CN117084232A - 一种脐带保存液及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脐带保存液，每100ml的脐带保存液中含有：复方电解质注射液91.8‑94.8ml、20％人血白蛋白5ml、庆大霉素0.2‑3.2ml；所述复方电解质注射液的成分配比为：每100ml的复方电解质注射液中含有氯化钠0.526g，葡萄糖酸钠0.502g，醋酸钠0.368g，氯化钾0.037g，氯化镁0.03g；所述庆大霉素为浓度为40mg/ml的硫酸庆大霉素注射液，成分为硫酸庆大霉素及无菌注射水；所述脐带保存液的保存温度为2‑8度。通过本发明提供的脐带保存液能够实现脐带在长途运输过程中的保存，该种保存液不仅可以确保脐带在长途运输过程中的稳定性，还可以有效抑制细菌生长，从而保障脐带生产的生物制品的有效性和安全性。

Description

一种脐带保存液及制备方法

技术领域

本发明涉及医疗用品技术领域，具体地，涉及一种脐带保存液及制备方法。

背景技术

脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是存在于脐带华通氏胶(Wharton’s jelly)和血管周围组织中的一种间充质干细胞，因其取材方便，无道德伦理争议，获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌生长因子的总量高，便于扩增和传代，极其适合用于科研及临床研究，是间充质干细胞的理想来源，成为应用最广泛的干细胞。

间充质干细胞在临床上的应用具有重要影响。但是目前用于临床治疗的间充质干细胞研究方面尚存有缺陷。现有技术中的脐带保存液由复方电解质注射液组成，主要维持溶液的ph和渗透压，模拟人体内环境从而保持脐带的稳定；人血白蛋白主要起到维持渗透压和营养供给的作用。

当孕妇分娩后，与胎儿的脐带将会从医院长途冷链运输到实验室中，我们要确保脐带处于一个相对稳定并且无菌的状态，现有技术中有很多保证脐带稳定无菌的保存液，但仍然需要一种可长时间确保脐带在长途运输中更稳定的无菌保存液。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种脐带保存液，以解决提升脐带保存液抑菌效果的问题，每100ml的脐带保存液中含有：复方电解质注射液91.8-94.8ml、20％人血白蛋白5ml、庆大霉素0.2-3.2ml；

所述复方电解质注射液的成分配比为：每100ml的复方电解质注射液中含有氯化钠0.526g，葡萄糖酸钠0.502g，醋酸钠0.368g，氯化钾0.037g，氯化镁0.03g；所述脐带保存液的保存温度为2-8度。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明提供的脐带保存液有效的限制了抗生素的使用，减少了脐带保存液中抗生素的种类，降低了抗生素的使用浓度。

实验证明虽然本发明减少了抗生素的作用，但是因为庆大霉素的加入，还是可以有效的抑制细菌的感染，并且本发明中的庆大霉素含量低于现有技术且符合药典的相关规定。本发明提供的脐带保存液中的复方电解质注射液与现有技术中的生理盐水相比更能显著提高脐带细胞的爬出量。

说明书附图

图1为本发明实施例提供的实验阶段流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的特点是使用复方电解质注射液代替生理盐水，显著提高了脐带细胞的爬出量；添加了人血白蛋白补充了能量来源；同时只添加微量庆大霉素这一种抗生素，不仅抑菌效果显著，而且最终生物制品符合药典对抗生素残留量的要求。

在一种实施例中，一种脐带保存液，每100ml的脐带保存液中含有：复方电解质注射液91.8-94.8ml、20％人血白蛋白5ml、庆大霉素的范围为0.2-3.2ml。

所述脐带保存液，每100ml的脐带保存液中含有：复方电解质注射液94.6ml、20％人血白蛋白5ml、庆大霉素的范围为0.4ml。

所述复方电解质注射液的成分配比为：每100ml的复方电解质注射液中含有氯化钠0.526g，葡萄糖酸钠0.502g，醋酸钠0.368g，氯化钾0.037g，氯化镁0.03g；所述脐带保存液的保存温度为2-8度。

所述庆大霉素为浓度为40mg/ml的硫酸庆大霉素注射液，成分为硫酸庆大霉素及无菌注射水。

在一种实施例中，上述脐带保存液的制备方法为：

a.调整环境温度，使环境温度保持在20-24度；

b.使用无菌注射器、移液管、采集瓶、培养瓶进行制备；

c.用注射器将袋装复方电解质注射液全部转移到培养瓶1中；

d.用注射器将袋装20％人血白蛋白全部转移到培养瓶2中；

e.用移液器取94.6ml复方电解质注射液于采集瓶中；

f.用移液器取5ml的20％人血白蛋白加到含复方电解质注射液的采集瓶中；

g.用无尘布包裹装有庆大霉素的玻璃瓶，掰断瓶口，并用移液枪取0.4ml加入到采集瓶中；

h.将采集瓶拧紧，用封口膜封上，上下颠倒混匀得到配制完成的脐带保存液；

i.将配制好的脐带保存液置于2-8℃保存。

在一种实施例中，上述脐带保存液的使用方法是：将新生儿脐带采集以后，依次用生理盐水和酒精清洗，然后将脐带放入脐带保存液中，脐带应完全浸没在脐带保存液中。放入脐带后的脐带保存液立即放入冷链物流公司专用的冷链运输箱，随后冷链运送(2-8℃)。

为验证以上脐带保存液的有益效果，检测脐带在本实施例的保存液中的保存情况；为了检测抑菌效果、庆大霉素残留率与细胞爬出量，设计如下试验四个实验阶段。如图1所示，图1为本发明实施例提供的实验阶段流程图。参考图1，本发明具有四个实验阶段，具体如下：

实验的第一阶段是庆大霉素的抑菌效果实验，用来检测脐带保存液最基本的功效，抑菌效果。抑菌效果试验的具体步骤如下：

脐带保存液分组设计；

实验步骤一，配制保存液。

配制保存液的过程中将配制两组保存液用于做比较实验，分别为保存液1组和保存液2组，其中，1组不添加庆大霉素，2组添加庆大霉素。本实施例的实验步骤一的设计，是用于比较保存液中添加庆大霉素与不添加庆大霉素对保存液抑菌效果的影响，用来验证庆大霉素是否会提升保存液的抑菌功能。本实验保存液的相关成分如下表表1所示，所用硫酸庆大霉素注射液初始浓度为40mg/ml，成分为硫酸庆大霉素及无菌注射水；本实验环节会对保存液的无菌、支原体两项指标进行检测。本次实验进行6-8根脐带的样本采集，对以上脐带进行编号以方便实验进行比对。

表1，为两组保存液的相关成分

实验步骤二，脐带检测。

完成保存液配制后，将会进行脐带检测。为保证快速洁净采集实验用脐带，脐带在采集后将放入保存液。装有脐带的保存液立即放入冷链运输箱，随后冷链运送，运送过程中环境温度保持在2-8℃。医院接收后先对脐带血进行特殊人源病毒检查，各项病毒检测为阴性后，方可接受。

实验步骤三，保存液检测。

脐带取出保存液后，将脐带保存液送检无菌检查，本实施例中的无菌检测方法为薄膜过滤法。将脐带保存液以薄膜过滤法进行无菌检测并得出检测数据，无菌检测方法为薄膜过滤法。

实验步骤四，检测结果分析。

针对以上无菌检查和支原体检查结果进行分析，评估在添加庆大霉素和不添加庆大霉素的脐带保存液的无菌检测效果。保存液添加硫酸庆大霉素的无菌保证效果和脐带组织原代分离工序的清洗效果。下表表2是所有带编号的脐带进行保存液无菌检测的检测结果的罗列。

表2，为脐带的保存液无菌检测结果

通过上述实验数据可以得出，添加庆大霉素组的保存液污染率为25％，不添加庆大霉素组的保存液污染率为71.4％，故本发明脐带保存液中添加庆大霉素可以有效地抑制细菌生长。

实验的第二阶段是庆大霉素浓度探究。

具体步骤为：

实验步骤五，不同硫酸庆大霉素浓度脐带保存液配制

使用初始浓度为40mg/ml的硫酸庆大霉素注射液，按照下表表3配制不同浓度硫酸庆大霉素脐带保存液。

表3，为不同浓度的硫酸庆大霉素的脐带保存液配比表

实验步骤六，制备菌悬液

取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌定量菌株各1支，添加1ml菌种复溶液，混合均匀，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；

以上菌悬液在供实验的同时，采用平板技术法按规定条件培养后计数；

实验中的菌悬液，采用平板计数法按规定条件培养后计数；

菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用以保证功效；

菌悬液若在2-8度下放置，应在24小时内使用。

实验步骤七，模拟脐带采集保存

生产中脐带保存液和脐带运输温度为2-8度，脐带分离时间需要小于等于96小时。模拟生产的情况，取制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌液，按(50-100)cfu/瓶，加入不同浓度硫酸庆大霉素浓度脐带保存液中，2-8度保存96小时。

实验步骤八，保存液中硫酸庆大霉素抑菌效果评价

取3支已保存96小时的脐带保存液100ml，在集菌管中过滤，用300ml的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml，共冲洗3次。冲洗后加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，于30-35度条件下培养不超过3天。

实验步骤九，检测结果分析

观察阳性组及不同浓度硫酸庆大霉素保存液组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌生长情况，分析不同浓度硫酸庆大霉素的抑菌效果来得出庆大霉素浓度中的最佳含量。

通过对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为代表的抑菌结果测试，保存液中硫酸庆大霉素浓度添加到80μg/ml以上时，可实现抑菌生长。

实验的第三阶段是庆大霉素残留量检测实验，用来检测脐带运输后脐带本身残留的庆大霉素残留量。

实验步骤十，标准品和样品处理。

在本步骤中，采用的标准品配制方法如下：首先取500μl灭菌注射液用水和500μl样本稀释液(2×)混匀。在混匀后的混合液中取出8.1μl丢掉，加上8.1μl 1μg/ml庆大霉素标准品进行混匀。下表表4是标准品浓度与样品溶液配制比例表。

表4，标准品配制比例

实验步骤十一，加标准品样本和抗体工作液

加入标准品样本50μl到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50μl/孔，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖后置37℃避光环境中反应30min。

实验步骤十二，洗板

小心解开盖板膜，将对应的微孔内的液体甩干。在每个微孔内加入洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次洗涤间隔10S，泼掉孔内洗涤液，用吸水纸拍干(排干后未被清除的气泡可用未使用的枪头戳破)。

实验步骤十三，加酶标二抗

在微孔中加入酶标二抗100μl/孔，轻轻震荡混匀，用盖膜板盖板后置37℃避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤十二。

实验步骤十四，显色

将底物液A液双氧水和底物液B液四甲基联苯胺等体积混匀配制成底物，将底物按100μl/孔加入各微孔板中，用盖膜板盖板后置37℃避光环境中反应15min。

实验步骤十五，测定

在每个微孔中加入终止液50μl/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪450nm处，本测定在10min内读完数据，测定每孔的OD值。下表表5为各样本所对应的庆大霉素残留浓度和含量的罗列清单。

表5，为样本对应的庆大霉素残留情况

按照上表的结果显示，样本编号如下：11501、20501、22201、51001、52101、70601、71601的七组脐带样本，他们的庆大霉素残留介于0.02ng/ml至0.10ng/ml之间。

根据药典中对生物制品中庆大霉素残留没有明确要求，疫苗中庆大霉素残留要求是≤50ng/剂，本发明中生物制品每剂为10ml，因此本公司规定生物制剂中庆大霉素残留≤5ng/ml，上述样品的实验检测结果均符合要求。

实验的第四阶段是复方电解质注射液对脐带细胞爬出量的促进，用来脐带保存液中的复方电解质注射液对脐带细胞爬出量是否有促进作用。以下为本发明实施例中复方电解质注射液对脐带细胞爬出量促进的具体步骤：

实验步骤十六，配制保存液。

将复方电解质注射液、生理盐水、人血白蛋白和庆大霉素的采集瓶，外表面喷75％酒精消毒后放入操作台内。根据实验设计里的配方配制保存液1与保存液2，两种保存液各100ml。

保存液1的成分如下：94.6ml生理盐水中加入5ml的20％浓度的人血白蛋白与0.4ml庆大霉素；

保存液2的成分如下：94.6ml复方电解质注射液中加入5ml的20％浓度的人血白蛋白与0.4ml庆大霉素。

将上述两种保存液，分别做好标记。将标记好的两种保存液密封好后，在环境温度为4℃-8℃条件下运送至脐带至医院，并置于4℃冰箱内备用。

实验步骤十七，脐带组织采集及运输。

从母体分离后，一根脐带立即分成两段，分别放入两种保存液中，4℃冷链运输至公司。

实验步骤十八，脐带原代细胞分离。

将装有脐带的采集瓶传入原代细胞分离间；按照脐带自母体分离后不同时间段，分别为2天、4天和6天，进行原代细胞的分离工作，步骤如下：

采集瓶外表面喷75％酒精后传入生物安全柜内；

用灭菌镊子夹住脐带一端至瓶口外约3cm剪取2cm的一段，放置于10cm细胞培养皿中，其余放入原瓶，封闭后4℃冰箱内保存；

取出的2cm脐带第一遍用生理盐水润洗，第二遍用75％酒精润洗，第三遍再用生理盐水润洗；

用有齿镊将脐带小段外层的表皮剥净，撕开华通氏胶，先剔除2根动脉，再剔除1根静脉，用生理盐水洗净血液，再用手术刀将华通氏胶部分切成大约2-3mm见方的组织块；

每组接种3个T25培养瓶，每瓶均匀分布30个组织块，培养瓶做好组别和时间标记，37℃、5％CO₂培养箱晾干90min；

配制10％胎牛血清FBS的完全培养基，晾干结束后小心补充8ml/T25瓶，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。

实验步骤十九，换液、统计及细胞收集。

采用贴壁培养的方式，培养7天后，按8ml/瓶更换新的10％胎牛血清FBS完全培养基。注意小心吸出，缓慢加入。

采用贴壁培养的方式，培养14天后，按8ml/瓶更换新的10％胎牛血清FBS完全培养基；显微镜下观察，统计每个培养瓶内的细胞克隆数(细胞爬出的区域数量)；同时观察细胞形态，40×、100×各拍2张，保存。

采用贴壁培养的方式，培养18天后，倒置显微镜下观察细胞形态，40×、100×各拍2张，保存。将组织块和培养基全部倒出，生理盐水清洗两遍，原代细胞收集，统计细胞数量，进行分析。

另外两根脐带组织进行重复实验，收集相应数据并做统计分析。下表表6是关于以上三种贴壁培养方式，培养的3根脐带的培养情况。

表6，为贴壁培养情况

注：表格中的/表示没有爬出的细胞

从上述表6的实验数据中我们可以看出，复方电解质注射液配制而成的保存液细胞的爬出量都显著高于生理盐水组。以上实验结果说明本发明中的脐带保存液对细胞爬出量都有显著的功能提升，除了抗菌效果显著以外，还对分离间充质干细胞有着显著的作用。

本发明提出了一种脐带保存液，主要用于脐带在长途运输过程中的保存，主要由复方电解质注射液、人血白蛋白和庆大霉素组成及其配比。保存液不仅可以确保脐带在长途运输过程中的稳定性，还可以有效抑制细菌生长，从而保障脐带生产的生物制品的有效性和安全性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (6)

1.一种脐带保存液，其特征在于，每100ml的脐带保存液中含有：复方电解质注射液91.8-94.8ml、20％人血白蛋白5ml、庆大霉素0.2-3.2ml。

2.根据权利要求1所述的脐带保存液，其特征在于，每100ml的脐带保存液的优化配方含有：复方电解质注射液94.6ml、20％人血白蛋白5ml、庆大霉素的范围为0.4ml。

3.根据权利要求1所述的脐带保存液，其特征在于，所述复方电解质注射液的成分配比为：每100ml的复方电解质注射液中含有氯化钠0.526g，葡萄糖酸钠0.502g，醋酸钠0.368g，氯化钾0.037g，氯化镁0.03g。

4.根据权利要求1所述的脐带保存液，其特征在于，所述庆大霉素为浓度为40mg/ml的硫酸庆大霉素注射液，成分为硫酸庆大霉素及无菌注射水。

5.根据权利要求1所述的脐带保存液，所述脐带保存液的保存温度为2-8度。

6.一种脐带保存液的制备方法，使用权利要求1中的脐带保存液，包括如下步骤：

调整环境温度，使环境温度保持在20-24度；

使用无菌注射器、移液管、采集瓶、培养瓶进行制备；

用注射器将袋装复方电解质注射液全部转移到培养瓶1中；

用注射器将袋装20％人血白蛋白全部转移到培养瓶2中；

用移液器取94.6ml复方电解质注射液于采集瓶中；

用移液器取5ml的20％人血白蛋白加到含复方电解质注射液的采集瓶中；

用无尘布包裹装有庆大霉素的玻璃瓶，掰断瓶口，并用移液枪取0.4ml加入到采集瓶中；

将采集瓶拧紧，用封口膜封上，上下颠倒混匀得到配制完成的脐带保存液；

将配制好的脐带保存液置于2-8℃保存。