CN117083304A - c－Met蛋白结合肽复合物 - Google Patents

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Abstract

[课题]本发明提供一种与c－Met蛋白结合的肽复合物。[解决手段]一种包含肽A的肽复合物，其中，肽A是由X1－X2－X3－V－S－X4－D－X5－D－X6－P－R－W－X7－MeC(序列号1)所记载的氨基酸序列所构成的肽，或由序列号1所记载的氨基酸序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成。X1为A、MeA、F或MeF。X2为V、T、E、Q或W。X3为A、R、Y或D。X4为F、MeF、L或MeF。X5为D、E、S、P或V。X6为(S)－2－氨基庚酸(Ahp)、R、L－正亮氨酸(Nle)、(S)－2,7－二氨基庚酸(Hty)或S。X7为S、A、L－α－氨基丁酸(Abu)、D、Q或V。

Description

c－Met蛋白结合肽复合物
技术领域
本发明关于一种包含与c－Met蛋白结合的肽的复合物等。
背景技术
近年来，以使因生病、外伤等而受损的身体组织进行再生为目标的再生医疗正受到瞩目。再生医疗因使用自身的细胞而将组织进行再生，故相较于从他人移植器官等的以往方法，具有不易引起免疫问题的优点。该等再生医疗中，需要培养干细胞等来自人体的细胞，并使其分化成目标组织。又，为了创造出再生医疗的进一步改良技术，而正持续进行使用所培养的哺乳类细胞，尤其来自人体的细胞的基础研究。
在此等再生医疗、研究等中，有效率地培养成为目标的细胞并使其繁殖的步骤变得重要。
在以干细胞为首的人体细胞的培养中，培养基成分扮演着重要的角色，尤其，其中成长因子(有时亦称为GF)为最重要的要素之一。但是，成长因子一般非常昂贵，且例如在使用干细胞的研究中，为了维持未分化状态的细胞等，需要大量的成长因子。
又，成长因子之一的肝细胞成长因子(HGF：hepatocyte growth factorreceptor)及其受体亦即c－Met(有时亦称为c－Met或Met)亦作为医药品的标靶而正在进行研究。
若c－Met为单次跨膜受体型酪氨酸激酶且配位基亦即HGF与c－MET结合，则c－MET二聚化而活化。已知c－Met的活化是胚胎发育、器官形成、创伤修复所需，例如，已知HGF与受体c－Met的结合是使相关的信息传递路径活化，促进/维持特异性内皮细胞的增殖及功能，促进血管新生，再进一步从血管新生形成侧支循环。因此，正寻求具有c－Met的活化作用的化合物，并正在进行研究。
在这样的背景下，专利文献1中报告了一种具有c－Met激动剂活性的抗体。又，非专利文献1中报告了迄今正在进行开发的HGF的代替物。
又，近年来，作为代替低分子、抗体等高分子的中分子化合物，作为肽，尤其是环状肽的医药组合物等的应用正受到瞩目。例如，专利文献2及非专利文献2中记载了能利用作为c－Met蛋白激动剂的肽复合物。该能利用作为c－Met蛋白激动剂的肽复合物已知会促进细胞的增殖、迁移等，正期待使用此细胞增殖作用而应用于医药品、细胞培养时的培养基组成物等各种用途。可列举例如作为以下的有用性：在培养用于再生医疗的细胞、组织等时所添加的成长因子代替物、器官移植时的器官保护剂、再生促进剂及用于治疗导致肝细胞成长因子的表达降低的疾病的治疗药。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2021－50793
专利文献2：日本专利第6426103号公报
非专利文献1：THE CHEMICAL TIMES(关东化学股份有限公司)2020No.2p.6－11特辑再生医疗关连技术能化学合成的成长因子代替化合物的开发植木亮介及山东信介
非专利文献2：Ito,K.et.al.,Nature communications,6,Article number：6373(2015)
发明内容
发明所欲解决的课题
如同前述，在以干细胞为首的细胞的培养中，需要添加高价的成长因子，其使干细胞等的医疗应用变得困难。又，成长因子因也很有可能作为医药品，故期望开发低价且能稳定提供的成长因子的代替物。在此种状况中，如同上述的公报所记载，已发现能利用作为c－Met蛋白激动剂的肽复合物，所述c－Met蛋白激动剂包含与c－Met蛋白结合的肽。然而，上述公报所记载的肽复合物中因存在表现比人类HGF更低活性的成分，因此期望开发该肽复合物以外的与c－Met蛋白结合的复合物。
此说明书所记载的发明的目的在于解决上述课题的任一个或两个以上。
解决课题的技术手段
本发明基本上是基于由实施例而得的下述见解：序列号1所示的肽会与c－Met蛋白结合。
又，本发明基本上是基于由实施例而得的下述见解：以利用连接子使上述的肽结合而取得二聚体结构的方式所设计的肽复合物会发挥作为c－Met蛋白激动剂的功能。
第一发明涉及一种肽复合物，其包含与c－Met蛋白结合的肽A。
肽A是由X1－X2－X3－V－S－X4－D－X5－D－X6－P－R－W－X7－MeC(序列号1)所记载的氨基酸序列所构成的肽、或由序列号1所记载的氨基酸序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的与c－Met蛋白结合的肽。
X1为可经N－烷基化的氨基酸。
X2为任意氨基酸。
X3为任意氨基酸。
X4为可经N－烷基化的疏水性氨基酸。
X5为任意氨基酸。
X6为在侧链具有可有取代的烷基链的氨基酸或S。
X7为任意氨基酸。
发明功效
根据本发明，可提供一种复合物，其包含与c－Met蛋白结合的新颖的肽。
又，根据本发明，可提供一种新颖的肽复合物，其具有c－Met激动剂活性。
再者，根据本发明，可提供一种作为在培养用于再生医疗的细胞、组织等时所添加的成长因子的代替物的细胞或组织培养用的培养基组成物，其包含具有c－Met激动剂活性的新颖的肽复合物。此例如亦能利用作为器官移植时的器官保护剂、再生促进剂。
又，根据本发明，可提供一种新颖的c－Met蛋白激动剂、包含此种c－Met蛋白激动剂的医药组合物。此例如有用于作为用于导致肝细胞成长因子(HGF)的表达降低的疾病的治疗药。
再者，根据本发明，可提供一种医药组合物，其包含促进细胞增殖的新颖的c－Met蛋白激动剂。
附图说明
[图1]图1为显示使用本发明的肽复合物及人类HGF的由磷酸－c－Met AlphaLISA分析法所进行的c－Met激动剂活性测量的结果。图中，黑色方块表示c－Met激动剂活性肽复合物(肽(序列号34)与连接子(序列号37)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的复合物No.49)，X表示人类HGF。横轴表示肽复合物或人类HGF的浓度(nM)，纵轴表示将由人类HGF所诱导的活化信号的最大值设为100时的活化信号的相对值。
[图2]图2为显示使用本发明的肽复合物及人类HGF的由HUVEC细胞增殖评价所进行的c－Met激动剂活性测量的结果。图中，黑色方块表示c－Met激动剂活性肽复合物(肽(序列号34)与连接子(序列号37)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的复合物No.49)，X表示人类HGF。横轴表示肽复合物或人类HGF的浓度(nM)，纵轴表示将由人类HGF所诱导的活化信号的最大值设为100时的活化信号的相对值。
[图3]图3为显示使用本发明的肽复合物、人类HGF及人类表皮生长因子(EGF)的人类肾脏近曲小管上皮细胞的管腔形成评价试验中的3天后的结果。
[图4]图4为显示使用本发明的肽复合物、人类HGF及人类表皮生长因子(EGF)的人类肾脏近曲小管上皮细胞的管腔形成评价试验中的8天后的结果。图中，黑色箭头表示具有分支的管腔形成。
[图5]图5为显示使用本发明的肽复合物及人类HGF的人类磷酸－受体酪氨酸激酶阵列分析法评价的结果。图5(1)表示阵列图，图5(2)表示评价结果。图中，黑色方框表示已固定有对于HGFR的抗体的孔。
具体实施方式
以下，针对用于实施本发明的方式进行说明。本发明并不受限于以下所说明的方式，亦包含本发明所属技术领域中技术人员在已知范围内由以下方式进行适当修正者。
第一发明涉及一种肽复合物，其包含与c－Met蛋白结合的肽A。
c－Met蛋白
c－Met蛋白为肝细胞成长因子(HGF)受体，且具有酪氨酸激酶活性。c－Met蛋白是由以二硫键进行结合而成的α次单元及β次单元所构成的跨膜受体。c－Met蛋白在活体内通过HGF结合而二聚化，接着发生自磷酸化，而使各种信号传递活化。其结果，通过使MAPK路径、Akt路径等的信号传递活化而促进细胞增殖，另一方面，阻碍细胞的凋亡诱导。若可使此功能亢进而促进细胞的增殖、迁移等，则有可能促进用于再生医疗的细胞制剂等的制造、肝硬化等难治性器官疾病的治愈等。
c－Met蛋白亦被称为c－Met、MET或HGFR。人类的c－Met蛋白的GenBank登录编号为NP＿000236，小鼠的c－Met蛋白的GenBank登录编号为NP＿032617。
肝细胞成长因子(HGF)
肝细胞成长因子(HGF)是多功能细胞因子，并是作为对于大范围的组织及细胞种类的成长因子而发挥功能的因子，其具有分子量约6万的重链与约3.5万的轻链进行二硫键结而成的异二聚体结构。HGF已知会促进上皮细胞、内皮细胞、间质细胞等的增殖，此外还具有形态形成诱导、细胞运动性亢进、抗细胞凋亡、血管新生作用等的功能。人类的HGF的GenBank登录编号为NP＿000592，小鼠的HGF的GenBank登录编号为NP＿001276387。优选为人类HGF，在本说明书中，若无特别记载，则HGF表示人类HGF。
与c－Met蛋白结合
所谓与c－Met蛋白结合，意指肽或肽复合物与c－Met蛋白结合。是否与c－Met蛋白结合，可通过现有的测量分子间结合的方法而测量，例如能由本身为现有的任意适当方式而决定，包含表面电浆共振(SPR)分析法、斯卡查德分析和/或放射免疫分析法(RIA)、酵素免疫分析法(EIA)及夹心竞争分等竞争结合分析法以及在该技术领域中本身为现有的其不同变体。优选为，例如由日本专利第6426103号公报(专利文献2)所记载的表面电浆共振(SPR)光谱所进行的评价。又，具有c－Met激动剂活性的化合物因通过与c－Met蛋白结合而表现c－Met激动剂活性，故能通过评价c－Met激动剂活性，亦即有无c－Met激动剂活性，而间接地评价该肽或复合物是否与c－Met蛋白结合。此外，在复合物中，只要该复合物的一部分或全部能与c－Met蛋白结合，则可谓该复合物与c－Met蛋白结合。例如，在该复合物包含肽A的情形中，该复合物中的肽A的部分可为与c－Met蛋白结合的部位，该复合物所含的其他部分亦可与c－Met蛋白结合。
c－Met激动剂活性
所谓c－Met激动剂活性，是指与c－Met蛋白结合而表现与HGF所具有的活性类似的影响的活性。肽或肽复合物是否具有c－Met激动剂活性，可通过现有的方法而测量，例如，如实施例所示，可使用磷酸－c－Met AlphaLISA分析法、HUVEC细胞增殖试验等而评价c－Met激动剂活性。又，亦可使用日本专利第6426103号公报(专利文献2)所记载的ELISA法而评价c－Met的磷酸化能力。
具有c－Met激动剂活性的肽复合物可治愈的疾病
具有c－Met激动剂活性的肽复合物可治愈的疾病的例子为缺血性心脏病、急性肝炎、暴发性肝炎、肝硬化、胆道闭锁、脂肪肝、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、糖尿病肾病、急性肺炎、肺纤维化、血管疾病、心肌梗塞、扩张型心肌病、皮肤溃疡、脑梗塞、闭塞性动脉硬化、胃溃疡及肌萎缩侧索硬化症等，可使用于治疗该等疾病。
肽复合物
肽复合物包含与c－Met蛋白结合的肽A的肽复合物。此肽复合物包含1个或2个以上的肽A。肽复合物优选为包含2个肽A。又，包含1个肽A的肽复合物的例子并未受限，例如为包含肽A与欲传递至c－Met蛋白的物质(有效负载)例如现有的医药组合物等的肽复合物、包含肽A与萤光蛋白质等成为标记的组合物的肽复合物。现有的医药组合物与肽A的复合物的情形，能利用肽A对于c－Met蛋白的结合能力而将欲传递至c－Met的医药组合物传递至c－Met蛋白。
作为欲传递至c－Met蛋白的物质，并无特别限定，可为本发明所属技术领域中技术人员所希望的任何物质。作为该物质的例子并未受限，但可列举如下：
化合物：不仅低分子化合物、中分子化合物，只要是能以细胞的摄入机制导入的化合物则皆可。可列举例如现有的低分子药剂。
肽：可为与体内的标靶结合而表现某种效果的肽，例如可为环状肽。
RI：只要为由放射性同位素所标记的低分子、中分子化合物、抗体等、可由放射性同位素标记的化合物则皆可。可列举例如正电子发射断层成像检查用的化合物。
蛋白质：只要为抗体、酵素等在体内表现有用功能的蛋白质则皆可。可列举例如用于酵素补充疗法的酵素。
核酸：只要为DNA、RNA等包含核苷酸序列者则皆可。可列举例如核酸医药品。
DDS：可为脂质体、微胞等DDS分子。在该DDS分子中，亦可进一步于内部包含医药品等化合物。
以及，可为上述所列举的该等物质的复合物。
肽复合物的例子包含(1)第一肽、(2)第二肽及(3)连接第一肽及第二肽的连接子的肽复合物。
此肽复合物亦可为仅由(1)第一肽、(2)第二肽及(3)连接第一肽及第二肽的连接子所构成的肽复合物。
此肽复合物中，第一肽及第二肽中的至少一者为肽A。
第一肽及第二肽可为相同亦可为不同，但优选为肽A。
亦即，肽复合物可为异二聚体亦可为同源二聚体。异二聚体是第一肽及第二肽为不同的肽(例如氨基酸序列不同的肽A)。同源二聚体是第一肽及第二肽同为肽A。优选的肽复合物为同源二聚体。
第一肽及第二肽优选为相同的肽A，且为第一肽及第二肽的C端与连接子结合而成的肽复合物。特优选为第一肽及第二肽为环状肽。
肽A
本说明书中，不仅记载包含肽A的复合物，亦记载肽A。
肽A为
由X1－X2－X3－V－S－X4－D－X5－D－X6－P－R－W－X7－MeC(序列号1)所记载的氨基酸序列所构成的与c－Met蛋白结合的肽；或
由序列号1所记载的氨基酸序列中1～3个(1个、2个或3个)氨基酸经取代、缺失、加成或插入而成的氨基酸序列所构成的与c－Met蛋白结合的肽。在此(2)的肽中，亦优选为维持序列号1中的第4位的V、第5位的S、第7位的D、第9位的D、第11位的P、第12位的R、第13位的W及第15位的MeC。
X1为可经N－烷基化的氨基酸，优选为可经N－甲基化的A或可经N－甲基化的F。再优选的X1为MeF(经N－甲基化的F)。
X2为任意氨基酸，优选为亲水性氨基酸、脂肪族/支链氨基酸或芳香族氨基酸，再优选为V、T、E、Q或W。最优选的X2为T。
X3为任意氨基酸，其为亲水性氨基酸、脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸，再优选为A、R、Y或D。最优选的X3为A。
X4为可经N－烷基化的疏水性氨基酸，优选为可经N－甲基化的疏水性氨基酸，再优选为可经N－甲基化的F或可经N－甲基化的L。最优选的X4为MeF(经N－甲基化的F)。
X5为任意氨基酸，优选为亲水性氨基酸、脂肪族/支链氨基酸或P，再优选为D、E、S、P或V。最优选的X5为E。
X6为在侧链具有可有取代的烷基链的氨基酸或S，优选为(S)－2－氨基庚酸(Ahp)、R、L－正亮氨酸(Nle)、(S)－2,7－二氨基庚酸(Hty)或S。再优选的X6为Ahp。
X7为任意氨基酸，优选为亲水性氨基酸或脂肪族氨基酸，再优选为S、A、L－α－氨基丁酸(Abu)、D、Q或V。最优选的X7为S。
所谓“可经N－烷基化的氨基酸”，表示在形成肽键的氮上具有烷基的氨基酸亦即N－烷基氨基酸或不具有烷基的氨基酸。作为N－烷基氨基酸，可列举例如N－丁基氨基酸、N－乙基氨基酸、N－甲基氨基酸等。又，所谓“可经N－甲基化”，表示包含N－甲基化氨基酸。例如，所谓可经N－甲基化的A，表示丙氨酸(A)或N－甲基丙氨酸(MeA)。
所谓“在侧链具有可有取代的烷基链的氨基酸”，指在侧链具有烷基链的氨基酸，例如属于脂肪族氨基酸群组的氨基酸、在该等氨基酸的侧链烷基的末端的官能基经取代的氨基酸，优选为该烷基所含的C为5以上的氨基酸。例如，包含Ahp、Nle、Hty等。
肽A的优选例为
甲、由MeF－T－A－V－S－MeF－D－E－D－Ahp－P－R－W－S－MeC(序列号34)所记载的氨基酸序列所构成的肽；或
乙、由序列号34所记载的氨基酸序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成的与c－Met蛋白结合的肽。
保守氨基酸取代
从特定的序列将1个、2个或3个氨基酸残基进行取代、缺失、加成或插入的情形，优选为进行保守氨基酸取代。所谓“保守氨基酸取代(conservative amino acidsubstitution)”，意指与功能性等价或类似的氨基酸的取代。肽中的保守氨基酸取代会对该肽的氨基酸序列带来静态变化。例如，具有同样的极性的一个或两个以上的氨基酸是功能性等价地发挥作用，而对所述肽的氨基酸序列带来静态变化。一般而言，某个群组内的取代可认为对结构及功能而言为保守。然而，如本发明所属技术领域中技术人员所知，特定的氨基酸残基所发挥的作用，可由包含该氨基酸的分子在三维结构中的意义所决定。例如，半胱氨酸残基可采取氧化型的(二硫化物)形式，其极性低于还原型的(硫醇)形式。精氨酸侧链长的脂肪族的部分能构成结构上及功能上重要的特征。又，包含芳香环的侧链(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)有助于离子－芳香族相互作用或阳离子－π相互作用。在此情形中，即使将具有该等侧链的氨基酸取代成属于酸性或非极性群组的氨基酸，结构上及功能上仍能为保守。脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸(二硫化物形式)等的残基可能对主链的立体结构带来直接效果，而无法屡次无结构变形地进行取代。
如同下述，保守氨基酸取代包含根据侧链的类似性的特异性取代(Lehninger，生化学，修订第2版，1975年刊登，73至75页：L.Lehninger,Biochemistry,2nd edition,pp73～75,Worth Publisher,New York(1975))及典型性取代。
又，保守氨基酸取代，例如，优选为取代成如下所述般在将天然氨基酸根据其共通的侧链性质所划分的群组中属于与某个氨基酸所属的群组相同的群组的氨基酸。
疏水性(亦称为非极性)氨基酸：为呈疏水性(非极性)的氨基酸，包含丙氨酸(亦记载为“Ala”或仅记载为“A”)、甘氨酸(亦记载为“Gly”或仅记载为“G”)、缬氨酸(亦记载为“Val”或仅记载为“V”)、亮氨酸(亦记载为“Leu”或仅记载为“L”)、异亮氨酸(亦记载为“Ile”或仅记载为“I”)、脯氨酸(亦记载为“Pro”或仅记载为“P”)、苯丙氨酸(亦记载为“Phe”或仅记载为“F”)、色氨酸(亦记载为“Trp”或仅记载为“W”)、酪氨酸(亦记载为“Tyr”或仅记载为“Y”)、甲硫氨酸(亦记载为“Met”或仅记载为“M”)。
此外，疏水性氨基酸亦可进一步分成以下群组。
脂肪族氨基酸：为在侧链具有脂肪酸或氢的氨基酸，包含Ala、Gly、Val、Ile、Leu。
脂肪族/支链氨基酸：为在侧链具有分支型脂肪酸的氨基酸，包含Val、Ile、Leu。
芳香族氨基酸：为在侧链具有芳香环的氨基酸，包含Trp、Tyr、Phe。亲水性(亦称为极性)氨基酸：为呈亲水性(极性)的氨基酸，包含：丝氨酸(亦记载为“Ser”或仅记载为“S”)、苏氨酸(亦记载为“Thr”或仅记载为“T”)、半胱氨酸(亦记载为“Cys”或仅记载为“C”)、天冬酰胺(亦记载为“Asn”或仅记载为“N”)、谷氨酰胺(亦记载为“Gln”或仅记载为“Q”)、天冬氨酸(亦记载为“Asp”或仅记载为“D”)、谷氨酸(亦记载为“Glu”或仅记载为“E”)、赖氨酸(亦记载为lysine；亦记载为“Lys”或仅记载为“K”)、精氨酸(亦记载为“Arg”或仅记载为“R”)、组氨酸(亦记载为“His”或仅记载为“H”)。
此外，亲水性氨基酸亦可进一步分成以下群组。
酸性氨基酸：为侧链呈酸性的氨基酸，包含Asp、Glu，
碱性氨基酸：为侧链呈碱性的氨基酸，包含Lys、Arg、His。
中性氨基酸：为侧链呈中性的氨基酸，包含Ser、Thr、Asn、Gln、Cys。
又，关于Gly及Pro，亦可划分成“对主链的方向造成影响的氨基酸”，在侧链包含硫分子的氨基酸、Cys及Met亦可划分成“含硫氨基酸”。
在本说明书中，“氨基酸”不仅包含天然氨基酸，亦包含非天然氨基酸。非天然氨基酸例如包含上述所记载的天然氨基酸经N－烷基化的N－烷基氨基酸、经形成肽键的氮经分支或未分支的低级(例如C1－C5，优选为C1－C3，更优选为C1)的烷基修饰而成者。N－烷基氨基酸中，优选为N－乙基氨基酸、N－丁基氨基酸或N－甲基氨基酸，再优选为N－甲基氨基酸。又，非天然氨基酸包含D型氨基酸(亦记载为D－氨基酸)、β－氨基酸、γ－氨基酸、氨基酸变异体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸、正亮氨酸、鸟氨酸等在活体内无法成为蛋白质的构成材料的氨基酸等。再者，包含对天然氨基酸的侧链进一步加成官能基或取代成另一官能基的氨基酸(例如，侧链的亚芳基、亚烷基等的部分具有取代或加成的氨基酸、侧链的亚芳基、亚烷基或烷基的C数经增加的氨基酸、在侧链的芳香环具有取代的氨基酸、经杂环化或稠环化的氨基酸等)。
此外，通过对天然氨基酸的侧链加成或取代官能基等结构等，而可赋予与天然氨基酸不同的性质。例如，A4p是在侧链加成哌啶基而成的丙氨酸，但通过加成该哌啶基，而与属于非极性氨基酸群组的丙氨酸不同，呈碱性的极性。
亦即，将天然氨基酸根据其共通的侧链性质所划分的前述的群组中，可包含具有同样的侧链性质的非天然氨基酸。例如，属于碱性氨基酸的精氨酸的N－甲基化氨基酸亦即N－甲基精氨酸(MeR)为非天然氨基酸，但由于呈碱性而可分类为碱性氨基酸。如此，亦可将表现与某种氨基酸同样的侧链性质的非天然氨基酸包含作为保守氨基酸取代的对象。
无限定地，非天然氨基酸中包含N－甲基氨基酸、Ahp、Nle、Hty、Abu等。例如，Ahp、Nle、Abu、Hty可划分为疏水性氨基酸，再者，Ahp、Nle、Abu亦可划分为脂肪族氨基酸，Hty亦可划分为芳香族氨基酸。此外，针对N－甲基氨基酸，亦可分类为N－烷基氨基酸，亦可根据未经N－甲基化的原本的氨基酸的侧链的性质而进行分类。
具体而言，肽A优选为由序列号2～序列号34中任一项所记载的氨基酸序列所构成的肽。此等之中，优选为由序列号34所记载的氨基酸序列所构成的肽。
肽A优选为环状肽。
所谓肽，指多个氨基酸连续而成的结构，其含义中亦包含多肽、蛋白质。此外，本申请案中，所谓氨基酸，不仅包含天然存在的氨基酸(天然氨基酸)，亦包含非天然存在的氨基酸(非天然氨基酸)。
又，本申请案中，本发明的肽亦包含：通过合成后环化而形成环状部的肽、将该肽进一步进行化学修饰而得的肽、肽与结合至肽的物质的复合物。
在本说明书中，为了肽的环化，有改变氨基酸的一部分的情形。肽亦包含此种含一部分经改变的氨基酸的肽。作为用于环化的改变的例子，有下述情形：将氯乙酰基加成至位于N端的氨基酸且与肽中的半胱氨酸残基结合而环化。包含加成氯乙酰基而成的各种(天然/非天然)氨基酸的肽，亦包含于本申请案的肽。
所谓环状肽，指肽中的2个氨基酸结合而其全部或一部分成为环状者。此外，在本申请案中亦包含肽中的氨基酸形成交联结构者、通过内酰氨成环或大环化反应而形成环状结构者、具有套索肽状结构者等。亦即，本申请案中，环状肽只要为其一部分形成环状结构者即可，亦可具有直链部。
一般而言，肽在活体内的代谢稳定性差，且因尺寸大故有难以穿透细胞膜的问题。对于此类课题，已有采取使肽进行环化的方法。若将肽进行环化，则蛋白酶耐性提升，代谢稳定性提升，且构形改变亦受到限制，因此暗示刚性增加且膜穿透性及与靶蛋白的亲和性提升。
关于肽的环化，可依照现有的方法进行。虽不受限于此，但例如可通过设计成在肽中包含2个以上的半胱氨酸残基，而在转译后通过二硫键而形成环状结构。又，依照Goto等人的方法(Y.Goto,et al.ACS Chem.Biol.3 120－129(2008))，通过遗传密码的重编程技術，而合成在N端具有氯乙醯基的肽，并亦可通过预先在肽中配置半胱氨酸残基而环化。由此，在转译后巯基会自动地对氯乙醯基进行亲核攻击，肽通过硫醚键而环化。亦可通过遗传密码的重编程技术，将进行结合而形成环状的其他氨基酸的组合配置于肽内而环化。或者，亦可通过合成在N端具有环酰氨的肽，在肽中配置L－2－氨基己二酸残基，并在该等之间进行结合而环化。如此，只要为现有的环化方法则可无特别限制地使用。
肽A的肽长度
肽A的肽长度(酰氨键的数量)并未被特别限定，但总氨基酸残基(结合至肽的物质或将该物质与肽结合的连接子包含氨基酸的情形，不含该等氨基酸)优选为20残基以内。优选为氨基酸为6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上，优选为氨基酸为19以下、18以下、17以下、16以下、15以下。
编码肽A的核酸
本说明书亦记载编码肽A(c－Met蛋白结合肽)的核酸。在本说明书中，“核酸”可为天然亦可为非天然，包含DNA、RNA及此等的嵌合体，但并不受限于此等。
连接子
用于肽复合物的连接子只要肽复合物可与c－Met蛋白结合，则其种类、长度等并未被特别限定。连接子的例子有氨基酸连接子(肽连接子)、化学连接子、脂肪酸连接子、核酸连接子、糖链连接子等，例如亦可为化学连接子与肽连接子等的复合物。作为化学连接子，可列举例如PEG(Polyethyleneglycol，聚乙二醇)连接子。又，连接子可为由脂肪酸所诱导的包含二价化学部分的脂肪酸连接子。氨基酸(肽)连接子包含至少1个任意氨基酸的连接子，例如可使用如美国专利第7,271,149号所记载的具有序列[Gly－Gly－Gly－Gly－Ser]n(式中，n为1、2、3、4、5或6)的肽等富含甘氨酸的肽、美国专利第5,525,491号所记载的富含丝氨酸的肽连接子。该等连接子可利用现有的方法或依据其的方法而与c－Met蛋白结合肽结合。例如，通过使连接子与c－Met蛋白结合肽的末端Cys残基结合，可使连接子与c－Met蛋白结合肽结合。又，亦可使连接子与c－Met蛋白结合肽的C端以外所含的氨基酸结合。
连接子的优选例为PEG连接子。PEG连接子包含聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇(PEG)衍生物的连接子。PEG连接子可包含氨基酸者。PEG连接子优选为包含8个以上的PEG分子单元者。连接子的具体例为(1)具有序列号35～41中任一项所记载的序列的连接子、或(2)由序列号35～41中任一项所记载的序列中1～3个氨基酸(氨基酸只要为能使用作为连接子的氨基酸，则未被特别限定，但例如为S、G及K以及该等氨基酸中的任一者或两者以上)经取代、缺失、加成或插入而成的序列所构成的连接子。
肽A、连接子及肽复合物可通过现有的方法(例如日本专利第6426103号公报(专利文献2))或适当修正现有的方法而制成。
c－Met蛋白激动剂
上述的肽复合物是通过c－Met蛋白的多聚体化而促进自磷酸化，并由此具有类似HGF的功能。因此，上述的肽复合物是有用于作为c－Met激动剂(兴奋剂)、包含c－Met蛋白激动剂的医药组合物等。
医药组合物
本说明书亦提供一种医药组合物，其包含上述的肽复合物与药学上可容许的载体。上述的肽复合物之中，包含c－Met蛋白激动剂的医药组合物用于治疗或预防选自由缺血性心脏病、急性肝炎、暴发性肝炎、肝硬化、胆道闭锁、脂肪肝、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、糖尿病肾病、急性肺炎、肺纤维化、血管疾病、心肌梗塞、扩张型心肌病、皮肤溃疡、脑梗塞、闭塞性动脉硬化、胃溃疡及肌萎缩侧索硬化症所组成的群组的疾病。
本发明的医药组合物包含本发明的肽复合物作为有效成分。由于具有类似HGF的功能，故对于促进细胞增殖、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡、诱导形态形成、血管新生、组织或器官的再生或保护十分有用，可被使用作为此等相关的疾病的治疗或预防剂。作为所述疾病，可列举例如急性肝炎、暴发性肝炎、肝硬化、胆道闭锁、脂肪肝、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、糖尿病肾病、急性肺炎、肺纤维化、血管疾病、心肌梗塞、扩张型心肌病、皮肤溃疡、脑梗塞、闭塞性动脉硬化、胃溃疡及肌萎缩侧索硬化症，但并不受限于此等。
上述医药组合物的投予形态并未被特别限定，可为经口投予亦可为非经口投予。作为非经口投予，可列举例如肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射等注射投予、经皮投予、经粘膜投予(经鼻、经口腔、经眼、经肺、经阴道、经直肠)投予等。
医药组合物中的肽，鉴于容易被代谢及排泄的性质，而可进行各种修饰。例如，可在多肽加成聚乙二醇(PEG)或糖链而延长血中滞留时间并使抗原性降低。又，亦可将聚乳酸－甘醇酸(PLGA)等活体内分解性的高分子化合、多孔羟基磷石灰、脂质体、表面修饰脂质体、以不饱和脂肪酸所制备的乳剂、纳米粒子、纳米球等使用作为缓释型基剂，并使多肽包含于其中。经皮投予的情形，亦可使弱电流流过皮肤表面并使其穿透角质层(离子电渗法)。
医药组合物可直接使用有效成分，亦可加入药学上可容许的载体、赋形剂、添加剂等而进行制剂化。作为剂形，可列举例如液剂(例如注射剂)、分散剂、悬浮剂、锭剂、丸剂、粉剂、栓剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆、含片剂、吸入剂、软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、泥敷剂等。
制剂化可适当使用例如赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、溶解剂、溶解辅助剂、着色剂、矫味矫臭剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、界面活性剂、pH调整剂、防腐剂、抗氧化剂等并通过常规方法而进行。
作为用于制剂化的成分的例子，可列举蒸馏水、食盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学上可容许的有机溶剂、动植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、羟丙纤维素、淀粉、玉米淀粉、无水硅酸、硅酸铝镁、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、黄芪胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、石油脂、石蜡、肉豆蔻酸辛基十二烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、高级醇、硬脂醇、硬脂酸、人类血清白蛋白等，但并不受限于此等。
作为改善难吸收性药物的吸收的吸收促进剂，可使用聚氧乙烯月桂醚类、月桂基硫酸钠、皂素等界面活性剂；甘胆酸、去氧胆酸、牛胆酸等胆盐；EDTA、柳酸类等螯合剂；己酸、癸酸、月桂酸、油酸、亚油酸、混合微胞等脂肪酸类；烯氨衍生物、N－酰基胶原蛋白肽、N－酰基氨基酸、环糊精类、几丁聚糖类、一氧化氮施予体等。
丸剂或锭剂亦能以糖衣、胃溶性、肠溶性物质被覆。注射剂可包含注射用蒸馏水、生理食盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇类等。再者，可加入湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、溶解剂、溶解辅助剂、防腐剂等。
本发明的医药组合物亦可与对上述疾病有用的其他药物或治疗法并用投予。
将本发明的医药组合物投予至哺乳类(例如，人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗、马、猴、猪、羊等)特别为人类的情形的投予量，依据症状、患者的年龄、性别、体重、感受性差异、投予方法、投予间隔、有效成分的种类、制剂的种类而异，并未被特别限定，但例如可单次或分多次投予30μg～1000mg、100μg～500mg、100μg～100mg。注射投予的情形，依据患者的体重，可单次或分多次投予1μg/kg～3000μg/kg、3μg/kg～1000μg/kg。
治疗方法
本说明书亦提供上述的各种疾病的治疗方法，其包含对于对象(例如哺乳类、患者等)投予有效量的肽复合物或有效量的医药组合物的步骤。又，本说明书亦记载在上述的医药组合物的制造中使用肽A或上述的肽复合物、使用肽A或上述的肽复合物的上述医药组合物的制造方法。
培养用培养基添加物、培养基
本说明书亦提供包含上述的肽复合物的培养用培养基添加物、包含肽复合物的培养用培养基。此培养用培养基添加物用于培养来自哺乳类的细胞或组织。作为进行培养的细胞的例子，并不受限于此，但可列举体细胞、生殖细胞、具有能分化成构成活体的全部组织或细胞的能力的细胞亦即多潜能干细胞。作为多潜能干细胞，可列举例如来自胚胎干细胞、精子干细胞、多潜能生殖干细胞、胚胎生殖细胞、诱导性多功能干细胞、培养纤维母细胞或骨髓干细胞的细胞。又，可为该等干细胞与体细胞的融合细胞，亦可为通过压力或细胞刺激所诱导/筛选的多潜能干细胞、通过培养将体细胞的核进行核移植所制成的初期胚胎而建立的多潜能干细胞。又，作为进行培养的组织的例子，可列举从细胞所分化的组织、从身体所取出的组织。例如，此培养用培养基添加物能使用于保护已再生的组织或用于器官移植的器官。
细胞或组织优选为来自人类、猴、黑猩猩等灵长类的细胞或组织，更优选为来自人类。
培养基只要是用于培养细胞或组织的培养基则未被特别限定，但优选为添加人类HGF而使用的培养基。可为血清培养基，优选为无血清培养基或低血清培养基。
培养用培养基添加物可为溶液的形态，亦可为经干燥的固体(例如，固状、粉末状等)的形态。在为溶液的形态的情形中，可直接使用作为培养用的培养基，亦可将以溶剂稀释并视需求添加上述添加剂而成者使用作为培养用的培养基。作为进行稀释时所使用的溶剂，可列举例如水、缓冲液、生理食盐水、用于各种细胞或组织培养的培养基等，此等可单独使用，亦可组合2种以上使用。
在培养用培养基添加物为经干燥的固体的形态的情形中，例如，亦可将溶解于水、缓冲液、生理食盐水、使用于各种细胞或组织培养的培养基等溶剂并视需求加入上述添加剂而成者使用作为培养用的培养基。
用于培养细胞或组织的培养基中或由此所得的细胞用的培养基中，本发明的肽复合物的含量可依据进行培养的细胞或组织而由本发明所属技术领域中技术人员进行任意设定，例如，相对于组合物总量或培养基总量，作为最终浓度，能为约0.01～约10000nmol/L，优选为约0.1～约1000nmol/L，更优选为约0.5～约1000nmol/L，再优选为约1～约100nmol/L。
DDS载体
上述的肽A具有与c－Met蛋白结合的性质。因此，肽A或包含肽A的肽复合物是通过与现有的传递至c－Met蛋白的物质例如药剂结合，而发挥作为DDS载体(药物传递用载体)、药物传递用复合物的功能。本说明书亦揭示该种DDS载体、药物传递用复合物。可使用现有的方法使肽A或肽复合物与药剂结合。
实施例
简称(一般)
埃(单位)为
牛血清白蛋白为BSA；
二甲基亚砜为DMSO；
二甲基甲酰氨为DMF；
N,N－二异丙基乙胺为DIPEA或DIEA；
3,6－二氧杂－1,8－辛烷－二硫醇为DODT；
达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基为DMEM；
50％效果浓度为EC50；
表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)为EGF；
9－芴甲氧羰基为Fmoc；
胎牛血清为FBS；
N2,N6－双(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－L－赖氨酸为Fmoc－Lys(Fmoc)－OH；
克(单位)为g；
O－(7－氮杂苯并三唑－1－基)－N,N,N’,N’－四甲基脲六氟磷酸盐为HATU；
HGF受体为HGFR；
液相色谱质谱仪为LC－MS或LC/MS；
毫升(单位)为mL；摩尔浓度(单位)为M；微升(单位)为μL；
毫摩尔浓度(单位)为mM；
毫克(单位)为mg；
乙腈为MeCN；
分钟(单位)为min；
毫米(单位)为mm；
纳米(单位)为nm；
肾上皮细胞用基础培养基(Renal Epithelial Cell Basal Medium)为REBM；
每分钟旋转数(单位)为rpm；
三氟乙酸为TFA；
三异丙基硅烷为TIS。
简称(非天然氨基酸)
MeF N－甲基－L－苯丙氨酸
MeA N－甲基－L－丙氨酸
Ahp (S)－2－氨基庚酸
Nle L－正亮氨酸
Hty (S)－2－氨基－4－(4－羟基苯基)丁酸
Abu (S)－2氨基丁酸
MeC N－甲基－L－半胱氨酸
PEG4c 1－氨基－3,6,9,12－四氧杂螺－15－十五酸
PEG8c 1－氨基－3,6,9,12－四氧杂螺十五烷－15－酸
PEG12c 1－氨基－3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36－十二氧杂三十九烷－39－酸
cPEG1c 3,3’－氧基二丙酸
cPEG9c 4,7,10,13,16,19,22,25,28－九氧杂三十一烷二酸
cPEG17c 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52－十七氧杂五十五烷二酸
OCOPEG13OCO 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33－十一氧杂三十五烷－1,35－二基双(碳酸氢盐)
实施例1
化学合成
在以下的实施例中的化学合成中所使用的全部原料、结构单元、试剂、酸、碱、固相树脂、溶剂，可直接使用市售品或由本发明所属技术领域中技术人员使用有机化学的方法而合成。此外，包含保护基的氨基酸，只要无特别记载，则可直接使用市售品。
固相树脂中的肽链的延伸，将各实施例所记载的树脂作为初始原料，并使用通常使用的肽偶合反应条件与Fmoc去除反应条件而进行。反应是使用肽自动合成机亦即Biotage公司的Siro I并依照制造厂商的说明书而进行。所使用的一般的氨基酸列举如下，侧链保护基显示于括号内。
Fmoc－Trp(Boc)－OH；Fmoc－Thr(tBu)－OH；Fmoc－N－Me－Gly－OH；Fmoc－Asp(OtBu)－OH；Fmoc－N－Me－Phe－OH；Fmoc－Ala－OH；Fmoc－N－Me－Ala－OH；Fmoc－His(Trt)－OH；Fmoc－Tyr(tBu)－OH；Fmoc－Val－OH；Fmoc－HydPro(tBu)－OH；Fmoc－Cys(Trt)－OH；Fmoc－Lys(Mtt)－OH；Fmoc－Ser(tBu)－OH；Fmoc－N－Me－Ser(tBu)－OH。
作为所得的粗精制肽的精制方法，利用Waters公司自动纯化系统－SQD2单四极杆质谱仪并使用反相分离HPLC，一边监测来自目标物质的m/z离子一边进行溶析。确认由ESI－positive的扫描模式所得的质谱与包含从目标物质的分子式所计算的多价离子的质谱在所使用的质量分析器的误差范围内一致。此外，包含所使用的管柱的精制条件显示于各实施例。
经化学合成的肽的结构决定已通过质谱分析法中的ESI－MS(+)确认分子量，所述分子量考量依照目标序列所使用的氨基酸与视需求所使用的结构单元并计算而得。此外，所谓“ESI－MS(+)”，表示在正离子模式下实施的电喷雾电离质谱法。所检测的质量是以“m/z”单位标示进行报告。此外，分子量约大于1000的化合物，已作为2价离子或3价离子而以高频率检测出。
实施例2
具有c－Met激动剂活性的肽的识别
c－Met激动剂肽是将Recombinant Human HGF R/c－MET Fc Chimera His－tagProtein(R&D systems公司)作为标靶，并利用国际公开WO2014/119600号、国际公开WO2012/033154号或国际公开WO2007/066627号所记载的节选方法进行识别。以确认该肽实际上是否具有c－Met激动剂活性为目的，化学合成该等肽。此外，以由连接子结合两个肽而成的同源二聚体的形式(肽复合物)进行合成。所合成的肽复合物所含的肽部分的氨基酸序列是显示于表1，连接子序列显示于表2。又，关于所合成的肽复合物(肽与连接子的组合)则显示于表3及4。
表1：肽部分的氨基酸序列
[表1－1]
[表1－2]
表2：连接子序列
[表2]
表3：肽复合物
[表3]
表4：肽复合物
[表4]
实施例3
具有c－Met激动剂活性的肽的化学合成
[实施例3－1]
关于表3所记载的肽复合物，只要无其他合成实施例，则与以下所记载的肽复合物同样地合成。此外，表3中的ESI－MS(m/z)表示ESI－MS(+)观测值，[M+XH]X+表示将此情形中的质子加成数表示作为(M+XH)X+显示时的X的值。
GFs＿c－Met＿0012＿7复合物(GFs＿c－Met＿0012＿7－PEG12c－K二聚体：表3 中的肽复合物No.8)的合成
[化学式1]
使用NovaPEG Rink Amide resin(默克，0.53mmol/g，0.005g)，以前述的一般方法从去除Fmoc基开始，合成目标的肽。此时，使用Biotage公司的Siro I作为固相合成机，依照制造厂商的说明书而进行合成。将Fmoc－Lys(Fmoc)－OH导入固相树脂后，去除两个Fmoc基，并从Lys上的2个氨基同时延伸，由此进行合成。各残基的导入相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/HATU/DIPEA(8.4当量/7.8当量/16.8当量)而进行反应。又，Fmoc去除与20％哌啶的DMF溶液在25℃下反应5分钟后，去除溶液后，再次加入20％哌啶的DMF溶液使其反应15分钟。氯乙酰基的导入是通过下述方式进行：对于由前步骤所得的保持有经Fmoc保护的肽的固相树脂，以前述方法去除α－氨基的Fmoc基之后，将0.3M氯乙酸的DMF溶液(8.4当量)、0.28M HATU的DMF溶液(7.8当量)、1.05M DIPEA的DMF溶液(16.8当量)加入固相树脂，并在25℃下重复2次振荡30分钟。侧链的去保护及从固相树脂的切除利用以下的方法实施。首先，将氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次与以二氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在装有固相树脂的反应容器中加入反应剂混合物－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在25℃振荡60分钟。将反应液从玻料过滤回收。将残留于反应容器的固相树脂与切除用混合物再次振荡，从玻料回收溶液成分，并与前述的滤液混合。若将此滤液加入已冷却至0℃的过剩的二乙醚/己烷(1/1)的混合溶剂，则产生混浊沉淀。将此混合物进行离心分离(8500rpm，0℃，30秒钟)，使溶液倾析。再次以已冷却至0℃的少量的二乙醚/己烷清洗所得的固体后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应以肽的最终浓度以固相树脂的摩尔数为基准成为2.5Mm的方式溶解于DMSO后，加入10当量的三乙氨，在25℃振荡16小时。使用EZ－2Elite将所得的反应溶液进行减压浓缩。
使用Gilson公司的ASPEC(注册商标)C18滤筒，将所得的混合物进行固相萃取。使用EZ－2Elite，将所得的萃取液进行减压浓缩。
以LC－MS进行分析，目标物的质谱会在主要波峰之一观测到。
分析条件：保持时间＝1.73分钟；管柱：Kinetex(注册商标)EVO C18 1.7μm2.1x50mm,移动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％B conc)：花费2.10分钟5－95％，之后花费0.75分钟95－95％；流量：0.6mL/min
ESI－MS(+)观测值m/z＝1725.0(M+3H)3+理论值m/z＝5170.91
[实施例3－2]
关于表4所记载的肽复合物，只要无其他合成实施例，则与以下所记载的肽复合物同样地合成。此外，表4中的ESI－MS(m/z)表示ESI－MS(+)观测值，[M+XH]X+表示将此情形中的质子加成数表示作为(M+XH)X+显示时的X的值。
GFs＿c－Met－0012复合物(GFs＿c－Met－0012－PEG12二聚体；表4中的肽复合 物No.17)的合成
[化学式2]
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.11g)，以前述的一般方法从去除Fmoc基开始，合成目标的肽。此时，使用Biotage公司的Siro I作为固相合成机，依照制造厂商的说明书而进行合成。将Fmoc－Lys(Fmoc)－OH导入固相树脂后，去除两个Fmoc基，并从Lys的2个氨基同时延伸，由此进行合成。各残基的导入是相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/HATU/DIPEA(8.4当量/8当量/16当量)进行反应。又，Fmoc去除与含有0.1M HOBt的5％哌啶的DMF溶液在25℃下反应5分钟后，去除溶液后，再次与含有0.1M HOBt的5％哌啶的DMF溶液再次反应15分钟。氯乙酰基的导入是通过下述方式进行：对于由前步骤所得的保持有经Fmoc保护的肽的固相树脂，以前述方法去除α－氨基的Fmoc基之后，将0.5M氯乙酸的DMF溶液(10当量)、0.49M HATU的DMF溶液(9.8当量)、0.5M DIPEA的DMF溶液(10当量)加入固相树脂，在室温下振荡30分钟。侧链的去保护及从固相树脂的切除利用以下的方法实施。首先，将氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次与以二氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在装有固相树脂的反应容器中加入反应剂混合物－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在25℃振荡60分钟。将反应液从玻料过滤回收。将残留于反应容器的固相树脂与切除用混合物再次振荡，从玻料回收溶液成分，并与前述的滤液混合。若将此滤液加入已冷却至0℃的过剩的二乙醚/己烷(1/1)的混合溶剂，则产生混浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2分钟)，使溶液倾析。再次以已冷却至0℃的少量的二乙醚/己烷清洗所得的固体后，在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应以肽的最终浓度以固相树脂的摩尔数为基准成为1Mm的方式溶解于DMSO/乙腈/水(18/1/1)后，加入20当量的三乙氨，在25℃振荡15小时。使用EZ－2Elite将所得的反应溶液进行减压浓缩。
所得的混合物使用以下条件进行精制(管柱：Waters XSelect(注册商标)C1819x150mm；移动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：花费3分钟13－38％，之后花费8分钟38－43％，之后花费1分钟43－60％；流量：17mL/min。
目标物的纯度从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比而算出，为59.97％。
分析条件：保持时间＝5.75分钟；管柱：Kinetex(注册商标)EVO C18 2.6μm2.1x150mm，移动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％Bconc)：花费7.15分钟20－60％，之后花费0.30分钟60－95％，之后花费1.55分钟95－95％；流量：0.5mL/min
ESI－MS(+)观测值m/z＝1300.6(M+4H)4+理论值m/z＝5196.56
实施例4
由磷酸－c－Met AlphaLISA分析法所进行的本发明的肽复合物的c－Met激动剂 活性测量
为了评价本发明的肽复合物的c－Met的活化能力(c－Met激动剂活性)而验证c－Met的磷酸化。
以包含10％FBS(Gibco公司)的DMEM，high glucose，GlutaMAX(注册商标)Supplement，pyruvate(赛默飞世尔科技公司)培养为人类细胞的A431细胞。使用Accutase(Innovative cell technologies公司)将细胞剥离后，以每1孔成为10000细胞的方式，播种于96孔板，并培养一晩。次日，为了使其饥饿而更换成包含0.1％BSA(西格玛奥瑞奇公司)的DMEM，high glucose，GlutaMAX(注册商标)Supplement，pyruvate(赛默飞世尔科技公司)，再培养一晩。之后，加入实施例3所合成的肽复合物或作为对照的重组人HGF蛋白(R&Dsystems公司)，刺激15分钟后，以AlphaLISA(注册商标)SureFire(注册商标)UltraTMPhospho-c-Met(Tyr1234/1235)套组(珀金埃尔默公司)所附属的裂解缓冲液(LysisBuffer)溶解细胞。分析是按照套组的规程而实施，信号的检测使用SpectraMax(注册商标)Paradigm(注册商标)多功能微孔板读数仪(Molecular Devices,LLC.)。
以GraphPad Prism(MDF Co.,Ltd.)分析所得的信号，将由HGF所诱导的信号的最大值设为100％，并将表现50％以上的活化者记载为2，将表现50％以下的活化者记载为1。其结果显示于表3。此外，虽同样地使用单体的肽进行活性测量，但未表现c－Met激动剂活性。
又，同样地进行，以GraphPad Prism算出C50的值以作为表现由HGF所诱导的信号的50％活性的肽的浓度。其结果显示于表4。此外，本分析法中，为对照的HGF的EC50值为0.66nM。
再者，关于肽(序列号34)与连接子(序列号37)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的复合物No.49)，将c－Met激动剂活性的图表显示于图1。该肽复合物的EC50为0.72nM，表现与HGF几乎相同的c－Met激动剂活性。
由此等结果，显示本发明的肽复合物确实具有c－Met激动剂活性。
实施例5
HUVEC细胞增殖评价
为了评价本发明的肽复合物的生物活性而验证细胞增殖诱导活性。
使用HuMedia－EG2(仓敷纺织公司)培养正常人类脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)。使用Accutase(Innovative cell technologies公司)将细胞剥离后，再悬浮于包含5％FBS(MBL公司)的Medium without serum or growth factors(Cell systems公司)，以成为每1孔10000细胞的方式，播种于96孔板，并培养一晩。次日，加入由实施例2所合成的肽(序列号34)与连接子(序列号37)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的肽复合物No.49)或作为对照的重组人HGF蛋白(R&D systems公司)，再培养2天。之后，去除培养基，使用CellTiter－Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay试剂(Promega公司)，按照附属的规程将细胞数进行定量。检测是使用SpectraMax(注册商标)Paradigm(注册商标)功能微量盘式分析仪(Molecular Devices公司)。
以GraphPad Prism分析所得的信号值并算出EC50。所得的活性的图表显示于图2。结果，HGF的EC50为0.37nM，该肽复合物的EC50为0.55nM，本发明的肽复合物表现与HGF几乎相同的c－Met激动剂活性。
由此结果，显示本发明的肽复合物具有诱导人类细胞的增殖的活性。
实施例6
合成以下的肽复合物。
[实施例6－1]
具有表1中的序列号34所记载的氨基酸序列的环状肽的合成
[化学式3]
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.65mmol/g，0.31g)，以前述的一般方法从去除Fmoc基开始，合成目标的肽。此时，使用Biotage公司的Siro I作为固相合成机，依照制造厂商的说明书而进行合成。各残基的导入相对于树脂1当量，使用Fmoc－AA/HATU/DIPEA(3.2当量/3当量/6.3当量)进行反应。又，Fmoc去除与20％哌啶的DMF溶液在25℃下反应5分钟后，去除溶液后，使其再次与20％哌啶的DMF溶液反应15分钟。氯乙酰基的导入是通过下述方式进行：对于由前步骤所得的保持有经Fmoc保护的肽的固相树脂，以前述的方法去除α－氨基的Fmoc基之后，将0.5M氯乙酸的DMF溶液(5当量)、0.49M HATU的DMF溶液(4.9当量)、0.5M DIPEA的DMF溶液(5当量)加入固相树脂，在室温下振荡30分钟。侧链的去保护及从固相树脂的切除利用以下的方法实施。首先，将氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次与以二氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在装有固相树脂的反应容器中加入反应剂混合物－A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在25℃振荡60分钟。将反应液从玻料过滤回收。将残留于反应容器的固相树脂与切除用混合物再次振荡，从玻料回收溶液成分，并与前述的滤液混合。若将此滤液加入已冷却至0℃的过剩的二乙醚/己烷(1/1)混合溶剂，则产生混浊沉淀，将此混合物进行离心分离(9000rpm，2分钟)，使溶液倾析。再次以已冷却至0℃的少量的二乙醚/己烷清洗所得的固体后，在减压下进行干燥。将所得的固体用于后续的环化反应。肽的环化反应以肽的最终浓度以固相树脂的摩尔数为基准成为2.5mM的方式溶解于DMSO/乙腈/水(18/1/1)后，加入10当量的三乙氨，在25℃振荡4小时。使用EZ－2Elite将所得的反应溶液进行减压浓缩。
所得的粗生成物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters Xbridge(注册商标)C185μm 50x150mm；移动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：花费3分钟5－30％，之后花费8分钟30－35％，之后花费1分钟35－60％；流量：120mL/min。
目标物的纯度从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比而算出，为96.90％。
分析条件：保持时间＝3.84分钟；管柱：Kinetex(注册商标)EVO C18 2.6μm2.1x150mm，移动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％B conc)：花费7.15分钟20－60％，之后花费0.30分钟60－95％，之后花费1.55分钟95－95％；流量：0.5mL/min
ESI－MS(+)观测值m/z＝1027.7(M+2H)2+
将所得的环状肽使用于合成肽复合物。
[实施例6－2]
GFs＿c－Met－00014336(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的肽复 合物No.49)的合成
[化学式4]
将GFs＿c－Met－00014234(8.0mg，3.51μmol)溶解于DMF(0.2mL)，加入DIPEA(2.3μL，13μmol)的DMF溶液(23μL)及双(2,5－二氧代吡咯烷－1－基)(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33－十一氧杂三十五烷－1,35－二基)双碳酸酯(1.38mg，1.67μmol)的DMF溶液(14μL)，并在25℃搅拌16小时。
所得的混合物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XSelect(注册商标)C1819x150mm；移动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：花费3分钟13－38％，之后花费8分钟38－43％，之后花费1分钟43－60％；流量：17mL/min。
目标物的纯度从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比而算出，为96.42％。
分析条件：保持时间＝5.07分钟；管柱：Kinetex(注册商标)EVO C18 2.6μm2.1x150mm，移动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％B conc)：花费7.15分钟20－60％，之后花费0.30分钟60－95％，之后花费1.55分钟95－95％；流量：0.5mL/min
ESI－MS(+)观测值m/z＝1177.2(M+4H)4+理论值m/z＝4703.25
[实施例6－3]
GFs＿c－Met－00014305(GFs＿c－Met－00014305－PEG17二聚体；表4中的肽复 合物No.50)的合成
[化学式5]
将实施例6－1所合成的环状肽(GFs＿c－Met－00014234)(8.0mg，3.51μmol)溶解于DMF(0.25mL)，加入三乙氨(2.0μL，14mmol)的DMF溶液(20μL)及双(2,5－二氧代吡咯烷－1－基)4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52－十七氧杂五十五烷二酸甲酯(1.75mg，1.65μmol)的DMF溶液(18μL)，并在25℃搅拌16小时。
所得的混合物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XSelect(注册商标)C18 5μm 19x150mm；移动相：A＝0.1％TFA in H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％Bconc)：花费3分钟12－37％，之后花费8分钟37－42％，之后花费1分钟42－60％；流量：17mL/min。
目标物的纯度从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比而算出，为94.19％。
分析条件：保持时间＝5.92分钟；管柱：Kinetex(注册商标)EVO C18 2.6μm2.1x150mm，移动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％B conc)：花费7.15分钟20－60％，之后花费0.30分钟60－95％，之后花费1.55分钟95－95％；流量：0.5mL/min
ESI－MS(+)观测值m/z＝1235.3(M+4H)4+理论值m/z＝4935.41
[实施例6－4]
GFs＿c－Met－00014318(GFs＿c－Met－00014318－PEG9二聚体；表4中的肽复合 物No.51)的合成
[化学式6]
将GFs＿c－Met－00014234(8.0mg，3.51μmol)溶解于DMF(0.25mL)，加入三乙氨(2.0μL，14μmol)的DMF溶液(20μL)及双(2,5－二氧代吡咯烷－1－基)4,7,10,13,16,19,22,25,28－九氧杂三十一烷二酸甲酯(1.17mg，1.65μmol)的DMF溶液(12μL)，并在25℃搅拌16小时。
所得的混合物使用以下的条件进行精制(管柱：Waters XSelect(注册商标)C1819x150mm；移动相：A＝0.1％TFA H2O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％B conc)：花费3分钟11－36％，之后花费8分钟36－41％，之后花费1分钟41－60％；流量：17mL/min。
目标物的纯度从以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比而算出，为94.56％。
分析条件：保持时间＝5.03分钟；管柱：Kinetex(注册商标)EVO C18 2.6μm2.1x150mm，移动相：A＝0.025％TFA in H2O，B＝0.025％TFA in MeCN；温度：60℃；梯度(％B conc)：花费7.15分钟20－60％，之后花费0.30分钟60－95％，之后花费1.55分钟95－95％；流量：0.5mL/min
ESI－MS(+)观测值m/z＝1147.1(M+4H)4+理论值m/z＝4582.2
实施例7
Tube formation评价
以增殖培养基(肾上皮细胞用基础培养基(REBM)+0.5％FBS+2.4mM L－丙氨酰－L－谷氨酰胺+10nM三碘甲腺原氨酸+10ng/mL rh EGF+100ng/mL氢化可的松半琥珀酸酯+5μg/mL重组人胰岛素+1μm肾上腺素+5ug/mL转铁蛋白)(ATCC)培养人类肾脏近曲小管上皮细胞(RPTEC)。使用Trypsin－EDTA将细胞剥离，再悬浮于分析培养基(REBM+0.5％FBS+2.4mML－丙氨酰－L－谷氨酰胺+10nM三碘甲腺原氨酸+100ng/mL氢化可的松半琥珀酸酯+1μm肾上腺素+5μg/mL转铁蛋白+1.8mM CaCl2)。
将RPTEC再悬浮于置于冰上的依照说明书将Cellmatrix(注册商标)Type I－A(新田明胶公司)、浓缩培养液(新田明胶公司)及再构成用缓冲液(新田明胶公司)进行混合而成者，以成为每1孔200000细胞的方式，在48孔板中逐一注入300uL。通过在CO2培养箱内(37℃，5％CO2)静置60分钟而使上述悬浮液凝胶化。
将2nM的HGF、1.6nM的EGF或使实施例2所合成的肽(序列号34)与连接子(序列号37)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的肽复合物No.49)成为0.08、0.4、2、10nM的方式加入分析培养基中，并在添加有如同前述的凝胶化后的悬浮液的48孔板的各孔中逐一添加400μL。在CO2培养箱中(37℃，5％CO2)静置，每3天更换培养基，并在开始培养3天后及8天后，使用相位差显微镜观察有无管腔形成并进行评价。
其结果显示于图3及图4。此外，图3为3天后的结果，a为MOCK(无添加)、b为添加有1.6nM EGF、c为添加有2nM HGF、d为添加有2nM的肽复合物(表4中的肽复合物No.49)的孔的观察结果。又，图4为8天后的结果，a为MOCK(无添加)、b为添加有2nM HGF、c为以0.08nM、d为以0.4nM、e为以2nM、f为以10nM的浓度添加有实施例2所合成的肽(序列号34)与连接子(序列号37)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG13二聚体；表4中的肽复合物No.49)的孔的观察结果。
由此结果，显示本发明的肽复合物与HGF相同地促进管腔形成。又，由图4f，显示不仅促进管腔形成，亦促进分支形成。由于管腔形成需要细胞的增殖、迁移及胶原蛋白分解等多功能作用，故显示本发明的肽复合物具有与HGF同样的生理活性。
实施例8
人类Phospho－RTK阵列分析法
以包含10％FBS(Gibco公司)的DMEM，high glucose，GlutaMAX(注册商标)Supplement，pyruvate(赛默飞世尔科技公司)培养A431细胞。使用Accutase(注册商标)(Innovative cell technologies公司)将细胞剥离后，以成为每1孔1000000细胞的方式，播种于6孔板，并培养一晩。
次日，为了使其饥饿而更换成包含分析培养基(0.1％BSA(Sigma公司)的DMEM，high glucose，GlutaMAX(注册商标)Supplement，pyruvate(赛默飞世尔科技公司))，再培养一晩。之后加入7.8nM的重组人HGF蛋白(R&D systems公司)或2nM的实施例2所合成的肽(序列号34)与连接子(序列号36)的复合物(GFs＿c－Met－00014336－PEG9二聚体；表4中的肽复合物No.51)，刺激10分钟后，以Proteome Profiler Human Phospho－RTK ArrayKit(R&Dsystems)所附属的裂解缓冲液溶解细胞。之后按照该套组的规程而实施，并使用C－DiGit(注册商标)(Scrum公司)检测WesternSure(注册商标)PREMIUM化学发光基质套组(LI－COR)化学发光信号。
将其结果显示于图5。此外，图5(2)的a为无添加的结果，b为添加HGF的结果，以及c为添加肽复合物的结果，在添加肽复合物时及添加HGF时，仅HGF R被特异性磷酸化。因此，显示本发明的肽复合物具有与HGF同样的特异性磷酸化模式。
产业利用性
本发明能利用于医药产业、生物技术产业等。
序列表
<110> 肽梦想株式会社
<120> 包含c-Met蛋白结合蛋白的复合物
<130> 21-068P
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸
<220>
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<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸
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<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸
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<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸
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<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Val Ser Xaa Asp Xaa Asp Xaa Pro Arg Trp Xaa Cys
1 5 10 15
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<221> MOD_RES
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<400> 23
Phe Glu Ala Val Ser Phe Asp Pro Asp Xaa Pro Arg Trp Ala Cys
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<210> 24
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<220>
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<220>
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<223> Xaa为Ahp
<220>
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Phe Glu Ala Val Ser Phe Asp Pro Asp Xaa Pro Arg Trp Ser Cys
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<210> 25
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<220>
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<220>
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<220>
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<223> 甲基化
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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<223> Xaa为Ahp
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<212> PRT
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<223> 合成多肽
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<220>
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<223> Xaa为Ahp
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<221> MOD_RES
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<212> PRT
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<223> 合成多肽
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 甲基化
<400> 30
Phe Thr Ala Val Ser Phe Asp Ser Asp Arg Pro Arg Trp Ser Cys
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 甲基化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为Ahp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 甲基化
<400> 31
Phe Thr Ala Val Ser Phe Asp Ser Asp Xaa Pro Arg Trp Ala Cys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 甲基化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为Ahp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 甲基化
<400> 32
Phe Thr Ala Val Ser Phe Asp Pro Asp Xaa Pro Arg Trp Ala Cys
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 甲基化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为Ahp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 甲基化
<400> 33
Phe Thr Ala Val Ser Phe Asp Pro Asp Xaa Pro Arg Trp Ser Cys
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲基化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 甲基化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为Ahp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 甲基化
<400> 34
Phe Thr Ala Val Ser Phe Asp Glu Asp Xaa Pro Arg Trp Ser Cys
1 5 10 15
<210> 35
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为PEG12c
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为PEG12c
<400> 35
Xaa Lys Xaa
1
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为cPEG9c
<400> 36
Gly Lys Xaa Lys Gly
1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为OCOPEG13OCO
<400> 37
Gly Lys Xaa Lys Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为cPEG17c
<400> 38
Gly Lys Xaa Lys Gly
1 5
<210> 39
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为PEG4c
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为PEG4c
<400> 39
Xaa Lys Xaa
1
<210> 40
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为PEG8c
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为PEG8c
<400> 40
Xaa Lys Xaa
1
<210> 41
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为cPEG1c
<400> 41
Gly Lys Xaa Lys Gly
1

Claims (16)

1.一种肽复合物，其包含与c－Met蛋白结合的肽A，其中，
所述肽A是由X1－X2－X3－V－S－X4－D－X5－D－X6－P－R－W－X7－MeC(序列号1)所记载的氨基酸序列所构成的肽，或由序列号1所记载的氨基酸序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成，
X1为可经N－烷基化的氨基酸，
X2为任意氨基酸，
X3为任意氨基酸，
X4为可经N－烷基化的疏水性氨基酸，
X5为任意氨基酸，
X6为在侧链具有可有取代的烷基链的氨基酸或S，
X7为任意氨基酸。
2.根据权利要求1的肽复合物，其中，
X1为可经N－甲基化的A或可经N－甲基化的F，
X2为亲水性氨基酸、脂肪族/支链氨基酸或芳香族氨基酸，
X3为亲水性氨基酸、脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸，
X4为可经N－甲基化的疏水性氨基酸，
X5为亲水性氨基酸、脂肪族/支链氨基酸或P，
X7为亲水性氨基酸或脂肪族氨基酸。
3.根据权利要求1的肽复合物，其中，
X1为可经N－甲基化的A或可经N－甲基化的F，
X2为V、T、E、Q或W，
X3为A、R、Y或D，
X4为可经甲基化的F或可经甲基化的L，
X5为D、E、S、P或V，
X6为(S)－2－氨基庚酸(Ahp)、R、L－正亮氨酸(Nle)、(S)－2,7－二氨基庚酸(Hty)或S，
X7为S、A、L－α－氨基丁酸(Abu)、D、Q或V。
4.根据权利要求1的肽复合物，其中，
所述肽复合物是由第一肽、第二肽以及连接第一肽及第二肽的连接子所构成，
第一肽及第二肽中的至少一者为所述肽A。
5.根据权利要求4的肽复合物，其中，
第一肽及第二肽可为相同亦可为不同，且为所述肽A。
6.根据权利要求5的肽复合物，其中，
所述肽A是由MeF－T－A－V－S－MeF－D－E－D－Ahp－P－R－W－S－MeC(序列号34)所记载的氨基酸序列所构成的肽，或由序列号34所记载的氨基酸序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的氨基酸序列所构成，且为与c－Met蛋白结合的肽。
7.根据权利要求6的肽复合物，其中，所述肽A为环状肽。
8.根据权利要求7的肽复合物，其中，第一肽及第二肽为相同的肽A，第一肽及第二肽的C端已与所述连接子结合。
9.根据权利要求8的肽复合物，其中，所述肽A是由序列号2～序列号34中任一项所记载的氨基酸序列所构成的肽。
10.根据权利要求9的肽复合物，其中，所述连接子为PEG连接子。
11.根据权利要求9的肽复合物，其中，所述连接子具有序列号35～41中任一项所记载的序列，或是由序列号35～41中任一项所记载的序列中1～3个氨基酸经取代、缺失、加成或插入的序列所构成的连接子。
12.一种c－Met蛋白激动剂，其包含如权利要求11的肽复合物。
13.一种医药组合物，其包含如权利要求5至12中任一项的肽复合物与药学上可容许的载体。
14.根据权利要求13的医药组合物，其用于治疗或预防选自由缺血性心脏病、急性肝炎、暴发性肝炎、肝硬化、胆道闭锁、脂肪肝、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、糖尿病肾病、急性肺炎、肺纤维化、血管疾病、心肌梗塞、扩张型心肌病、皮肤溃疡、脑梗塞、闭塞性动脉硬化、胃溃疡及肌萎缩侧索硬化症所组成的群组的疾病。
15.一种培养用培养基添加物，其包含如权利要求1至11中任一项的肽复合物。
16.根据权利要求15的培养用培养基添加物，其用于培养来自人体的细胞或组织。
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