BPA-N(IL2)＝仅与IL2培养的TCR，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图36A-图36C显示在长期细胞因子撤除(LTWD)后用各种TCR+/-mbIL15(第3.1组-第3.30组)转座的细胞与野生型或突变型新抗原脉冲的树突细胞共培养过夜后的IFN-γ分泌。BPA-N(IL2)＝仅与IL2培养的TCR，具有mbIL15的TCR＝AP15TB-NU或BP15TA-NU。
图37A-图37I显示在与野生型或突变型新抗原脉冲的树突细胞共培养过夜之后，LTWD培养前和LTWD培养后用各种TCR+mbIL15(第3.1组-第3.30组)转座的细胞中4-1BB诱导的比较。数据表示为CD3+、CD4+或CD8+T细胞的4-1BB+的％。
图38是一组代表性饼图，其显示用BPA-N表达的TCR001或AP15TB-NU或BP15TA-NU表达的mbIL15转座的细胞在第11天(扩增后)时的活CD3+T细胞记忆和效应亚群的平均频率。
图39是一组代表性饼图，其显示用BPA-N表达的TCR001或AP15TB-NU或BP15TA-NU表达的mbIL15转座的细胞在第22天(扩增后)时的活CD3+T细胞记忆和效应亚群的平均频率。
图40A-图40E是一组饼图，其显示在LTWD培养4周后用测试质粒(第3.1组-第3.30组)转座的细胞中的活CD3+T细胞记忆和效应亚群的平均频率。
具体实施方式
本公开提供了包含至少三个顺反子的重组多顺反子核酸载体，其中第一顺反子编码人工T细胞受体(TCR)的α链，第二顺反子编码人工TCR的β链，并且第三顺反子编码包含IL-15和IL-15Rα的融合蛋白(例如，mbIL15)或者其功能片段或功能变体。在一些实施例中，多顺反子核酸进一步包含编码标记蛋白(例如，HER1t)的第四顺反子。在一些实施例中，顺反子由包含2A元件的多核苷酸序列分隔。还提供了包含这些载体的免疫效应细胞、利用载体离体工程化以表达由载体编码的三种蛋白质的免疫效应细胞、包含这些载体或利用这些载体制备的工程化免疫效应细胞的药物组合物以及使用这些载体或利用这些载体制备的工程化免疫效应细胞治疗受试者的方法。
与利用至少两个载体以表达三种蛋白质的现有技术系统相比，本文描述的多顺反子载体尤其适用于制造基本上同质的工程化细胞(例如，免疫效应细胞)群的方法。
5.1定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与所主张的主题所属领域中技术人员通常理解的相同含义。应当理解，前面的一般描述和以下详细描述仅是示范性和说明性的，而非对所主张的任何主题的限制。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。必须注意，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a和an)”和“所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。在本申请中，除非另外说明，否则“或者”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。本文中使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为对所描述的主题进行限制。
如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰数值或数值范围时，表示高于该值或范围的5％至10％(例如，高于至多5％至10％)和低于该值或范围的5％至10％(例如，低于至多5％至10％)的偏差仍在所叙述值或范围的预期含义内。
如本文所用，术语“T细胞受体”和“TCR”可互换使用并且是指包含来自αβT细胞受体的CDR或可变区的分子。TCR的实例包括但不限于全长TCR、TCR的抗原结合片段、缺少跨膜区和细胞质区的可溶性TCR、含有通过柔性接头连接的TCR可变区的单链TCR、通过工程化二硫键连接的TCR链、单TCR可变结构域、单肽-MHC特异性TCR、多特异性TCR(包括双特异性TCR)、TCR融合、包含共刺激区的TCR、人TCR、人源化TCR、嵌合TCR、重组产生的TCR和合成TCR。在某些实施例中，TCR是包含全长α链和全长β链的全长TCR。在某些实施例中，TCR是缺乏跨膜区和/或细胞质区的可溶性TCR。在某些实施例中，TCR是包含通过肽接头连接的Vα和Vβ的单链TCR(scTCR)，诸如具有如以下PCT公开号中描述的结构的scTCR：WO 2003/020763、WO 2004/033685或WO 2011/044186，其各自通过引用以其全文并入本文。在某些实施例中，TCR包含跨膜区。在某些实施例中，TCR包含共刺激信号传导区。
如本文所用，术语“全长TCR”是指包含第一多肽链和第二多肽链的二聚体的TCR，该第一多肽链和第二多肽链各自包含TCR可变区和TCR恒定区，该TCR恒定区包含TCR跨膜区和TCR细胞质区。在某些实施例中，全长TCR包含一个或两个未经修饰的TCR链，例如，未经修饰的α或βTCR链。在某些实施例中，全长TCR包含一个或两个经改变的TCR链，诸如嵌合TCR链和/或相对于未经修饰的TCR链包含一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的TCR链。在某些实施例中，全长TCR包含成熟的全长TCRα链和成熟的全长TCRβ链。
如本文所用，术语“TCR可变区”是指成熟TCR多肽链(例如，TCRα链或β链)中的不由TCRα链的TRAC基因、TCRβ链的TRBC1或TRBC2基因或TCRδ链的TRDC基因编码的部分。在一些实施例中，TCRα链的TCR可变区涵盖成熟TCRα链多肽中的由TRAV和/或TRAJ基因编码的所有氨基酸，并且TCRβ链的TCR可变区涵盖成熟TCRβ链多肽中的由TRBV、TRBD和/或TRBJ基因编码的所有氨基酸(参见例如，Lefranc和Lefranc,(2001)“T cell receptor FactsBook.”Academic Press,ISBN 0-12-441352-8，其通过引用以其全文并入本文)。TCR可变区通常包含框架区(FR)1、2、3和4以及互补决定区(CDR)1、2和3。
如本文所用，术语“α链可变区”和“Vα”可互换使用并且是指TCRα链的可变区。
如本文所用，术语“β链可变区”和“Vβ”可互换使用并且是指TCRβ链的可变区。
如本文在TCR的上下文中所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指可见于TCR链(例如，α链或β链)的可变区内的非连续抗原结合位点。这些区域已描述于Lefranc,(1999)TheImmunologist 7:132-136；Lefranc等人,(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212；Lefranc(2001)“T cell receptor FactsBook.”Academic Press,ISBN 0-12-441352-8；Lefranc等人,(2003)Dev Comp Immunol.27(1):55-77；以及Kabat等人,(1991)“Sequences ofprotein of immunological interest”中，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。在某些实施例中，根据Lefranc(1999)同上文献中描述的IMGT编号系统确定CDR。在某些实施例中，根据Kabat同上文献中描述的Kabat编号系统定义CDR。在某些实施例中，例如基于TCR与同源抗原(例如，肽或肽-MHC复合物)的相互作用的结构分析，以经验定义CDR。在某些实施例中，根据不同的惯例(例如，根据Kabat或IMGT编号系统，或基于结构分析以经验)定义TCR的α链和β链CDR。
如本文所用，术语“框架氨基酸残基”是指TCR链(例如，α链或β链)的框架区中的那些氨基酸。如本文所用，术语“框架区”或“FR”包括作为TCR可变区的一部分但并非CDR的一部分的氨基酸残基。
如本文所用，关于TCR的术语“恒定区”是指由TRAC基因(对于TCRα链)或者TRBC1或TRBC2基因(对于TCRβ链)编码的TCR部分，任选地缺乏全部或部分跨膜区和/或全部或部分细胞质区。在某些实施例中，TCR恒定区缺乏跨膜区和细胞质区。TCR恒定区不包括由TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD、TRBJ、TRDV、TRDD、TRDJ、TRGV或TRGJ基因编码的氨基酸(参见例如，“Tcell receptor FactsBook,”同上文献)。
如本文所用，术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”可互换使用并且是指MHC I类分子和/或MHC II类分子。
如本文所用，术语“MHC I类”是指MHC I类α链和β2微球蛋白链的二聚体，并且术语“MHC II类”是指MHC II类α链和MHC II类β链的二聚体。
如本文所用，术语“人白细胞抗原”和“HLA”可互换使用，并且还可以指由MHC基因编码的蛋白质。HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G是指MHC I类基因的主要和次要基因产物。HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR是指MHC I类基因的基因产物，其在抗原呈递细胞、B细胞和T细胞上表达。
如本文所用，术语“肽-MHC复合物”是指MHC分子(MHC I类或MHC II类)，其具有结合在MHC的本领域公认的肽结合袋中的肽。在一些实施例中，MHC分子是在细胞表面上表达的膜结合蛋白。在一些实施例中，MHC分子是缺乏跨膜区或细胞质区的可溶性蛋白。
如本文所用，关于重组跨膜蛋白的术语“胞外”是指位于细胞外部的重组跨膜蛋白的一个或多个部分。
如本文所用，关于重组跨膜蛋白的术语“跨膜”是指嵌入细胞的质膜中的重组跨膜蛋白的一个或多个部分。
如本文所用，关于重组跨膜蛋白的术语“细胞质”是指位于细胞的细胞质中的重组跨膜蛋白的一个或多个部分。
如本文所用，术语“共刺激信号传导区”是指负责介导细胞内信号传导事件的共刺激分子的细胞内部分。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，TCR)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，肽-MHC复合物)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对(例如，TCR和肽-MHC复合物)成员之间1:1的相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)来表示。亲和力可以以本领域已知的多种方式测量和/或表达，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是根据koff/kon的商来计算，而KA是根据kon/koff的商来计算。Kon是指缔合速率常数，并且koff是指解离速率常数。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术来确定，诸如使用或KinExA确定。如本文所用，“较低亲和力”是指较大的KD。
“亲合力”一般是指结合分子(例如，TCR)和其结合配偶体(例如，肽-MHC复合物)的亲和力。本文描述的结合分子能够经由两个(或更多个)位点结合抗原，其中多种相互作用协同作用以增强“表观”亲和力。亲合力是本文描述的结合分子(例如，TCR)和相关抗原(例如，肽-MHC复合物)之间结合强度的量度。亲合力与以下二者有关：抗原决定簇与抗原结合分子上的其抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数量。
例如，“特异性结合于”可用于指TCR优先结合于特定抗原(例如，特定肽或特定肽-MHC复合物组合)的能力，本领域技术人员可理解此类结合。例如，特异性结合于抗原的TCR可以结合于其他抗原，通常以较低的亲和力结合，如通过例如或本领域已知的其他免疫测定法所确定(参见例如，Savage等人,(1999)Immunity.10(4):485-92，所述文献通过引用以其全文并入本文)。在具体实施例中，特异性结合于抗原的TCR结合于抗原的缔合常数(Ka)是当TCR结合于另一抗原时的Ka的至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍或10,000倍大。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语并且是指TCR可以结合的抗原(例如，肽或肽-MHC复合物)的局部区域。在某些实施例中，TCR结合的表位可以通过例如以下项确定：NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换联用质谱法(例如，液相色谱电喷雾质谱)、流式细胞术分析、诱变作图(例如，定点诱变作图)和/或结构建模。对于X射线晶体学，可以使用本领域的任何已知方法来实现结晶(例如，GiegéR等人,(1994)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A,(1990)Eur JBiochem 189:1-23；Chayen NE,(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A,(1976)JBiol Chem 251:6300-6303，这些文献中的每一者均通过引用以其全文并入本文)。TCR:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术来研究，并且可以使用计算机软件进行细化，诸如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.发行；参见例如，MethEnzymol(1985)第114卷及第115卷,编辑Wyckoff H.W.等人；U.S.2004/0014194)；和BUSTER(Bricogne G,(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt1):37-60；BricogneG,(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,编辑Carter CW；以及Roversi P等人,(2000)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)，这些文献中的每一者均通过引用以其全文并入本文。诱变作图研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法来完成。关于诱变技术，包括丙氨酸扫描诱变技术的描述，参见例如，Champe M等人,(1995)J BiolChem 270:1388-1394和Cunningham BC&Wells J A,(1989)Science244:1081-1085，这些文献中的每一者均通过引用以其全文并入本文。在具体实施例中，使用丙氨酸扫描诱变研究来确定抗原的表位。在具体实施例中，使用氢/氘交换联用质谱法来确定抗原的表位。在某些实施例中，抗原是肽-MHC复合物。在某些实施例中，抗原是由MHC分子呈递的肽。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指本文描述的治疗或预防措施。在一些实施例中，“治疗”方法采用向患有疾病或病症或者易患有此类疾病或病症的受试者施用TCR或表达TCR的细胞，以预防、治愈、延迟、减轻疾病或病症或者复发性疾病或病症的严重程度，或改善其一种或多种症状，或者以延长受试者的存活期，超过在不存在此类治疗的情况下所预期的存活期。
如本文所用，术语“有效量”在向受试者施用疗法的上下文中是指实现期望的预防或治疗效果的疗法的量。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人的动物。在一个实施例中，受试者是人或非人的动物。在一个实施例中，受试者是人。
可以使用数学算法来实现对两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的“同一性百分比”的测定。用于比较两个序列的数学算法的具体、非限制性实例是Karlin S和Altschul S F,(1990)PNAS 87:2264-2268的算法，如Karlin S和Altschul SF,(1993)PNAS90:5873-5877中进行修改，这些文献中的每一者均通过引用以其全文并入本文。此类算法被并入Altschul SF等人,(1990)J Mol Biol 215:403的NBLAST和XBLAST程序中，该文献通过引用以其全文并入本文。可以用NBLAST核苷酸程序参数集(例如，以分数＝100，字长＝12)执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序参数集(例如，以分数＝50，字长＝3)执行BLAST蛋白搜索，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以如AltschulS F等人,(1997)Nuc Acids Res 25:3389-3402中所述使用间隙BLAST，该文献通过引用以其全文并入本文。可替代地，PSI BLAST可用于执行检测分子之间的距离关系的迭代搜索。Id.当利用BLAST、间隙BLAST和PSI BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如，万维网上的国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一具体、非限制性实例是Myers和Miller,(1988)CABIOS 4:11-17的算法，该文献通过引用以其全文并入本文。将这种算法并入到ALIGN程序(第2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4。
在容许或不容许空位的情况下，可使用类似于以上所述的那些技术的技术，确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常仅对确切的匹配进行计数。
如本文所用，术语“抗体(antibody/antibodies)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子。抗体的实例包括单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异源缀合物抗体、抗体-药物缀合物、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、affybodies、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)，以及上述任一者的抗原结合片段。在某些实施例中，本文描述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何子类别(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施例中，本文描述的抗体是IgG抗体或其类别(例如，人IgG1或IgG4)或子类别。在具体实施例中，该抗体是人源化单克隆抗体。在另一具体实施例中，该抗体是人单克隆抗体。
如本文所用，术语“顺反子”是指多核苷酸序列，可以自该多核苷酸序列产生转基因产物。
如本文所用，术语“多顺反子载体”是指包含多顺反子表达盒的多核苷酸载体。
如本文所用，术语“多顺反子表达盒”是指多核苷酸序列，其中三个或更多个转基因的表达受到共同转录调控元件(例如，共同启动子)的调控并且可以同时表达三个或更多个来自相同mRNA的单独蛋白质。例示性多顺反子载体包括但不限于三顺反子载体(含有三个顺反子)和四顺反子载体(含有四个顺反子)。
如本文所用，术语“多顺反子多核苷酸”是指包含三个或更多个顺反子的多核苷酸。
如本文所用，术语“转录调控元件”是指介导另一多核苷酸序列的转录调控的多核苷酸序列。例示性转录调控元件包括但不限于启动子和增强子。
如本文所用，“弗林蛋白酶识别位点”是指可以由弗林蛋白酶切割的氨基酸序列或编码该氨基酸序列的核苷酸序列。弗林蛋白酶也称为PACE。在一些实施例中，弗林蛋白酶识别位点包含氨基酸序列RXXR(SEQ ID NO:1)，其中位置2处的X是任何氨基酸并且位置3处的X是精氨酸或赖氨酸。在一些实施例中，弗林蛋白酶识别位点包含下表1中所示的序列。
表1.例示性弗林蛋白酶识别位点的氨基酸序列和编码其的多核苷酸序列。
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在一些实施例中，弗林蛋白酶识别位点包含与SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:2或4包含1、2或3个氨基酸修饰；或由与SEQ ID NO:3或5的多核苷酸序列75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，当位于在编码第一蛋白质的第一多核苷酸序列与编码第二蛋白质的第二多核苷酸序列之间的载体中时，弗林蛋白酶识别位点能够介导第一蛋白质与第二蛋白质切割开(经由弗林蛋白酶)，导致从相同mRNA分子中产生两种不同的多肽。
响应于弗林蛋白酶对弗林蛋白酶识别位点的识别，弗林蛋白酶诱导给定多肽在弗林蛋白酶识别位点或其一部分的C末端侧上的切割。因此，通过弗林蛋白酶介导的在弗林蛋白酶识别位点处的切割所产生的多肽可以在其C末端上保留全部或部分弗林蛋白酶识别位点。例如，本公开的第一多肽的C末端可包含氨基酸序列RAKR(SEQ ID NO:2)或RA。
如本文所用，“2A元件”是指当在mRNA中表达时，可以在细胞中对mRNA进行翻译的期间诱导核糖体跳跃的多核苷酸序列。因此，可以从单个mRNA分子产生两个单独的多肽。由2A元件编码的氨基酸序列被称为“自切割肽”。2A元件可能源自病毒。例示性2A元件包括T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。
如本文所用，术语“P2A元件”是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:19或21的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:18或20的氨基酸序列；或(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:18或20的氨基酸序列。在一些实施例中，当位于在编码第一蛋白质的第一多核苷酸序列与编码第二蛋白质的第二多核苷酸序列之间的载体中时，P2A元件能够通过阻止肽键的合成来介导第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列翻译为来自相同mRNA分子的两个不同序列，例如，在P2A元件的翻译产物的C末端处的倒数第二个残基(例如，甘氨酸)和最后一个残基(例如脯氨酸)之间，例如，使得倒数第二个残基(例如，甘氨酸)成为第一蛋白质的C末端残基，并且最后一个残基(例如，脯氨酸)成为第二蛋白质的N末端残基。在一些实施例中，P2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKR(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，P2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKRSGSG(SEQ ID NO:4)，并且P2A元件可以称为“fP2A元件”。在一些实施例中，fP2A元件是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:11的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施例中，P2A元件在其5'端处另外包含编码GSG的多核苷酸序列(例如，SEQ ID No:20和21)。
如本文所用，术语“T2A元件”是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:23或25的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列；或(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列。在一些实施例中，当位于在编码第一蛋白质的第一多核苷酸序列与编码第二蛋白质的第二多核苷酸序列之间的载体中时，T2A元件能够通过阻止肽键的合成来介导第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列翻译为来自相同mRNA分子的两个不同序列，例如，在T2A元件的翻译产物的C末端处的倒数第二个残基(例如，甘氨酸)和最后一个残基(例如脯氨酸)之间，例如，使得倒数第二个残基(例如，甘氨酸)成为第一蛋白质的C末端残基，并且最后一个残基(例如，脯氨酸)成为第二蛋白质的N末端残基。在一些实施例中，T2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKR(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，T2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKRSGSG(SEQ ID NO:4)，并且T2A元件可以称为“fT2A元件”。在一些实施例中，fT2A元件是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:13的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施例中，T2A元件在其5'端处另外包含编码GSG的多核苷酸序列(例如，SEQ ID No:24和25)。
如本文所用，术语“F2A元件”是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:27或29的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:26或28的氨基酸序列；或者(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:26或28的氨基酸序列。在一些实施例中，当位于在编码第一蛋白质的第一多核苷酸序列与编码第二蛋白质的第二多核苷酸序列之间的载体中时，F2A元件能够通过阻止肽键的合成来介导第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列翻译为来自相同mRNA分子的两个不同序列，例如，在F2A元件的翻译产物的C末端处的倒数第二个残基(例如，甘氨酸)和最后一个残基(例如脯氨酸)之间，例如，使得倒数第二个残基(例如，甘氨酸)成为第一蛋白质的C末端残基，并且最后一个残基(例如，脯氨酸)成为第二蛋白质的N末端残基。在一些实施例中，F2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKR(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，F2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKRSGSG(SEQ ID NO:4)，并且F2A元件可以称为“fF2A元件”。在一些实施例中，fF2A元件是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:15的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施例中，F2A元件在其5'端处另外包含编码GSG的多核苷酸序列(例如，SEQ ID No:28和29)。
如本文所用，术语“E2A元件”是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:31或33的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:30或32的氨基酸序列；或者(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:30或32的氨基酸序列。在一些实施例中，当位于在编码第一蛋白质的第一多核苷酸序列与编码第二蛋白质的第二多核苷酸序列之间的载体中时，E2A元件能够通过阻止肽键的合成来介导第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列翻译为来自相同mRNA分子的两个不同序列，例如，在E2A元件的翻译产物的C末端处的倒数第二个残基(例如，甘氨酸)和最后一个残基(例如脯氨酸)之间，例如，使得倒数第二个残基(例如，甘氨酸)成为第一蛋白质的C末端残基，并且最后一个残基(例如，脯氨酸)成为第二蛋白质的N末端残基。在一些实施例中，E2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKR(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，E2A元件在其5'端处另外包含编码弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸序列，例如，RAKRSGSG(SEQ ID NO:4)，并且E2A元件可以称为“fE2A元件”。在一些实施例中，fE2A元件是指多核苷酸，其(i)包含与SEQ ID NO:17的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；(ii)编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列；或(iii)编码包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施例中，E2A元件在其5'端处另外包含编码GSG的多核苷酸序列(例如，SEQ ID No:32和33)。
在N末端/5'端处包含弗林蛋白酶识别位点的2A元件的实例见于下表2中。2A位点本身在表3中细分。
表2.例示性弗林蛋白酶-2A元件的多核苷酸序列和其翻译的氨基酸序列。
表3.例示性2A元件的氨基酸和多核苷酸序列。
如本文所用，术语“反向末端重复序列”、“ITR”、“反向重复序列/同向重复序列”和“IR/DR”可互换使用并且是指例如具有约230个核苷酸(例如，220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239或240个核苷酸)的多核苷酸序列，其侧接(例如，有或无插入多核苷酸序列)表达盒(例如，多顺反子表达盒)的一端，当与相应的例如反向互补(例如，完全或不完全反向互补)的例如具有约230个核苷酸(例如，220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239或240个核苷酸)的多核苷酸序列组合使用时，该表达盒的一端可被转座酶多肽切割；侧接(例如，有或无插入多核苷酸序列)表达盒(例如，多顺反子表达盒)的相对端(例如，如以下中所描述：Cui等人,J.Mol.Biol.2002；318(5):1221-35，所述文献的内容通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，ITR，例如DNA转座子(例如，睡美人转座子、piggyBac转座子、TcBuster转座子和Tol2转座子)的ITR含有两个同向重复序列(“DR”)，例如不完全的同向重复序列，其例如具有约30个核苷酸(例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸)，位于ITR的各端。术语“ITR”和“DR”当关于单链或双链DNA载体使用时，是指有义链的DNA序列。转座酶多肽可以识别DNA的有义链和/或反义链。
如本文所用，术语“左ITR”当关于线性单链或双链DNA载体使用时，是指位于多顺反子表达盒的5'的ITR。如本文所用，术语“右ITR”当关于线性单链或双链DNA载体使用时，是指位于多顺反子表达盒的3'的ITR。当使用圆形载体时，左ITR比右ITR更靠近多顺反子表达盒的5'端，并且右ITR比左ITR更靠近多顺反子表达盒的3'端。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列元件或氨基酸序列元件以功能关系连接。例如，当多核苷酸序列与另一多核苷酸序列处于功能关系时，该多核苷酸序列是可操作地连接的。在一些实施例中，如果转录调控多核苷酸序列(例如，启动子、增强子或其他表达控制元件)影响编码蛋白质的多核苷酸序列的转录，则该转录调控多核苷酸序列可操作地连接至该编码蛋白质的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指DNA或RNA的聚合物。多核苷酸序列可以是单链或双链；含有天然、非天然或改变的核苷酸；并且含有天然、非天然或改变的核苷酸间键合，诸如氨基磷酸酯键合或硫代磷酸酯键合，而非在未经修饰的多核苷酸序列的核苷酸之间发现的磷酸二酯。多核苷酸序列包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有多核苷酸序列，包括但不限于重组手段，例如从重组文库或细胞基因组克隆多核苷酸序列，使用普通克隆技术和聚合酶链式反应等，以及通过合成手段。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用并且是指通过一个或多个肽键连接的氨基酸聚合物。如本文所用，“氨基酸序列”是指描述构成多肽的氨基酸残基的相对顺序和同一性的信息。
如本文所用，关于蛋白质或多肽的术语“功能变体”是指与参考蛋白的氨基酸序列相比包含至少一个氨基酸修饰(例如，取代、缺失、添加)的蛋白质，其保留至少一种特定功能。在一些实施例中，参考蛋白是野生型蛋白。例如，IL-15蛋白的功能变体可以指与野生型IL-15蛋白相比包含氨基酸取代的IL-15蛋白，其保留结合IL-15受体α链(IL-15Rα)的能力。并非参考野生型蛋白质的所有功能都需要由蛋白质的功能变体保留。在一些情况下，选择性地减少或消除一种或多种功能。
如本文所用，关于蛋白质或多肽的术语“功能片段”是指保留至少一种特定功能的参考蛋白质片段。例如，IL-15蛋白的功能片段可以指保留特异性结合IL-15Rα的能力的蛋白质片段。并非参考蛋白的所有功能都需要由蛋白质功能片段保留。在一些情况下，选择性地减少或消除一种或多种功能。
如本文所用，关于多核苷酸序列的术语“修饰”是指与参考多核苷酸序列相比包含至少一个核苷酸取代、改变、倒位、添加或缺失的多核苷酸序列。如本文所用，关于氨基酸序列的术语“修饰”是指与参考氨基酸序列相比包含至少一个氨基酸残基取代、改变、倒位、添加或缺失的氨基酸序列。
如本文所用，关于多核苷酸序列的术语“源自”是指与其所源自的天然存在的参考核酸序列具有至少85％序列同一性的多核苷酸序列。关于氨基酸序列的术语“源自”是指与其所源自的天然存在的参考氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。如本文所用，术语“源自”并不指示获得多核苷酸或氨基酸序列的任何具体工艺或方法。例如，多核苷酸或氨基酸序列可以以化学方式合成。
如本文所用，术语“连接至”是指两个分子或部分之间的共价或非共价结合。技术人员将理解，当第一分子或部分连接至第二分子或部分时，该连接不需要是直接的，而是可以通过插入分子或部分实现。
如本文所用，术语“细胞因子”是指介导和/或调控生物或细胞功能或过程(例如，免疫、炎症和造血)的分子。如本文所用，细胞因子包括但不限于淋巴因子、趋化因子、单核因子和白细胞介素。如本文所用，术语细胞因子还涵盖功能变体和野生型细胞因子的功能变体。
如本文所用，术语“标记蛋白”或“标记多肽”可互换使用并且是指可在细胞表面上表达的蛋白质或多肽，其可用于标记或耗竭表达标记蛋白或多肽的细胞。在一些实施例中，表达标记蛋白或多肽的细胞的耗竭通过施用特异性结合标记蛋白或多肽的分子(例如，介导抗体依赖性细胞毒性的抗体)来进行。
如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指参与促进免疫效应功能的细胞。免疫效应细胞的实例包括但不限于T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞)、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
如本文所用，术语“免疫干细胞”是指具有多能性并且可以分化成一种或多种类型的免疫细胞(包括免疫效应细胞)的细胞。免疫干细胞包括但不限于骨髓干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、脐血干细胞、淋巴细胞祖细胞、干细胞记忆T细胞和干细胞记忆样T细胞。在某些实施例中，免疫干细胞是从成人和胎儿骨髓、脐带血或外周血中分离和/或富集的。
如本文所用，术语“免疫效应功能”是指免疫效应细胞的专门功能。任何给定免疫效应细胞的效应功能可能不同。例如，CD8+T细胞的效应功能是细胞溶解活性，并且CD4+T细胞的效应功能是分泌细胞因子。
5.2T细胞受体
在一个方面，本公开提供可以经由本公开的多顺反子表达盒表达的TCR。在某些实施例中，TCR包含T细胞受体(TCR)α链和TCRβ链，该TCRα链包含α链可变(Vα)区和α链恒定(Cα)区，该TCRβ链包含β链可变(Vβ)区和β链常数(Cβ)。本文公开的TCR中包含的恒定结构域的氨基酸序列显示于下表4和表5中。
表4.TCR Cα区的氨基酸序列。
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表5.TCR Cβ区的氨基酸序列。
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如本文所用，“LIV取代的”是指本文公开的Cα序列，其相对于SEQ ID NO:40，包含位置112处的亮氨酸残基、位置114处的异亮氨酸残基和位置115处的缬氨酸残基。参见例如SEQ ID No:41和42。在一些实施例中，并且独立于LIV取代，本文公开的Cα序列可以在位置48处包含半胱氨酸，替代苏氨酸残基。(比较SEQ ID No:40-44)。在一些实施例中，本文公开的Cβ序列在残基57处的丝氨酸被半胱氨酸取代。这示于SEQ ID No:50和51中。
肿瘤蛋白p53(也称为“p53”)通过例如调控细胞分裂来充当肿瘤抑制因子。在一些实施例中，野生型全长p53具有SEQ ID NO:340的氨基酸序列，如下所示。
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD(SEQ ID NO:340)
Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)，也称为GTP酶Kras、V-Ki-Ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因或KRAS2，是小GTP酶超家族的成员。存在两种KRAS转录变体：KRAS变体A和KRAS变体B。在下文中，除非另有规定，否则提及“KRAS”(突变的或未突变的)均指变体A和变体B两者。在一些实施例中，野生型KRAS变体A具有SEQ ID NO:341的氨基酸序列并且野生型KRAS变体B具有SEQ ID NO:342的氨基酸序列，两者均如下所示。
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM(SEQ ID NO:341)MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM(SEQ ID NO:342)
EGFR(也称为ERBB1或HER1)是一种属于细胞表面受体中的受体酪氨酸激酶(RTK)超家族的跨膜糖蛋白，其通过胞外生长因子介导细胞信号传导。野生型(WT)、未突变的人EGFR氨基酸序列的实例包括GenBank登录号NP_00l 333826.1(同种型e前体)、NP_00l333827.1(同种型f前体)、NP_001333828.l(同种型g前体)、NP_00l333829.l(同种型h前体)、NP_00l333870.l(同种型i前体)、NP_005219.2(同种型a前体)、NP_958439.l(同种型b前体)、NP_958440.l(同种型c前体)和NP_95844l.l(同种型d前体)中公开的那些。在一些实施例中，野生型EGFR具有SEQ ID NO:343的氨基酸序列
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA(SEQ ID NO:343)
例示性TCR的氨基酸序列阐述于本文表6中。
表6A.TCR001的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR001与来自肿瘤蛋白p53(p53)的肽相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原并且具有氨基酸改变R175H(其中p53蛋白的位置175从Arg突变为His)。在一些实施例中，TCR001与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用和/或对其具有特异性，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6B.TCR002的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR002与来自p53的肽相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR002与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6C.TCR003的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR003与来自p53的肽相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR003与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6D.TCR004的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR004与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR004与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6E.TCR005的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR005与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR005与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6F.TCR006的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR006与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR006与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6G.TCR007的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR007与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR007与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6H.TCR008的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR008与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR008与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6I.TCR009的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR009与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR009与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6J.TCR010的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR010与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR010与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6K.TCR011的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR011与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR011与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6L.TCR012的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR012与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR012与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6M.TCR013的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR013与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R175H。在一些实施例中，TCR013与HLA-DRB1*13:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6N.TCR014的氨基酸序列
/>
在一些实施例中，TCR014与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变Y220C。在一些实施例中，TCR014与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2020/264269中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6O.TCR015的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR015与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变Y220C。在一些实施例中，TCR015与HLA-DRB1*4:01:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6P.TCR016的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR016与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变Y220C。在一些实施例中，TCR016与HLA-DRB3*02:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6Q.TCR017的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR017与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变G245S。在一些实施例中，TCR017与HLA-DRB3*02:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6R.TCR018的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR018与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变G245S。在一些实施例中，TCR018与HLA-DRB3*02:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6S.TCR019的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR019与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变G245S。在一些实施例中，TCR019与HLA-DRB3*02:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6T.TCR020的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR020与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变G245S。在一些实施例中，TCR020与HLA-DRB3*02:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6U.TCR021的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR021与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR021与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6V.TCR022的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR022与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D。在一些实施例中，TCR022与HLA-A*11:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2021/163434中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6W.TCR023的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR023与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR023与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6X.TCR024的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR024与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR024与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6Y.TCR025的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR025与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR025与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6Z.TCR026的氨基酸序列
/>
/>
在一些实施例中，TCR026与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR026与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AA.TCR027的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR027与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR027与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AB.TCR028的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR028与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR028与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AC.TCR029的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR029与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR029与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AD.TCR030的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR030与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR030与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AE.TCR031的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR031与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR031与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AF.TCR032的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR032与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR032与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AG.TCR033的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR034与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR034与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AH.TCR034的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR034与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR034与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AI.TCR035的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR035与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR035与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AJ.TCR036的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR036与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR036与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AK.TCR037的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR037与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR037与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AL.TCR038的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR038与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR038与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AM.TCR039的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR039与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR039与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AN.TCR040的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR040与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR040与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AO.TCR041的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR041与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR041与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AP.TCR042的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR042与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR042与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AQ.TCR043的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR043与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR043与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AR.TCR044的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR044与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR044与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AS.TCR045的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR045与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR045与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AT.TCR046的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR046与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR046与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AU.TCR047的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR047与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR047与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AV.TCR048的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR048与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248Q。在一些实施例中，TCR048与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AW.TCR049的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR049与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR049与HLA-A*68:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AX.TCR050的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR050与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR050与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AY.TCR051的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR051与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR051与HLA-DPA1*03:01/DPB1*02:01:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6AZ.TCR052的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR052与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR052与HLA-A*68:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BA.TCR053的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR053与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR053与HLA-A*68:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BB.TCR054的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR054与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR054与DPA1*01:03/DBP1*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BC.TCR055的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR055与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR055与HLA-C*01:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2021/163477中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BD.TCR056的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR056与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR056与HLA-A*02:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BE.TCR057的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR057与p53相互作用和/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自p53的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型p53序列具有氨基酸改变R248W。在一些实施例中，TCR057与HLA-A*68:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/067243中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BF.TCR058的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR058与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR058与HLA-C*01:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2021/163477中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BG.TCR059的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR059与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR059与HLA-C*01:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2021/163477中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BH.TCR060的氨基酸序列。
/>
在一些实施例中，TCR060与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR060与HLA-DPA1*01:03链和HLA-DPB1*03:01链背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2021/173902中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BI.TCR061的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR061与肿瘤蛋白KRAS(KRAS)相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12C。在一些实施例中，TCR061与HLA-DRB1*11:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/060349中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BJ.TCR062的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR062与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D。在一些实施例中，TCR062与HLA-C*08:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2018/026691中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BK.TCR063的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR063与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D。在一些实施例中，TCR063与HLA-C*08:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2018/026691中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BL.TCR064的氨基酸序列。
/>
/>
在一些实施例中，TCR064与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D。在一些实施例中，TCR064与HLA-C*08:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2018/026691中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BM.TCR065的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR065与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D。在一些实施例中，TCR065与HLA-Cw*08:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2017/048593中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BN.TCR066的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR066与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D。在一些实施例中，TCR066与HLA-C*08:02背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2018/026691中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BO.TCR067的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR067与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D和/或G12V。在一些实施例中，TCR067与HLA-A11背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2016/085904中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BP.TCR068的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR068与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D和/或G12V。在一些实施例中，TCR068与HLA-A11背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2016/085904中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BQ.TCR069的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR069与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D和/或G12V。在一些实施例中，TCR069与HLA-A11背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2016/085904中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BR.TCR070的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR070与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D和/或G12V。在一些实施例中，TCR070与HLA-A11背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2016/085904中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BS.TCR071的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR071与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12D和/或G12V。在一些实施例中，TCR071与HLA-A11背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2016/085904中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BT.TCR072的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR072与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12R。在一些实施例中，TCR072与HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/154275中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BU.TCR073的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR073与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12R。在一些实施例中，TCR073与HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/154275中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BV.TCR074的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR074与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR074与HLA-A3异二聚体背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2020/086827中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BW.TCR075的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR075与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR075与HLA-A*11:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO2019/112941中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BX.TCR076的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR076与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR076与HLA-DRB1*7:01背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/060349中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BY.TCR077的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR077与表皮生长因子受体(EGFR)肿瘤蛋白相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自EGFR的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型EGFR序列具有氨基酸改变E746-A750del。在一些实施例中，TCR077与HLA-DPA1*02:01和HLA-DPB1*01:01的异二聚体背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2019/213195中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6BZ.TCR078的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR078与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR078与HLA-DPA1*01:03链和HLA-DPB1*03:01链背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2021/173902中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6CA.TCR079的氨基酸序列。
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在一些实施例中，TCR079与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR079与HLA-DPA1*01:03链和HLA-DPB1*03:01链背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2021/173902中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
表6CB.TCR080的氨基酸序列
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在一些实施例中，TCR080与KRAS相互作用/或对其具有特异性。在一些实施例中，肽来自KRAS的新抗原。在一些实施例中，新抗原相对于野生型KRAS序列具有氨基酸改变G12V。在一些实施例中，TCR080与HLA-DPA1*01:03链和HLA-DPB1*03:01链背景下的新抗原相互作用，如国际公开号WO 2021/173902中所描述，该文献通过引用以其全文并入本文。
本公开还提供了其他TCR Vα和Vβ序列以及任何其他α或β链在本文所述的多顺反子载体、工程化细胞或药物组合物中的用途。这些TCR Vα和Vβ序列以及α或β链包括国际公开号WO 2016/085904、WO 2017/048593、WO 2018/026691、WO 2019/060349、WO 2019/067243、WO 2019/070435、WO 2019/112941、WO 2019/213195、WO 2020/086827、WO 2020/154275、WO 2020/264269、WO 2021/163434、WO 2021/163477和WO 2021/173902中描述的那些，该等文献通过引用以其全文并入本文。
本文公开的TCR的CDR可以使用任何本领域公认的编号惯例来定义。另外或替代地，CDR可以凭经验定义，例如，基于对TCR与同源抗原(例如，肽或肽-MHC复合物)的相互作用的结构分析定义。在一些实施例中，TCR的CDR3可进一步包含N末端半胱氨酸和/或C末端苯丙氨酸或色氨酸。
本文公开的TCR可以任何TCR结构形式使用。例如，在某些实施例中，TCR是包含全长α链和全长β链的全长TCR。可以从全长TCR中去除跨膜区(以及任选地还去除细胞质区)以产生可溶性TCR。因此，在某些实施例中，TCR是缺乏跨膜区和/或细胞质区的可溶性TCR。产生可溶性TCR的方法是本领域众所周知的。在一些实施例中，可溶性TCR包含促进二聚化的工程化二硫键，参见例如美国专利号7,329,731，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，可溶性TCR通过使本文描述的TCR的胞外结构域与其他蛋白质结构域(例如，麦芽糖结合蛋白、硫氧还原蛋白、人恒定κ结构域或亮氨酸拉链)融合来产生，参见例如，等人,Front Oncol.2014；4:378，所述文献通过引用以其全文并入本文。还可以产生包含通过肽接头连接的Vα和Vβ的单链TCR(scTCR)。此类scTCR可包含Vα和Vβ，其各自连接至TCR恒定区。替代地，scTCR可包含Vα和Vβ，其中Vα、Vβ、或Vα和Vβ两者不连接至TCR恒定区。例示性scTCR描述于PCT公开号WO 2003/020763、WO 2004/033685和WO 2011/044186中，该等文献中的每一者均通过引用以其全文并入本文。此外，本文公开的TCR可包含两条多肽链(例如，α链和β链)，其中这些链已被工程化以各自具有可形成链间二硫键的半胱氨酸残基。因此，在某些实施例中，本文公开的TCR包含通过工程化二硫键连接的两条多肽链。具有工程化二硫键的例示性TCR描述于美国专利号8,361,794和8,906,383中，该等文献中的每一者均通过引用以其全文并入本文。
在某些实施例中，本文公开的TCR包含具有跨膜区的一条或多条链(例如，α链和/或β链)。在某些实施例中，本文公开的TCR包含具有跨膜区的两条链(例如，α链和β链)。跨膜区可以是该TCR链的内源跨膜区、该内源跨膜区的变体或异源跨膜区。在某些实施例中，本文公开的TCR包含具有内源跨膜区的α链和β链。
在某些实施例中，本文公开的TCR包含具有细胞质区的一条或多条链(例如，α链和/或β链)。在某些实施例中，本文公开的TCR包含各自具有细胞质区的两条链(例如，α链和β链)。细胞质区可以是该TCR链的内源细胞质区域、该内源细胞质区的变体或异源细胞质区。在某些实施例中，本文公开的TCR包含两条链(例如，α链和β链)，其中两条链均具有跨膜区，但一条链缺乏细胞质区。在某些实施例中，本文公开的TCR包含两条链(例如，α链和β链)，其中两条链均具有内源跨膜区但缺乏内源细胞质区。在某些实施例中，本文公开的TCR包含α链和β链，其中两条链均具有内源跨膜区但缺乏内源细胞质区。在某些实施例中，本文公开的TCR包含来自共刺激分子的共刺激信号传导区；参见例如PCT公开号：WO 1996/018105、WO 1999/057268和WO 2000/031239以及美国专利号7,052,906，所有这些文献均通过引用以其全文并入本文。
在某些实施例中，本公开提供了包含融合在一起的TCR的α链可变区(Vα)和β链可变区(Vβ)的多肽。例如，此类多肽可以依次包含Vα和Vβ、或Vβ和Vα，任选地在两个区域之间具有接头(例如，肽接头)。例如，弗林蛋白酶和/或2A切割位点(例如，表2或表3中序列中的一个)或其组合可以用于Vα/Vβ融合多肽的接头中。在某些实施例中，本公开提供了包含融合在一起的TCR的α链和β链的多肽。例如，此类多肽可以依次包含α链和β链、或β链和α链，任选地在两条链之间具有接头(例如，肽接头)。例如，弗林蛋白酶和/或2A切割位点(例如，表2或表3中序列中的一个)或其组合可以用于α/β融合多肽的接头中。例如，融合多肽可从N末端至C末端包含：TCR的α链、弗林蛋白酶切割位点、2A切割位点和TCR的β链。在某些实施例中，多肽从N末端至C末端包含：TCR的β链、弗林蛋白酶切割位点、2A元件和TCR的α链。
5.3使用方法
在另一方面，本公开提供一种使用本文公开的多顺反子多核苷酸、重组载体、工程化细胞(例如，包含异源和/或重组核酸的细胞)或药物组合物治疗受试者的方法。可以使用本文公开的方法来治疗受试者中将受益于本公开的重组细胞、或者本公开的多核苷酸或载体的治疗的任何疾病或病症。
在某些实施例中，该方法包含向受试者施用有效量的如本文公开的重组细胞或其群体。
如下文所公开，施用于受试者的细胞对于受试者可以是自体的或同种异体的。在某些实施例中，在癌症治疗后直接从癌症患者获得自体细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是使用损害免疫系统的药物进行治疗后，在患者正常从治疗中恢复的时间段期间，在治疗后不久，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或对其离体扩增的能力为改善的。同样，在使用本文描述的方法进行离体操作后，这些细胞可能处于用于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在某些实施例中，在该恢复期期间从血液、骨髓、淋巴结、胸腺或者另一组织或体液、或单采血液成分术产物收集细胞。此外，在某些方面，可使用动员和调理方案在受试者中产生有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，尤其是在治疗后的限定时间窗期间。
所采用的细胞的数量将取决于多种情况，包括细胞的寿命、待使用的方案(例如，施用次数)、细胞增殖的能力、重组构建体的稳定性等。在某些实施例中，细胞以分散体的形式应用，通常注射到感兴趣的部位或附近。细胞可以在任何生理学上可接受的介质中施用。
在某些实施例中，癌症是肺癌、胆管癌症(例如，胆管癌)、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌或妇科癌症。在某些实施例中，癌症是白血病(例如，混合谱系白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病)、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌(例如，神经胶质瘤，例如，胶质母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌(例如，肝内胆管细胞癌)、关节癌、颈部癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、骨髓瘤(例如，慢性骨髓癌)、结肠癌、食道癌、宫颈癌、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、大网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、胃癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、癌瘤、肉瘤(例如，滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤)、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、头颈癌、输尿管癌和尿膀胱癌。在某些实施例中，癌症是黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌或滑膜肉瘤。在一个实施例中，癌症是滑膜肉瘤或脂肪肉瘤(例如，粘液样/圆细胞脂肪肉瘤)。在某些实施例中，癌症是肺癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌、妇科癌症或卵巢癌。
本文所述的多顺反子多核苷酸、重组载体、工程化细胞或药物组合物可以通过多种途径递送至受试者。这些包括但不限于肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌内、腹膜内、经皮、静脉内、瘤内、结膜、鞘内和皮下途径。还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的调配物以用作喷雾剂。在某些实施例中，本文所述的多顺反子多核苷酸、重组载体、工程化细胞或药物组合物经静脉内递送。在某些实施例中，本文所述的多顺反子多核苷酸、载体、工程化细胞或药物组合物经皮下递送。在某些实施例中，本文所述的多顺反子多核苷酸、重组载体、工程化细胞或药物组合物经瘤内递送。在某些实施例中，本文所述的多顺反子多核苷酸、重组载体、工程化细胞或药物组合物经递送至肿瘤引流淋巴结中。
将对治疗和/或预防病症有效的多顺反子多核苷酸、重组载体、工程化细胞或药物组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
待在组合物中采用的精确剂量还将取决于各种因素，包括但不限于施用途径和感染或其所引起的疾病的严重度，并且应根据执业者的判断和每个受试者的情况来决定。例如，有效剂量还可以取决于施用方式、目标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人还是动物、施用的其他药物或治疗是预防性的还是治疗性的而变化。通常，患者是人，但也可以治疗非人的哺乳动物，包括转基因哺乳动物。对治疗剂量进行最佳滴定以优化安全性和功效。
5.4IL-15/IL-15Rα融合蛋白
本公开还提供包括细胞因子的重组载体。在一些实施例中，细胞因子是白细胞介素。在一些实施例中，细胞因子是膜结合的。在一些实施例中，细胞因子是包含可溶性细胞因子或其功能片段或功能变体的融合蛋白，其可操作地连接至细胞因子或其功能片段或功能变体的同源受体，任选地为其膜结合形式。在一些实施例中，融合蛋白包含可操作地连接至人IL-15Rα(hIL-15Rα)的人IL-15(hIL-15)。在膜结合形式中，该融合蛋白在本文中称为膜结合IL-15(mbIL15)。在一些实施例中，hIL-15直接可操作地连接至hIL-15Rα。在一些实施例中，hIL-15间接可操作地连接至hIL-15Rα。在一些实施例中，hIL-15经由肽接头间接可操作地连接至hIL-15Rα。
在一些实施例中，肽接头包含：SEQ ID NO:81的氨基酸序列或者相对于SEQ IDNO:81的氨基酸序列含有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。在一些实施例中，接头的氨基酸由以下项组成：SEQ ID NO:81的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:81的氨基酸序列包含1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，接头的氨基酸由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，接头由与SEQ ID NO:82的多核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:82的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，hIL-15包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，hIL-15包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列。在一些实施例中，hIL-15的氨基酸序列由与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，hIL-15的氨基酸序列由SEQ ID NO:76的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，hIL-15由与SEQ ID NO:77的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，hIL-15由SEQ ID NO:77的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，hIL-15Rα包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，hIL-15Rα包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施例中，hIL-15Rα的氨基酸序列由与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，hIL-15Rα的氨基酸序列由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，hIL-15Rα由与SEQ ID NO:79的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，hIL-15Rα由SEQ ID NO:79的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:70或73至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:70至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:73至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:70或73的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列。在一些实施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列由与SEQ ID NO:70或73的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列由与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列由与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:70或73的氨基酸序列组成。在一些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成。在一些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，融合蛋白由与SEQ ID NO:71或74的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，融合蛋白由与SEQ ID NO:71的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，融合蛋白由与SEQ ID NO:74的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，融合蛋白由SEQ ID NO:71或74的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，融合蛋白由SEQ ID NO:71的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，融合蛋白由SEQID NO:74的多核苷酸序列编码。
例示性细胞因子融合蛋白及其组分公开于表7中。另外的例示性mbIL15融合体公开于Hurton等人,“Tethered IL-15augments antitumor activity and promotes astem-cell memory subset in tumor-specific T cells,”PNAS,113(48)E7788-E7797(2016)中，该文献的全部内容通过引用并入本文。
例示性细胞因子融合蛋白和组分多肽的氨基酸序列和多核苷酸序列提供于本文表7中。
表7.例示性IL-15/IL-15Rα融合蛋白和其组分的氨基酸和多核苷酸序列。
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5.5标记蛋白
本文描述的标记蛋白发挥作用以允许通过施用特异性结合于标记蛋白并可介导或催化对重组细胞的杀伤的试剂，例如抗体，在体内选择性耗竭与本文公开的重组载体接触的细胞(例如，“重组细胞”)。在一些实施例中，标记蛋白在重组细胞的表面上表达。
在一些实施例中，标记蛋白包含细胞表面蛋白的胞外结构域或其功能片段或功能变体。在一些实施例中，细胞表面蛋白是人表皮生长因子受体1(hHER1)。在一些实施例中，标记蛋白包含能够被抗hHER1抗体结合的经截短的HER1蛋白。在一些实施例中，标记蛋白包含能够被抗hHER1抗体结合的经截短的hHER1蛋白的变体。在一些实施例中，hHER1标记蛋白通过施用识别重组细胞的表面上表达的hHER1标记蛋白的抗体而允许耗竭经输注的重组细胞，来提供安全机制。结合hHER1标记蛋白的例示性抗体是西妥昔单抗(cetuximab)。
在一些实施例中，hHER1标记蛋白从N末端至C末端包含：hHER1的结构域III或其功能片段或功能变体；hHER1的结构域IV的N末端部分；和人CD28的跨膜区。
在一些实施例中，hHER1的结构域III包含：SEQ ID NO:104的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在一些实施例中，hHER1的结构域III的氨基酸序列由以下项组成：SEQ ID NO:104的氨基酸序列；或包含1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施例中，该hHER1的结构域IV的N末端部分包含SEQ ID NO:105的氨基酸1-40、1-39、1-38、1-37、1-36、1-35、1-34、1-33、1-32、1-31、1-30、1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11或1-10。在一些实施例中，hHER1的结构域III的C末端与hHER1的结构域IV的N末端部分的N末端直接融合。
在一些实施例中，hHER1的结构域IV的N末端部分的C末端经由肽接头与CD28跨膜结构域的N末端间接融合。在一些实施例中，肽接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。在一些实施例中，肽接头的长度为约5-25、5-20、5-15、5-10、10-20或10-15个氨基酸。
在一些实施例中，肽接头包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列或者相对于SEQ IDNO:108的氨基酸序列含有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头的氨基酸序列由以下项组成：SEQ ID NO:108的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:108的氨基酸序列包含1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，肽接头的氨基酸序列由SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，标记蛋白包含与SEQ ID NO:100、103、112或113的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，标记蛋白包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，标记蛋白包含与SEQ ID NO:103的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，标记蛋白包含与SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，标记蛋白包含与SEQ ID NO:113的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，标记蛋白包含SEQ ID NO:100或103的氨基酸序列。在一些实施例中，标记蛋白包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施例中，标记蛋白包含SEQ IDNO:103的氨基酸序列。
在一些实施例中，标记蛋白由与SEQ ID NO:100、103、112或113的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由与SEQ ID NO:100的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由与SEQ ID NO:103的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由与SEQ IDNO:112的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由与SEQ ID NO:113的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，标记蛋白由SEQ ID NO:100、103、112或113的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由SEQ ID NO:100的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由SEQ ID NO:103的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由SEQ ID NO:112的氨基酸序列组成。在一些实施例中，标记蛋白由SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，标记蛋白源自人CD20(hCD20)。在一些实施例中，标记蛋白包含经截短的hCD20蛋白，其包含胞外区(hCD20t)或其功能片段或功能变体。在一些实施例中，hCD20标记蛋白通过施用识别重组细胞的表面上表达的hCD20标记蛋白的抗体而允许耗竭经输注的重组细胞，来提供安全机制。结合hCD20标记蛋白的例示性抗体是利妥昔单抗(rituximab)。
例示性标记蛋白的氨基酸序列在本文的表8中提供。
表8.例示性标记蛋白的氨基酸序列。
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5.6载体
在一个方面，本文提供包含多顺反子表达盒的重组载体，该多顺反子表达盒包含至少三个顺反子。在一些实施例中，多顺反子表达盒包含至少4、5或6个顺反子。在一些实施例中，多顺反子表达盒包含3个顺反子。在一些实施例中，多顺反子表达盒包含4个顺反子。在一些实施例中，多顺反子表达盒包含5个顺反子。在一些实施例中，多顺反子表达盒包含6个顺反子。
在一些实施例中，载体是非病毒载体。例示性非病毒载体包括但不限于质粒DNA、转座子、附加型质粒、微环、微串和寡核苷酸(例如，mRNA、裸DNA)。在一些实施例中，多顺反子载体是DNA质粒载体。
在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体可以是有复制能力的或无复制能力的。病毒载体可以是整合的或非整合的。已经开发了许多基于病毒的系统以用于将基因转移到哺乳动物细胞中，并且本领域普通技术人员可以选择合适的病毒载体。例示性病毒载体包括但不限于腺病毒载体(例如，腺病毒5)、腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV2、3、5、6、8、9)、逆转录病毒载体(MMSV、MSCV)、慢病毒载体(例如，HIV-1、HIV-2)、γ逆转录病毒载体、疱疹病毒载体(例如，HSV1、HSV2)、甲病毒载体(例如，SFV、SIN、VEE、M1)、黄病毒(例如，昆津病毒、西尼罗河病毒、登革病毒)、弹状病毒载体(例如，狂犬病病毒、VSV)、麻疹病毒载体(例如，MV-Edm)、新城疫病毒载体、痘病毒载体(例如，VV)、麻疹病毒和小核糖核酸病毒载体(例如，柯萨奇病毒)。
在一些实施例中，载体或多顺反子表达盒包含一种或多种另外的元件。另外的元件包括但不限于启动子、增强子、聚腺苷酸化(polyA)序列和选择基因。
在一些实施例中，载体包含编码选择标记的多核苷酸序列，该选择标记向其中表达选择标记的细胞赋予特定性状，从而能够人工选择那些细胞。例示性选择标记包括但不限于抗生素抗性基因，例如，对卡那霉素、氨苄西林或三氯生具有抗性。
在一些实施例中，多顺反子表达盒包含转录调控元件。例示性转录调控元件包括但不限于启动子和增强子。在一些实施例中，多顺反子表达盒包含第一5'顺反子的5'的启动子序列。在一些实施例中，启动子包含与SEQ ID NO:150的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，启动子包含SEQ ID NO:150的多核苷酸序列。在一些实施例中，启动子的多核苷酸序列由与SEQ ID NO:150的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列组成。在一些实施例中，启动子的多核苷酸序列由SEQ ID NO:150的多核苷酸序列组成。
在一些实施例中，多顺反子表达盒包含3'末端顺反子的3'的polyA序列。在一些实施例中，polyA序列包含与SEQ ID NO:151的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，polyA序列包含SEQ ID NO:151的核酸序列。在一些实施例中，polyA序列由与SEQ ID NO:151的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，polyA序列由SEQ ID NO:151的核酸序列组成。
例示性启动子的多核苷酸序列和polyA序列提供于本文的表9中。
表9.例示性启动子的多核苷酸序列和polyA序列。
在一些实施例中，多顺反子表达盒包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码与表10A-表10C中所列举的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
表10A.由多顺反子表达盒编码的例示性氨基酸序列。
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表10B.由多顺反子表达盒编码的例示性氨基酸序列
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表10C.由多顺反子表达盒编码的例示性氨基酸序列
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下表11A、表11B和表11C提供例示性多核苷酸序列，其用于构建本公开的载体。如表11A、表11B和表11C所示，本公开的载体可以包括以下序列中的一种或多种：(1)“AP”序列，其编码(i)本文公开的Cα序列和(ii)本文公开的P2A元件序列；(2)“BT”序列，其编码(i)本文公开的Cβ序列和(ii)本文公开的T2A元件序列；(3)“BT15”序列，其编码(i)本文公开的Cβ序列，(ii)本文公开的T2A元件序列，和(iii)本文公开的mbIL15序列；(4)“AT”序列，其编码(i)本文公开的Cα序列和(ii)本文公开的T2A元件序列；(5)“BP”序列，其编码(i)本文公开的Cβ序列和(ii)本文公开的P2A元件序列；(6)“BP15”序列，其编码(i)本文公开的Cβ序列，(ii)本文公开的P2A元件序列，和(iii)本文公开的mbIL15序列；(7)“AP15”序列，其编码(i)本文公开的Cα序列，(ii)本文公开的P2A元件序列，和(iii)本文公开的mbIL15序列；(8)“15T”序列，其编码(i)本文公开的mbIL15序列和(ii)本文公开的T2A元件序列；(9)“AP15T”序列，其编码(i)本文公开的Cα序列，(ii)本文公开的P2A元件序列，(iii)本文公开的mbIL15序列，和(iv)本文公开的T2A元件序列；(10)“AT15”序列，其编码(i)本文公开的Cα序列，(ii)本文公开的T2A元件序列，和(iii)本文公开的mbIL15序列；(11)“15P”序列，其编码(i)本文公开的mbIL15序列，和(ii)本文公开的P2A元件序列；(12)“AT15P”序列，其编码(i)本文公开的Cα序列，(ii)本文公开的T2A元件序列，(iii)本文公开的mbIL15序列，和(iv)本文公开的P2A元件序列；(13)“BP15T”序列，其编码(i)本文公开的Cβ序列，(ii)本文公开的P2A元件序列，(iii)本文公开的mbIL15序列，和(iv)本文公开的T2A元件序列；(14)“BT15P”序列，其编码(i)本文公开的Cβ序列，(ii)本文公开的T2A元件序列，(iii)本文公开的mbIL15序列，和(iv)本文公开的P2A元件序列。
本文提供的核苷酸序列(和其相应的氨基酸序列)可以以任何适当的组合使用。“适当的组合”是如下组合，其中所期望的分子功能由本文公开的一个或多个序列提供。例如，一般来说，本文提供的任何2A元件序列可以提供核糖体跳跃(通过2A元件)的功能，以及任选地弗林蛋白酶介导的切割(通过弗林蛋白酶识别位点)的功能。因此，在替代实施例中，本公开的载体中的“AT”序列可以被本公开的“AP”序列替换。类似地，也可以使用包含Cα区序列和E2A或F2A元件序列的“AE”和“AF”序列。包含Cβ区序列和2A元件序列的“BT”、“BP”、“BE”和“BF”序列也都是可互换的。包含mbIL15序列和2A元件序列的“15T”、“15P”、“15E”和“15F”序列也都是可互换的。另外，TCRα、TCRβ和mbIL15序列的任何组合可以从5'至3'以任何顺序出现在本公开的载体上，并且可以被提供适当的2A元件序列功能(例如核糖体跳跃、弗林蛋白酶切割)的序列分隔开。
因此，本公开的序列以任何适当的组合或5'至3'的顺序提供核糖体跳跃、弗林蛋白酶识别、TCRα功能、TCRβ功能和mbIL15功能。
表11A.用于多顺反子表达盒的例示性多核苷酸序列。
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表11B.用于多顺反子表达盒的例示性多核苷酸序列。
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表11C.用于多顺反子表达盒的例示性多核苷酸序列。
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5.7转座子和转座酶系统
在一些实施例中，重组载体的转基因经由合成DNA可转座元件，例如，DNA转座子/转座酶系统，例如，睡美人(SB)，引入至免疫效应细胞中。SB属于DNA转座子的Tc1/mariner超家族。DNA转座子以一种简单的剪切-粘贴方式从一个DNA位点易位到另一位点。转座是一种精确的工艺，其中将指定的DNA区段从一个DNA分子中切除，并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一位点。
例示性DNA转座子/转座酶系统包括但不限于睡美人(参见例如，US6489458、US8227432，其各自的内容通过引用以其全文并入本文)、piggyBac转座子系统(参见例如，US9228180；Wilson等人,“PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in HumanCells,”Molecular Therapy,15:139-145(2007)，其各自的内容通过引用以其全文并入本文)、piggyBac转座子系统(参见例如，Mitra等人,“Functional characterization ofpiggyBac from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalianDNAtransposon,”Proc.Natl.Acad.Sci USA110:234-239(2013)，其内容通过引用以其全文并入本文)、TcBuster(参见例如，Woodard等人“Comparative Analysis of the RecentlyDiscovered hAT Transposon TcBuster in Human Cells,”PLOS ONE,7(11):e42666(2012年11月)，其内容通过引用以其全文并入本文)和Tol2转座子系统(参见例如，Kawakami,“Tol2:a versatile gene transfer vector in vertebrates,”Genome Biol.2007；8(增刊1):S7，其各自的内容通过引用以其全文并入本文)。另外的例示性转座子/转座酶系统提供于US7148203；US8227432；US20110117072；Mates等人,Nat Genet,41(6):753-61(2009)；以及Ivies等人,Cell,91(4):501-10,(1997)中，这些文献各自的内容通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文描述的转基因经由SB转座子/转座酶系统引入至免疫效应细胞中。SB转座子系统包含SB转座酶和SB转座子。SB转座子系统可包含天然存在的SB转座酶或保留活性的衍生物、变体和/或片段，以及天然存在的SB转座子或保留活性的衍生物、变体和/或片段。例示性SB系统描述于Hackett等人,“A Transposon and TransposaseSystem for Human Application,”Mol Ther 18:674-83,(2010)中，该文献的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，载体包含左反向末端重复序列(ITR)，即，位于表达盒的5'的ITR；和右ITR，即，位于表达盒的3'的ITR。左ITR和右ITR侧接载体的多顺反子表达盒。在一些实施例中，左ITR相对于多顺反子表达盒处于相反方向，而右ITR相对于多顺反子表达盒处于相同方向。在一些实施例中，右ITR相对于多顺反子表达盒处于相反方向，而左ITR相对于多顺反子表达盒处于相同方向。
在一些实施例中，左ITR和右ITR是选自由以下项组成的组的DNA转座子的ITR：睡美人转座子、piggyBac转座子、TcBuster转座子和Tol2转座子。在一些实施例中，左ITR和右ITR是睡美人DNA转座子的ITR。
在一些实施例中，左ITR包含与SEQ ID NO:290或291的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，左ITR包含与SEQ ID NO:290的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，左ITR包含SEQ ID NO:290的多核苷酸序列。在一些实施例中，左ITR包含与SEQ ID NO:291的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，左ITR包含SEQ ID NO:291的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含与SEQ ID NO:292、293或294的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含与SEQ ID NO:292的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含与SEQ ID NO:293的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含与SEQ ID NO:294的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含SEQ ID NO:292的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含SEQ ID NO:293的多核苷酸序列。在一些实施例中，右ITR包含SEQ ID NO:294的多核苷酸序列。
例示性SB ITR的多核苷酸序列提供于本文的表12中。
表12.例示性SB ITR的多核苷酸序列。
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在一些实施例中，DNA转座酶是SB转座酶。在一些实施例中，SB转座酶选自由以下项组成的组：SB11、SB100X、hSB110和hSB81。在一些实施例中，SB转座酶是SB11。例示性SB转座酶描述于US9840696、US20160264949、US9228180、WO2019038197、US10174309和US10570382中，这些文献各自的完整内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，DNA转座酶包含与SEQ ID NO:300的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，DNA转座酶包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列。在一些实施例中，DNA转座酶的氨基酸序列由与SEQ ID NO:300的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，DNA转座酶的氨基酸序列由SEQ ID NO:300的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，DNA转座酶包含缺乏N末端甲硫氨酸的氨基酸序列。在一些实施例中，DNA转座酶包含与缺乏N末端甲硫氨酸(即，SEQ ID NO:300的氨基酸2-340)的SEQ IDNO:300的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，DNA转座酶包含缺乏N末端甲硫氨酸(即，SEQ ID NO:300的氨基酸2-340)的SEQID NO:300的氨基酸序列。在一些实施例中，DNA转座酶的氨基酸序列由与缺乏N末端甲硫氨酸(即，SEQ ID NO:300的氨基酸2-340)的SEQ ID NO:300的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，DNA转座酶的氨基酸序列由缺乏N末端甲硫氨酸(即，SEQ ID NO:300的氨基酸2-340)的SEQ ID NO:300的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，DNA转座酶由与SEQ ID NO:301的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。在一些实施例中，DNA转座酶由SEQ ID NO:301的多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，DNA转座酶由引入至细胞中的多核苷酸编码。在一些实施例中，编码DNA转座酶的多核苷酸是DNA载体。在一些实施例中，编码DNA转座酶的多核苷酸是RNA载体。在一些实施例中，DNA转座酶在第一载体上编码，并且转基因在第二载体上编码。在一些实施例中，将DNA转座酶作为多肽直接引入至细胞群体。
例示性SB转座酶的氨基酸和多核苷酸序列提供于本文的表13中。
表13.例示性SB转座酶的氨基酸和多核苷酸序列。
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5.8免疫效应细胞和工程化方法
在一个方面，本文提供了包含重组载体的细胞，例如免疫效应细胞，该重组载体包含多顺反子表达盒(例如，本文描述的载体)。在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。例如，在某些实施例中，T细胞选自由以下项组成的组：初始T细胞(CD4+或CD8+)；杀伤CD8+T细胞；细胞毒性CD4+T细胞；对应于Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、滤泡辅助性(Tfh)、调节性(Treg)谱系的CD4+T细胞；CD8+细胞毒性T细胞、CD4+细胞毒性T细胞；CD4+辅助T细胞(例如，Th1或Th2细胞)；CD4/CD8双阳性T细胞；肿瘤浸润性T细胞(TIL)；胸腺细胞；记忆T细胞、(例如，中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞或干细胞记忆T细胞)和天然杀伤T细胞，例如，不变的自然杀伤T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD39negCD69neg T细胞或CD8+CD39negCD69neg细胞，如例如以下中所描述：Krishna等人,“Stem-like CD8 T cellsmediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer,”2020370(6522):1328-1334，其通过引用以其全文并入本文。细胞免疫系统的前体细胞(例如，T淋巴细胞的前体)也可用于呈递本文公开的TCR，因为这些细胞可以分化、发育或成熟为效应细胞。因此，在某些实施例中，哺乳动物细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导型多能干细胞)、造血干细胞或淋巴细胞祖细胞。在某些实施例中，造血干细胞或淋巴细胞祖细胞分离和/或富集自例如骨髓、脐带血或外周血。在一些实施例中，免疫效应细胞是CD4+T细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞是CD8+T细胞。在一个方面，本文提供包含本文所述的多顺反子载体的免疫效应细胞群体。在一些实施例中，免疫效应细胞群体包含CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞群体是离体培养物。
在一个方面，本文提供将本文所述的载体引入至多个细胞(例如，免疫效应细胞)中以产生多个工程化细胞(例如，免疫效应细胞)的方法。将载体引入至细胞中的方法是本领域众所周知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入至宿主细胞，例如哺乳动物(例如，人)细胞中。例如，可以通过转染或转导将表达载体转移至宿主细胞中。用于将载体引入至宿主细胞中的例示性方法包括但不限于电穿孔(本文中也称为电转移)、超声处理、磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、通过穿过微流体装置引起的机械变形等，参见例如，Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，经由电穿孔将多顺反子载体引入至免疫效应细胞或免疫效应细胞群体中。替代递送系统包括例如胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在一些实施例中，将多顺反子载体引入至离体、体外或体内的细胞，例如免疫效应细胞的群体中。在一些实施例中，将多顺反子载体引入至离体的细胞，例如免疫效应细胞的群体中。
在一些实施例中，mbIL-15与转基因TCR在T细胞中的共表达产生含有T干细胞记忆细胞(Tscm)的最终药物产品，这些T干细胞记忆细胞能够自我更新并分化成其他效应T细胞亚群。mbIL-15在T细胞上的表达可维持自我更新的T干细胞记忆或T干细胞记忆样(Tscm样)细胞的群体，这些细胞分别由表面标记物表型CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+或CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+定义。在一些实施例中，mbIL-15在T细胞上的表达能够在不存在外部生长和存活因素(即，细胞因子或抗原刺激)的情况下维持如上文所定义的Tscm或Tscm样亚群。
在一些实施例中，与由本文所述的三顺反子载体产生的转基因TCR共表达mbIL-15的T细胞群体包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％ Tscm细胞。在一些实施例中，与由本文所述的三顺反子载体产生的转基因TCR共表达mbIL-15的T细胞群体包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％Tscm样细胞。在一些实施例中，与由本文所述的三顺反子载体产生的转基因TCR共表达mbIL-15的T细胞群体包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％ CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+细胞。在一些实施例中，与由本文所述的三顺反子载体产生的转基因TCR共表达mbIL-15的T细胞群体包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+细胞。
5.8.1免疫效应细胞的来源
可以通过本领域已知的任何合适方法从受试者获得免疫效应细胞。例如，T细胞(例如，CD4+T细胞和CD8+T细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，使用本领域技术人员已知的多种技术从受试者收集的血液中获得免疫效应细胞(例如，T细胞)。在一些实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。通过裂解红细胞和去除单核细胞，例如通过Percoll梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞分离出T细胞。
可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))或培养基中用于后续的处理步骤。可以通过本领域技术人员已知的方法，诸如通过使用半自动“流通”离心机，来完成洗涤步骤。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，诸如例如无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含缓冲液的盐水溶液。替代地，可以除去单采血液成分术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
可以进一步通过正向选择或负向选择技术(例如，抗体包被的珠、流式细胞术等)分离特定的细胞亚群。在一些实施例中，可以进一步通过正向选择或负向选择技术(例如，抗体包被的珠、流式细胞术等)分离特定T细胞亚群，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。
在某些实施例中，哺乳动物细胞是在细胞表面上呈递本文公开的TCR的细胞群体。细胞群体可以是异质的或同质的。在某些实施例中，群体的至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％)是如本文所描述的细胞。在某些实施例中，群体是基本上纯的，其中群体的至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％)是同质的。在某些实施例中，群体是异质的并且包含混合的细胞群体(例如，细胞具有不同的细胞类型、发育阶段、起源，通过不同的方法分离、纯化或富集，用不同的试剂刺激，和/或通过不同的方法工程化)。在某些实施例中，细胞是外周血单核细胞(PBMC)(例如，人PBMC)群体。
根据需要，可以富集或纯化细胞群体。在某些实施例中，调节性T细胞(例如，CD25+T细胞)例如通过使用缀合至表面(诸如珠、颗粒或细胞)的抗CD25抗体从群体中被耗竭。在某些实施例中，抗CD25抗体缀合至荧光染料(例如，用于荧光活化细胞分选)。在某些实施例中，表达检查点受体(例如，CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT、VISTA、BTLA、TIGIT、CD137或CEACAM1)的细胞例如通过使用与缀合至表面(诸如珠、颗粒或细胞)的检查点受体特异性结合的抗体从群体中被耗竭。在某些实施例中，可以选择T细胞群体，使得其表达以下项中的一者或多者：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-13、颗粒酶(例如，颗粒酶B)和穿孔素，或其他合适的分子，例如，其他细胞因子。用于确定此类表达的方法描述于例如PCT公开号：WO 2013/126712中，该文献通过引用以其全文并入本文。
5.8.2制造方法
本文所描述的工程化细胞可通过本领域已知的任何方法制造。例示性方法示于美国专利公开号2020/0347350和国际公开号WO 2019/067242中，这些专利的全部内容通过引用并入。
5.9药物组合物
本文提供了药物组合物，其包含本文公开的工程化免疫效应细胞群体，该工程化免疫效应细胞群体在生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂中具有期望的纯度(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且包括缓冲剂，诸如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文所述的药物组合物可用于诱导受试者中的免疫应答并治疗病症，诸如癌症。在一个实施例中，本公开提供一种包含本文所述的工程化免疫效应细胞群体的药物组合物，其用作药物。在另一实施例中，本公开提供一种用于治疗癌症的方法中的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含在药学上可接受的载体中的本文公开的工程化免疫效应细胞群体和任选的一种或多种另外的预防剂或治疗剂。
药物组合物可以经调配用于向受试者施用的任何途径。施用途径的具体实例包括肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、肌内)。在一些实施例中，药物组合物经调配用于静脉内施用。注射剂可以以常规形式(作为液体溶液或悬浮液)制备。注射剂可含有一种或多种赋形剂。例示性赋形剂包括例如水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其他此类试剂，诸如例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
在一些实施例中，药物组合物经调配用于静脉内施用。用于静脉内施用的合适载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇和其混合物)的溶液。
待用于体内施用的组合物可以是无菌的。这可以通过例如无菌过滤膜进行过滤而容易地实现。
用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载体包括例如水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、多价螯合剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性媒剂的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸林格注射液。非水性肠胃外媒剂包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将呈抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，这些肠胃外制剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵以及苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的多价螯合剂或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性媒剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH值调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。待在药物组合物中采用的精确剂量还将取决于施用途径和所引起的病状的严重程度，并且应根据执业者的判断和每个受试者的情况来决定。例如，有效剂量还可以取决于施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、施用的其他药物或治疗是预防性的还是治疗性的而变化。对治疗剂量进行最佳滴定以优化安全性和功效。
5.10试剂盒
在一个方面，本文提供了试剂盒，其包含本文所述的一种或多种药物组合物、工程化效应细胞(例如，重组细胞)群体、多核苷酸或载体以及使用说明书。此类试剂盒可包括例如载体、包装或容器，其被隔开以容纳一个或多个容器，诸如小瓶、管等。合适的容器包含例如瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施例中，容器由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。
在具体实施例中，本文提供了一种药物试剂盒，其包含一个或多个容器，该一个或多个容器填充有本文所述的药物组合物中的一种或多种成分，本文提供的工程化免疫效应细胞群体、多核苷酸或载体。在一个实施例中，该试剂盒包含药物组合物，该药物组合物包含本文所述的工程化免疫效应细胞群体。在一个实施例中，该试剂盒包含药物组合物，该药物组合物包含根据本文所述的方法进行工程化的免疫效应细胞群体。在一些实施例中，该试剂盒含有本文所述的药物组合物和预防剂或治疗剂。任选地，与此类容器相关联的可以是呈监管药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了制造、使用或销售机构获得的用于人类施用的批准。
6.实例
本公开的实例通过说明和解释的方式来提供，并且不旨在限制本公开的范围。
6.1实例1：转座子质粒的构建
为了改善多基因共表达的同质性和产品的可制造性，构建了包含多顺反子表达盒的重组核酸SB转座子质粒。多顺反子表达盒各自包括可操作地连接至多顺反子多核苷酸的转录调节元件，该多顺反子多核苷酸编码TCR001的TCRα链(本文称为“TCRα”或“A”)、TCR001的TCRβ链(本文称为“TCRβ”或“B”)和膜结合的IL-15/IL-15Rα融合蛋白(本文称为“mbIL15”或“15”)，其各自由弗林蛋白酶识别位点和介导核糖体跳跃以实现单独多肽链的表达的P2A元件或T2A元件分隔开。
本实例中使用的TCR，即TCR001，是嵌合TCR，其具有鼠源性恒定区和在HLA-A*02:01背景下对p53蛋白的R175H突变(其中p53蛋白的位置175从Arg突变为His)具有特异性的人Vα和Vβ区。
简而言之，通过使人Vα区(包括其N末端信号序列(SEQ ID NO:1006)，其在位置2处具有谷氨酸)与通过取代氨基酸位置48处的半胱氨酸、氨基酸位置112处的亮氨酸、氨基酸位置114处的异亮氨酸以及氨基酸位置115处的缬氨酸进行修饰的鼠Cα区(SEQ ID NO:41)融合产生TCRα。通过使人Vβ区(包括其N末端信号序列(SEQ ID NO:2006)，其在位置2处具有丙氨酸)与通过取代氨基酸位置57处的半胱氨酸进行修饰的鼠Cβ(SEQ ID NO:51)融合产生TCRβ。通过将人IL-15(SEQ ID NO:76)经由富含Gly-Ser的接头肽(SEQ ID NO:81)连接至人IL-15Rα(SEQ ID NO:78)构建mbIL15，其IgE信号序列(SEQ ID NO:83)N末端连接至人IL-15。这三种多肽构建体各自的示意图示于图1中，每个构建体从N末端(左)至C末端(右)显示。
为了探索基因/元件顺序对表达和功能的影响，用编码TCRα、TCRβ和mbIL15中的每一个的多核苷酸生成了八个三顺反子多核苷酸表达盒。在每个表达盒中，这三个元件与以下项成对融合：a)编码与P2A元件连接的弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸(SEQ ID NO:11)(本文称为“fP2A”或“P”)，和b)编码与T2A元件连接的弗林蛋白酶识别位点的多核苷酸(SEQID NO:13)(本文称为“fT2A”或“T”)。将所得三顺反子表达盒(包括合适的转录调控元件)插入到睡美人(SB)转座子质粒的ITR之间。每个表达盒和SB质粒的开放阅读框(ORF)中的元件的5'至3'顺序示于表E1中，并且这八个表达盒的ORF的示意图示于图2A中。
表E1.三顺反子SB转座子质粒。
| 质粒名称 | 盒名称 | 元件顺序(5'至3') |
| 质粒APBT15 | 盒APBT15 | TCRα-fP2A-TCRβ-fT2A-mbIL15 |
| 质粒ATBP15 | 盒ATBP15 | TCRα-fT2A-TCRβ-fP2A-mbIL15 |
| 质粒AP15TB | 盒AP15TB | TCRα-fP2A-mbIL15-fT2A-TCRβ |
| 质粒AT15PB | 盒AT15PB | TCRα-fT2A-mbIL15-fP2A-TCRβ |
| 质粒BPAT15 | 盒BPAT15 | TCRβ-fP2A-TCRα-fT2A-mbIL15 |
| 质粒BTAP15 | 盒BTAP15 | TCRβ-fT2A-TCRα-fP2A-mbIL15 |
| 质粒BP15TA | 盒BP15TA | TCRβ-fP2A-mbIL15-fT2A-TCRα |
| 质粒BT15PA | 盒BT15PA | TCRβ-fT2A-mbIL15-fP2A-TCRα |
这些转座子质粒的ORF的多核苷酸序列示于表E2中。
表E2.SB质粒ORF的多核苷酸序列。
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不考虑每个P2A和T2A位点处的N末端信号序列切割或核糖体跳跃，由每个ORF产生的相应理论多肽翻译产物示于表E3中。
表E3.由SB质粒ORF编码的多肽序列。
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出于对照目的，制备三个另外的SB转座子质粒。质粒15含有单顺反子表达盒，即盒15，其编码mbIL15。质粒APB含有双顺反子表达盒，即盒APB，其编码TCRα(5')和TCRβ(3')，具有插入的fP2A元件。质粒BPA含有双顺反子表达盒，即盒BPA，其编码TCRβ(5')和TCRα(3')，具有插入的fP2A元件。这些表达盒，包括合适的转录调控元件，被插入到SB转座子质粒的ITR之间。每个对照表达盒和SB质粒的ORF中的元件的5'至3'顺序示于表E4中，以及这些三个表达盒的ORF的示意图示于图2B中。
表E4.对照SB转座子质粒。
| 质粒名称 | 盒名称 | 元件顺序(5'至3') |
| 质粒15 | 盒15 | mbIL15 |
| 质粒APB | 盒APB | TCRα-fP2A-TCRβ |
| 质粒BPA | 盒BPA | TCRβ-fP2A-TCRα |
还构建了编码SB11转座酶的质粒，即质粒TA。
6.2实例2：T细胞的产生和评估
本实例描述从实例1中所描述的质粒共表达TCRα、TCRβ和mbIL15的T细胞的产生和评估。双转座(使用编码TCRα/TCRβ和mbIL15的单独质粒)和单转座(一起使用编码TCRα/TCRβ和mbIL15的三顺反子质粒)二者的基因转移过程的示意图示于图3中。
简而言之，外周血单核细胞(PBMC)从获自正常供体的白细胞去除术产物中富集(Discovery Life Sciences，Austin,TX)。收集所得的PBMC，冷冻保存，并储存在液氮罐的气相中。
为了产生此实例2中所描述的TCR-T细胞，将实例1中所描述的质粒电穿孔到富集的PBMC中。简而言之，将冷冻保存的PBMC解冻，重悬于补充培养基中，并在37℃/5％CO2培养箱中温育一小时。然后制备表E5中列出的PBMC测试物。
表E5.PBMC测试物。
| 组 | 名称 | 描述 |
| 1 | NT细胞 | 未转座的PBMC |
| 2 | mbIL15细胞 | 用质粒15和质粒TA转座的PBMC |
| 3 | APB细胞 | 用质粒APB和质粒TA转座的PBMC |
| 4 | BPA细胞 | 用质粒BPA和质粒TA转座的PBMC |
| 5 | APB+15细胞 | 用质粒APB、质粒15和质粒TA转座的PBMC |
| 6 | BPA+15细胞 | 用质粒BPA、质粒15和质粒TA转座的PBMC |
| 7 | APBT15细胞 | 用质粒APBT15和质粒TA转座的PBMC |
| 8 | ATBP15细胞 | 用质粒ATBP15和质粒TA转座的PBMC |
| 9 | AP15TB细胞 | 用质粒AP15TB和质粒TA转座的PBMC |
| 10 | AT15PB细胞 | 用质粒AT15PB和质粒TA转座的PBMC |
| 11 | BPAT15细胞 | 用质粒BPAT15和质粒TA转座的PBMC |
| 12 | BTAP15细胞 | 用质粒BTAP15和质粒TA转座的PBMC |
| 13 | BP15TA细胞 | 用质粒BP15TA和质粒TA转座的PBMC |
| 14 | BT15PA细胞 | 用质粒BT15PA和质粒TA转座的PBMC |
测试物如下制备：
第1组：收获静止的细胞，加以离心，重悬于补充培养基中，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
第2组-第14组：收获静置的细胞，加以离心，与表E5中列出的质粒一起重悬于电穿孔缓冲液中并进行电穿孔。电穿孔后，收集细胞悬浮液，转移至补充培养基中，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
电穿孔后24小时内(第1天)，从培养物中收获细胞，加以计数并通过流式细胞术取样以确定mbIL15和TCR转基因表达。简而言之，将每个测试物的最多1×106个细胞首先用人Fc Block(BD Biosciences 564220)在室温下染色10分钟，以减少背景染色。将细胞悬浮液进一步用明亮的染色缓冲液(BD Biosciences 566349)中稀释的荧光染料缀合抗体(列于表1中)在4℃下染色30分钟。使用对TCRb的鼠恒定区具有特异性的PerCP-Cy5.5缀合的抗小鼠TCRb抗体检测TCR表达。使用的其他荧光缀合抗体包括：CD3(克隆OKT-3)、IL-15(34559)、CD8(克隆RPA-T8)和Invitrogen紫色活/死染料(表E6)。
表E6.荧光缀合抗体。
用FACS缓冲液(PBS、2％ FBS、0.1％叠氮化钠)洗涤细胞。使用NovoCyte Quanteon流式细胞仪系统(Agilent)采集数据，并使用FlowJo软件(版本10.7.1；TreeStar，Ashland,OR)进行分析，以确定每个测试物中存在的每个转基因亚群(mbIL15+mTCR+、mbIL15negmTCR+、mbIL15+mTCRneg、mbIL15negmTCRneg)的百分比。除非另有描述，否则基于门控细胞事件、单重态、活细胞事件和CD3+细胞评定转基因表达。
流式细胞术的结果示于图4和表E7中。
表E7.转基因T细胞的第1天电穿孔后的规格和转基因表达。
6.3实例3：扩增的T细胞的产生和评估
本实例描述从实例1中所描述的质粒共表达TCRα、TCRβ和mbIL15的T细胞的产生和评估。除了下文所指示的以外，以类似于实例2中所描述的方式产生本实例3中描述的TCR-T细胞。
简而言之，将冷冻保存的PBMC解冻，重悬于补充培养基(IL-7+IL-15)中，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育一小时。
如上文在表E5中列出的测试物接着如下制备：
第1组：收获静置的细胞，加以离心，重悬于恢复培养基(含有IL-7+IL-15+n-乙酰半胱氨酸(NAC)的50:50培养基)中，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
第2组-第14组：收获静置的细胞，加以离心，与表E5中列出的质粒一起重悬于电穿孔缓冲液中并进行电穿孔。电穿孔后，收集细胞悬浮液，转移至恢复培养基(含有IL-7+IL-15+NAC的50:50培养基)，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
第3组-第14组：电穿孔后24小时内(第1天)，使用mTCR抗体和细胞分离系统(Miltenyi Biotec)分离出mTCR阳性(mTCR+)细胞。将来自第1组和第2组的活细胞以及来自第3组-第14组的富集TCR+的活细胞转移至/>培养板(Wilson WolfManufacturing)，并用第一扩增培养基(含有IL-21+IL-7的50:50培养基)与经照射的同种异体饲养细胞和OKT3抗体一起温育。用细胞因子定期饲养细胞。第一期扩增13天后，收获细胞，并用如实例2中所述的小鼠TCRβ抗体和IL-15抗体在CD3+门控群体上检测mTCR和mbIL15的表达。用NC3000细胞计数器获取细胞计数和存活率。除非另有描述，否则基于门控细胞事件、单重态、活细胞事件和CD3+细胞评定转基因表达。
在以下两个不同的时间点评定每个测试物的mTCR和mbIL15的表达以及细胞存活率：1)电穿孔后(第1天)，和2)第一扩增期后(第13天)。
电穿孔后(第1天)的TCR表达示于图5A-图5B中。图5A提供来自每个测试物的代表性TCR表达数据。图5B提供来自三个供体的TCR表达数据，其表示为CD3+细胞中的mTCR+细胞％。
第一期扩增后(第13天)的TCR和mbIL15表达示于图6A-图6C中。图6A提供来自每个测试物的代表性TCR和mbIL15表达数据。图6B提供来自三个供体的TCR表达数据，其表示为CD3+细胞中的mTCR+细胞％，并且图6C提供CD3+细胞中的TCR+mbIL15+细胞％。
在第一期扩增后(第13天)还评定了TCR+和TCR+mbIL15+细胞数量，如图7A-图7B中所示。图7A提供来自三个供体的TCR表达数据，其表示为mTCR+T细胞的总数，并且图7B提供TCR+mbIL15+T细胞的总数。
图8A和图8B中分别显示了电穿孔后(第1天)和第一期扩增后(第13天)的细胞存活率。
转基因表达数据和细胞计数数据表明，BP15TA和AP15TB是得到具有最高TCR和mbIL15表达水平的mbIL15+TCR+T细胞的最有效候选者。存活率数据表明，不管三顺反子mbIL15+TCR载体(第7组-第14组)的大小，其存活率与双载体共转染系统(第5组和第6组)类似。
如下文所描述，还在第一期扩增后(第13天)测量了TCR-T细胞的功能。
对用不同的多顺反子质粒电穿孔所产生的TCR-T细胞的活化进行评定。第一期扩增13天后，将细胞与具有HLA-A*02:01内源性表达的野生型或突变型新抗原肽脉冲的T2细胞共培养。过夜温育后，收获细胞并用4-1BB抗体检测CD3+CD8+细胞上对4-1BB分子的诱导。结果示于图9A-图9B中，证明mbIL15/TCR-T细胞对靶标新抗原具有高度的亲合性和特异性，如通过4-1BB共刺激受体的上调所测量，其中对野生型序列的识别可忽略不计。使用不同多顺反子质粒产生的mbIL15/TCR-T细胞之间的功能没有显著差异。
还评定了用不同多顺反子质粒电穿孔的TCR-T细胞的磷酸化STAT5水平。第一期扩增13天后，洗涤细胞并在不含细胞因子的50:50培养基中温育过夜，以稳定STAT5的磷酸化。第二天，在CD3+细胞上使用pSTAT5(pY694)检测到STAT5的磷酸化。结果示于图10中，证明所表达的mbIL15具有功能性。IL15信号传导被活化，从而诱导STAT5(IL15受体下游)的磷酸化。使用不同多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞中STAT5的磷酸化在质粒之间没有显著差异，但相对于缺乏mbIL15的仅TCR条件，磷酸化在所有含有mbIL15的质粒中增加。
评定用不同多顺反子质粒电穿孔的TCR-T细胞在活化9天后的细胞凋亡水平。第一期扩增13天后，洗涤细胞并用CD3/CD28(ThermoFisher)活化9天。活化后，用AnnexinV/7ADD试剂盒(Biolegend)监测CD3+TCR+细胞的细胞凋亡。结果示于图11中，证明CD3+TCR+细胞上mbIL15的表达抑制AICD(活化诱导的细胞死亡)，如通过膜联蛋白V和/或PI染色的较少细胞所测量。这种对AICD的抑制在所测试的不同多顺反子质粒之间没有显著差异，与双载体系统(APB+mbIL15和BPA+mbIL15)也没有不同。
如下文所述进行第二扩增期，并评定第二扩增期后的载体拷贝数(VCN)。简而言之，使用mTCR抗体通过MACS分离出来自第3组-14组的T细胞。然后将来自第2组-第14组的T细胞与第二扩增培养基(含有IL-21的50:50培养基)以及经照射的饲养细胞和OKT3抗体一起温育。用细胞因子定期饲养细胞。第二期扩增15天后，收获细胞并使用qPCR检测VCN，作为样品中每个细胞的睡美人转基因DNA拷贝的平均数量。结果示于表E8中，证明两轮扩增后在TCR-T细胞和mbIL15/TCR-T细胞中检测到低水平的载体。
表E8.第二扩增期后的载体拷贝数(VCN)。
| 组 | 名称 | VCN |
| 2 | mbIL15细胞 | 0.3 |
| 3 | APB细胞 | 0.4 |
| 4 | BPA细胞 | 1.4 |
| 5 | APB+15细胞 | 2.6 |
| 6 | BPA+15细胞 | 2.1 |
| 7 | APBT15细胞 | 4.7 |
| 8 | ATBP15细胞 | 4.5 |
| 9 | AP15TB细胞 | 5.3 |
| 10 | AT15PB细胞 | 3.9 |
| 11 | BPAT15细胞 | 1.5 |
| 12 | BTAP15细胞 | 2.1 |
| 13 | BP15TA细胞 | 2.3 |
| 14 | BT15PA细胞 | 2.9 |
结论：本实例中描述的一系列数据表明，BP15TA和AP15TB是产生具有最高TCR和mbIL15表达水平的mbIL15 TCR-T细胞的最有效候选者。所有所评估的表达mbIL15的质粒都增加了STAT5的磷酸化，表明mbIL15以足够的水平表达于T细胞中以引发下游信号传导。此外，mbIL15与转基因TCR的共表达会减少T细胞活化后的AICD。此外，所有所测试的三顺反子mbIL15/TCR质粒都产生了可接受的VCN值。
6.4实例4：具有不同鼠恒定区的多顺反子TCR构建体的评估。
该实例评估不同的鼠恒定区对上文实例1-实例3中所述的TCR构建体的影响。
简而言之，除了每条链的恒定区未被半胱氨酸取代之外，此处检验的TCRα链和TCRβ链的氨基酸序列均与实例1-实例3中所描述的TCRα链和TCRβ链相同。具体说来，通过使人Vα区(包括其N末端信号序列(SEQ ID NO:1006)，其在位置2处具有谷氨酸)与通过取代氨基酸位置112处的亮氨酸、氨基酸位置114处的异亮氨酸以及氨基酸位置115处的缬氨酸进行修饰的鼠Cα区(SEQ ID NO:42)融合产生TCRα链。通过使人Vβ区(包括其N末端信号序列(SEQID NO:2006)，其在位置2处具有丙氨酸)与鼠野生型Cβ(SEQ ID NO:52)融合产生TCRβ链。如实例1-实例3中所述，含有半胱氨酸取代的恒定结构域的构建体在下文中被称为“S型式”，并且含有非半胱氨酸取代的恒定结构域的新生成的构建体在下文中被称为“N型式”。图12中提供了这些构建体的示意图。
统一质粒(下文称为“NU型式”)与“N型式”相比，在TCR恒定区的核苷酸序列方面有所不同。所有“NU型式”均含有编码TCR恒定区(Cα和Cβ)的相同核苷酸序列；然而，由“NU型式”编码的TCR恒定区的氨基酸序列与“N型式”相同。“N型式”和“NU型式”之间不存在其他差异。
为了产生此实例4中所描述的TCR-T细胞，将上文所描述的质粒电穿孔到富集的PBMC中。简而言之，将冷冻保存的PBMC解冻，更换到50:50培养基中并进行电穿孔。然后制备表E9中列出的PBMC测试物。当指示细胞被转座的情况下，将细胞与指示的质粒和质粒TA进行共电穿孔。
表E9.PBMC测试物。
| 组 | 名称 | 描述 |
| 2.1 | NT细胞 | 未转座的PBMC |
| 2.2 | BPA细胞 | 用质粒BPA转座的PBMC |
| 2.3 | BPA-N细胞 | 用N型式的质粒BPA转座的PBMC |
| 2.4 | AP15TB细胞 | 用质粒AP15TB转座的PBMC |
| 2.5 | BP15TA细胞 | 用质粒BP15TA转座的PBMC |
| 2.6 | AP15TB-N细胞 | 用N型式的质粒AP15TB转座的PBMC |
| 2.7 | BP15TA-N细胞 | 用N型式的质粒BP15TA转座的PBMC |
| 2.8 | AP15TB-NU细胞 | 用统一N型式的质粒AP15TB转座的PBMC |
| 2.9 | BP15TA-NU细胞 | 用统一N型式的质粒BP15TB转座的PBMC |
测试物如下制备：
第2.1组：收获细胞，加以离心，重悬于恢复培养基(含有IL-7+IL-15+n-乙酰半胱氨酸(NAC)的50:50培养基)中，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
第2.2组-第2.9组：收获细胞，加以离心，与表E9中列出的质粒一起重悬于电穿孔缓冲液中并进行电穿孔。电穿孔后，收集细胞悬浮液，转移至恢复培养基(含有IL-7+IL-15+NAC的50:50培养基)，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
电穿孔后24小时内(第1天)，将活细胞转移至培养板(Wilson WolfManufacturing)并用第一扩增培养基(含有IL-21+IL-7+IL-12+T Cell TransActTM的50:50培养基)温育。用细胞因子定期饲养细胞。第一期扩增11天后，用mTCR抗体分离出TCR+细胞。将分离的TCR+T细胞转移至/>培养板(Wilson Wolf Manufacturing)并用第二扩增培养基(含有3000IU/ml的IL-2+T Cell TransActTM的50:50培养基)温育。用细胞因子定期饲养细胞。第二期扩增11天或16天后，收获细胞并进行下述各种测定。
评定用不同多顺反子质粒电穿孔的T细胞的转基因表达。在第1天(电穿孔后)、第11天(富集前)(第1期扩增后)、第11天(富集后)和第22天(第2期扩增后)，收获细胞并用小鼠TCRβ抗体和IL-15Rα抗体在CD3+门控群体上检测mTCR和mbIL15的表达。电穿孔后第1天，不同型式的多顺反子质粒之间的TCR表达水平相似(图13A)。在第11天富集之前，与仅TCR相比，mbIL15/TCR T细胞中的TCR表达所呈趋势较低；然而，在第11天富集后TCR表达相当(图13B)。第22天，当收获细胞时，TCR表达相当，多顺反子质粒的“S”和“N”型式之间没有明显差异。发现在整个过程中，在不同型式的多顺反子质粒之间TCR和mbIL15的共表达是相似的(图14-图15)。
针对用不同多顺反子质粒电穿孔的T细胞，评定其总细胞计数(图16A-图16B)和mTCR+细胞计数(图17A-图17B)的倍数扩增。倍数扩增值计算为：第11天的细胞数量/第1天的细胞数量(图16A)和第22天的细胞数量/第11天的细胞数量(图16B)。在第一期扩增和第二期扩增期间，用mbIL15/TCR三顺反子质粒转座的细胞的扩增量往往小于用仅TCR双顺反子质粒转座的细胞。然而，所有组都实现了显著程度的扩增，并且不同型式的多顺反子质粒之间没有观察到差异。mTCR+细胞数量计算为：总细胞数量×CD3群体(％)×mTCR群体(％)。
上述转基因表达和细胞生长数据表明，使用N型式和NU型式的多顺反子质粒产生的细胞与使用S型式的多顺反子质粒产生的细胞在表型上没有差异。
为了进行下文所述的pSTAT5测定、4-1BB诱导测定和IFN-γ测定，将第二扩增期延长至16天(由于逻辑载量(logistic load))。第27天时，用pSTAT5(pY694)在CD3+细胞上检测到T细胞中STAT5的磷酸化。图18中所示的pSTAT5数据表明，所表达的mbIL15具有功能性。IL15信号传导被活化，从而诱导STAT5(IL15受体下游)的磷酸化。用不同型式的多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞中的STAT5的磷酸化没有显著差异。与单独表达TCR的细胞相比，共表达mbIL15和TCR的细胞中的磷酸化STAT5的水平呈较高趋势。
为了评定所产生的TCR-T细胞的抗原特异性活化，在第二期扩增16天后，将所产生的TCR-T细胞与野生型或突变型新抗原脉冲的DC(HLA匹配)进行过夜共培养，并且测量4-1BB诱导和IFN-γ分泌。用4-1BB抗体检测CD3+CD8+细胞上4-1BB的诱导。通过ELISA(克隆2G1和B133.5，Thermo Fisher)测量IFN-γ的分泌。示于图19A中的4-1BB诱导结果以及示于图19B中的IFN-γ分泌结果表明，用不同型式的多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞的功能没有显著差异。
进行长期撤除(LTWD)测定以检验在无细胞因子条件下培养的T细胞的转基因表达、存活和活化。LTWD测定如下进行。将第22天(第一期扩增和第二期扩增后)的工程化T细胞转移至T25烧瓶中，并在无细胞因子的培养基(50:50)中培养4周。每周更换培养基中的50％。对于对照组(第2.2组和第2.3组，表E9)，每周用300U/ml IL-2处理两次细胞，同时更换培养基中的50％。使用NovoCyte Quanteon流式细胞仪系统(Agilent)采集流式数据，并使用FlowJo软件(版本10.7.1；TreeStar，Ashland,OR)进行分析。(数据n＝4，汇总自2个独立实验)
在4周LTWD温育后，用小鼠TCRβ抗体在CD3+门控群体上检测mTCR的表达(图20A)并获取细胞计数和存活率(图20B)。此mTCR表达和细胞计数数据表明，使用不同型式的多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞之间没有显著差异。在所有组中在长期细胞因子撤除后存活细胞的数量均减少，但来自共表达mbIL15和TCR的组的细胞与来自仅TCR的组的细胞相比存活率高5-6倍。
LTWD培养后TCR-T细胞的活化通过与野生型或突变型新抗原(10μg/mL)脉冲的DC(HLA匹配)共培养过夜后的4-1BB诱导和IFN-γ分泌来评定。如上文所述，用4-1BB抗体检测CD8+T细胞上对4-1BB的诱导(图21A-图21B)，并且通过ELISA测量IFN-γ分泌(图22A-图22B)。这些数据表明，在LTWD培养中存活下来的mbIL15 TCR-T细胞保留了其特定功能，并且比来自对照仅TCR组(IL-2处理)的T细胞表现出更有效的活化；然而，用不同型式的多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞的功能没有显著差异。
还评定了用不同多顺反子载体电穿孔的TCR-T细胞的记忆表型。T细胞记忆亚群定义为：CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+＝干细胞记忆样(Tscm样)；CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+＝干细胞记忆(Tscm)；CD45RA-CD45RO+CD62L+CD95+＝中枢记忆(Tcm)；CD45RA-CD45RO+CD62L-CD95+＝效应记忆(Tem)。T细胞效应子(Teff)定义为CD45RA+CD45RO+CD62L-CD95+。图23A-图23C中的饼图显示用测试质粒转座的细胞中在第一期扩增后第11天(图23A)、第二期扩增后第22天(图23B)以及LTWD培养4周后(图23C)的活CD3+T细胞记忆和效应子亚群的平均频率。
记忆表型数据显示TCR-T记忆和效应子分化的动力学。在扩增后第11天和第22天，不同的多顺反子TCR质粒之间没有差异(图23A-图23B)。相对于不具有mbIL15的TCR-T细胞，表达mbIL15的TCR-T细胞中Tscm和Teff细胞较多，而Tcm细胞较少。在不存在或存在IL-2的情况下培养4周后，TCR-T细胞主要分化成Teff细胞(超过85％)。表达mbIL15的TCR-T细胞在不存在细胞因子的情况下被培养4周，分化成3个主要亚群：Teff细胞、Tscm样细胞和Tscm细胞(图23C)。这些结果表明mbIL15足以支持Tscm表型。
结论：由不同型式的多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞显示出相当的特征，包括TCR表达、记忆表型、特异性和IFN-γ分泌。该数据支持去除第一代载体中所使用的小鼠恒定结构域中的半胱氨酸取代以及使用统一的小鼠恒定区不会在mbIL15 TCR-T细胞产物中产生任何显著变化。
6.5实例5：使用各种三顺反子TCR/mbIL15载体产生的T细胞的产生和评估
本实例描述对表达mbIL15以及使用如下所述的三顺反子载体产生的不同TCRα/TCRβ链的T细胞的评估。与实例4中描述的载体类似，本实例中使用的三顺反子表达盒各自包括可操作地连接至多顺反子多核苷酸的转录调控元件，该多顺反子多核苷酸编码TCRα链(本文称为“TCRα”或“A”)、TCRβ链(本文称为“TCRβ”或“B”)和膜结合的IL-15/IL-15Rα融合蛋白(本文称为“mbIL15”或“15”)，其各自由弗林蛋白酶识别位点和介导核糖体跳跃以实现单独多肽链的表达的P2A元件或T2A元件分隔开。
本实例中使用的九个TCR各自针对不同的靶标，如表E10中所示。所列出的九个TCR中的每一个的Vα氨基酸序列和Vβ氨基酸序列对应于表6中所提供的序列。通过使Vα序列与通过取代氨基酸位置112处的亮氨酸、氨基酸位置114处的异亮氨酸和氨基酸位置115处的缬氨酸进行修饰的鼠Cα区(SEQ ID NO:42)融合产生每个TCRα链。通过使Vβ序列与鼠野生型Cβ(SEQ ID NO:52)融合产生每个TCRβ链。
表E10.TCR靶标。
对于上述TCR中的每一个，构建并评估了三个载体：1)仅TCR(BA)；2)A15B；和3)B15A。仅TCR(BA)载体含有双顺反子表达盒，其编码TCRβ链和TCRα链的，这些链由弗林蛋白酶识别位点和P2A元件分隔开，按以下从5'至3'的方向：TCRβ-TCRα。AP15TB载体含有三顺反子表达盒，其编码TCRα链、TCRβ链和mbIL15，按以下从5'至3'的方向：TCRα-mbIL15-TCRβ。BP15TA载体含有三顺反子表达盒，其编码TCRα链、TCRβ链和mbIL15，按以下从5'至3'的方向：TCRβ-mbIL15-TCRα。
除了下文所指示的以外，以类似于实例2-实例4中所描述的方式产生本实例中描述的TCR-T细胞。当指示细胞被转座的情况下，除非另有说明，否则将细胞与指示的质粒以及质粒TA或类似的转座酶表达质粒进行共电穿孔。
简而言之，将冷冻保存的PBMC解冻，重悬于50:50培养基中并置于37℃/5％ CO2培养箱中，之后进行电穿孔。
然后制备如表E11中列出的测试物。
表E11.PBMC测试物。
| 组 | TCR | 名称 | 描述 |
| 3.1 | 无 | NT | 未转座的PBMC |
| 3.2 | TCR001 | BPA-N1 | 用TCR001 BPA-N转座的PBMC |
| 3.3 | TCR001 | AP15TB-NU2 | 用TCR001 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.4 | TCR001 | BP15TA-NU3 | 用TCR001 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.5 | TCR057 | BPA-N | 用TCR057 BPA-N转座的PBMC |
| 3.6 | TCR057 | AP15TB-NU | 用TCR057 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.7 | TCR057 | BP15TA-NU | 用TCR057 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.8 | TCR009 | BPA-N | 用TCR009 BPA-N转座的PBMC |
| 3.9 | TCR009 | AP15TB-NU | 用TCR009 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.10 | TCR009 | BP15TA-NU | 用TCR009 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.11 | TCR016 | BPA-N | 用TCR016 BPA-N转座的PBMC |
| 3.12 | TCR016 | AP15TB-NU | 用TCR016 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.13 | TCR016 | BP15TA-NU | 用TCR016 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.14 | 无 | NT | 未转座的PBMC |
| 3.15 | TCR022 | BPA-N | 用TCR022 BPA-N转座的PBMC |
| 3.16 | TCR022 | AP15TB-NU | 用TCR022 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.17 | TCR022 | BP15TA-NU | 用TCR022 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.18 | TCR075 | BPA-N | 用TCR075 BPA-N转座的PBMC |
| 3.19 | TCR075 | AP15TB-NU | 用TCR075 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.20 | TCR075 | BP15TA-NU | 用TCR075 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.21 | TCR055 | BPA-N | 用TCR055 BPA-N转座的PBMC |
| 3.22 | TCR055 | AP15TB-NU | 用TCR055 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.23 | TCR055 | BP15TA-NU | 用TCR055 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.24 | TCR064 | BPA-N | 用TCR064 BPA-N转座的PBMC |
| 3.25 | TCR064 | AP15TB-NU | 用TCR064 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.26 | TCR064 | BP15TA-NU | 用TCR064 BP15TA-NU转座的PBMC |
| 3.27 | 无 | NT | 未转座的PBMC |
| 3.28 | TCR077 | BPA-N | 用TCR077 BPA-N转座的PBMC |
| 3.29 | TCR077 | AP15TB-NU | 用TCR077 AP15TB-NU转座的PBMC |
| 3.30 | TCR077 | BP15TA-NU | 用TCR077 BP15TA-NU转座的PBMC |
1使用与实例4中的BPA-N组相同的质粒产生。
2使用与实例4中的AP15TB-NU组相同的质粒产生。
3使用与实例4中的BP15TA-NU组相同的质粒产生。
测试物以三批如下制备(批次1＝第3.1组-第3.13组；批次2＝第3.14组-第3.26组；批次3＝第3.27组-第3.30组)：
第3.1组、第3.14组和第3.27组：收获细胞，加以离心，重悬于恢复培养基(含有IL-7+IL-15+n-乙酰半胱氨酸(NAC)的50:50培养基)中，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
第3.2组-第3.13组、第3.15组-第3.26组和第3.28组-第3.30组：收获细胞，加以离心，与表E10中列出的质粒一起重悬于电穿孔缓冲液中并进行电穿孔。电穿孔后，收集细胞悬浮液，转移至恢复培养基(含有IL-7+IL-15+NAC的50:50培养基)，并在37℃/5％ CO2培养箱中温育过夜。
电穿孔后24小时内(第1天)，将活细胞转移至培养板(Wilson WolfManufacturing)并用第一扩增培养基(含有IL-21+IL-7+IL-12+T Cell TransActTM的50:50培养基)温育。用细胞因子定期饲养细胞。第一期扩增11天后，用mTCR抗体分离出TCR+细胞。将分离的TCR+T细胞转移至/>培养板(Wilson Wolf Manufacturing)并用第二扩增培养基(含有3000U/ml的IL-2+T Cell TransActTM的50:50培养基)温育。在此第二扩增期期间，用细胞因子定期饲养细胞。第二期扩增11天或16天后，收获细胞并进行下述各种测定。
评定用不同多顺反子质粒电穿孔的T细胞的转基因表达。在第1天(电穿孔后)、第11天(第1期扩增后)和第22天(第2期扩增后)，收获细胞并用小鼠TCRβ抗体和IL-15Rα抗体在CD3+门控群体上检测mTCR和mbIL15的表达。结果示于图24-图28中。
针对用不同多顺反子质粒电穿孔的T细胞，评定其总细胞计数和mTCR+细胞计数的倍数扩增。倍数扩增值计算为：第11天的细胞数量/第1天的细胞数量和第22天的细胞数量/第11天的细胞数量。mTCR+细胞数量计算为：总细胞数量×CD3群体(％)×mTCR群体(％)。结果示于表E12中。
表E12.第一扩增期和第二扩增期期间的总细胞和mTCR+细胞计数的倍数扩增。
如转基因表达和细胞生长数据所表明，使用含有不同TCR序列的多顺反子质粒产生的细胞在表型上彼此没有差异。
为了评定所产生的TCR-T细胞的活化，在第二期扩增16天后，将所产生的TCR-T细胞与野生型或突变型新抗原脉冲的DC(HLA匹配)进行过夜共培养，并且测量4-1BB诱导和IFN-γ分泌。用4-1BB抗体检测CD3+CD8+细胞上4-1BB的诱导。用ELISA抗体对测量IFN-γ的分泌。4-1BB诱导结果示于图29A-图29I中，而IFN-γ分泌结果示于图30A-图30I中。结果表明，当用其同源新抗原攻击时，mbIL-15TCR-T细胞对靶标新抗原具有高度亲合性和特异性，如通过4-1BB共刺激受体的上调和IFN-γ的分泌所测量，其中对野生型序列的识别可忽略不计。
从电穿孔到TCR审查的第二扩增期的所有数据都表明，用一个质粒表达TCRα、TCRβ和mbIL15的三顺反子系统成功产生了mbIL15 TCR-T细胞，并且所产生的mbIL15TCR-T细胞的特征在转基因表达、细胞生长和功能特异性(4-1BB诱导和IFN-γ分泌)方面与TCR-T细胞相当。
针对用编码如上文所述产生的TCR001+/-mbIL15的多顺反子质粒电穿孔的T细胞，评定TCR-T细胞的细胞溶解活性(过夜恢复+11天第一期扩增+11天第二期扩增)，然后在第22天收获并冷冻。在实验当天，将冷冻的第22天TCR-T细胞解冻并在含有3000U/ml的IL-2的培养基中恢复3天。然后，将回收的TCR-T细胞与AU565(Mut+HLAneg)或Tyk-nu(Mut+HLA+)细胞一起温育。过夜温育后，对剩余的T细胞进行彻底洗涤，并使用基于CellTiter Glo发光的测定法测量TCR特异性细胞溶解后留在培养物中的存活细胞的程度。结果示于图31中。
根据减去背景的值将特异性裂解计算为：
针对用编码如上文所述产生的TCR022+/-mbIL15或TCR075+/-mbIL15的多顺反子质粒电穿孔的T细胞，还评定TCR-T细胞的细胞溶解活性(过夜恢复+11天第一期扩增+11天扩增)，然后在第22天收获并冷冻。在实验当天，将冷冻的第22天TCR-T细胞解冻并在含有3000U/ml的IL-2的培养基中恢复3天。同时，将Saos-2细胞接种于96孔板中。过夜温育后，将HLA*11:01质粒转染至Saos-2细胞中，并在第二天，将WT或MUT新抗原肽(1ug/ml)加载到经转染的Saos-2细胞上持续2小时。然后，将回收的TCR-T细胞与所得Saos-2细胞一起温育过夜。过夜温育后，对剩余的T细胞进行彻底洗涤，并使用基于CellTiter Glo发光的测定法测量TCR特异性细胞溶解后留在培养物中的存活细胞的程度。结果示于图32A-图32B中。
根据减去背景的值将特异性裂解计算为：
细胞溶解活性数据表明，使用三顺反子系统产生的mbIL15 TCR-T细胞对靶肿瘤细胞表现出特异性裂解活性。
进行长期撤除(LTWD)测定以检验在无细胞因子条件下培养的T细胞的转基因表达、存活和活化。LTWD测定如下进行。将第22天(第一期扩增后和第二期扩增后)的工程化T细胞转移至T25烧瓶中，并在无细胞因子的培养基(50:50)中培养4周。每周更换培养基中的50％。对于对照仅TCR(BA)组，每周用300U/ml IL-2处理两次细胞，同时更换培养基中的50％。使用NovoCyte Quanteon流式细胞仪系统(Agilent)采集流式数据，并使用FlowJo软件(版本10.7.1；TreeStar，Ashland,OR)进行分析。(数据n＝4，汇总自2个独立实验)
在4周LTWD温育后，用小鼠TCRβ抗体在CD3+门控群体上检测mTCR的表达(图33)并获取细胞计数和存活率(图34A-图34C)。此mTCR表达和细胞计数数据表明，使用不同多顺反子质粒产生的mbIL15 TCR-T细胞之间没有显著差异。在所有组中在长期细胞因子撤除后存活细胞的数量均减少，但来自共表达mbIL15和TCR的组的细胞与来自仅TCR的组的细胞相比存活率高5-6倍。
LTWD培养后TCR-T细胞的活化通过与野生型或突变型新抗原脉冲的DC(HLA匹配)共培养过夜后的4-1BB诱导和IFN-γ分泌来评定。如上文所述，用4-1BB抗体检测CD3+CD8+细胞上对4-1BB的诱导(图35A-图35I)并且用ELISA抗体对测量IFN-γ分泌(图36A-图36C)。关于针对第27天和LTWD后收获的T细胞所评定的4-1BB诱导的比较示于图37A-图37I中。这些数据表明，在LTWD培养中存活下来的mbIL15 TCR-T细胞仍具有功能性，并且比来自仅TCR组的细胞被更强地活化。数据还表明，在4周细胞因子撤除(LTWD)后，mbIL15 TCR-T细胞与第二扩增期后的那些细胞相比，显示出对4-1BB甚至更有效的诱导。
还评定了用不同多顺反子载体电穿孔的TCR-T细胞的记忆表型。T细胞记忆亚群定义为：CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+＝干细胞记忆样(Tscm样)；CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+＝干细胞记忆(Tscm)；CD45RA-CD45RO+CD62L+CD95+＝中枢记忆(Tcm)；CD45RA-CD45RO+CD62L-CD95+＝效应记忆(Tem)。T细胞效应子(Teff)定义为CD45RA+CD45RO+CD62L-CD95+。表E13和表E14中的数据以及图38-图40中的代表性饼图显示用测试质粒转座的细胞中在第11天(扩增后)(表E13和图38)、第22天(扩增后)(表E14和图39)以及LTWD培养4周后(图40A-图40E)活CD3+T细胞记忆和效应子亚群的平均频率。
表E13.D11时工程化T细胞的记忆表型。
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表E14.D22时工程化T细胞的记忆表型。
记忆表型数据显示TCR-T记忆和效应子分化的动力学。向TCR-T细胞添加mbIL15导致扩增产物中的记忆表型发生变化，相对于传统TCR-T细胞，该扩增产物含有更少的中枢记忆细胞(Tcm)，以及更多的效应(Teff)和干细胞记忆(Tscm)群体。在存在IL-2的情况下培养4周后，TCR-T细胞主要分化成Teff细胞。表达mbIL15的TCR-T细胞在不存在细胞因子的情况下被培养4周，分化成3个主要亚群：Teff细胞、Tscm样细胞和Tscm细胞。这些结果表明mbIL15足以引导T细胞分化为Tscm表型。
结论：使用18种不同的构建体(2个不同方向；AP15TB和BP15TAX 9TCR)成功产生了mbIL15 TCR-T细胞。向TCR-T细胞添加mbIL15导致扩增产物中的记忆表型发生变化，相对于传统TCR-T细胞，该扩增产物含有更少的中枢记忆细胞(Tcm)，以及更多的效应(Teff)和干细胞记忆(Tscm)群体。此外，长期撤除细胞因子支持(LTWD)表明一部分mbIL15 TCR-T细胞的存活率显著高于缺乏mbIL15的TCR-T细胞的存活率。对留存的mbIL15 TCR-T细胞的功能和表型评估揭示，这些细胞保留了其功能性新抗原特异性和效力，同时显示出多数TscmTCR-T细胞能够再生TCR-T细胞效应子池。这表明mbIL15 TCR-T细胞可能会建立长寿命的肿瘤特异性TCR-T细胞，其有可能克服肿瘤微环境或其他负调节因子的抑制。该非临床数据支持mbIL15 TCR-T细胞平台的临床应用，并提供证据表明该策略可以引起癌症治疗的功效改善。
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本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上，除了所描述的那些之外，根据前面的描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)通过引用以其全文并出于所有目的并入本文，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)被具体地和单独地指出通过引用以其全文并入用于所有目的。
其他实施例在以下权利要求范围内。
Claims (184)
1.一种包含多顺反子表达盒的重组载体，其中所述多顺反子表达盒包含可操作地连接至多顺反子多核苷酸的转录调控元件，所述多顺反子多核苷酸包含：
a.第一多核苷酸序列，其编码包含α链可变(Vα)区和α链恒定(Cα)区的T细胞受体(TCR)α链；
b.第二多核苷酸序列，其包含第一2A元件；
c.第三多核苷酸序列，其编码包含β链可变(Vβ)区和β链恒定(Cβ)区的TCRβ链；
d.第四多核苷酸序列，其包含第二2A元件；以及
e.第五多核苷酸序列，其编码包含IL-15或其功能片段或功能变体和IL-15Rα或其功能片段或功能变体的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第一2A元件和所述第二2A元件中的任一者或两者独立地是P2A元件、T2A元件、F2A元件或E2A元件。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第一2A元件是P2A元件。
4.根据权利要求2或3所述的重组载体，其中所述P2A元件包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:18或20的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ IDNO:18或20的氨基酸序列。
5.根据权利要求2或3所述的重组载体，其中所述P2A元件包含与SEQ ID NO:19或21的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
6.根据权利要求1或3至5中任一项所述的重组载体，其中所述第二2A元件是T2A元件。
7.根据权利要求2或6所述的重组载体，其中所述T2A元件包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ IDNO:22或24的氨基酸序列。
8.根据权利要求2或6所述的重组载体，其中所述T2A元件包含与SEQ ID NO:23或25的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组载体，其中所述第二多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列中的任一者或两者独立地编码弗林蛋白酶识别位点。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其中所述弗林蛋白酶识别位点包含：SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的重组载体，其中所述弗林蛋白酶识别位点由SEQ ID NO:3或5的多核苷酸序列或者含有1、2或3个核苷酸修饰的SEQ ID NO:3或5的多核苷酸序列编码。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组载体，其中所述第二多核苷酸序列包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的重组载体，其中所述第二多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:11的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的重组载体，其中所述第四多核苷酸序列包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:12的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的重组载体，其中所述第四多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:13的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组载体，其中所述IL-15或其功能片段或功能变体包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的重组载体，其中所述IL-15或其功能片段或功能变体由与SEQ ID NO:77的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的重组载体，其中所述IL-15Rα或其功能片段或功能变体包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至15中任一项所述的重组载体，其中所述IL-15Rα或其功能片段或功能变体由与SEQ ID NO:79的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组载体，其中所述IL-15或其功能片段或功能变体经由肽接头可操作地连接至所述IL-15Rα或其功能片段或功能变体。
21.根据权利要求20所述的重组载体，其中所述肽接头包含：SEQ ID NO:81的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
22.根据权利要求20所述的重组载体，其中所述肽接头由与SEQ ID NO:82的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的重组载体，其中所述融合蛋白是膜结合的。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的重组载体，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO:70或73的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的重组载体，其中所述融合蛋白由与SEQ ID NO:71或74的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的重组载体，其中所述Cα区包含与SEQ ID NO:40-49的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的重组载体，其中所述Cα区由与SEQ ID NO:55、57或58的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
28.根据权利要求1至26中任一项所述的重组载体，其中所述Cβ区包含与SEQ ID NO:50-54或60的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
29.根据权利要求1至26中任一项所述的重组载体，其中所述Cβ区由与SEQ ID NO:56或59的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列。
31.根据权利要求30所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；或者所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列。
32.根据权利要求31所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:230的多核苷酸序列；所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；或者所述第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:232的多核苷酸序列。
33.根据权利要求30所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ IDNO:161的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列。
34.根据权利要求30所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:180或210的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:181的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列。
35.根据权利要求33所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:230的多核苷酸序列；并且所述第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:232的多核苷酸序列。
36.根据权利要求35所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:250或270的多核苷酸序列；并且所述第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:252的多核苷酸序列。
37.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列。
38.根据权利要求37所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；或者所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列。
39.根据权利要求38所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:233的多核苷酸序列；所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；或者所述第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:235的多核苷酸序列。
40.根据权利要求37所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ IDNO:163的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列。
41.根据权利要求37所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:182或212的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQID NO:183的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列。
42.根据权利要求40所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:233的多核苷酸序列；并且所述第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:235的多核苷酸序列。
43.根据权利要求41所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:253或273的多核苷酸序列；并且所述第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:255的多核苷酸序列。
44.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第三多核苷酸序列。
45.根据权利要求44所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:169的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；或者所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第九组合多核苷酸序列。
46.根据权利要求45所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:230的多核苷酸序列；所述第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:236的多核苷酸序列；所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；或者所述第九组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:238的多核苷酸序列。
47.根据权利要求44所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第九组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
48.根据权利要求44所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:184或214的氨基酸序列的第九组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
49.根据权利要求47所述的重组载体，其中所述第九组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:238的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
50.根据权利要求48所述的重组载体，其中所述第九组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:258或278的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
51.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第三多核苷酸序列。
52.根据权利要求51所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:167的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；或者所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:165的氨基酸序列的第十二组合多核苷酸序列。
53.根据权利要求52所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:233的多核苷酸序列；所述第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:239的多核苷酸序列；所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；或者所述第十二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:241的多核苷酸序列。
54.根据权利要求51所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:165的氨基酸序列的第十二组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
55.根据权利要求51所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:185或215的氨基酸序列的第十二组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
56.根据权利要求54所述的重组载体，其中所述第十二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:241的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
57.根据权利要求55所述的重组载体，其中所述第十二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:261或281的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
58.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列。
59.根据权利要求58所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；或者所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:167的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列。
60.根据权利要求59所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:233的多核苷酸序列；所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:234的多核苷酸序列；或者所述第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:239的多核苷酸序列。
61.根据权利要求58所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ IDNO:167的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列。
62.根据权利要求58所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:186的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ IDNO:187或217的氨基酸序列的第十组合多核苷酸序列。
63.根据权利要求61所述的重组载体，其中所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:234的多核苷酸序列；并且所述第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:239的多核苷酸序列。
64.根据权利要求62所述的重组载体，其中所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:254的多核苷酸序列；并且所述第十组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:259或279的多核苷酸序列。
65.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列。
66.根据权利要求65所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；或者所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:169的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列。
67.根据权利要求66所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:230的多核苷酸序列；所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:231的多核苷酸序列；或者所述第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:236的多核苷酸序列。
68.根据权利要求65所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ IDNO:169的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列。
69.根据权利要求65所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:188的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ IDNO:189或219的氨基酸序列的第七组合多核苷酸序列。
70.根据权利要求68所述的重组载体，其中所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:231的多核苷酸序列；并且所述第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:236的多核苷酸序列。
71.根据权利要求69所述的重组载体，其中所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:251的多核苷酸序列；并且所述第七组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:256或276的多核苷酸序列。
72.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第一多核苷酸序列。
73.根据权利要求72所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第六组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；或者所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:170的氨基酸序列的第十三组合多核苷酸序列。
74.根据权利要求73所述的重组载体，其中所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:234的多核苷酸序列；所述第六组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:235的多核苷酸序列；所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；或者所述第十三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:242的多核苷酸序列。
75.根据权利要求72所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:170的氨基酸序列的第十三组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
76.根据权利要求72所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:190的氨基酸序列的第十三组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
77.根据权利要求75所述的重组载体，其中所述第十三组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:242的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
78.根据权利要求76所述的重组载体，其中所述第十三组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:262的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
79.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第一多核苷酸序列。
80.根据权利要求79所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第五多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第三组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；或者所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第十四组合多核苷酸序列。
81.根据权利要求80所述的重组载体，其中所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:231的多核苷酸序列；所述第三组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:232的多核苷酸序列；所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；或者所述第十四组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:243的多核苷酸序列。
82.根据权利要求79所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第十四组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
83.根据权利要求79所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:191的氨基酸序列的第十四组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
84.根据权利要求82所述的重组载体，其中所述第十四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:243的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
85.根据权利要求83所述的重组载体，其中所述第十四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:263的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
86.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第五多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第一多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第三多核苷酸序列。
87.根据权利要求86所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；或者所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列。
88.根据权利要求87所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:233的多核苷酸序列；或者所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列。
89.根据权利要求86所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
90.根据权利要求86所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:182或212的氨基酸序列的第四组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
91.根据权利要求89所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:233的多核苷酸序列；并且所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
92.根据权利要求90所述的重组载体，其中所述第四组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:253或273的多核苷酸序列；所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
93.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第五多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第三多核苷酸序列。
94.根据权利要求93所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；或者所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列。
95.根据权利要求94所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:230的多核苷酸序列；或者所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列。
96.根据权利要求93所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
97.根据权利要求93所述的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:180或210的氨基酸序列的第一组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
98.根据权利要求96所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:230的多核苷酸序列；所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:59的多核苷酸序列。
99.根据权利要求97所述的重组载体，其中所述第一组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:250或270的多核苷酸序列；所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且所述第三多核苷酸序列包含SEQ ID NO:56的多核苷酸序列。
100.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第五多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列、所述第三多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列和所述第一多核苷酸序列。
101.根据权利要求100所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；或者所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列。
102.根据权利要求101所述的重组载体，其中所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:231的多核苷酸序列；或者所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列。
103.根据权利要求100所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:168的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
104.根据权利要求100所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:188的氨基酸序列的第二组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:172的氨基酸序列的第十一组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
105.根据权利要求103所述的重组载体，其中所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:231的多核苷酸序列；所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
106.根据权利要求104所述的重组载体，其中所述第二组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:251的多核苷酸序列；所述第十一组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:240的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
107.根据权利要求1至29中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸按从5'至3'的顺序包含：所述第五多核苷酸序列、所述第四多核苷酸序列、所述第三多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第一多核苷酸序列。
108.根据权利要求107所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；或者所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列。
109.根据权利要求108所述的重组载体，其中所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:234的多核苷酸序列；或者所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列。
110.根据权利要求107所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
111.根据权利要求107所述的重组载体，其中所述第三多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:186的氨基酸序列的第五组合多核苷酸序列；所述第五多核苷酸序列和所述第四多核苷酸序列一起包含编码SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第八组合多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列编码SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列。
112.根据权利要求110所述的重组载体，其中所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:234的多核苷酸序列；所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:57的多核苷酸序列。
113.根据权利要求111所述的重组载体，其中所述第五组合多核苷酸序列包含SEQ IDNO:254的多核苷酸序列；所述第八组合多核苷酸序列包含SEQ ID NO:237的多核苷酸序列；并且所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或58的多核苷酸序列。
114.根据权利要求1至113中任一项所述的重组载体，其中所述多顺反子多核苷酸进一步包含
f.第六多核苷酸序列，其包含第三2A元件；以及
g.第七多核苷酸序列，其包含标记蛋白。
115.根据权利要求114所述的重组载体，其中所述第三2A元件是P2A元件、T2A元件、F2A元件或E2A元件。
116.根据权利要求114或115中任一项所述的重组载体，其中所述标记蛋白包含：HER1的结构域III或其功能片段或功能变体；HER1的结构域IV的N末端部分；以及CD28的跨膜结构域或其功能片段或功能变体。
117.根据权利要求116所述的重组载体，其中所述HER1的结构域III或其功能片段或功能变体包含与SEQ ID NO:104的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
118.根据权利要求116所述的重组载体，其中所述HER1的结构域IV的N末端部分包含SEQ ID NO:105的氨基酸1-40、1-39、1-38、1-37、1-36、1-35、1-34、1-33、1-32、1-31、1-30、1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11或1-10。
119.根据权利要求116所述的重组载体，其中所述HER1的结构域IV的N末端部分包含SEQ ID NO:105的氨基酸1-21。
120.根据权利要求116所述的重组载体，其中所述HER1的结构域IV的N末端部分包含：SEQ ID NO:106的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:106的氨基酸序列。
121.根据权利要求114至120中任一项所述的重组载体，其中CD28的跨膜区包含：SEQID NO:107的氨基酸序列或者含有1、2或3个氨基酸修饰的SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
122.根据权利要求114至121中任一项所述的重组载体，其中所述标记蛋白包含与SEQID NO:100、103或112的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
123.根据权利要求1至122中任一项所述的重组载体，其中所述Vα区包含：互补决定区1α(CDR1α)、CDR2α和CDR3α，其分别包含SEQ ID NO:1001+10n、1002+10n和1003+10n的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
124.根据权利要求1至123中任一项所述的重组载体，其中所述Vβ区包含：CDR1β、CDR2β和CDR3β，其分别包含SEQ ID NO:2001+10n、2002+10n和2003+10n的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
125.根据权利要求1至124中任一项所述的重组载体，其中所述Vα区包含：来自包含SEQID NO:1004+10n、1005+10n、1006+10n或1007+10n的氨基酸序列的Vα区的CDR1α、CDR2α和CDR3α，其中n是0至79的整数。
126.根据权利要求1至125中任一项所述的重组载体，其中所述Vβ区包含：来自包含SEQID NO:2004+10n、2005+10n、2006+10n或2007+10n的氨基酸序列的Vβ区的CDR1β、CDR2β和CDR3β，其中n是0至79的整数。
127.根据权利要求1至126中任一项所述的重组载体，其中所述Vα区包含与SEQ ID NO:1004+10n、1005+10n、1006+10n或1007+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
128.根据权利要求1至127中任一项所述的重组载体，其中所述Vβ区包含与SEQ ID NO:2004+10n、2005+10n、2006+10n或2007+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
129.根据权利要求1至128中任一项所述的重组载体，其中所述Vα区包含与SEQ ID NO:1004+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述Vβ区包含与SEQ ID NO:2004+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数；其中所述Vα区包含与SEQ IDNO:1005+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述Vβ区包含与SEQ ID NO:2005+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数；其中所述Vα区包含与SEQID NO:1006+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述Vβ区包含与SEQ ID NO:2006+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数；或者其中所述Vα区包含与SEQ ID NO:1007+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述Vβ区包含与SEQ ID NO:2007+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中n是0至79的整数。
130.根据权利要求1至129中任一项所述的重组载体，其中所述TCRα链包含与SEQ IDNO:1008+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
131.根据权利要求1至129中任一项所述的重组载体，其中所述TCRα链包含与SEQ IDNO:1009+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
132.根据权利要求1至129中任一项所述的重组载体，其中所述TCRα链包含与SEQ IDNO:1010+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
133.根据权利要求1至132中任一项所述的重组载体，其中所述TCRβ链包含与SEQ IDNO:2008+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
134.根据权利要求1至132中任一项所述的重组载体，其中所述TCRβ链包含与SEQ IDNO:2009+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
135.根据权利要求1至132中任一项所述的重组载体，其中所述TCRβ链包含与SEQ IDNO:2010+10n的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中n是0至79的整数。
136.根据权利要求1至135中任一项所述的重组载体，其中所述转录调控元件包含启动子。
137.根据权利要求136所述的重组载体，其中所述启动子是人延伸因子1-α(hEF-1α)杂合启动子。
138.根据权利要求136或137所述的重组载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:150的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
139.根据权利要求1至138中任一项所述的重组载体，其进一步包含位于所述多顺反子表达盒的3'端处的polyA序列。
140.根据权利要求139所述的重组载体，其中所述polyA序列包含与SEQ ID NO:151的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
141.根据权利要求1至140中任一项所述的重组载体，其进一步包含左反向末端重复序列(ITR)和右ITR，其中所述左ITR和所述右ITR侧接所述多顺反子表达盒。
142.根据权利要求141所述的重组载体，其按从5'至3'的顺序包含：
i.所述左ITR；
ii.所述转录调控元件；
iii.所述第一多核苷酸序列；
iv.所述第二多核苷酸序列；
v.所述第三多核苷酸序列；
vi.所述第四多核苷酸序列；
vii.所述第五多核苷酸序列；和
viii.所述右ITR。
143.根据权利要求1至142中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体是非病毒载体。
144.根据权利要求143所述的重组载体，其中所述非病毒载体是质粒。
145.根据权利要求1至142中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体是病毒载体。
146.根据权利要求1至145中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体是多核苷酸。
147.一种多核苷酸，其编码与选自由SEQ ID NO:161、163、164、165、167、169、170和171组成的组的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
148.一种多核苷酸，其包含与选自由SEQ ID NO:232、235、236、238、239、241、242和243组成的组的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
149.一种细胞群，其包含根据权利要求1至146中任一项所述的重组载体或根据权利要求147或148所述的多核苷酸。
150.根据权利要求149所述的细胞群，其中将所述重组载体或所述多核苷酸整合到所述细胞群的基因组中。
151.根据权利要求149或150所述的细胞群，其中所述细胞是免疫效应细胞。
152.根据权利要求151所述的细胞群，其中所述免疫效应细胞选自由以下项组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
153.根据权利要求152所述的细胞群，其中所述免疫效应细胞是选自由以下项组成的组的一种或多种T细胞：初始T细胞(CD4+或CD8+)；杀伤CD8+T细胞；细胞毒性CD4+T细胞；辅助CD4+T细胞；对应于Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、滤泡辅助性(Tfh)、调节性(Treg)谱系的CD4+T细胞；肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；以及记忆T细胞(中枢记忆、效应记忆、干细胞记忆、干细胞样记忆)。
154.根据权利要求152所述的细胞群，其包含α/βT细胞、γ/δT细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。
155.根据权利要求152所述的细胞群，其包含CD4+T细胞、CD8+T细胞，或CD4+T细胞和CD8+T细胞两者。
156.根据权利要求149至155中任一项所述的细胞群，其中所述细胞是离体的。
157.根据权利要求149至156中任一项所述的细胞群，其中所述细胞是人类的。
158.根据权利要求149至157中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+细胞。
159.根据权利要求149至157中任一项所述的细胞群，其中所述细胞群是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+细胞。
160.一种包含多顺反子表达盒的细胞群，所述多顺反子表达盒包含
a.第一顺反子，其包含编码融合蛋白的多核苷酸序列，所述融合蛋白包含IL-15或其功能片段或功能变体和IL-15Rα或其功能片段或功能变体；
b.第二顺反子，其包含编码TCRβ链的多核苷酸序列，所述TCRβ链包含Vβ区和Cβ区；以及
c.第三顺反子，其包含编码TCRα链的多核苷酸序列，所述TCRα链包含Vα区和Cα区，
其中所述细胞群是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+细胞。
161.一种包含多顺反子表达盒的细胞群，所述多顺反子表达盒包含
a.第一顺反子，其包含编码融合蛋白的多核苷酸序列，所述融合蛋白包含IL-15或其功能片段或功能变体和IL-15Rα或其功能片段或功能变体；
b.第二顺反子，其包含编码TCRβ链的多核苷酸序列，所述TCRβ链包含Vβ区和Cβ区；以及
c.第三顺反子，其包含编码TCRα链的多核苷酸序列，所述TCRα链包含Vα区和Cα区，
其中所述细胞群是T细胞，其包含多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％CD45RA+CD45RO+CD62L+CD95+细胞。
162.一种产生工程化细胞群的方法，其包括：
将根据权利要求141或142所述的重组载体以及DNA转座酶或编码DNA转座酶的多核苷酸引入细胞群中；以及
在其中所述转座酶将所述多顺反子表达盒整合到所述细胞群的所述基因组中的条件下培养所述细胞群，从而产生所述工程化细胞群。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述左ITR和所述右ITR是选自由以下项组成的组的DNA转座子的ITR：睡美人转座子、piggyBac转座子、TcBuster转座子和Tol2转座子。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述DNA转座子是所述睡美人转座子。
165.根据权利要求162至164中任一项所述的方法，其中所述转座子是睡美人转座酶。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述睡美人转座酶选自由以下项组成的组：SB11、SB10、SB100X、hSB110和hSB81。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述睡美人转座酶是SB11。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述SB11包含与SEQ ID NO:300的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
169.根据权利要求167所述的方法，其中所述SB11由与SEQ ID NO:301的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列编码。
170.根据权利要求162至169中任一项所述的方法，其中编码所述DNA转座酶的所述多核苷酸是DNA载体或RNA载体。
171.根据权利要求162至170中任一项所述的方法，其中所述左ITR包含与SEQ ID NO:290或291的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列；并且所述右ITR包含与SEQ ID NO:292、293或294的多核苷酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
172.根据权利要求162至171中任一项所述的方法，其中使用电穿孔、超声处理、磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、通过穿过微流体装置引起的机械变形、或胶体分散系统，将所述重组载体以及所述DNA转座酶或编码所述DNA转座酶的多核苷酸引入到所述细胞群。
173.根据权利要求172所述的方法，其中使用电穿孔将所述重组载体以及所述DNA转座酶或编码所述DNA转座酶的多核苷酸引入到所述细胞群。
174.根据权利要求162至173中任一项所述的方法，其中所述方法在30天、25天、20天、15天、14天、10天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天之内完成。
175.根据权利要求162至173中任一项所述的方法，其中所述方法在少于30天、25天、20天、15天、14天、10天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天之内完成。
176.根据权利要求162至175中任一项所述的方法，其中将所述细胞群冻存并且在引入所述重组载体以及所述DNA转座酶或编码所述DNA转座酶的多核苷酸之前解冻。
177.根据权利要求162至176中任一项所述的方法，其中在引入所述重组载体以及所述DNA转座酶或编码所述DNA转座酶的多核苷酸之前，所述细胞群是静置的。
178.根据权利要求162至177中任一项所述的方法，其中在引入所述重组载体和所述DNA转座酶或编码所述DNA转座酶的多核苷酸之前，所述细胞群是非静置的。
179.根据权利要求162至178中任一项所述的方法，其中所述细胞群包含扩增的人离体细胞。
180.根据权利要求162至179中任一项所述的方法，其中所述细胞群不是离体活化的。
181.根据权利要求162至180中任一项所述的方法，其中所述细胞群包含T细胞。
182.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求149至161中任一项所述的细胞群，从而治疗所述癌症。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌、妇科癌症和卵巢癌。
184.一种治疗有此需要的受试者的自身免疫性疾病或疾患的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求149至161中任一项所述的细胞群，从而治疗所述自身免疫性疾病或疾患。
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