CN117088879A - 一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱，核心骨架为angustifoline型，并提供了提取方法和应用，化合物3用于抗肿瘤药物的制备。本发明的新的angustifoline型结构骨架的天然金雀花碱经分离提取而得，其中化合物3对多种肿瘤细胞株具有显著抑制作用，可用于抗肿瘤药物的制备。
Description
技术领域
本发明属于金雀花碱类生物碱技术领域，具体涉及一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱及其应用。
背景技术
天然的金雀花碱类生物碱根据其结构的差异，可以分为：金雀花碱型(cytisine)、鹰爪豆碱型(sparteine)、albine型、狭叶碱型(angustifoline)、camoensidine型、类金雀花碱型(cytisine-like)、苏苦西碱型(tsukushinamine)和lupanacosmine型8种结构类型。这些天然金雀花碱型生物碱主要分布于豆科植物中，具有抗炎、抗肿瘤、杀虫与抗病毒、抑制破骨细胞、影响中枢神经系统等药理活性。
红豆树(Ormosia hosiei Hemsl.et Wils)是豆科红豆属植物，别称鄂西红豆，何氏红豆等，主要分布于浙江、福建、安徽、江西等地，以种子入药，味苦，性平，有小毒，主治疝气，腹痛，血滞，闭经。红豆树涉及抗炎、抗肿瘤、影响中枢神经系统等多方面生物活性，是具有较大开发潜力的经济林木。研究表明红豆树的主要化学成分包括黄酮类、挥发油类、生物碱类化合物，其中生物碱是红豆树中主要的化学成分，以类金雀花碱型生物碱为主。目前红豆树中单体生物碱类成分已报道的数量不多，仅报道了11个，有cytisine-like和angustifoline两个类型生物碱。其中cytisine-like生物碱报道了9个，其结构和活性分别为：hosieines A-D具有显著的烟碱乙酰胆碱酯酶受体(nAChR)的亲和活性，hositisine B和hositisine E表现出抗炎作用，hosimonoal、hositisine C和hositisine D对人肝癌肿瘤细胞株(HepG2细胞)表现出中等的抑制活性；angustifoline生物碱仅报道了2个，其结构或活性分别为：hositisine A表现出显著地抗炎活性，tinctorine对HepG2肿瘤细胞株具有中等的抑制活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种红豆树中的抗肿瘤angustifoline型金雀花碱类生物碱及其应用，该angustifoline型金雀花碱类生物碱是通过分离提取而得的新化合物，其中化合物3对多种肿瘤细胞株具有显著抑制作用，可用于用于抗肿瘤药物的制备。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱，所述抗肿瘤金雀花碱类生物碱的核心骨架为angustifoline型，
所述angustifoline型的结构骨架如下：
其中R基为氢、羟基、或其他可取代基团，C-6位的立体构型为R型或S型；C-5和C-6之间为单键或双键；C-7和C-9位的立体构型为R型或S型；C-11位的立体构型为R型或S型。
优选地，所述抗肿瘤金雀花碱类生物碱包括化合物1～化合物4为新化合物，结构式依次为：
本发明还提供了红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱的提取方法，该方法为：
步骤一、将干燥红豆树种子粉碎，然后分别加入体积比1：3的质量分数为95％的乙醇溶液浸提3次，浓缩后得到种子浸提物；
步骤二、将步骤一中得到的种子浸提物使用水溶解，得到种子浸提物水溶液，用质量分数为2％的硫酸溶液调节至pH＝2，混匀后静置，采用石油醚萃取，得到萃取后酸水溶液；
步骤三、将步骤二中得到的酸水溶液用浓度为2mol/L NaOH溶液调节至pH＝10，混匀后静置，采用氯仿萃取，得到氯仿萃取液，经浓缩，得到氯仿层浸膏；
步骤四、将步骤三中的氯仿层浸膏先后采用依次采用正相硅胶柱色谱分离、反相ODS柱色谱分离、Sephadex LH-20柱色谱分离，并辅以HPLC方法进行纯化，获得化合物1～化合物4，经鉴定，结构式依次为：
本发明还提供了上述提取方法提取的抗肿瘤金雀花碱类生物碱的应用，所述化合物3用于抗肿瘤药物的制备。
优选地，所述抗肿瘤药物包括抗人肝癌肿瘤细胞株HepG2、人卵巢癌肿瘤细胞株A2780或者人乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7的药物。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明从红豆树中提取到4个新的天然angustifoline型抗肿瘤金雀花碱类生物碱，其中化合物3对人肝癌肿瘤细胞株HepG2、人卵巢癌肿瘤细胞株A2780和对人乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7有抑制作用，可用于抗肿瘤药物的制备。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的化合物1的1H-1H COSY和HMBC的相关信号图。
图2是本发明的化合物1的实验与计算ECD曲线。
图3是本发明的化合物2的实验与计算ECD曲线。
图4是本发明的化合物3和4HMBC和ROESY的相关信号。
图5是本发明的化合物1的1H NMR图谱。
图6是本发明的化合物1的13C NMR图谱。
图7是本发明的化合物1的HSQC图谱。
图8是本发明的化合物1的1H-1H COSY图谱。
图9是本发明的化合物1的HMBC图谱。
图10是本发明的化合物1的ROESY图谱。
图11是本发明的化合物2的1H NMR图谱。
图12是本发明的化合物2的13C NMR图谱。
图13是本发明的化合物2的ROESY图谱。
图14是本发明的化合物3的1H NMR图谱。
图15是本发明的化合物3的13C NMR图谱。
图16是本发明的化合物4的1H NMR图谱。
图17是本发明的化合物4的13C NMR图谱。
图18是本发明的化合物3的实验与计算ECD曲线。
图19是本发明的化合物4的实验与计算ECD曲线。
具体实施方式
实施例1
红豆树中新型生物碱类生物碱的制备方法，具体制备步骤如下：
步骤一、将干燥红豆树种子粉碎，然后分别加入体积比1：3的95％乙醇浸提三次，浓缩后得到种子浸提物；
步骤二、将步骤一中得到的种子浸提物使用温水溶解，得到种子浸提物水溶液，用质量分数为2％的硫酸溶液调节至pH＝2，混匀后静置，采用石油醚萃取，得到萃取后酸水溶液；
步骤三、将步骤二中得到的酸水溶液用浓度为2mol/L NaOH溶液调节至pH＝10，混匀后静置，采用氯仿萃取，得到氯仿萃取液，经浓缩，得到氯仿层浸膏；
步骤四、将步骤三中的氯仿层浸膏采用正相硅胶柱色谱分离(二氯甲烷-甲醇-二乙胺)得到3个流分(Aa～Ac)、将流分Aa经反相ODS柱色谱分离(甲醇-水)分离得到5个亚流分(Aa1～Aa5)、亚流分Aa2进一步经正相硅胶、Sephadex LH-20凝胶(乙醇)色谱分离得到5个亚流分(Aa2a～Aa2e)，亚流分Aa2c经HPLC方法(MeOH:H2O＝70:30)进行纯化，获得单体化合物1和2。采用相同的分离流程，化合物3和4分别在亚流分Aa3a和Aa2e中获得。用NMR、MS、UV、IR波谱分析技术鉴定其结构。
下面通过实施例2-5对化合物1～4进行分析。
实施例2
化合物1的结构鉴定：
实施例1分离的化合物1为白色粉末。通过HR-ESI-MS给出的准分子离子265.1911[M+H]+(计算值265.1917)，给出分子式为C15H24N2O2，不饱和度为5。化合物1的1H-NMR谱(CD3OD，600MHz，表1，图5)显示了3个烯烃质子信号(δH 5.05,1H,s)、(δH 5.73,1H,m)、(δH5.07,1H,m)和1个甲基信号(δH 2.34,3H,s)。13C-NMR谱(CD3OD，150MHz，表1，图6)和HSQC谱(图7)显示存在15个碳信号，分别为1个甲基(δC 41.3)，8个亚甲基(δC 115.7,67.0,50.5,32.1,30.5,27.5,19.1和15.6)，4个次甲基(δC 136.3,63.4,37.1和30.6)，2个季碳(一个羰基碳δC 174.3和一个连氧季碳δC 84.5)。上述官能团占用2个不饱和度，剩余3个不饱和度，说明结构中存在三环体系。
1H-1H COSY谱(图1，图8)分析化合物1中存在两个结构片段a与b。两个片段的连接方式通过HMBC谱(图9)得以确定。化合物1具有H-3、H-4与C-2的HMBC相关信号(图1)，说明C-2位的羰基与片段a相连；H-4/C-6，H-5/C-6和C-7，H-10/C-6和C-8的HMBC相关信号可以确定，片段a与片段b通过C-6和N-1连接；H-11/C-13以及H-13/C-11、C-17的HMBC相关信号说明C-11、C-13和C-17与N-12相连。综上，化合物1的平面结构为N-methyl-11-allyl-6-hydroxy-tetrahydrocytisine。
化合物1相对构型通过ROESY图谱进行分析。化合物1中存在4个手性中心C-6、C-7、C-9和C-11，其中桥头碳C-7和C-9的氢处于顺式，令桥头碳上的H-7和H-9为α位，则C-11和C-13处于β位。在ROESY图谱中(图10)，H-5β/H-13β，H-13α/H-8β，H-8α/H-10α，以及H-10β/H-11的ROESY相关信号，可以确定上述氢空间上接近，H-11处于β位。连接羟基的季碳C-6的相对构型无法通过ROESY图谱得以确定。为了阐明化合物的C-6位羟基的相对构型，对两种可能的异构体1a(6α-OH)和1b(6β-OH)进行1H和13C NMR化学位移计算。通过运用DP4+方法进行分析，1a的DP4+概率预测值为100％，可知1a是正确的结构。
明确相对构型为1a后，在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上使用TD-DFT计算化合物1的ECD曲线。(6R,7R,9R,11R)-1的计算ECD曲线和化合物1实验ECD曲线之间基本一致(图2)，以此判断化合物1的绝对构型为6R,7R,9R,11R。故化合物1的结构为(6R,7R,9R,11R)-N-methyl-11-allyl-6α-hydroxy-tetrahydrocytisine。
表1化合物1和2的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据，溶剂CD3OD：
实施例3
化合物2的结构鉴定
化合物2，为淡黄色油状物。通过HR-ESI-MS给出的准分子离子265.1911[M+H]+(计算值265.1917)，确定其分子式为C15H24N2O2，不饱和度为5。化合物2的1H NMR谱(表1，图11)显示3个烯烃质子信号和1个甲基信号。13C NMR谱(表1，图12)显示存在15个碳信号。对比化合物2与化合物1的13C NMR谱，发现两者化学位移没有显著差异。通过其二维谱图的详细分析，发现化合物2与化合物1具有相同的平面结构。
化合物2相对构型通过ROESY图谱进行分析。令桥头碳上的H-7和H-9为α位，观察到H-10β/H-11的关键ROESY相关信号(图13)，可以推断H-11处于β位，那么化合物2与化合物1两者C-7、C-9、C-11位上构型一致，二者差别仅存在于C-6位上羟基的构型。因此，化合物2的6-OH的相对构型为β型。为进一步推断其绝对构型，在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上使用TD-DFT进行ECD计算。(6S,7R,9R,11R)-2的计算ECD曲线和化合物2实验ECD曲线之间基本一致(图3)，以此判断化合物2的绝对构型为6S,7R,9R,11R。故化合物2推测为(6S,7R,9R,11R)-N-methyl-11-allyl-6β-hydroxy-tetrahydrocytisine。
实施例4
化合物3的结构鉴定
化合物3，为淡黄色油状物。通过HR-ESI-MS给出的准分子离子247.1802[M+H]+(计算值247.1811)，确定其分子式为C15H22N2O，不饱和度为6。化合物3的1H NMR谱(表2，图14)显示了4个烯烃质子信号和1个甲基信号。13C NMR谱(表2，图15)显示存在15个碳信号，结合DEPT 135谱和HSQC谱显示存在1个甲基，7个亚甲基，5个次甲基和2个季碳(其中一个为羰基碳)。上述官能团占用3个不饱和度，剩余3个不饱和度，说明该化合物也存在三环骨架。
结合1H和13C NMR数据发现，与化合物1相比，化合物3最大的差别在于增加了一个烯烃信号[δH 5.05(1H,s),δC 102.3；δC 142.1]，同时减少了一个连氧季碳(δC-684.5)和一个仲碳(δC-532.1)信号。H-3/C-5、H-4/C-5和C-6、H-5/C-6和C-7的HMBC相关信号(图4A)，可知双键位于C-5和C-6位。综上，化合物3是化合物1的C-6位羟基形成5,6双键的结构。
利用ROESY图谱(图4B)分析化合物3的相对构型。化合物3中存在3个手性中心C-7、C-9和C-11，其中桥头碳C-7和C-9的氢处于顺式。令桥头碳上的H-7和H-9为α位，则C-11和C-13处于β位。在ROESY图谱中，H-13α/H-8β，H-8α/H-10α，以及H-10β/H-11的ROESY相关信号，可以确定上述氢空间上接近，H-11处于β位。在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上使用TD-DFT进行ECD计算，(7S,9S,11S)-3的计算ECD曲线和化合物3实验ECD曲线之间基本一致(图18)，可以确定化合物3的绝对构型为7S,9S,11S。故化合物推测为(7S,9S,11S)-N-methyl-11-allyl-5,6-dehydro-tetrahydrocytisine。
表2化合物3和4的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据，溶剂CD3OD：
实施例5
化合物4的结构鉴定
化合物4为淡黄色油状物。通过HR-ESI-MS给出准分子离子247.1803[M+H]+(计算值247.1811)，确定分子式为C15H22N2O，不饱和度为6。化合物4的1H NMR谱(表2，图16)显示了4个烯烃质子信号和1个甲基信号。13C NMR谱(表2，图17)显示存在15个碳信号，结合DEPT135谱和HSQC谱显示存在1个甲基，7个亚甲基，5个次甲基，2个季碳(其中一个为羰基碳)。进一步对比化合物4与化合物3的HMBC及1H-1HCOSY二维谱相关信号，发现化合物4与化合物3具有相同的平面结构。
利用ROESY图谱(图4B)分析化合物4的相对构型。化合物4中存在3个手性中心C-7、C-9和C-11，其中桥头碳C-7和C-9的氢处于顺式。令桥头碳上的H-7和H-9为α位，则C-11和C-13处于β位。在ROESY图谱中，H-8β/H-13α、H-8β/H-11、H-8α/H-10的相关信号，可以确定上述氢空间上接近，H-11处于α位。由此可知，化合物4和化合物3二者为C-11的差向异构体。在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上使用TD-DFT进行ECD计算，(7S,9S,11R)-4的计算ECD曲线和化合物4实验ECD曲线之间基本一致(图19)，可以确定化合物4的绝对构型为7S,9S,11R。故化合物推测为(7S,9S,11R)-N-methyl-11-allyl-5,6-dehydro-tetrahydrocytisine。
综上，本发明中从红豆树中提取的金雀花碱类生物碱具有angustifoline型结构骨架，分子结构为：
angustifoline型结构骨架的金雀花碱类生物碱中R基为氢、羟基、或其他可取代基团，C-6位的立体构型为R型或S型；C-5和C-6之间为单键或双键；C-7和C-9位的立体构型为R型或S型；C-11位的立体构型为R型或S型。
化合物1的R基为羟基，C-6位的立体构型为R型，C-5和C-6之间为单键，C-7和C-9位的立体构型为R型，C-11位的立体构型为R型。
化合物2的R基为羟基，C-6位的立体构型为S型，C-5和C-6之间为单键，C-7和C-9位的立体构型为R型，C-11位的立体构型为R型。
化合物3的C-5和C-6之间为双键，C-7和C-9位的立体构型为S型，C-11位的立体构型为S型。
化合物4的C-5和C-6之间为双键，C-7和C-9位的立体构型为S型，C-11位的立体构型为R型。
本发明所述的红豆树中提取的金雀花碱类生物碱1～4为新化合物。
实施例6
本发明化合物抗肿瘤活性筛选
采用MTT法对本发明化合物进行抗肿瘤活性筛选，分别取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，边缘孔用无菌PBS填充，每孔100μL，在5％CO2，37℃条件下培养至细胞贴壁，实验组加入10μM浓度的本发明新化合物，轻轻摇晃96孔板，使培养基与药物混合均匀，继续在5％CO2，37℃培养箱中孵育48小时。另设调零组(含DMSO溶媒的培养液)，考察加入药物后对细胞的影响。孵育结束后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡20min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪560nm波长处测定各孔吸光值，计算抑制率。
其中化合物3在10μM浓度下，对人肝癌肿瘤细胞株HepG2的抑制率为11％，对人卵巢癌肿瘤细胞株A2780的抑制率为45.1％，对人乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7的抑制率为20.6％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (5)
1.一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱，其特征在于，所述抗肿瘤金雀花碱类生物碱的核心骨架为angustifoline型，
所述angustifoline型的结构骨架如下：
其中R基为氢、羟基、或其他可取代基团，C-6位的立体构型为R型或S型；C-5和C-6之间为单键或双键；C-7和C-9位的立体构型为R型或S型；C-11位的立体构型为R型或S型。
2.根据权利要求1中所述的一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱，其特征在于，所述抗肿瘤金雀花碱类生物碱包括化合物1～化合物4，结构式依次为：
3.一种红豆树中的抗肿瘤金雀花碱类生物碱的提取方法，其特征在于，该方法为：
步骤一、将干燥红豆树种子粉碎，然后分别加入体积比1：3的质量分数为95％的乙醇溶液浸提3次，浓缩后得到种子浸提物；
步骤二、将步骤一中得到的种子浸提物使用水溶解，得到种子浸提物水溶液，用质量分数为2％的硫酸溶液调节至pH＝2，混匀后静置，采用石油醚萃取，得到萃取后酸水溶液；
步骤三、将步骤二中得到的酸水溶液用浓度为2mol/L NaOH溶液调节至pH＝10，混匀后静置，采用氯仿萃取，得到氯仿萃取液，经浓缩，得到氯仿层浸膏；
步骤四、将步骤三中的氯仿层浸膏先后采用依次采用正相硅胶柱色谱分离、反相ODS柱色谱分离、Sephadex LH-20柱色谱分离，并辅以HPLC方法进行纯化，获得化合物1～化合物4，经鉴定，结构式依次为：
。
4.一种如权利要求3所述提取方法提取的抗肿瘤金雀花碱类生物碱的应用，其特征在于，所述化合物3用于抗肿瘤药物的制备。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括抑制人肝癌肿瘤细胞株HepG2、人卵巢癌肿瘤细胞株A2780或者人乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7的药物。
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