CN117085122A - 抗人il-4ra的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗人白介素4‑受体A的抗体及其在治疗疾病例如嗜酸性粒细胞性食管炎中的应用、包括其的药物组合物或试剂盒，及其用途。

Description

抗人IL-4RA的抗体及其用途
技术领域
本发明属于过敏性疾病治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗人白介素4-受体A的抗体、包含其的药物组合物或试剂盒，及其例如用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎的用途。
背景技术
白介素-4受体(interleukin-4Recptor，IL-4R)是一种跨膜受体，存在两种不同的形式：一种为I型IL-4R，为高亲和力IL-4Rα亚基(即本发明中的IL-4RA)，和中度亲和力γC亚基组成，它结合白介素-4(interleukin-4，IL-4)并介导IL-4诱导的细胞增殖、活化等生物学功能作用；另一种为Ⅱ型IL-4R，由高亲和力IL-4Rα亚基(IL-4RA)和白介素-13受体α亚基(IL-13Rα)组成，II型IL-4R同时也是白介素-13(interleukin-13，IL-13)的同源功能受体，可以结合IL-13(Wang及Secombes，Cytokine.2015.75卷，1期，8-13页(2015))。IL-4R在T、B、造血干细胞及内皮细胞、上皮细胞、肌肉、纤维母细胞、肝细胞和脑组织中均有表达，IL-4与受体结合后IL-4RA与γC亚基或IL-13Rα亚基共同作用激活胞质内多种非受体型蛋白质酪氨酸激酶，进一步启动下游信号转导途径(Nelms等人，Annu Rev Immunol，17卷，701-738页(1999)；LaPorte等人，Cell，132卷，2期，259-272页(2008))。
IL-4RA可高亲和力的与IL-4及IL-13结合，是以上提及的I型及II型IL-4R的主要功能性亚基，抑制IL-4RA可有效阻断IL-4及IL-13所介导的相关生物学功能(Gessner等人，Immunobiology，201卷，285页(2000))。
嗜酸性粒细胞性食管炎(eosinophilic esophagitis，EoE)是指嗜酸性粒细胞浸润食管引起的一种慢性食管疾病，在青少年及儿童中好发，其表现出胃灼热/反流、呕吐、吞咽困难、食物嵌塞，甚至腹痛等多种症状(Gonsalves Nirmala P,Aceves Seema S,Diagnosis and treatment of eosinophilic esophagitis.[J].J Allergy ClinImmunol,2020,145:1-7)。对于EoE患者来说需要饮食限制，并且在某些情况下需要反复医院干预，患者生活质量低。
EOE常与过敏性疾病相关，50％-60％ EoE患者既往有过敏体质病史，如鼻炎、支气管哮喘、特应性皮炎等特异反应性疾病，并出现相应症状。胃食管反流病(GERD)、过敏原(主要为食物过敏原)、上皮屏障的改变以及可能的微生物群结合均可能引发EOE，食物过敏原等渗透上皮并激活受体和嗜酸性粒细胞等炎症细胞，后者分泌细胞因子，诱发慢性炎症、组织损伤和纤维化(Vinit C,Dieme A,Courbage S,et al.Eosinophilic esophagitis:Pathophysiology,diagnosis,and management[J].Archives De Pédiatrie,2019，26(3):182-190)。
EOE是由辅助性T细胞2(Th2)介导的免疫炎症反应，IL-4能够诱导初始T细胞成为Th2细胞，Th2细胞分泌IL-5，后者通过促进嗜酸性粒细胞趋化因子的释放和嗜酸性粒细胞的存活，从而增强嗜酸性粒细胞的招募能力，加重炎症反应(Joshua B.Wechsler,IkuoHirano,柏小寅,钱家鸣.嗜酸性粒细胞性胃肠炎的生物治疗[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2018,12(04):437-444)。抗人IL-4RA单抗Dupilumab的临床第二项3期试验B部分评估了其在12岁及以上嗜酸性粒细胞性食管炎患者中的研究使用，结果显示与安慰剂相比，每周服用300毫克Dupilumab的患者临床和组织学疾病指标有显着改善，EoE症状减轻64％，而安慰剂组为41％。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的人IL-4RA，作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了如下的杂交瘤细胞株：
本发明人发现：
杂交瘤细胞株13E5能够分泌产生与人IL-4RA特异性结合的特异性抗体(命名为13E5)，并且该抗体能够十分有效地阻断人IL-4RA和IL-4的结合。
进一步地，本发明人创造性地制得了抗人IL-4RA的人源化抗体(分别命名为13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L4、13E5H4L2)。
前述抗体能有效地结合人IL-4RA，阻断人IL-4RA与其配体IL-4或IL-13的结合，抑制人IL-4RA下游信号通路的激活；具有用于制备防治嗜酸性粒细胞性食管炎的药物的潜力。
由此提供了下述发明：
1.抗体或其抗原结合片段，特别地，所述抗体或其抗原结合片段结合IL-4RA，优选人IL-4RA，用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎，其中：根据Kabat，IMGT，Chothia或AbM编号系统，所述抗体包含：
SEQ ID NO:2所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，
优选地，根据IMGT编号系统，所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，或由其组成，
并且所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO:8所示的序列或其变体，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:9所示的序列或其变体，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:10所示的序列或其变体，或由其组成，
其中所述变体的序列为与对应序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
2.项目1所述的抗体，其中所述抗体包括：
(1)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体；
(3)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体；
(4)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体；
(5)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其变体；
(6)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其变体；
(7)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体；或
其中所述变体的序列为与对应序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
3.项目1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链可变区的框架区FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，和轻链可变区的框架区FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中
(1)FR-H1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和
FR-L4包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(2)FR-H1包含SEQID NO:35的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和
FR-L4包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(3)FR-H1包含SEQID NO:43的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和
FR-L4包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(4)FR-H1包含SEQID NO:51的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和
FR-L4包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(5)FR-H1包含SEQID NO:59的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和
FR-L4包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
其中所述变体的序列与对应序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
4.项目1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
5.项目4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的恒定区是人源化的，优选来自人IgG，更优选IgG4。
6.项目5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链恒定区采用Iggamma-4链C区，更优选GenBank登记号为ACCESSION：P01861.1的Ig gamma-4链C区；轻链恒定区采用Ig kappa链C区，更优选GenBank登记号为ACCESSION:P01834的Ig kappa链C区。
7.项目1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，dAb，Fab/c，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。
8.生物材料，所述生物材料选自抗体偶联物，多特异性抗体(优选双特异性抗体)，融合蛋白或药物组合物，用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎，所述生物材料包含项目1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述抗体偶联物还包含与所述的抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分，所述偶联部分选自纯化标签(如His标签)，细胞毒性剂，可检测的标记，放射性同位素，发光物质，有色物质，酶或聚乙二醇，
优选地，所述多特异性抗体还包含针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段，
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
优选地，所述药物组合物为单独使用或者与一种或多种药物联用。
优选地，所述药物组合物为适合于口服施用于胃肠道(GI)的剂型，优选地，所述剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂；或所述药物为适合于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射、病灶内注射的剂型。
9.项目1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目8所述的生物材料在制备用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎的药物或试剂盒中的用途，优选所述试剂盒还包含另外的治疗剂，所述治疗剂选自如下的一种或多种：IL-4/IL-13通路抑制剂、IL-1β抑制剂、IL-5抑制剂、IL-8抑制剂、IL-9抑制剂、IL-13抑制剂、IL-17抑制剂、IL-25抑制剂、JAK抑制剂、STAT6抑制剂、TNF抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-3抑制剂、IgE抑制剂、前列腺素D2抑制剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、糖皮质激素、长效β2-激动剂(如沙美特罗或福莫特罗)、质子泵抑制剂、减充血剂、抗组胺剂和非类固醇抗炎剂(NSAID)、NSAID(非甾体抗炎药)、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、治疗肿瘤的药物(优选为化疗剂或生长抑制剂，靶向治疗剂，抗体-药物缀合物，表达嵌合抗原受体的T细胞、抗体或其抗原结合片段、血管生成抑制剂、抗肿瘤剂、癌症疫苗、佐剂及其组合、烷化剂、抗代谢药物，抗生素，植物类药物和/或激素类药物)，
其中所述IL-4/IL-13通路抑制剂不是项目1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述的IL-4/IL-13通路抑制剂选自抗IL-4抗体、抗IL-13抗体、抗IL-4/IL-13抗体、IL-4受体(IL-4R)抑制剂(如Dupilumab抗体或其生物等价物、AMG317或MEDI9314)、JAK抑制剂、STAT6抑制剂。
10.治疗嗜酸性粒细胞性食管炎的方法，包括给需要的受试者施用项目1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目8所述的生物材料，优选地，所述受试者选自哺乳动物(诸如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物)，优选地，所述受试者是人，更优选0-1岁婴儿、1-5岁儿童、6-12岁少年、12-18岁青少年及18岁以上成人。
11.项目10所述的方法，其中所述方法还包括给受试者施用另外的治疗剂或者联合疗法，所述治疗剂选自如下的一种或多种：IL-4/IL-13通路抑制剂、IL-1β抑制剂、IL-5抑制剂、IL-8抑制剂、IL-9抑制剂、IL-13抑制剂、IL-17抑制剂、IL-25抑制剂、JAK抑制剂、STAT6抑制剂、TNF抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)抑制剂、IgE抑制剂、前列腺素D2抑制剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、糖皮质激素、长效β2-激动剂(如沙美特罗或福莫特罗)、质子泵抑制剂、减充血剂、抗组胺剂和非类固醇抗炎剂(NSAID)、NSAID(非甾体抗炎药)、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、治疗肿瘤的药物(优选为化疗剂或生长抑制剂，靶向治疗剂，抗体-药物缀合物，表达嵌合抗原受体的T细胞，抗体或其抗原结合片段，血管生成抑制剂，抗肿瘤剂，癌症疫苗，佐剂及其组合，烷化剂，抗代谢药物，抗生素，植物类药物和/或激素类药物)，或其组合，所述联合疗法包括饮食疗法和食管扩张术，
其中所述IL-4/IL-13通路抑制剂不是项目1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述的IL-4/IL-13通路抑制剂选自抗IL-4抗体、抗IL-13抗体、抗IL-4/IL-13抗体、IL-4受体(IL-4R)抑制剂(如Dupilumab抗体或其生物等价物、AMG317或MEDI9314)、JAK抑制剂、STAT6抑制剂，
更优选地，所述另外的治疗剂与项目1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段同时或顺序施用。
12.杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO:C2018131，或由所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎。
在本发明的某些实施方案中，提供IL-4/IL-13通路抑制剂在制备治疗或者抑制或者预防个体嗜酸性粒细胞性食管炎的药物中的用途。
在本发明的某些实施方案中，提供与IL-4RA结合的抗体或其抗原结合片段在制备治疗或抑制或预防个体嗜酸性粒细胞性食管炎的药物的用途。
在本发明中，所述治疗EoE包括减轻至少一种症状或征象，包括但不限于食管嗜酸性粒细胞浸润、食管壁增厚、食管炎、食管内气管状环或突起的出现、胸腹痛、拒食、呕吐、吞咽困难及食物嵌塞。
在本发明的一些实施方案中，所述“嗜酸性粒细胞浸润”是指患者的器官或组织(包括血液、食管、胃、十二指肠以及回肠)内存在嗜酸性粒细胞，活组织检查中至少一个高倍视野下嗜酸性粒细胞大于等于15个。
在本发明的一些实施方案中，所述“患者”包括可能显示出EoE相关生物标志物水平升高的亚群。EoE相关生物标志物包括但不限于食管嗜酸性粒细胞、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)、血清嗜酸粒细胞过氧化物酶、趋化因子配体17(CCL17)、IgE、骨膜蛋白、IL-5、IL-13、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(EDN)。
本文所述“过敏原”包括能在易感者身上引发过敏反应的任何物质、化合物、颗粒或组合物，包含食物，例如奶制品、鸡蛋、小麦、豆类、鱼类、树坚果和贝类等。
在本发明某些实施方案中，本发明所述患者选自0-1岁婴儿、1-5岁儿童、6-12岁少年、12-18岁青少年及18岁以上成人。
在本发明某些实施方案中，将IL-4/IL-13通路抑制剂与第二种治疗物质或疗法联合施用。
本发明所述的IL-4/IL-13通路抑制剂包括但不限于抗IL-4抗体、抗IL-13抗体、双特异性抗IL-4/IL-13抗体、IL-4受体(IL-4R)抑制剂、JAK抑制剂、STAT6抑制剂。在一些实施方案中，IL-4/IL-13通路抑制剂是IL-4R抑制剂，例如抗IL-4R抗体，更优选的为抗IL-4RA抗体。
在本发明某些实施方案中，所述方法包括向受试者或患者同时或顺序施用第二治疗剂，优选地，所述第二治疗剂选自IL-1β抑制剂、IL-5抑制剂、IL-8抑制剂、IL-9抑制剂、IL-13抑制剂、IL-17抑制剂、IL-25抑制剂、JAK抑制剂、STAT6抑制剂、TNF抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)抑制剂、IgE抑制剂、前列腺素D2抑制剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、糖皮质激素、长效β2-激动剂、质子泵抑制剂、减充血剂、抗组胺剂和非类固醇抗炎剂(NSAID)、NSAID(非甾体抗炎药)、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、治疗肿瘤的药物(优选为化疗剂或生长抑制剂，靶向治疗剂，抗体-药物缀合物，表达嵌合抗原受体的T细胞、抗体或抗原其结合片段、血管生成抑制剂、抗肿瘤剂、癌症疫苗、佐剂及其组合、烷化剂，抗代谢药物，抗生素，植物类药物和/或激素类药物)，或其组合。
在本发明某些实施方案中，所述联合施用的疗法包括但不限于饮食疗法和食管扩张术。
在本发明某些实施方案中，所述IL-4R抑制剂是Dupilumab抗体或其生物等价物。
在本发明某些实施方案中，所述IL-4R抑制剂是AMG317或MEDI9314。
在本发明某些实施方案中，所述长效β2-激动剂是沙美特罗或福莫特罗。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本发明中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“抗原结合区”意指特异性结合指定抗原的蛋白或蛋白的部分。例如，含有与抗原相互作用并对抗体赋予其对于抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的该部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一或多个“互补决定区”(complementarity-determining region，“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区(fragment region，“FR”)。CDR是促成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。
如本发明中所使用的，术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或可与完整抗体竞争对靶抗原的特异性结合的其抗原结合片段，并且包括，例如嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体和双特异性抗体或其抗原结合片段。这样的“抗体”是抗原结合蛋白的种类。完整抗体通常包含至少两个全长重链和两个全长轻链，但在一些情况下，可包括更少的链，诸如可只包含重链的天然存在于骆驼科动物中的抗体。抗体或其抗原结合片段可只来源于单个来源，或可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可来源于如下文中进一步描述的两个不同来源。抗体或其抗原结合片段可通过重组DNA技术在杂交瘤中产生，或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。除非另外指出，否则术语“抗体”，除了包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体和片段。
如本发明中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白链(重链或轻链)”的“抗原结合片段”(或简称“片段”)，包含缺乏至少一些存在于抗体全长链中的氨基酸但能够特异性结合抗原的抗体的部分(无论如何获得或合成该部分)。此类片段具有生物活性，因为它们特异性结合靶抗原并且可与其它抗体或其抗原结合片段竞争对给定的表位的特异性结合。在一个方面，此类片段将保留至少一个存在于抗体全长轻链或重链中的CDR，并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可以例如通过完整抗体的酶促或化学切割产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括，但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。还设想本文中公开的抗体的功能性部分例如一个或多个CDR可被共价地结合于第二蛋白或小分子以生成导向身体中的特定靶的治疗剂，从而具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期，例如融合蛋白。
如本发明中所使用的，术语“抗体全长链”、“全长抗体”、“完整抗体(intactantibody)”和“全抗体(whole antibody)”在本文中可互换地用来指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有如本文定义的Fc区的重链。
术语“轻链”包括全长轻链和其具有充足的可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链和其具有充足的可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端，并且CH结构域在羧基末端，CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
如本发明中所使用的，术语“Fab片段”由一条轻链和CH1以及一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。
如本发明中所使用的，术语“Fc”区含有两个包含抗体的CH1和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
如本发明中所使用的，术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(其含有VH结构域和CH1结构域以及还有CH1与CH2结构域之间的区域的部分)，以便可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
如本发明中所使用的，术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
如本发明中所使用的，术语“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
如本发明中所使用的，术语“Fd”片段意指由VH和CH 1结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544-546(1989))。
如本发明中所使用的，术语“dAb”片段(Ward等人，Nature 341:544-546(1989))由VH结构域组成。
如本发明中所使用的，术语“Fab’-SH”是本文对Fab’的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。
如本发明中所使用的，术语“Fab/c”片段是免疫球蛋白经胃蛋白酶消化形成的抗体裂解中间产物，其兼有Fab和Fc区的优点，即具有扩散能力强，体内代谢清除慢的特点，并能保持高度亲和力(刘建军，《细胞与分子免疫学杂志》，1989(4):29-29)。
如本发明中所使用的，术语“单链抗体”是其中重链与轻链可变区通过柔性接头连接来形成单条多肽链(其形成抗原结合区)的Fv分子(参见，例如，Bird等人，Science.242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90:5879-5883(1988))。单链抗体在国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利U.S.P 4,946,778和U.S.P 5,260,203(所述国际专利申请公开号和美国专利号的公开内容通过引用并入)中进行了详细描述。
如本发明中所使用的，术语“结构域抗体”是只含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区通过肽接头共价地连接，以生成多价结构域抗体(特别是双价结构域抗体)。双价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
如本发明中所使用的，术语“双价抗原结合蛋白”或“双价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。双价抗体可以是双特异性的。
如本发明中所使用的，术语“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向不止一种抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。
如本发明中所使用的，术语“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体是分别具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可通过多种方法产生，包括，但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，所述表位存在于相同或不同的蛋白质靶标上。
如本发明中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
如本发明中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的框架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522525(1986)；Reichmann etal.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。
如本发明中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。术语还用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及用于天然存在的氨基酸聚合物。术语还可包括已例如通过添加糖类残基以形成糖蛋白而被修饰的或磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可由天然存在的细胞和非重组细胞产生；或其由基因工程或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。
术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括抗体，例如抗人IL-4RA抗体(也称为IL-4RA抗体)、IL-4RA结合蛋白、具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的抗体或序列。
术语“多肽片段”是指相较于全长蛋白质具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。此类片段还可相较于全长蛋白质含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度为约5至500个氨基酸。例如，片段的长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在人IL-4RA抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的部分或正好其包括2个CDR的可变结构域等。
术语“人IL-4RA”、“hIL-4RA”、“人IL-4受体A”、“人IL-4受体α亚基”可互换使用并指人白介素4受体α亚基。人IL-4RA是指其成熟肽(GenbankID:NP_001244336.1)。IL-4和IL-13是IL-4RA的主要内源激动剂。除非另外指定或根据其中使用术语的上下文清楚地了解，否则“IL-4RA”是指人IL-4RA。
多肽的“衍生物”是以与插入、缺失或取代变体不同的方式，例如通过另一种化学部分的缀合而化学修饰的多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)，例如缀合PEG的多肽。
如本发明中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本发明中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。在分子结合动力学测定的几个参数中，KD值为解离平衡常数，在抗体药物研究中，是表征被测抗体与靶抗原分子亲和作用的强弱的参数，计算方法为KD＝kdis/kon，平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。kon，结合速率常数＝抗原抗体复合物形成的速率，kon愈小提示抗体与抗原结合的速度愈快；kdis，解离速率常数＝抗体从抗原-抗体复合物中解离的速率，kdis愈小即抗体从抗原上脱离的速度愈慢，抗体与抗原结合越稳固。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，L1蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪或Fortebio分子相互作用仪中测定的。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本发明中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文中使用的，术语"百分比序列同一性"与"百分比序列同源性"可互换使用。
如本文中使用的，术语“相似性”或“序列相似性”、“同一性”是指两个或更多个蛋白质或多肽分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列测定的。“百分比同一性”意指被比较的分子中的氨基酸之间的相同残基的百分比，并且可基于待比较的最小的分子的大小来计算。为了进行这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的缺口(如果有的话)。当用于多肽时，术语"大体上的同一性"，是指两个肽序列，当例如使用程序GAP或BESTFIT，利用程序提供的缺省缺口权重，进行最佳对齐时，共有至少70％、75％或80％的序列同一性，至少90％或95％的序列同一性，和至少97％、98％或99％的序列同一性。在某些情况下，不相同的残基位点相异在于保守氨基酸置换。"保守氨基酸置换"是这样的置换，即其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如，电荷或正在水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。一般地，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守置换的情况下，可上调百分比序列同一性以就置换的保守性质进行修正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见例如Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族羟基侧链:甘氨酸、丙氨酸、缅氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链:苯丙氨酸、醋氨酸和色氨酸；5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可选择地，保守置换是在Gonnet等人，Science 256:1443-45(1992)(通过引用合并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250 1og-1ikelihood matrix)中具有正值的任何变化。“中度保守的”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量多肽的序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给不同置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性的量度来匹配序列。例如，GCG包括程序例如"Gap"和"Bestfit"，所述程序(使用由程序指定的缺省参数)可用于测定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1(University of Wisconsin，WI)。还可使用缺省或推荐的参数利用FASTA比较多肽序列，参见GCG Version6.10FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.183:63-98(1990):Pearson,Methods Mo l.Biol.132:185-219(2000))。当将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库相比较时，另一个优选算法是计算机程序BLAST，特别地blastp或tblastn(使用程序提供的缺省参数)。参见，例如，Altschul等人，Mo l.Biol.215:403-410(1990):Al tschul等人，Nucleic AcidsRes.25:3389-402(1997)
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如IL-4RA与IL-4结合相关的疾病如嗜酸性粒细胞性食管炎)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如例如IL-4RA与IL-4结合相关的疾病如嗜酸性粒细胞性食管炎)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
施用方式
下述内容并非限制本发明的抗体或其抗原结合片段、所述的抗体偶联物、融合蛋白、药物或者所述的多(双)特异性抗体的施用方式。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、所述的抗体偶联物、融合蛋白、药物或者所述的多(双)特异性抗体可以配制成适合于单次或多次施用的药物组合物。
本发明的抗体或其抗原结合片段、所述的抗体偶联物、融合蛋白、药物或者所述的多(双)特异性抗体以适合的各种途径施用，包括但不限于，口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部、皮下、腹膜内、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、所述的抗体偶联物、融合蛋白、药物或者所述的多(双)特异性抗体口服施用或注射施用，例如静脉注射或腹腔注射。
本文中使用的短语“胃肠外施用”是指，通过注射进行的除了肠内和局部施用以外的施用模式，且包括但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。
在某些实施方案中，所述相关因子抑制剂(例如，抗人IL-4R抗体)通过非胃肠外途径施用，在某些实施方案中，口服施用。其它非胃肠外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。还可以执行施用，例如，一次、多次，和/或在一个或多个延长的时间段中。本发明的抗体或其抗原结合片段、所述的抗体偶联物、融合蛋白、药物或者所述的多(双)特异性抗体适合的剂型，包括但不限于，片剂、含片、丸剂、胶囊剂(例如硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂)、酏剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂(肌肉内、静脉内、腹腔内)、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液、分散剂和用于口服或非口服给药的缓释制剂的剂型。
本发明的药物含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。
相对于现有技术，本发明具有例如如下优点：
本发明抗人IL-4RA抗体能够以高亲和力与人IL-4RA结合，并通过阻断人IL-4和人IL-13与人IL-4RA结合来抑制人IL-4和人IL-13介导的相关细胞生物学效应，如细胞增殖、IL-4和IL-13诱导的CD23表达水平的上调等。具有活性高、排除种属差异性等优点，可用于制备阻断人IL-4和IL-13与人IL-4RA结合的药物、制备治疗或预防例如嗜酸性粒细胞性食管炎的药物，具有良好的应用前景和市场价值。
附图说明
图1：13E5和Dupilumab与抗原人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc的结合活性。
图2：13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3和Dupilumab与抗原IL-4RA-mFc的结合活性。
图3：13E5H4L2、13E5H4L4、和Dupilumab与抗原IL-4RA-mFc的结合活性。
图4：13E5和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性。
图5：13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性。
图6：13E5H4L2、13E5H4L4、和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性。
图7：13E5H4L4和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性检测结果。
图8：13E5H4L4与人IL-4RA亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图9：Dupilumab与人IL-4RA亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图10：13E5H1L1与人IL-4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图11：13E5H2L2与人IL-4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图12：13E5H3L3与人IL-4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.39nM。
图13：13E5H4L2与人IL-4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图14：Dupilumab与人IL-4RA亲和力常数检测结果。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0.39nM。
图15：13E5H1L1、13E5H2L2和Dupilumab抑制IL-4诱导的TF-1细胞的增殖。
图16.：13E5H1L1、13E5H2L2和Dupilumab抑制IL-13诱导的TF-1细胞的增殖。
图17.：13E5H4L2、13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-4诱导的TF-1细胞的增殖。
图18.：13E5H4L2、13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-13诱导的TF-1细胞的增殖。
图19.：13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-4诱导的单核细胞CD23表达水平上调。
图20.：13E5H4L4和Dupilumab抑制IL-13诱导的单核细胞CD23表达水平上调。
图21：13E5H4L4抑制GM-CSF处理后的嗜酸性粒细胞向IL-4趋化。
图22：13E5H4L4抑制IL-4诱导的HUVEC细胞分泌CCL26。
图23：13E5H4L4抑制IL-4诱导的A549细胞分泌CCL26。
图24：13E5H4L4和Dupilumab抑制嗜酸性粒细胞向IL-4处理后的HUVEC细胞上清趋化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明的下述实施例中，使用的BALB/C小鼠购自广东省医学实验动物中心。
在本发明的下述实施例1-8中，所用的阳性对照抗体Dupilumab VAB 16F3-1(以下简称Dupilumab)，生产自中山康方生物医药有限公司，其序列参考RegeneronPharmaceuticals,Inc的专利，申请号：PCT/US2007/021210中所述的抗体VAB 16F3-1重链可变区(序列如SEQ ID NO：70所示；恒定区为Ig gamma-1chain C region,ACCESSION:P01857)以及与抗体VAB 16F3-1轻链可变区(编码序列如SEQ ID NO：71所示；恒定区为Igkappa chain C region；ACCESSION:P01834)。
本发明中同型对照抗体hIgG(也写作hIgG4)重链序列为SEQ ID NO:68,轻链序列为SEQ ID NO:69。
实施例1抗人IL-4RA的抗体13E5的制备
1杂交瘤细胞株13E5的制备
制备抗IL-4RA抗体所用的抗原IL-4RA-mFc是人IL-4RA成熟肽(GenbankID:NP_001244336.1)与mFc标签(SEQ ID NO:67)的融合蛋白(中山康方生物医药有限公司合成)并用于免疫BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)。参考目前已存在的技术方法(例如，Stewart,S.J.,“Monoclonal Antibody Production”,in Basic Methods in antibodyProduction and Characterization,Eds.G.C.Howard and D.R.Bethell,Boca Raton:CRCPress,2000)取经抗原免疫的BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞通过细胞融合技术形成杂交瘤细胞。用IL 4RA-hFc蛋白(其中IL-4RA同上，hFc为人IgG Fc纯化标签，具体为Ig gamma-1chain C region，Genbank编号：P01857，位置114-330)作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA法筛选，得到分泌与IL-4RA-hFc特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对间接ELISA筛选得到的杂交瘤细胞，通过竞争ELISA筛选出能够分泌与配体IL4-N-his(IL4的NCBI Gene ID:AAH70123.1)竞争结合IL-4RA-hFc的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到两株稳定分泌抗人IL-4RA抗体的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株分别命名为杂交瘤细胞株LT008，其分泌的单克隆抗体分别命名为13E5。
杂交瘤细胞株LT008(IL-4RA-13E5)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2018131，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2.抗人IL-4RA的抗体13E5的制备
用CD培养基(Chemical Defined Medium)对上面制得的LT008细胞株分别进行培养(CD培养基，内含1％青链霉素，于5％ CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体13E5。
实施例2：抗人IL-4RA的抗体13E5的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1中培养的LT008细胞株中提取mRNA。
按照InvitrogenIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，片段长348bp。其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，长度为116个氨基酸，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO:7所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示，长度为107个氨基酸，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO:10所示。
实施例3：抗人IL-4RA的人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4的设计和制备
1.抗IL-4RA人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4的轻链和重链序列的设计
根据人IL-4RA蛋白的三维晶体结构(Hage T,Reinemer P,Sebald W.Crystals ofa 1:1complex between human interleukin-4and the extracellular domain of itsreceptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2):831-6.)以及实施例2获得的抗体13E5的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，Iggamma-4chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体13E5H1L1的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO:7所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO:10所示。
(2)人源化单克隆抗体13E5H2L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO:7所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：10所示。
(3)人源化单克隆抗体13E5H3L3的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO:7所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO:10所示。
(4)人源化单克隆抗体13E5H4L4的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:23所示，其长度为348bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，长度为116aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO:7所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，长度为321bp。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，长度为107aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO:10所示。
(5)人源化单克隆抗体13E5H4L2的重链和轻链序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:23；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:24；
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:17所示；
其编码的氨基酸序列SEQ ID NO:18所示。
2.人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-4chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。
将13E5H1L1重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、13E5H2L2的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、13E5H3L3的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA、13E5H4L2的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA和13E5H4L4的重链可变区cDNA和轻链可变区的cDNA，分别克隆到pUC57 simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-13E5H1，pUC57simple-13E5L1，pUC57simple-13E5H2，pUC57simple-13E5L2，pUC57simple-13E5H3，pUC57simple-13E5L3，pUC57simple-13E5H4和pUC57simple-13E5L4。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，酶切得到可变区片段，亚克隆到含有相应重链恒定区片段和含有相应轻链恒定区片段的pcDNA3.1载体(对于重链恒定区片段，通过限制酶(HindIII&EcoRI)的酶切克隆入载体pcDNA3.1中；对于轻链恒定区片段，通过限制酶(HindIII&EcoRI)的酶切克隆入载体pcDNA3.1中)中获得pcDNA3.1-13E5H1，pcDNA3.1-13E5L1，pcDNA3.1-13E5H2 pcDNA3.1-13E5L2，pcDNA3.1-13E5H3，pcDNA3.1-13E5L3，pcDNA3.1-13E5H4和pcDNA3.1-13E5L4。随后将含有相应的轻、重链重组质粒一起(pcDNA3.1-13E5H1和pcDNA3.1-13E5L1，pcDNA3.1-13E5H2和pcDNA3.1-13E5L2，pcDNA3.1-13E5H3和pcDNA3.1-13E5L3，pcDNA3.1-13E5H4和pcDNA3.1-13E5L4，以及pcDNA3.1-13E5H4和pcDNA3.1-13E5L2)分别转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4。
实施例4.ELISA方法检测抗体与抗原的结合活性
1.鼠源抗体13E5和人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4与抗原人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc的结合活性
1.1采用间接ELISA方法检测抗体13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4与抗原人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc的结合活性。
实验步骤：酶标板中包被人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc并进行孵育，封闭后分别加入待测抗体，经孵育洗板后，加入山羊抗鼠IgG(H+L)，HRP(购自Jackson ImmunoResearchInc.，货号：109-035-062)或山羊抗人IgG(H+L)，HRP(购自Jackson ImmunoResearch Inc.，货号：109-035-088)，孵育洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色反应，显色终止后在酶标仪中检测450nm波长吸光度。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
450nm读数结果显示：抗体13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4均能有效地结合抗原人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc，其结合效率呈剂量依赖关系。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图分析，结果表明如表1、表2、表3所示，13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4均可与抗原人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc有效结合，结合活性与同靶点阳性对照抗体Dupilumab相当(图1、图2、图3)。
表1：13E5和Dupilumab与抗原人IL-4RA-hFc或人IL-4RA-mFc的结合活性。
表2：13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3和Dupilumab与抗原IL-4RA-mFc的结合活性。
表3：13E5H4L2、13E5H4L4、和Dupilumab与抗原IL-4RA-mFc的结合活性。
1.2采用竞争ELISA方法检测抗体13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4阻断IL4-N-his与抗原IL-4RA-hFc结合的活性
采用ELISA的方法测定13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4与靶抗原的配体人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的EC50(半数效应浓度)，以考察13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和13E5H4L4阻断靶抗原的配体与人IL-4RA-hFc结合的活性。
酶标板中包被人IL-4RA-hFc并进行封闭后，分别加入待测抗体，然后加入等体积的人IL4-N-His(中山康方生物医药有限公司合成)进行混匀并孵育，洗板后加入小鼠抗-his，HRP(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285A)并孵育，洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色并终止。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。具体检测结果列在表4、表5、表6中。
以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图得到所检测抗体相应的阻断EC50。由图4、图5、图6可见，13E5、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2和13E5H4L4均能有效地阻断配体人IL4-N-His与抗原人IL-4RA-hFc的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系，其中13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2和13E5H4L4与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性均优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab。
表4：13E5和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性检测结果
表5：13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性检测结果
表6：13E5H4L2、13E5H4L4、和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性检测结果
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2.人源化抗体13E5H4L4与抗原IL-4RA-hFc的结合活性
2.1采用竞争ELISA方法检测抗体13E5H4L4阻断IL4-N-his与抗原IL-4RA-hFc结合的活性。
采用ELISA的方法测定13E5H4L4与靶抗原的配体人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的EC50(半数效应浓度)，以考察13E5H4L4阻断靶抗原的配体与人IL-4RA-hFc结合的活性。
酶标板中包被人IL-4RA-hFc并进行封闭后，分别加入待测抗体，然后加入等体积的人IL4-N-His(中山康方生物医药有限公司合成)进行混匀并孵育，洗板后加入小鼠抗-his,HRP(购自康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285A)并孵育，洗板后用TMB(Neogen，308177)进行显色并终止。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。具体检测结果列在表7中。
以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图得到所检测抗体相应的阻断EC50。由图7可见，13E5H4L4能有效地阻断配体人IL4-N-His与抗原人IL-4RA-hFc的结合，阻断效率呈现剂量依赖关系，其中13E5H4L4与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性均优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab。
表7：13E5H4L4和Dupilumab与人IL4-N-His竞争结合人IL-4RA-hFc的活性检测结果
实施例5.人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2、13E5H4L4与人IL-4RA的亲和力常数测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2、13E5H4L4以及Dupilumab与人IL-4RA的亲和力常数。
5μg/ml抗原固定在AMC传感器上，时间60s，传感器在PBST中平衡300s，固定在传感器上的抗原与抗体结合，抗体浓度为0.39-25nM(两倍梯度稀释)，时间120s，抗原抗体在PBST中解离，时间600s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.7再生。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
人源化抗体13E5H4L4和Dupilumab(作为阳性对照)与人IL-4RA的亲和力常数测定结果见表8，检测结果如图8～9所示。
表8：13E5H4L4和Dupilumab与人IL-4RA亲和力常数检测结果
抗体名称 KD(M) kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error Rmax(nm)
13E5H4L4 2.63E-11 5.56E+06 1.60E+05 1.46E-04 9.74E-06 0.1370-0.1667
Dupilumab 1.14E-11 7.08E+06 2.15E+05 8.10E-05 1.13E-05 0.1325-0.2184
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon。
结果表明，人源化抗体13E5H4L4与人IL-4RA均有较强的结合能力，与同靶点阳性对照抗体Dupilumab相当。
人源化抗体13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2以及Dupilumab(作为阳性对照)与人IL-4RA的亲和力常数测定结果见表9，检测结果如图10-14所示。
表9：13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H3L3、13E5H4L2和Dupilumab与人IL-4RA亲和力常数检测结果
抗体 KD(M) kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error Rmax(nm)
13E5H1L1 1.00E-11 5.78E+06 1.94E+05 5.79E-05 1.12E-05 0.1347-0.2008
13E5H2L2 2.83E-11 2.44E+06 9.77E+04 6.90E-05 1.44E-05 0.1377-0.1944
13E5H3L3 1.82E-11 2.79E+06 1.46E+05 5.09E-05 1.90E-05 0.0824-0.1332
13E5H4L2 1.79E-11 1.78E+07 1.16E+06 3.18E-04 2.15E-05 0.0521-0.1012
Dupilumab 1.17E-11 2.35E+06 1.68E+05 2.75E-05 1.73E-05 0.2131-0.3131
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon。
结果表明，人源化抗体13E5H1L1与抗原亲和力优于同靶点阳性对照抗体Dupilumab；13E5H1L1、13E5H2L2与人IL-4RA的解离速率常数kdis小于同靶点阳性对照抗体Dupilumab，提示13E5H2L2与人IL-4RA的结合更为稳固。13E5H1L1、13E5H4L2与抗原人IL-4RA的结合速率常数大于同靶点阳性对照抗体Dupilumab，提示13E5H1L1、13E5H4L2与抗原人IL-4RA结合速率较Dupilumab更快。
实施例6.细胞生物学活性分析
通过细胞增殖法检测13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2、13E5H4L4阻断人IL-4和人IL-13促TF-1细胞增殖的细胞生物学活性。具体如下：
TF-1细胞(购自美国模式培养物集存库，American type culture collection，货号：CRL-2003)正常培养(完全培养液：RPMI 1640+10％FBS+2.5g/L葡萄糖+2ng/mL GM-CSF)；实验当天，离心收集TF-1细胞，不含GM-CSF的培养液重悬细胞沉淀，计数，每孔2万个细胞接种至96孔板中；按实验设计进行给药处理：抗体终浓度为0.05、0.5、5nM；IL-4设三个浓度：0.041、0.41、4.1nM，抗体组中IL-4采用0.41nM；IL-13设三个浓度：1.58、15.8、79nM，抗体组中IL-13采用15.8nM；给药后将96孔板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养72h；72h后，参照CCK8试剂盒(购自日本同仁，货号：CK04)说明书，加入CCK8试剂，混匀，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3-4h后读取OD(450nm)值。同时，绘制细胞数-OD曲线，即接种梯度稀释的TF-1细胞于96孔板，加入CCK8试剂，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3-4h后读取OD(450nm)值。根据OD值计算实验各组细胞数,GraphPad Prism 5做图。
本研究的同型对照抗体为人抗鸡蛋溶酶体(human anti-Hen Egg Lysozyme IgG，anti-HEL，即human IgG，简称hIgG)，其序列来自于Acierno等人发表的Affinitymaturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies中Fab F10.6.6序列的可变区序列(Acierno等人.J Mol Biol.2007；374(1):130-46.)，设计为本研究的同型对照抗体，在中山康方生物医药有限公司实验室制备而成。
human IgG委托南京金斯瑞生物对抗体的重轻链(全序列或可变区)基因进行氨基酸的密码子优化和基因合成，参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，采用酶切、DNA胶回收、连接转化、菌落PCR或酶切鉴定等标准的分子克隆技术将重轻链基因分别亚克隆到哺乳动物表达系统的抗体重链表达载体和抗体轻链表达载体(都是pcDNA3.1载体)，并进一步对重组表达载体的重轻链基因进行测序分析(重链序列为SEQ IDNO:68,轻链序列为SEQ ID NO:69)。测序验证正确后，大量制备去内毒素级别的表达质粒并将重轻链表达质粒瞬时共转染HEK293细胞进行重组抗体的表达。培养7天后收集细胞培养液，进行rProteinA柱(GE)亲和纯化，收获的抗体样品用SDS-PAGE和SEC-HPLC标准分析技术对其进行质量鉴定。
检测结果如图15～18所示。由图15～18可知，人IL-4和人IL-13均能有效促进TF-1细胞的增殖，且呈剂量依赖关系；相比同型对照抗体(Human IgG)，Dupilumab、13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2、13E5H4L4、均可特异性抑制由IL-4和IL-13诱导的TF-1细胞的增殖，且呈剂量依赖关系。
结果表明，13E5H1L1、13E5H2L2、13E5H4L2、13E5H4L4可特异性抑制人IL-4和人IL-13诱导的TF-1细胞的增殖，其中13E5H1L1和13E5H4L4活性与阳性对照药Dupilumab相当。
实施例7.13E5H4L4抑制PBMC细胞CD23表达水平的上调
本实施例的目的旨在通过流式细胞术检测13E5H4L4对人IL-4和人IL-13引起的人PBMC细胞表面CD23表达水平上调的中和生物活性。具体如下：
正常人外周血(肝素抗凝)，采用ficoll密度梯度离心法分离得到人新鲜PBMC，3次离心洗涤后，计数并调整细胞密度至2.5×106/mL；接种至低吸附96孔板中，每孔加入200μLPBMC(即50万/孔)；每孔对应加入25μL抗体Dupilumab和13E5H4L4(终浓度分别为30，3，0.3nM)，并设计空白对照及同型对照Human IgG(终浓度为30nM)，室温孵育30min。30min后，加入25μL人IL-4(终浓度为100pM)或25μL人IL-13(终浓度为300ng/mL)，培养箱孵育2.5天；2.5天后，收集各组PBMC至1.5mL EP管中，每管加入500μL1％ PBSA，1000xg，离心5min，去上清；加入50μLCD23-PE抗体(用1％PBSA稀释50倍)，冰上孵育40min。40min后，加入1mL1％PBSA，1000xg，离心5min，去上清。加入200μL 1％PBSA重悬细胞，转移到流式管中，上机检测。
检测结果如图19、20所示。
结果表明，人IL-4和人IL-13可上调人PBMC中单核细胞表面CD23的表达水平，13E5H4L4可特异性结合人IL-4RA，从而有效阻断IL-4和IL-13对CD23表达水平的上调。
实施例8.抗IL-4RA抗体对IL-4诱导的人嗜酸性粒细胞趋化作用的影响
健康志愿者外周血裂红后，1200rpm离心5min，15mL HBSS(即Hank's平衡盐溶液，中山康方生物医药有限公司自制)洗涤细胞2次，完全培养基(1640+10％FBS)洗涤一次，完全培养基重悬细胞计数，加入终浓度为50pM的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(peprotech，货号300-03)培养过夜。次日，将transwell小室(Thermo，货号：140629)置于24孔板中，上室加入100μL完全培养基，37℃平衡1h；收集细胞，分别与完全培养基或13E5H4L4抗体(中山康方生物医药有限公司自制，批号：201811)或同型对照抗体hIgG4(中山康方生物医药有限公司自制，批号：20190910)置于37℃孵育1h。1h后，弃掉上室中的完全培养基，将细胞与完全培养基或抗体的预孵液加入上室中，下室分别加入400μL含1nM IL-4(peprotech，货号200-04)的完全培养基，置于37℃培养箱趋化2.5h。2.5h后取出上室，收集下室细胞，离心洗涤，加入FITC标记抗人CD66b抗体(Biolegend，货号305104)和APC标记抗人CD16抗体(Biolegend，货号302012)冰上避光孵育30min，离心洗涤后200μL 1％PBSA(PBS+1％BSA(sigma，货号：V900933-1KG))重悬细胞，流式仪上机检测下室中的嗜酸性粒细胞的浓度。趋化抑制率％＝(对照组嗜酸性粒细胞浓度-实验组嗜酸性粒细胞浓度)/对照组嗜酸性粒细胞浓度*100％。
结果如图21所示，相对于同型对照，抗IL4-RA抗体13E5H4L4能有效抑制GM-CSF处理后的嗜酸性粒细胞向IL-4趋化。
实施例9.抗IL-4RA抗体抑制IL-4刺激引起的CCL26分泌
细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-13等)能够刺激内皮细胞产生大量趋化因子。EoE中过表达的IL-4和IL-13刺激食管鳞状细胞产生趋化因子eotaxin-3(CCL26)，这是一种有效的嗜酸性粒细胞趋化剂，可以将激活的嗜酸性粒细胞趋化到食管，进行脱颗粒并释放有毒产物，导致食管损伤和重塑，CCL26也被证明在嗜酸性食管炎病变中高表达(Rothenberg M E.Biology and Treatment of Eosinophilic Esophagitis[J].Gastroenterology,2009,137(4):1238-1249)。
收集人非小细胞肺癌细胞系肺泡基底上皮细胞A549(购自中国科学院)，用10％FBS的DMEM重悬细胞，5x 105/孔/500μL接种于24孔板中，培养于37℃，5％二氧化碳培养箱；收集人脐静脉内皮细胞HUVEC(购自澳赛尔斯)，用内皮细胞培养基重悬细胞，5x 105/孔/500μL接种于24孔板中，培养于37℃，5％二氧化碳培养箱；2h后，待细胞贴壁，添加IL-4(购自peprotech，货号：200-04)和抗体刺激3天；收集细胞上清，用试剂盒(R&D，货号：DCC260B)检测CCL26含量。
结果如图22-23所示。结果表明，在HUVEC细胞和A549细胞体系中，抗IL-4RA抗体13E5H4L4能降低IL-4刺激引起的CCL26的分泌，且具有较好的浓度依赖性，与IL-4组相比，***p<0.001。
实施例10.抗IL-4RA抗体抑制IL-4刺激引起的嗜酸性粒细胞的趋化作用
收集HUVEC细胞，用10％FBS的DMEM或内皮细胞培养基重悬细胞，5x 105/孔分别接种于不同的24孔板中，培养于37℃，5％二氧化碳培养箱2h，待细胞贴壁，添加IL-4和抗体处理3天；收集细胞上清作为条件培养基。用肝素钠抗凝剂采集新鲜血液(来自健康捐献者)；将新鲜血液与HBSS按1：3混匀；加入Ficoll于50mL离心管中，按3：4比例缓慢加入稀释后的血液于液面上层，25℃，420xg离心30min，升5降0。吸去上层，取下层红细胞层；按1：5体积比加入1X裂红液，轻微涡旋，裂红15-20min，25℃，1200xg离心5min；收集粒细胞，加入10mLHBSS重悬细胞，25℃，1200xg离心5min，洗两次。用1640培养基洗涤一次；AOPI计数和活率；嗜酸性粒细胞分选试剂盒(miltenyi，货号：130-092-010)分离嗜酸性粒细胞(EOS)；将transwell小室置于24孔板上，上室加入100μL 1640培养基，37℃平衡1h；取嗜酸性粒细胞(EOS)，按100μL/孔(20万细胞)加入到上室，下室分别加入400μL条件培养基(即上述细胞上清)，置于培养箱趋化2.5h；取出上室，收集下室细胞，250xg离心5min去上清；加入FITC抗-人CD66b抗体(1μL/100μL)(Biolegend，货号305104)和PE抗-人CD16抗体(1μL/100μL)(Biolegend，货号360704)荧光抗体孵育，洗涤后用200μL 1％PBSA重悬，上机50μL分析EOS细胞数。抑制率％＝(IL-4组-抗体组)/(IL-4组)x 100％，各处理组扣除空白对照组后计算。
结果如图24所示。结果表明，在经IL-4处理后的HUVEC细胞上清中，随着抗IL-4RA抗体浓度增加，其对EOS趋化抑制作用增强，表明抗IL-4RA抗体能够梯度抑制IL-4刺激引起的嗜酸性粒细胞的趋化作用。并且在HUVEC细胞体系中，13E5H4L4对EOS的趋化抑制率高于阳性对照dupilumab(购自Regeneron，批号：7L615F)对EOS的趋化抑制率，13E5H4L4对IL-4刺激引起的EOS趋化抑制效果更好。
与IL-4组相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列(备注：下划线表示CDR区)
13E5重链可变区：
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13E5轻链可变区
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13E5H1重链可变区
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13E5L1轻链可变区
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13E5H2重链可变区
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13E5L2轻链可变区
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13E5L3轻链可变区
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13E5H4重链可变区
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13E5L4:轻链可变区
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13E5重链骨架区
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:
13E5轻链骨架区
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mFc标签的序列：
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hIgG的重链序列
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hIgG的轻链序列
DIELTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYTSQSMS
GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSGSWPRTFGGGTKLDIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:69)VAB 16F3-1 VH-2
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCEASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGLS RTSVSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLEMNSLRPEDTALYYCAKWGTRGYFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：70)
16F3-1 VL
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISIWLAWYQQSPGKAPKLLINVASRLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFVTYYCQQANSFPITFGQGTRLATK(SEQ ID NO：71)

Claims (12)

1.抗体或其抗原结合片段，特别地，所述抗体或其抗原结合片段结合IL-4RA，优选人IL-4RA，用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎，其中：根据Kabat，IMGT，Chothia或AbM编号系统，所述抗体包含：
SEQ ID NO:2所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，
优选地，根据IMGT编号系统，所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO:6所示的序列或其变体，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，或由其组成，
并且所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO:8所示的序列或其变体，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO:9所示的序列或其变体，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:10所示的序列或其变体，或由其组成，
其中所述变体的序列为与对应序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
2.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包括：
(1)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体；
(2)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体；
(3)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体；
(4)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其变体；
(5)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其变体；
(6)(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其变体，和
(ii)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体；或
其中所述变体的序列为与对应序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
3.权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链可变区的框架区FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，和轻链可变区的框架区FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中
(1)FR-H1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和
FR-L4包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
(2)FR-H1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和FR-L4包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(3)FR-H1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和FR-L4包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(4)FR-H1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和FR-L4包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列或其变体，或由其组成；(5)FR-H1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-H4包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L1包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L2包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
FR-L3包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或其变体，或由其组成；和FR-L4包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列或其变体，或由其组成；
其中所述变体的序列与对应序列具有至少80％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
5.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的恒定区是人源化的，优选来自人IgG，更优选IgG4。
6.权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链恒定区采用Iggamma-4链C区，更优选GenBank登记号为ACCESSION：P01861.1的Ig gamma-4链C区；轻链恒定区采用Ig kappa链C区，更优选GenBank登记号为ACCESSION:P01834的Ig kappa链C区。
7.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，dAb，Fab/c，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。
8.生物材料，所述生物材料选自抗体偶联物，多特异性抗体(优选双特异性抗体)，融合蛋白或药物组合物，用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎，所述生物材料包含权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述抗体偶联物还包含与所述的抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分，所述偶联部分选自纯化标签(如His标签)，细胞毒性剂，可检测的标记，放射性同位素，发光物质，有色物质，酶或聚乙二醇，
优选地，所述多特异性抗体还包含针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段，
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
优选地，所述药物组合物为单独使用或者与一种或多种药物联用。
优选地，所述药物组合物为适合于口服施用于胃肠道(GI)的剂型，优选地，所述剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂；或所述药物为适合于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射、病灶内注射的剂型。
9.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求8所述的生物材料在制备用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎的药物或试剂盒中的用途，优选所述试剂盒还包含另外的治疗剂，所述治疗剂选自如下的一种或多种：IL-4/IL-13通路抑制剂、IL-1β抑制剂、IL-5抑制剂、IL-8抑制剂、IL-9抑制剂、IL-13抑制剂、IL-17抑制剂、IL-25抑制剂、JAK抑制剂、STAT6抑制剂、TNF抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)抑制剂、IgE抑制剂、前列腺素D2抑制剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、糖皮质激素、长效β2-激动剂(如沙美特罗或福莫特罗)、质子泵抑制剂、减充血剂、抗组胺剂和非类固醇抗炎剂(NSAID)、NSAID(非甾体抗炎药)、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、治疗肿瘤的药物(优选为化疗剂或生长抑制剂，靶向治疗剂，抗体-药物缀合物，表达嵌合抗原受体的T细胞，抗体或其抗原结合片段，血管生成抑制剂，抗肿瘤剂，癌症疫苗，佐剂及其组合，烷化剂，抗代谢药物，抗生素，植物类药物和/或激素类药物)，
其中所述IL-4/IL-13通路抑制剂不是权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述的IL-4/IL-13通路抑制剂选自抗IL-4抗体、抗IL-13抗体、抗IL-4/IL-13抗体、IL-4受体(IL-4R)抑制剂(如Dupilumab抗体或其生物等价物、AMG317或MEDI9314)、JAK抑制剂、STAT6抑制剂。
10.治疗嗜酸性粒细胞性食管炎的方法，包括给需要的受试者施用权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求8所述的生物材料，优选地，所述受试者选自哺乳动物(诸如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物)，优选地，所述受试者是人，更优选0-1岁婴儿、1-5岁儿童、6-12岁少年、12-18岁青少年及18岁以上成人。
11.权利要求10所述的方法，其中所述方法还包括给受试者施用另外的治疗剂或者联合疗法，所述治疗剂选自如下的一种或多种：IL-4/IL-13通路抑制剂、IL-1β抑制剂、IL-5抑制剂、IL-8抑制剂、IL-9抑制剂、IL-13抑制剂、IL-17抑制剂、IL-25抑制剂、JAK抑制剂、STAT6抑制剂、TNF抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)抑制剂、IgE抑制剂、前列腺素D2抑制剂、免疫抑制剂、皮质类固醇、糖皮质激素、长效β2-激动剂(如沙美特罗或福莫特罗)、质子泵抑制剂、减充血剂、抗组胺剂和非类固醇抗炎剂(NSAID)、NSAID(非甾体抗炎药)、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、治疗肿瘤的药物(优选为化疗剂或生长抑制剂，靶向治疗剂，抗体-药物缀合物，表达嵌合抗原受体的T细胞，抗体或其抗原结合片段，血管生成抑制剂，抗肿瘤剂，癌症疫苗，佐剂及其组合，烷化剂，抗代谢药物，抗生素，植物类药物和/或激素类药物)，或其组合，所述联合疗法包括饮食疗法和食管扩张术，
其中所述IL-4/IL-13通路抑制剂不是权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述的IL-4/IL-13通路抑制剂选自抗IL-4抗体、抗IL-13抗体、抗IL-4/IL-13抗体、IL-4受体(IL-4R)抑制剂(如Dupilumab抗体或其生物等价物、AMG317或MEDI9314)、JAK抑制剂、STAT6抑制剂，
更优选地，所述另外的治疗剂与权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段同时或顺序施用。
12.杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO:C2018131，或由所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎。
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