CN117083087A

CN117083087A - 基于蛋白质的眼疾治疗

Info

Publication number: CN117083087A
Application number: CN202280018932.1A
Authority: CN
Inventors: 拉姆·H·纳加拉杰; 鲁班·B·纳奥米; 多萝塔·L·斯坦科夫斯卡
Original assignee: Fort Worth Health Science Center University Of North Texas; University of Colorado
Current assignee: Fort Worth Health Science Center University Of North Texas; University of Colorado
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2023-11-17

Abstract

用于受试者的视网膜疾病、损伤或状况的基于肽的疗法，包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含至少一种源自热休克蛋白的肽，所述热休克蛋白包括Hsp20和αB‑crystallin。所施用的肽可以乙酰化和/或与细胞穿透肽缀合。肽的施用可以减少或防止至少一种视网膜细胞类型的损失，所述视网膜细胞类型包括视网膜神经节细胞和视网膜内皮细胞。这些细胞的损失会导致患有眼疾的病人的视网膜损伤和视力丧失。所述药物组合物可以通过给药装置进行玻璃体内给药。单次注射就可能在治疗上足以治疗各种眼疾。

Description

基于蛋白质的眼疾治疗

政府利益声明

本发明是在国家卫生研究院的政府资助下进行的(补助金号5R01EY028179-02)。政府对本发明拥有一定的权利。

相关申请的交叉参考

本申请要求2021年2月22日提交的第63/152,128号美国临时专利申请(标题为“基于蛋白质的眼疾治疗”)和2021年10月29日提交的第63/273,643号美国临时专利申请(标题为“基于蛋白质的眼疾治疗”)的优先权。以上每一个申请都通过参考的方式被整体合并到本文中，且用于全部目的。

技术领域

本公开一般性地涉及组合物、系统和方法，用于治疗因外伤或疾病引起的视网膜损伤。具体实施方法包括：将至少一种热休克肽或其一部分递送至受试者的视网膜细胞，该受试者患有眼损伤或处于发展为眼损伤的风险中。

背景技术

全世界有近7,500万人患有青光眼，并且大约有800万人因青光眼病而失明。仅在美国，就有近300万人患有青光眼，并且该数字预计到2050年将比翻倍还多。因为与青光眼相关的视力下降常常主要归因于眼睛内部的升高压力(称为眼内压)，所以传统的青光眼首要疗法通常包括局部施用降低眼内压的药物。然而，即使这种方法成功地降低了眼压，许多患者仍然会失明，这是因为轴突变性以及视网膜中细胞(称为视网膜神经节细胞(“RGCs”))的持续死亡。造成轴突变性和RGC死亡的因素多种多样，有单独因素，更有综合因素，这些因素使得青光眼和其他眼疾的治疗非常困难。因此，需要安全和有效的方法来防止RGC死亡和轴突变性。

发明内容

本公开包括针对各种眼疾(包括青光眼)的基于肽的新型疗法。实施方式包括源自热休克蛋白(“HSPs”)的肽。可以玻璃体内注射所公开的HSP肽，以在受试者的单眼(双眼)中提供定向的局部作用。通过施用一种或多种所公开的HSP肽，可以成功地治疗、预防和/或减轻眼疾的至少一种症状，所公开的HSP肽可以与细胞穿透肽(“CPP”)缀合以增加细胞穿透性和效果。如本文概述的实验数据所显示的，通过基本上阻止、减缓和/或降低眼内张力、RGC死亡、视网膜内皮细胞死亡、炎性细胞因子产生、轴突变性和/或视网膜毛细血管变性，所公开的HSP肽、药物组合物和相关疗法可以预防或治疗视网膜损伤。

根据本公开的具体实施例，提供了一种方法，该方法用于治疗、降低风险、预防和/或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状，该方法可以包括向受试者的玻璃体内施用治疗有效量的组合物，该组合物包括至少一种源自生物活性热休克蛋白的多肽，所述热休克蛋白诸如Hsp20。该至少一种多肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVKHFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。

在该方法的一些实施例中，所述多肽可以乙酰化。在该方法的一些实施例中，所述多肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。在该方法的一些实施例中，多肽可以表现出分子伴侣活性。在该方法的一些实施例中，可以在眼科手术过程期间或手术之后施用组合物。在一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以是青光眼。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱落和视网膜色素变性。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可能是由以下原因引起的：兴奋性毒性损伤、物理损伤、化学损伤、神经营养因子剥夺、氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、轴突运输失败、或者以上的组合。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以包括人类视网膜神经节细胞的损失。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以包括高眼压。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以包括视神经变性。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以包括病理性细胞凋亡和/或蛋白质聚集。

根据本公开的具体实施例，提供了一种系统，该系统用于治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状，该系统可以包括治疗有效量的组合物，该组合物包括至少一种源自生物活性热休克蛋白的多肽，所述热休克蛋白诸如Hsp20。所述多肽可具有与G⁷³HFSVLLDVKHFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。该系统还可以包括玻璃体内注射装置，该装置配置成向受试者施用所述组合物。

在该系统的一些实施例中，所述多肽可以乙酰化。在该系统的一些实施例中，多肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。在该系统的一些实施例中，所述玻璃体内注射装置可以是结核菌素注射器、Hamilton注射器或Tribofilm Staclear型注射器。在该系统的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：青光眼、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱落、视网膜色素变性、视网膜神经节细胞损失、视网膜内皮细胞损失、视网膜毛细血管细胞损失、高眼压、视神经变性、病理性细胞凋亡以及蛋白质聚集。

根据本公开的具体实施例，提供了一种药物组合物，它可以包括至少一种源自Hsp20的多肽。该多肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVKHFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。该药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以配制成用于治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状。该药物组合物可以配制成用于玻璃体内给药。

在所述组合物的一些实施例中，多肽可以乙酰化。在组合物的一些实施例中，多肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。在该组合物的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：青光眼、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱落、视网膜色素变性、视网膜神经节细胞损失、视网膜内皮细胞损失、视网膜毛细血管细胞损失、高眼压、视神经变性、病理性细胞凋亡以及蛋白质聚集。

根据本公开的具体实施例，包括至少一种源自生物活性热休克蛋白的多肽的药物组合物可以用于制备药物，该药物用于治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状。所述热休克蛋白可以是Hsp20。所述多肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVKHFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的的氨基酸序列，并且所述药物组合物可以被配制成用于玻璃体内给药。

在一些制备实施例中，所述多肽可被乙酰化。在一些制备实施例中，多肽可具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。在一些制备实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：青光眼、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱落、视网膜色素变性、视网膜神经节细胞损失、视网膜内皮细胞损失、视网膜毛细血管细胞损失、高眼压、视神经变性、病理性细胞凋亡以及蛋白质聚集。

根据本公开的具体实施例，一种治疗、降低风险、预防和/或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状的方法，可以包括向受试者玻璃体内施用治疗有效量的组合物，该组合物包括至少一种源自生物活性热休克蛋白的多肽，该热休克蛋白诸如αB-crystallin。所述多肽可以具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³至少90％相同的氨基酸序列。

在该方法的一些实施例中，所述多肽可以与细胞穿透肽缀合。在该方法的一些实施例中，所述细胞穿透肽可以具有与VPTLK至少80％相同的氨基酸序列。在该方法的一些实施例中，可以在眼科手术过程期间或手术之后施用所述组合物。

在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以是青光眼。在该方法的一些实施例中，视网膜疾病、损伤或状况可以包括人类视网膜神经节细胞的损失。在该方法的一些实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以包括人类视网膜神经节细胞功能的损失。在该方法的一些实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可能使由物理损伤、化学损伤、神经营养因子剥夺或其组合引起的。在该方法的一些实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以包括高眼压。在该方法的一些实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以包括视神经变性。

根据本公开的具体实施例，提供了一种用于治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状的系统，该系统可以包括治疗有效量的组合物，该组合物包括至少一种源自生物活性热休克蛋白的多肽，所述热休克蛋白诸如αB-crystallin。所述多肽可以具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³至少90％相同的氨基酸序列。该系统还可包括配置成向受试者施用组合物的玻璃体内注射装置。

在该系统的一些实施例中，所述多肽可以与细胞穿透肽缀合。在该系统的一些实施例中，所述细胞穿透肽的氨基酸序列至少有80％与VPTLK相同。在该系统的一些实施例中，所述玻璃体内注射装置可以是结核菌素注射器。在该系统的一些实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：青光眼、视网膜神经节细胞损失、视网膜神经节细胞功能衰退、视网膜内皮细胞损失、高眼压和视神经变性。

根据本公开的具体实施例，提供了一种药物组合物，该药物组合物可以包括至少一种源自αB-crystallin的多肽。所述多肽可以具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³至少90％相同的氨基酸序列。所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。所述药物组合物可以配制成用于治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状。所述药物组合物可以配制成用于玻璃体内给药。

在药物组合物的一些实施例中，多肽可以与细胞穿透肽缀合，所述细胞穿透肽的氨基酸序列与VPTLK至少有80％相同。在药物组合物的一些实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：青光眼、视网膜神经节细胞损失、视网膜神经节细胞功能衰退、视网膜内皮细胞损失、高眼压以及视神经变性。

根据本公开的具体实施例，包括至少一种源自生物活性热休克蛋白的多肽的药物组合物可以用于制备药物，该药物用于治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状。所述热休克蛋白可以包括αB-crystallin。所述多肽可以具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVK⁹²至少90％相同的氨基酸序列。所述药物组合物可以配制成用于玻璃体内给药。在一些制备实施例中，多肽可与细胞穿透肽缀合，所述细胞穿透肽的氨基酸序列可以与VPTLK至少80％相同。在一些制备实施例中，所述视网膜疾病、损伤或状况可以选自由以下组成的组：青光眼、视网膜神经节细胞损失、视网膜神经节细胞功能衰退、视网膜内皮细胞损失、高眼压以及视神经变性。

本“发明内容”既不打算也不应被解释为代表本公开的全部程度和范围。此外，本文中提及的“本公开”或其各个方面，应被理解为指本公开的一些实施例，而不必被解释为将所有实施例限制为某一特定描述。在本“发明内容”、附图和“具体实施方式”中以不同的详细程度阐述了本公开，并且，在本“发明内容”中包括或不包括元素和组分等，并不意味着对本公开的范围进行限制。所公开的任何实施例中的特征都可以相互组合使用，而不受任何限制。另外，对于本领域普通技术人员而言，通过考虑以下“具体实施方式”和附图，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。

附图说明

附图显示了本发明的一些实施例，其中，在附图中所示的不同视图或实施例中，相同的附图标记指代相同或相似的元素或特征。

图1A是线条图，显示了根据本文公开的实施例，微珠注射对眼内压的影响。

图1B是条块图，显示了根据本文公开的实施例，在基于微珠的高眼压小鼠模型中，玻璃体内施用HSP肽对RGC死亡的影响。

图1C是共聚焦显微镜图像，显示了根据本文公开的实施例，使用Brna3和β-III-tubulin免疫染色法，玻璃体内施用HSP肽对健康小鼠RGCs或高眼压小鼠RGCs的影响。

图2A是线条图，显示了根据本文公开的实施例，硅油注射对眼内压的影响。

图2B是条块图，显示了根据本文公开的实施例，在基于硅油的高眼压小鼠模型中，玻璃体内施用HSP肽对RGC死亡的影响。

图2C是共聚焦显微镜图像，显示了根据本文公开的实施例，使用Brna3免疫染色法，玻璃体内施用HSP肽对健康小鼠RGCs或高眼压小鼠RGCs的影响。

图3A是条块图和相应的免疫印迹，显示了根据本文公开的实施例，促炎细胞因子暴露对人视网膜内皮细胞存活的影响。

图3B是条块图和相应的免疫印迹，显示了根据本文公开的实施例，HSP肽施用对促炎细胞因子暴露后人视网膜内皮细胞存活的影响。

图3C是条块图和相应的免疫印迹，显示了根据本文公开的实施例，肽施用之后人视网膜内皮细胞中的HSP肽水平。

图4A是共聚焦显微镜图像，显示了根据本文公开的实施例，在玻璃体内注射HSP肽的小鼠的视网膜中存在用Cy5染料标记的HSP肽。

图4B是条块图，显示了在图4A所描绘的视网膜细胞中检测到的荧光水平。

图4C是共聚焦显微镜图像，显示了根据本文公开的实施例，图4A中的HSP肽存在于玻璃体内注射有HSP肽的小鼠RGCs中。

图5A是显微镜图像，显示了根据本文公开的实施例，施用HSP肽对眼损伤后视网膜毛细血管细胞变性的影响。

图5B是条块图，显示了图5A中检测到的无细胞视网膜细胞的数量。

图6包括三个条块图，显示了根据本文公开的实施例，施用HSP肽对眼损伤后视网膜中炎性细胞因子表达的影响。

图7是条块图和相应的免疫印迹，显示了根据本文公开的实施例，与细胞穿透肽(CPP)缀合的peptain-1(P1)对视网膜内皮细胞的穿透。

图8A是Cytation5显微镜图像面板，显示了根据本文公开的实施例，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对营养因子剥夺后大鼠原代RGCs保护的影响。

图8B是条块图，显示了根据本文公开的实施例，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对营养因子剥夺后大鼠原代RGCs保护的定量影响。

图9A是Cytation5显微镜图像面板，显示了根据本文公开的实施例，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对内皮素-3诱导死亡后大鼠原代RGCs保护的影响。

图9B是条块图，显示了根据本文公开的实施例，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对内皮素-3诱导死亡后大鼠原代RGCs保护的定量影响。

图10A是Cytation5显微镜图像面板，显示了根据本文公开的实施例，在使用莫里森高眼压模型通过视网膜神经节细胞标记物Brna3的免疫标记检测眼内压升高六周后，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对大鼠外周视网膜中RGCs保护的影响。

图10B是条块图，显示了根据本文公开的实施例，在挪威棕色大鼠眼内压升高六周后，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对外周视网膜中RGC保护的定量影响。

图10C是条块图，显示了根据本文公开的实施例，在挪威棕色大鼠眼内压升高六周后，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对中周视网膜中RGCs保护的定量影响。

图10D是线条图，显示了在IOP升高的眼睛和对侧眼睛中测量的眼内压曲线，以验证根据本文公开的实施例在图10A-10C中反映的眼内压升高情况。

图11是光学显微镜图像面板，显示了根据本文公开的实施例，在挪威棕色大鼠眼内压升高六周后，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对视神经轴突保护的影响。

图12A是条块图，显示了根据本文公开的实施例，在挪威棕色大鼠眼内压升高六周后，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对RGC功能的影响。

图12B是与图12A中条块图相对应的图形视网膜电图(“PERG”)迹线的集合。

图13A是条块图，显示了根据本文公开的实施例，在RGC死亡的人类视网膜外植体模型中离体培养七天后，与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对人RGCs保护的定量影响。

图13B是共聚焦显微镜图像面板，显示了与细胞穿透肽缀合的peptain-1(P1-CPP)对图13A中表示的人RGCs保护的影响。

图14A是表示RNA测序结果的条块图，显示了根据本文公开的实施例，与IOP升高和载体处理两周相比，在IOP升高和P1-CPP处理两周后分离的大鼠RGCs中显著上调和下调的典型通路。

图14B是根据本文公开的实施例，与从IOP升高的载体对照大鼠分离的RGCs相比，从IOP升高、P1-CPP处理的大鼠分离的RGCs的促存活CREB通路中前12个差异表达基因的热图分析。

图14C是条块图，显示了根据本文公开的实施例，与IOP升高的载体处理的对照大鼠相比，从IOP升高、P1-CPP处理的大鼠分离的RGCs中Creb1基因表达的相对折叠变化。

具体实施方式

本公开涉及组合物、方法和系统，用于治疗、降低风险、预防和/或减轻视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状，包括青光眼和相关眼损伤。实施例包括通过肽递送方法减少或预防视网膜细胞死亡，所述肽递送方法涉及施用包含至少一种HSP肽(诸如源自Hsp20或αB-crystallin的肽)的药物组合物。在一些实施例中，所述HSP肽可以与CPP缀合，这可增加HSP肽对目标细胞(例如RGCs)的穿透，从而也提高了HSP肽的期望效果。为了向视网膜细胞递送外源性HSP肽，可以玻璃体内施用所述药物组合物。可以在受试者被诊断出患有眼疾(诸如青光眼)之前和/或之后，或者在受试者眼睛受伤后，一次或多次施用药物组合物，该药物组合物还可以包括可接受的载体和/或赋形剂。按照所公开的方式(例如直接给药到受试者的一只眼睛或两只眼睛中)施用药物组合物，可以增加眼睛中抗凋亡HSP肽的水平，从而显著抑制视网膜细胞死亡、降低眼内压和/或减少轴突变性，否则这些就会在眼部受伤或眼疾发病后发生。虽然不限于任何特定理论，但是施用药物组合物可以上调促存活CREB信号通路的一种或多种成分。这些益处可以以眼科治疗领域之前未曾设想过的安全且有效的方式预防、改善和/或阻止视网膜损伤。

除非下文另有定义，否则本文所用的技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。对本发明而言，为清楚起见，定义了以下术语。

本文所用的“HSPs”是应激蛋白，每个均具有约80到约100个氨基酸残基的crystallin(晶体蛋白)核心域。在另外的生理功能中，HSPs还可以在其所存在的细胞内展现出抗凋亡和分子伴侣活性。HSPs可以在类别上分为小HSP肽(～12–43kDa)和大HSP肽(～100–110kDa)。小HSP肽的例子包括α-crystallin(由αA和αB两个亚基组成)、Hsp20和Hsp27。

本文中提到的“HSP肽”是从HSPs(诸如Hsp20和αB-crystallin)衍生而来的多肽。术语“肽”或“多肽”在本文中可以互换使用。构成每种HSP肽的氨基酸数目可以改变，其在各个实施例中范围从约2个氨基酸到约50个氨基酸、从约6个氨基酸到约40个氨基酸、从约10个氨基酸到约30个氨基酸、从约12个氨基酸到约28个氨基酸、从约14个氨基酸到约26个氨基酸、从约16个氨基酸到约24个氨基酸、从约18个氨基酸到约22个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸或约21个氨基酸。每种HSP肽均可均构成其所来源的全长蛋白的crystallin核心域的一部分。例如，HSP肽可以包括其所来源的HSPs的crystallin核心域中存在的约20-25％氨基酸。尽管HSP肽的尺寸较小，但仍可以保留相应的全尺寸crystallin核心域的分子伴侣和抗凋亡特性。每个氨基酸的每个氨基都通过肽键与另一氨基酸的羧基链接。本文公开的HSP肽可通过酶解和/或化学裂解从天然存在的人类或非人类HSPs直接提取。替换地，HSP肽可以通过肽合成技术制备。所得到的HSP肽可以以各种形式存在，诸如具有或不具有一定程度三维折叠的氨基酸链。与它们所来源的HSPs一样，所公开的HSP肽可以是细胞可渗透的，可以抑制蛋白质聚集和细胞凋亡，并且可以展现出稳健的分子伴侣活性。因此，肽可以有效地防止或治疗涉及蛋白质聚集和细胞凋亡的疾病或状况。

HSP肽可以在一些实施例中乙酰化，而在另一些实施例中不会乙酰化。“乙酰化”肽是包括至少一种乙酰化氨基酸(如赖氨酸)的肽。在一些例子中，可以进行化学乙酰化处理，以便在将它们加入药物组合物之前生成乙酰化HSP肽。本文公开的乙酰化肽不易受到蛋白水解酶的影响，从而使其在生物体内更加稳定。

本文所用的“受试者”是指人类或其他哺乳动物。非人类受试者可以包括但不限于各种哺乳动物，诸如家养宠物和/或牲畜。受试者可被视为需要治疗。所公开的组合物、方法和系统可以有效地治疗健康的人类受试者、被诊断患有青光眼或糖尿病视网膜病变的病人、被诊断患有一种或多种其他眼疾的病人、遭受各种眼部损伤的病人、糖尿病患者、或者经历视力下降的患者。

本文所用的“眼疾”包括与眼睛有关的所有疾病或状况，包括对受试者的一只眼睛或两只眼睛有负面影响的疾病或状况。本文公开的治疗方法所针对的眼部疾病、损伤和状况可能会特别损害视网膜组织，包括RGCs、视网膜内皮细胞和视网膜毛细血管。本文考虑的眼疾的非限制性例子可以包括青光眼、黄斑变性、白内障形成、糖尿病性眼病、糖尿病性视网膜病变、视网膜脱落、视网膜色素变性、RGC死亡、眼内压升高、高眼压、轴突变性、兴奋性毒性损伤、物理损伤(例如缺血和/或再灌注)、化学损伤、神经营养因子剥夺、氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、轴突运输失败或者以上的组合。

本文所用的“青光眼”是指一种疾病，其特征是：由于视神经受到不可逆转的损伤而导致视觉功能永久丧失。青光眼的两种主要类型是原发性开角型青光眼和闭角型青光眼，这两种青光眼的其中一种或者两种可以根据本文所述的实施例得以治疗。

本文所用术语“眼内压”是指眼睛内部的流体压力。正常人眼睛的眼内压通常在约10毫米汞柱至约21毫米汞柱的范围内。“升高的”眼内压或“高眼压”通常被认为大于或等于约21毫米汞柱。升高的眼内压可能是导致青光眼的危险因素。

本文所述的治疗视网膜损伤包括：对于由疾病、损伤或其他状况引起的或与之相关的视网膜损伤的至少一种症状进行治疗、降低其风险、预防或减轻。因此，“治疗”、“处理”或“减轻”既指治疗性治疗，也指预防性或防备性措施，其目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况和/或症状。需要治疗的人包括那些已经被诊断出患有病症的人，以及那些容易感染或发展成病症的人。如果受试者根据本公开的方法接受治疗有效量的药物组合物之后，其视力损伤、视力下降、视力异常、轴突变性、RGC死亡、视网膜内皮细胞死亡和/或视网膜毛细血管变性中的一种或多种出现可观察到的和/或可测量到的减轻或消失，则受试者被成功地“治疗”了视网膜损伤。本文中的术语“治疗”或“处理”的用法一致，只是为了便于说明，因此不应被理解为限制性的。

“减轻”、“减少”或“降低”是指减小视网膜损伤的严重程度、范围、频率或时长。

包含HSP肽或HSP肽组合的组合物的“有效量”是指足以执行特定目的的量，并且可以根据经验和常规方式相对于所述目的进行确定。例如，本文所用的“有效量”可以被定义为给受试者施用后，将恢复或超过受试者RGCs、视网膜内皮细胞和/或视网膜毛细血管细胞中天然HSP水平的HSP肽的量。术语“治疗有效量”是指包含HSP肽的组合物的量，其将可检测地并且可重复地治疗、降低风险、预防或减轻受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状。这包括但不限于降低病征或病症的频率或严重程度，诸如眼内压升高、RGC死亡、视网膜内皮细胞死亡、视网膜毛细血管变性、视力下降、RGC胞体变性、和/或RGC轴突变性。相对于未根据本文公开的方法施用公开的药物组合物的受试者的眼睛而言，这种改善是可以考虑的。本领域技术人员会理解，治疗可以改善疾病状况，但可能不是完全治愈疾病。例如，通过患眼视野损失不再发展或者患眼视野损失的发展速度得以减慢，可以证明对于青光眼患者的成功治疗。

“给药”和“施用”化合物、组合物或制剂应被理解为提供本文所述的化合物、组合物或制剂，化合物、组合物或制剂的前药，或者药物组合物。所述化合物、制剂或组合物可以由他人提供或施加给受试者(例如，经玻璃体)，或者可以由受试者自行施用。

“药物组合物”或“药物制剂”是指包括一定量(例如单位剂量)的一种或多种公开化合物的组合物，例如，可选择与CPP缀合的乙酰化或非乙酰化HSP肽，以及一种或多种无毒的药学上可接受的添加剂，包括载体、稀释剂和/或佐剂，以及可选择的其他生物活性成分。此类药物组合物可以通过标准药物配制技术而制备，例如在麦克出版公司(位于宾夕法尼亚州伊斯顿)的雷氏药学大全(Remington’s pharmaceutical Sciences)(第19版)中公开的那些技术。

本文中使用的“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，其有助于药物组合物达到所需的形式或稠度。每种赋形剂或载体在混合时都必须与药物组合物的其他成分相兼容，以避免以下相互作用，即，在给受试者施用时会显著降低本公开组合物药效的相互作用，以及会导致药物组合物不具有药学上可接受性的相互作用。此外，每种赋形剂或载体都必须具有足够高的纯度，以便使其在药学上是可接受的。药学上可接受载体的非限制性例子可以包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油或类似物。附加地或替代地，载体可以包括：润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、悬浮剂、防腐剂或类似物。

本文中使用的“野生型”是指天然存在的蛋白质或其一部分，如同它通常存在于生物体内的。

本文所述实施方案中使用的制剂、化合物、组合物、抗体等被认为在使用前已被纯化和/或分离。纯化的材料通常是“基本纯的”，这意味着HSP肽或其他分子已经从天然伴随它的成分中分离出来。例如，当HSP肽至少有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、98％或99％(按重量计)不含与它天然结合的蛋白质和其他有机分子时，可认为HSP肽基本是纯的。

本文使用的术语“相同”或“相似”表示两个或多个多肽序列或其基础核酸序列之间的关系，如通过比较这些序列而确定的。在本领域中，“相同”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，如通过这些序列的串之间的匹配所确定的。

除非上下文另有明确说明，否则单数词“一”、“一个”和“这个”包括复数指代。类似地，词语“或”意在包括“和”，除非上下文另有明确指示。词语“组成”意味着“包括”。同样，“由A或B组成”意味着包括A或B，或者A和B，除非上下文另有明确说明。尽管与本文所述方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但下文将描述合适的方法和材料。另外，这些材料、方法和例子只是说明性的，并不具有限制性。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过参考而并入本文中。不承认本文所引用的参考文献是要求保护的本发明的现有技术。

HSP肽

本公开的HSP肽包括源自人类HSPs的基本上纯的多肽。HSP肽可以是细胞可渗透的，并且可以抑制蛋白质聚集和/或细胞凋亡。

实施例可以包括：源自Hsp20的一种或多种肽，源自αB-crystallin的一种或多种肽，或者源自Hsp20和αB-crystallin的一种或多种肽的混合物。也可以使用源自其他HSPs的肽，非限制性的例子可以包括αA-crystallin和Hsp27。在一些例子中，Hsp20肽对于预防、降低和/或减缓与眼睛损伤或疾病相关的RGC死亡可能是最有效的。在其他例子中，αB-crystallin肽对于相同或不同的目的可能是最有效的，这些目的诸如预防、降低或抑制视网膜内皮细胞死亡、视网膜毛细血管变性和/或炎症细胞因子产生。取决于受试者和/或被治疗的病症和/或治疗方法，特定的HSP肽可以表现出不同程度的功效。

Hsp20肽可以具有与G⁷³HFSVLLDVKHFSPEEIAVK⁹¹(SEQ ID NO:1)至少约90％相同、至少约95％相同或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，Hsp20肽可以乙酰化。乙酰化Hsp20肽的一个例子可以具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹(SEQ ID NO:2)至少约90％相同、至少约95％相同或100％相同的氨基酸序列。玻璃体内施用与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2相似或相同的Hsp20肽可以有效预防、减少和/或延缓患有青光眼和/或与之相关的一种或多种病症(诸如高眼压或轴突变性)的受试者的RGC死亡。

αB-crystallin肽可以具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³(SEQ ID NO:3)至少约90％相同、至少约95％相同或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，αB-crystallin肽也可以乙酰化。与SEQ ID NO:3相似或相同的αB-crystallin肽可以有效预防、减少和/或减缓患有青光眼和/或与之相关的一种或多种病症(如高眼压或轴突变性)的受试者的RGC死亡。施用与SEQ ID NO:3相似或相同的αB-crystallin肽还可以有效预防、减少和/或减缓视网膜内皮细胞的死亡和/或视网膜毛细血管细胞的不可逆损伤，这可通过无细胞毛细血管数量的增加来证明。在一些例子中，施用与SEQ ID NO:3相似或相同的αB-crystallin肽还可以有效减少或抑制眼损伤后一种或多种促炎细胞因子的表达。

实施例可以包括与至少一种CPP缀合的HSP肽。CPP可以增加与之缀合的HSP肽的视网膜细胞穿透性，这相对于单独递送HSP肽，可增加或最大限度地将HSP肽递送到眼睛的最高内界膜。因此，玻璃体内施用CPP缀合的HSP肽可以进一步预防、降低和/或减缓与眼损伤或疾病相关的RGC死亡和/或功能衰退。在一些非限制性的实施例中，CPP可以与类似于或相同于SEQ ID NO:3的αB-crystallin肽特异性缀合。实施例还可以包括与一种或多种Hsp20肽缀合的CPP，其可具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相似或相同的氨基酸序列。可以与一种或多种公开的HSP肽缀合的CPP的一个例子可具有与VPTLK(SEQ ID NO:6)至少约80％相同或100％相同的氨基酸序列。施用HSP肽(例如，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，与具有至少约80％或100％与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列的CPP缀合)，可导致RGC死亡的特别显著的减少和/或减缓，并保持轴突完整性，这可至少部分由CREB信号通路的一种或多种成分的上调驱动。

药物组合物

本公开的药物组合物适用于治疗、降低风险、预防或减轻由视网膜细胞功能衰退和/或视网膜细胞死亡(包括RGC死亡、视网膜内皮细胞死亡和/或视网膜毛细血管变性)引起的或与之相关的眼部疾病、损伤和/或状况的至少一种症状。药物组合物的实施例可以包括至少一种HSP肽，其可与CPP缀合。该药物组合物还可以包括药学上可接受的载体，所述载体配置成促进和/或稳定HSP肽向受试者目标位置的递送。

在一些实施例中，药物组合物可以包括两种或多种不同HSP肽的混合物，其中一种或多种HSP肽可以与CPP缀合。例如，药物组合物可以包括Hsp20肽和αB-crystallin肽的混合物。根据这些例子，Hsp20肽与αB-crystallin肽的比率可以是约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3或约1:2。

在实施例中，药物组合物可以包括一种或多种赋形剂，或者与一种或多种赋形剂同时施用。合适的赋形剂可以根据所使用的特定剂型而变化。此外，可针对特定功能选择合适的赋形剂，诸如便于制造稳定剂型的能力。赋形剂的选择也可以是为了符合法规要求。非限制性赋形剂的例子包括：填料、粘合剂、崩解剂、润滑剂、胶凝剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、着色剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。在一些实施例中，可以使用一种或多种递送载体，其中的非限制性例子可以包括纳米颗粒、纳米凝胶和/或腺相关病毒载体(“AAV载体”)。本领域技术人员将理解，某些药学上可接受的赋形剂可以具有一种以上的功能，并且可以根据赋形剂在最终组合物中的含量以及组合物中还存在哪些其他成分来发挥其替代功能。

在实施例中，HSP肽可以与一种或多种缓冲剂和/或稀释剂同时施用，其中非限制性的例子可以包括各种浓度的氢氧化钠和磷酸钠。

特定赋形剂和/或载体的加入可以取决于施用途径。例如，用于肠外施用的制剂可以包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和/或栓剂。非水溶剂可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油和/或可注射酯。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸脂、甘油明胶或类似物。为了增加肽的稳定性或吸收性，可以使用碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂。

在一些实施例中，药物组合物也可以作为局部组合物提供，例如以滴眼液的形式。滴眼液可以用水基或非水基配制，水基或非水基还包括一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮剂。根据这些实施例，药物组合物中HSP肽的浓度可以高于玻璃体内实施时的浓度。

治疗途径

治疗眼疾的方法可以包括向受试者的眼睛施用治疗有效量的本文公开的HSP肽组合物。所述组合物可以在遭受眼部损伤(包括眼部外科手术)后施用，或者在诊断出眼部疾病后施用。实施例还可以包括向未诊断的受试者施用所公开的HSP肽组合物，以防止受试者发展成得病或者减轻发病时症状的严重程度。在一些例子中，可以在确定受试者罹患眼部疾病的风险高于平均水平或遭受眼部损伤的风险高于平均水平后进行预防性给药。在一些实施例中，所公开的药物组合物的玻璃体内给药在恢复或超出受试者视网膜细胞中一种或多种HSPs的自然水平方面可能是唯一有效的，所述视网膜细胞例如包括RGCs(或RGC胞体)、视网膜内皮细胞和/或视网膜毛细血管。上述水平可足以减少视网膜细胞损失，该视网膜细胞损失如果不加以治疗，将导致不可逆的视网膜损伤。

可以在患有急性闭角型青光眼的受试者手术后不久和/或手术期间，将HSP肽组合物注射到受试者的一只或两只眼睛中。这种治疗可以减少视神经变性，并最终减缓或防止视力完全丧失。在被诊断患有原发性开角型和正常眼压青光眼的受试者中，施用由源自Hsp20和/或αB-crystallin的HSP肽组成的HSP肽组合物也可减少、预防或减缓RGC死亡。施用包括源自αB-crystallin的HSP肽的组合物(无论是否含有缀合的CPP)，可以特别有效地减少、预防和/或抑制RGC死亡、视网膜内皮细胞死亡、视网膜毛细血管变性和/或视网膜细胞功能衰退。在一些实施例中，在受试者遭受创伤性脑伤之后施用HSP肽组合物，可以保护脑神经元。同样的HSP组合物还可以有效地保护糖尿病患者的肾近端小管上皮细胞。

如前文所述，药物组合物可以包括至少一种药学上可接受的载体，或与之同时给药。与此相关的是，药物组合物可以单独给药，也可以与其他治疗制剂联合给药，可以连续给药或同时给药。这样的附加制剂可以配制成也可以不配制成用于治疗相同的眼疾。

本文公开的药物组合物的给药频率可以变化。在实施例中，可以每天、每周、每月或每年施用药学上有效量的组合物。对受试者施用所公开组合物的次数以及治疗周期的长短可以取决于引起视网膜损伤或有引起视网膜损伤风险的病症的严重程度或类型。例如，与施用HSP肽组合物以治疗疾病(诸如青光眼)的实施例相比，施用药物组合物以治疗眼部损伤的实施例可能涉及较少的离散性施用，而施用HSP肽组合物以治疗疾病可能需要更持久的治疗方法。治疗周期的长短也可以根据患者的具体情况而定，并由医生或其他医疗保健提供者定期重新评估。在不同的实施例中，药物组合物可以在受伤后立即给药，例如在受伤后的一小时内、两小时内、六小时内、12小时内或24小时内给药。制剂可以被施用一次或多次，例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。

本文公开的药物组合物可以使用注射装置进行给药，诸如结核菌素注射器或静脉滴注装置，这些装置可以专门为本文所述目的而构造。在一些例子中，给药装置可以是一次性使用的装置，其可以包括在试剂盒中，该试剂盒还包括单剂量的药物组合物。因此，注射装置可以构成用于治疗、降低风险、预防或减轻视网膜损伤的至少一种症状的系统的一部分。

虽然给药途径可以变化，而且多种途径均可接受，但是所公开组合物的玻璃体内施用对于治疗一种或多种眼疾最为有效。由于治疗过程期间和治疗后受试者可能会经受疼痛，因此传统上不赞成玻璃体内施用。玻璃体内施用还可能增加出血、视网膜撕裂和脱落、白内障形成和眼部感染的可能性。然而，通过本文所述的特定HSP肽组合物的局部玻璃体内施用所实现的强大疗效和全身副作用的减少，可能会超过这些潜在的副作用。

玻璃体内施用的潜在替代方法可以包括眼部局部用药、腹腔注射。腹腔注射后，所公开的HSP肽组合物可以有效地穿过血-水屏障并最终进入视网膜细胞，其中所注射的组合物中的HSP肽可以预防、减少或以其他方式改善视网膜损伤。其他可接受的施用方法的非限制性例子可以包括静脉施用、肌内施用、皮下施用或局部施用。

给受试者施用的药物组合物的治疗有效量可以变化。在实施例中，提供给受试者的每一玻璃体内剂量的药物组合物可以包括范围为约100μg/mL至约500μg/mL的HSP肽浓度。例如，剂量可取决于所治疗的病症、病症的严重程度、制剂的性质(例如，有或没有CPP缀合)、给药方法、受试者的病症、受试者的年龄、受试者的体重、或以上的组合。剂量水平通常足以使作用部位的浓度至少与已在体外、体内或组织培养中显示出有效的浓度相同。

为了适应多种施用技术和时间安排，本文所公开的药物组合物可以按照本领域技术人员采用的方法，与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起制备成单位剂量形式或多剂量形式。示例性制剂的形式可以是水基或油基溶液、悬浮液或乳液。为了提高稳定性和长期储存，可以冻干药物组合物。

提供以下实验性例子，以说明本发明的示例性实施例，它们不应被认为是限制性的。

例子

例1

为了确定Hsp20和αB-crystallin肽对RGC死亡的影响，采用了第一小鼠高眼压模型，在该模型中给小鼠玻璃体内注射每种肽。

第一高眼压模型是通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪并局部施加0.5％盐酸丙卡因来初步麻醉小鼠而产生的。通过在每只动物的右眼前房中注射聚苯乙烯微珠(直径10μm，每毫升PBS含500万珠)单侧诱导高眼压。使用33G的针在角膜中心附近轻轻穿刺角膜，并注入一个小气泡以提升眼睛的前房。通过与Hamilton注射器相连的微量移液管将小体积(2μL)的微珠注入气泡下方的前房中。在被注射的眼睛上局部涂抹抗生素软膏以防止感染。

每周用眼压计测量眼内压，连续六周。特别地，将小鼠放入充满持续流动异氟醚(5％异氟醚，2升/分钟，与氧气混合)的麻醉室中。眼压计每周进行五次测量，去掉最高读数和最低读数，然后从剩余读数中得出每只小鼠的平均眼内压。

在每周注射微珠以增加眼内压三周之后，还在玻璃体内注射在PBS中的1μg剂量的Hsp20肽(peptain-3a)或αB-crystallin肽(peptain-1)，每周一次、注射时间跨度为三周，所述Hsp20肽具有SEQ ID NO:2，所述αB-crystallin肽具有SEQ ID NO：3。微珠注射六周后，解剖眼睛，并在4℃下用4％ PFA进行后固定过夜。随后将视网膜解剖出来并在PBS中清洗三次，然后封闭(PBS中5％正常驴血清和1％Triton X-100)过夜。接着对全装片视网膜进行Brn3a和βIII-tubulin(1:500稀释)的免疫染色，Brn3a和βIII-tubulin分别是RGCs和轴突细胞的标记物。然后用Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG或结合德克萨斯红的山羊抗兔IgG(1:250稀释)对视网膜进行染色。使用蔡司共聚焦仪的20倍镜头获得来自每个视网膜区域的四个图像场。使用ImageJ软件(NIH)计算全装片视网膜四个象限的中周边区域中Brn3a阳性的RGC数目(细胞/mm²)。对侧未受伤的眼睛被用作对照。

如图1A所示，眼微珠注射使眼内压在一周内从12毫米汞柱升高到30毫米汞柱以上。此后眼内压逐渐下降，在四周时到达一个低水平。尽管这个下降，但眼内压仍明显高于未注射微珠的对照小鼠(与第0天相比，*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001)。

图1B用图表描绘了玻璃体内肽注射对RGC存活的影响，其中ns＝不显著，***p<0.001,****p<0.0001。如图所示，在参与研究六周后，从对照小鼠(“Cont”)取出的视网膜每平方毫米具有大约3,400个RGCs。相比之下，注射有微珠和PBS(“载体”)的未经处理小鼠在六周后每平方毫米的RGCs不到2,300个。从用peptain-1(“Pept-1”)处理的小鼠中提取的视网膜在六周后每平方毫米具有超过3,200个RGCs，而从用peptain-3a(“Pept-3a”)处理的小鼠中提取的视网膜在六周后每平方毫米具有约3,000个RGCs。因此，相对于载体对照，peptain-1和peptain-3a都显著地(并且程度相似)减少了眼内压升高到高压水平的视网膜中的RGCs的损失。

图1C显示了从中获得图1B的定量RGC浓度的视网膜共聚焦显微镜图像。在从健康处理组102取出的视网膜中RGC数量最多，这一点可以从更多的Brn3a阳性的RGC染色得到证明。在未经处理的高眼压组104中，Brn3a染色要低得多。peptain-1组106和peptain-3a组108显示RGC死亡分别显著降低4％和12％(与载体对照组相比)。同时进行的βIII-tubulin免疫染色证实，peptain-1和peptain-3a还能抑制轴突变性，这由轴突细胞死亡的明显减少所证明。

例2

为了证实相同的Hsp20(peptain-3a)肽和αB-crystallin(peptain-1)肽对防止高眼压小鼠中RGC死亡的作用，建立了第二高眼压小鼠模型，在该模型中，给小鼠玻璃体内注射每种肽。

第二高眼压模型是通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪并局部施加0.5％盐酸丙卡因麻醉小鼠而产生的。在靠近角膜缘的颞上侧，将一根33G的针穿过每只受试眼睛的角膜，以到达前房，而不会损伤晶状体或虹膜。在这个孔之后，将大约两微升的硅油(1,000mPa.s)缓慢注入前房，直到产生的油滴膨胀到覆盖虹膜的大部分区域，缓慢拔出针。在注射之后，轻轻按摩上眼睑以闭合角膜切口并减少漏油，在注射的眼睛表面涂抹兽用抗生素软膏以防止感染。

两周后，去除硅油滴。用33G的针做两个角膜通道切口：一个通道切口在角膜中心上方，一个通道切口在角膜中心下方。用一根附接到3mL鲁尔锁注射器的33G的针将PBS注射到每只眼睛的前房中，以允许硅油通过下方通道切口流出。去除油后，在眼睛表面涂抹兽用抗生素软膏。

在去除油两天后，玻璃体内注射1μg剂量的peptain-3a或peptain-1(在PBS中)。在用持续流动的异氟醚(5％异氟醚，2升/分钟，与氧气混合)麻醉下，使用眼压计每周监测一次每只眼睛的眼内压，直到硅油注射后四周。去除油两周后(第28天)，取出视网膜，并用Brn3a和βIII-tubulin抗体进行免疫染色，以便对存活的RGCs进行可视化和计数。

如图2A所示，注入的硅油(“SO”)导致眼内压在两周内从约12毫米汞柱上升到约25毫米汞柱。在去除油两天后，眼内压降到约13毫米汞柱，并一直保持在约12毫米汞柱的正常范围内，直到第28天。

图2B用图表描绘了玻璃体内肽注射对RGC存活的影响，其中，与硅油去除两周后的对照样品相比，ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。对于硅油注射两周后的对照样品，###p<0.001。

如左侧两个条带所示，从健康对照小鼠(未注射硅油)摘除的视网膜具有每平方毫米大约3,900个RGCs(“2wk”)，而在硅油注射两周后注射硅油的视网膜每平方毫米只包含2,400个RGCs。此外，从健康对照小鼠(未注射硅油)摘除的视网膜在去除硅油两周后(“2+2wk”)每平方毫米具有大约3,400个RGCs，而从高眼压小鼠(“载体”)中取出的视网膜在去除硅油两周后每平方毫米只有大约2,000个RGCs。在去除硅油两周后(“2+2wk”)，从用peptain-1(“Pept-1”)处理的小鼠中摘取的视网膜每平方毫米具有略低于2,900个RGCs，从用peptain-3a(“Pept-3a”)处理的小鼠中摘取的视网膜也是如此。这些数据再次表明，相对于载体对照组，peptain-1和peptain-3a都能显著(并且程度相似)减少眼内压升高到高压水平的视网膜中的RGCs的损失。

图2C显示了染色RGCs的共聚焦显微镜图像。由更多的Brn3a阳性染色所证明，在从未注射硅油的健康对照组202中取出的视网膜中RGC数量最多，而在注射后两周从注射硅油的小鼠(高眼压组204)中取出的视网膜中RGC数量最少。相对于对照组202，未经处理的高眼压组204中的RGC计数减少了39％。健康对照组206中的RGC数量在第四周仍保持高水平，而未经处理的高眼压组208中的RGC数量在去除硅油两周后显著下降，与PBS处理组206相比，在第四周下降了41％。(与PBS处理的对照组206相比)peptain-1处理组210和peptain-3a处理组212分别将RGC死亡显著减少了15.7％和14.2％。

例3

进行第三个实验，以评估peptain-1的能力，特别是，处理糖尿病视网膜病变的标志物。因为在患有糖尿病视网膜病变的受试者中通常观察到视网膜内皮细胞死亡和视网膜毛细血管细胞死亡，所以在体外测量了在施用和未施用肽的情况下，促炎细胞因子介导的细胞凋亡后它们的存活率。

人视网膜内皮细胞(“HRECs”)在无血清培养基中用200μg/mL的peptain-1或乱序对照肽处理三小时。第一个乱序对照肽的序列是SLKEKRNFDVSEVKHVLFVDP(SEQ ID NO:4)，第二个乱序对照肽的序列是FEPSVRFSKVDHLVKENDLVK(SEQ ID NO:5)。然后用促炎细胞因子的组合(50U/mL的IFN-γ+20ng/mL的TNF-α+20ng/mL的IL-1β)处理所有测试细胞48小时。

使用含有蛋白酶抑制剂混合物的1X RIPA缓冲液制备细胞裂解物。细胞裂解物的蛋白质浓度用BCA法测量，并使用25μg的蛋白质进行免疫印迹。为了测量HREC细胞凋亡，对细胞进行了活性(裂解)胱天蛋白酶-3免疫染色，胱天蛋白酶-3是细胞凋亡的标志物。β-肌动蛋白抗体染色被用作对照，用于测量管家蛋白的水平，以及用于计算与胱天蛋白酶-3水平相比的蛋白质密度。用裂解胱天蛋白酶-3抗体处理过的免疫印迹膜最终会被剥离，并检测peptain-1抗体。

如图3A所示，促炎细胞因子混合物(“CM”)导致HREC细胞凋亡显著增加(***p＜0.001)，表现为与未用CM处理的对照细胞相比，更高水平的裂解胱天蛋白酶-3(蛋白质水平＝三份测量结果的平均值±标准差)。如蛋白免疫印迹图像所示，对照细胞和用CM处理的细胞中β-肌动蛋白的水平相似。图顶部的蛋白免疫印迹图像显示了表示细胞凋亡的裂解胱天蛋白酶-3的稳健水平，其下方的定量条块图(密度图)描绘了测量的胱天蛋白酶-3水平与β-肌动蛋白水平的密度比。如图所示，相对于β-肌动蛋白，未用CM处理的对照细胞几乎不含裂解胱天蛋白酶-3，而用CM处理过的细胞中，胱天蛋白酶-3与β-肌动蛋白的密度比约为1:1。

图3B显示，相对于仅用CM处理的对照HRECs，用CM和peptain-1处理的HRECs的存活率明显更高(*p<0.05，**p<0.01)，如通过免疫印迹所检测的用CM和peptain-1处理的细胞中裂解胱天蛋白酶-3与β-肌动蛋白水平的密度比降低(～0.5)所指示的，以及如膜印迹最右侧三条道所显示的，相对于仅用CM处理的细胞以及用CM和乱序肽(“Scr-1”和“Scr-2”)处理的细胞，用CM和petpain-1处理的细胞中产生明显更淡的裂解胱天蛋白酶-3条带。相对于peptain-1处理的细胞，在用CM和乱序肽处理的HRECs中也观察到了明显更多的细胞死亡，如图表所显示的，这些样本中的裂解胱天蛋白酶-3与β-肌动蛋白的密度比更大(*p<0.05)。

图3C显示，在用CM和peptain-1处理的细胞中，peptain-1的水平确实明显增加。特别是，与只用CM处理的细胞以及用CM和乱序对照肽(“Scr-1”和“Scr-2”)处理的细胞相比，用CM和peptain-1处理的细胞中peptain-1与β-肌动蛋白的密度比明显更高(～2.25)。条块图上方的印迹图像显示，在仅用CM处理的细胞以及用CM和乱序肽处理的细胞中没有可见的peptain-1条带。

例4

进行第四个实验，以确定小鼠玻璃体内注射之后，peptain-1是否可以转移到视网膜中。

为了能够对肽进行可视化追踪，在C端含有半胱氨酸残基的peptain-1与磺基-氰基5马来酰亚胺(Cy5)染料进行了缀合。向小鼠(C57BL6/J)玻璃体内注射1μg的与Cy5缀合的peptain-1(在2μL PBS中)。对侧眼用作阴性对照。四小时后，测量视网膜平片和匀浆组织中的Cy5荧光强度。

如图4A的视网膜平片所示，相对于对照样本，注射了peptain-l-Cy5的小鼠视网膜中的Cy5荧光明显更强。图4B以图表形式显示的荧光数据(从匀浆视网膜组织获得)证实：静脉注射后，peptain-1确实穿透了小鼠的视网膜组织，而没有使用任何转移试剂。图4C再次显示了在peptain-l-Cy5注射24小时后视网膜血管的明显穿透，其中第一列图像显示了用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(“DAPI”)染色的视网膜血管，该DAPI与存在于视网膜细胞的细胞核中的DNA结合。从上排中间的图像可以看出，在未注射peptain-l-cy5的对照细胞中未检测到Cy5荧光，而在注射了peptain-1-cy5的小鼠中(下排，中间图像)，视网膜神经节细胞的细胞核中包含显著水平的肽。因此，玻璃体内注射的peptain-1在注射后大约四小时遍布于整个受检视网膜。

例5

进行第五个实验，以确定玻璃体内注射peptain-1是否能有效治疗和/或保护眼损伤后的视网膜毛细血管细胞。

这种高眼压模型是通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪并局部施加0.5％的盐酸丙卡因麻醉12周大的C57BL/6J小鼠而产生的。为了进行I/R损伤，用一根33号针插管进入右眼前房中，该针连接到装有250毫升0.9％氯化钠溶液的抬高的小袋上。这导致眼内压在60分钟升高到120毫米汞柱。在I/R损伤后立即在玻璃体内注射peptain-1或乱序肽(0.5μg，1μLPBS中)，一周后再次注射。注射PBS的眼睛用作载体对照。对侧眼用作附加的对照。

I/R损伤或首次玻璃体内注射peptain-1 14天后，处死小鼠并摘除眼球。通过在光学显微镜下解剖而分离视网膜，并用弹性蛋白酶(40U/mL)在37℃下轻轻搅拌处理视网膜35分钟。在小心去除内界膜(ILM)后，将视网膜置于具有pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液的12孔板中，然后摇晃视网膜过夜以使剩余的RGCs变松。然后将视网膜转移到玻璃显微载玻片上，并用20μL移液管在Tris-HCl缓冲液中轻轻搅拌，小心地移除剩余的神经元组织。应用过碘酸希夫(PAS)染色来观察分离出的视网膜毛细血管层。使用倒置的荧光显微镜对安装好的毛细血管进行成像，并对来自每个处理组的无细胞毛细血管进行计数和分析。

如图5A所示，相对于未受到I/R损伤的视网膜(“对照组”)，在仅注射PBS的载体对照组眼睛中，I/R损伤(“载体”)显著增加了无细胞变性视网膜毛细血管细胞的数量，这是视网膜损伤的常见标志物。玻璃体内注射的乱序肽(“Scrb”)显示出与载体处理类似的图案。然而，玻璃体内注射的peptain-1(“Pept-1”)保护视网膜细胞免受I/R损伤，这体现在经peptain-1处理的细胞中存在的视网膜中无细胞毛细血管的数量低于未处理的细胞，如图的右下方图像所显示的，并且如图5B的图表所示，其中ns＝不显著，**p＜0.01，***p<0.0001。因此，玻璃体内施用的peptain-1减少了毛细血管变性，否则在I/R损伤后自然会发生这种毛细血管变性。

例6

进行第六个实验，以确定peptain-1(SEQ ID NO:3)是否抑制小鼠眼损伤后视网膜中炎性细胞因子的产生。小鼠受到I/R损伤，并且在I/R损伤后立即玻璃体内注射0.5μg的peptain-1或乱序肽。为了测量促炎细胞因子的水平，小鼠在I/R损伤两天后被处死并解剖视网膜。然后从视网膜裂解总RNA，将两微克RNA逆转录以合成cDNA，并且进行定量实时PCR。PCR引物的序列如下：TNF-α正向引物5'-GACAAGGCTGCCCCGACTA-3'和反向引物5'-AGGGCTCTTGATGGCAGAGA-3'；IL-1β正向引物5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'和反向引物5'-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3'；IFN-γ正向引物5'-CAGGCCAGACAGCACTCGAATG-3'和反向引物5'-AGGGAAGCACCAGGTGTCAAGT-3'。使用比较Ct法(2-ΔΔCT)分析mRNA水平，然后将其标准化为β-肌动蛋白(正向引物5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'和反向引物5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3')。

图6的图表显示，在I/R损伤后两天，与对侧视网膜(“对照组”)相比，载体对照组(“载体”)中IL-1β和TNF-α的mRNA水平显著增加(分别是12.6倍和12.0倍)，并且乱序肽处理组在I/R损伤后显示与载体组相似的图案(分别是30.9倍和10.4倍)(Scrb＝乱序肽，ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3-4)。各组中IFN-γ的mRNA水平没有明显变化。与I/R损伤后的载体组相比，peptain-1处理使IL-1β表达的增加减少4.6倍，TNF-α表达的增加减少6.2倍。因此，玻璃体内注射peptain-1降低了视网膜细胞中促炎细胞因子的上调，否则这种上调会在I/R损伤后自然发生。因此，在不拘泥于任何特定理论的情况下，peptain-1可以阻断一种或多种导致眼损伤后视网膜毛细血管变性的炎症通路。

例7

进行第七个实验，以确定与仅用peptain-1(P1)培养20小时相比，用与CPP缀合的P1(Pl-CPP)培养细胞20小时后，HRECs中的P1水平是否更高。

使用含有蛋白酶抑制剂混合物的1X RIPA缓冲液制备HREC裂解液。用BCA法测量细胞裂解液的蛋白质浓度，并用25μg蛋白质进行免疫印迹。培养HRECs一段时间后，使用抗P1抗体测量其中的P1水平。β-肌动蛋白抗体染色被用作对照，用于测量管家蛋白水平以及计算P1/β-肌动蛋白密度水平。

如图7的免疫印迹图所示，未用P1或P1-CPP处理的对照细胞中的β-肌动蛋白水平与用P1或P1-CPP培养的细胞中测得的水平相似。在用P1培养的细胞中检测到的P1水平高于对照细胞中的P1水平，这是通过P1对β-肌动蛋白的密度来测量的。相比之下，用P1-CPP处理的细胞中检测到的P1水平明显高于在只用P1培养的细胞中检测到的P1水平，这体现在与只用P1培养的细胞相比，P1对β-肌动蛋白的密度比明显更大(P1 vs.P1-CPP***p<0.001)。因此，在20小时的时间内，CPP有效地增加了HRECs中P1的渗透性和保留性。

例8

进行第八个实验，以确定P1-CPP是否能抑制因营养因子剥夺而产生的啮齿动物青光眼模型中的RGC死亡。

首先从出生后四至六天大的幼鼠中分离出原代RGCs。然后在存在12.5μg/mL P1-CPP的情况下，分离出的RGCs的处理组被培养并被剥夺营养因子达48小时。对照组细胞(用载体处理)被另外培养并被剥夺营养因子达48小时，但不添加P1-CPP。然后通过CytoCalcein^TM Violet 450荧光监测细胞，评估两组中RGC存活率。该实验进行了四次，以获得统计学意义。

如图8A的显微镜图像所示以及在图8B的定量条块图中所证实的，在包含标准营养因子水平(脑源性神经营养因子(BDNF，50ng/mL；位于美国新泽西州罗基希尔的派普泰克公司(Peprotech))、睫状神经营养因子(CNTF，10ng/mL；派普泰克公司)和福斯可林(5ng/mL；美国密苏里州圣路易斯市的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corp.))的全培养基中，对照组RGCs和用P1-CPP处理的RGCs的存活数量相似。Pl-CPP处理将神经营养因子介导的RGC损失显著减少64％(****p<0.0001；ns＝不显著)。因此，Pl-CPP保护大鼠RGCs免受通常因营养因子剥夺而引起的死亡。

例9

进行第九个实验，以确定P1-CPP是否能抑制由内皮素-3介导的死亡导致的啮齿动物青光眼模型中的RGC损失。

从出生后4到6天大的幼鼠中分离出原代RGCs。在P1-CPP(12.5μg/mL)或载体存在的情况下，用内皮素-3(ET-3；100nM)处理原代RGCs，然后通过监测膜渗透性活细胞标记染料CytoCalcein^TM Violet 450(英杰公司(Invitrogen))来评估RGC存活率。该实验进行了两次，以获得统计学意义。

如图9A的荧光图像和图9B的相应条块图所示，内皮素-3的应用显著降低了未用P1-CPP处理的细胞中的RGC存活率(存活率为64％)(p***＜0.001)。如进一步显示的，经内皮素-3处理的RGCs在Pl-CPP情况下的存活百分比(存活率为79.5％)高于在载体对照情况下的存活百分比(**p<0.01)。事实上，相对于未使用内皮素-3或Pl-CPP的对照细胞，在经受内皮素-3的Pl-CPP处理的细胞中，RGCs的存活百分比是相似的。

因此，P1-CPP有效地保护了大鼠RGCs免受内皮素-3诱导的死亡。

例10

进行第十个实验，以确定在由眼内压升高产生的青光眼的啮齿动物模型(莫里森青光眼模型)中，玻璃体内施用P1-CPP是否能抑制RGC损失。

为了升高眼内压(IOP)，将大约50-100μL的1.8M NaCl以足以灼伤房水丛的力注射到大鼠眼睛的巩膜静脉中。这一过程会造成小梁网瘢痕，导致IOP升高和视神经受损。然后，每周对IOP升高的眼睛进行玻璃体内注射2μg(每只眼)P1-CPP或载体对照，共注射六周。未经处理的天真大鼠被用作阴性对照。六周后，解剖出眼睛，并将其用4％ PFA在4℃下固定过夜。然后将视网膜与一抗，即山羊抗Brn3a(1:200，SC-31984，圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz Biotechnology,Inc.))在4℃下培养三天。用PBS清洗三次后，将视网膜在4℃下在相应的二抗中过夜培养，二抗即结合Alexa 488的驴抗山羊抗体(1:1000稀释度，A11055，英杰公司)。清洗后，在四个象限(上象限、下象限、鼻象限和颞象限)切片，制备视网膜平片，并用Prolong Gold抗淬灭试剂(生命技术公司(Life Technologies))装片。该实验共进行三次，以获得统计学意义。在Cytation5显微镜中用放大倍数×20捕获平片的图像。图像是在两个不同的偏心点拍摄的，它们分别位于视神经头到视网膜周边之间距离的三分之一(中周)和三分之二(外周)。在四个象限(包括上象限、下象限、鼻象限和颞象限)的每一个中，在每个偏心点各采集两张图像，每个视网膜共采集16张图像。RGC计数由人工计数确定。计数由一名蒙面观察者进行，该观察者不知道动物的处理组别。

如图10A的荧光图像和图10B的相应条块图所示，相对于压力升高的注射载体的对照组细胞，在施用P1-CPP后，压力升高(“IOP”)的外周视网膜神经节细胞的存活数量更多(*p＜0.03；ns＝不显著)。结果在中周视网膜细胞中是相似的，如图10C所示(***p＜0.001)，这表明P1-CPP处理增强了眼内压升高的啮齿动物眼中的RGC存活率。图10D证实，与对侧对照组相比，在实验的六周持续时间内，每只大鼠的目标眼中的眼内压(以毫米汞柱为单位)确实显著升高。

例11

进行第十一个实验，以确定在由眼内压升高引起青光眼的啮齿动物模型(莫里森青光眼模型)中，玻璃体内施用P1-CPP是否能促进视神经轴突保护。

如例10中一样，挪威棕色大鼠的眼睛中的眼内压升高，每周向大鼠玻璃体内注射2μg(每只眼)的Pl-CPP或载体对照，共注射六周。未处理的天真大鼠被用作阴性对照。用2％多聚甲醛、2.5％戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中固定视神经。在脱水前，将视神经转移至2％四氧化锇(在PBS中)达一小时，并包埋在Epon中。使用超微切片机获取视神经横截面，并用1％PPD染色，被染色截面的图像是在蔡司LSM 510META共聚焦显微镜中使用浸油放大倍数×100拍摄的。在覆盖中心的五个点以及每个视神经截面的每个象限的外周区域拍摄图像。

图11的显微镜图像显示，在眼内压升高的视网膜神经节细胞中，相对于用Pl-CPP处理，使用载体对照处理后观察到更多数目的轴突塌陷(由箭头表示)。因此，在通过升高眼内压产生的大鼠青光眼模型中，Pl-CPP促进了视神经轴突保护。

图12

进行第十二个实验，以确定在通过眼内压升高产生青光眼的啮齿动物模型(莫里森大鼠青光眼模型)中，玻璃体内施用Pl-CPP是否能够缓解RGC功能下降。

与例10和例11中一样，挪威棕色大鼠的眼睛中的眼内压升高，每周向大鼠的玻璃体内注射2μg(每只眼)的P1-CPP或载体对照，总共六周。使用未经处理的天真大鼠作为阴性对照，通过在IOP升高手术后第六周测量的图形视网膜电图(PERG)振幅来评估RGC功能。简言之，通过腹腔注射(100μL/100g体重)氯胺酮(密苏里州圣约瑟夫的VEDCO公司)/甲苯噻嗪(密苏里州圣约瑟夫的VEDCO公司)混合物(最终浓度分别为55.6mg/mL，5.6mg/mL)来麻醉大鼠。按照制造商的说明，使用仪器(佛罗里达州迈阿密的智听公司(Intelligenthearing systems))迈阿密PERG系统(佛罗里达州迈阿密，/>)进行PERG测量。参考电极和接地电极分别皮下放置在头皮中和尾部区域，角膜电极定位在下眼窝中并与眼球接触。为防止角膜干燥，向双眼施加少量几滴GelTear眼药水。附接到系统上的两个单独的LED监视器被用于以0.095周/度的空间频率和500cd/m2的亮度显示反差水平条。显示监视器与眼睛之间的距离保持在10厘米。以大约60度的角度放置LED监视器，以便更好地投射光信号。每一运行产生的PERG波形由来自双眼的372次扫描(开-关)组成，通过PERG软件分别针对每只眼睛进行PERG波形的处理和平均。应用PERG软件对PERG总平均波形进行分析，以识别主要的正波(P1)和负波(N2)，从而计算振幅和潜伏期。PERG振幅读数(以μV为单位)如图12A所示。与天真大鼠(7.65μV)相比，IOP升高造成PERG振幅(4.55μV)下降63％，这通过P1-CPP处理而维持(7.55μV)(**p<0.001；*p<0.03；ns＝不显著)。在图12B中显示了相应的PERG迹线。因此，P1-CPP处理改善了通过升高眼内压产生的大鼠青光眼模型中RGCs的视觉功能。

例7-12表明，与单用P1相比，P1-CPP不仅可以改善P1的视网膜细胞穿透，还可以保护原代大鼠RGCs免受神经营养因子剥夺和内皮素-3诱导的细胞死亡。P1-CPP的玻璃体内给药还能保护RGC轴突在为期六周的眼内压升高期间不发生塌陷，并且能够为在相同条件下的RGCs提供功能性保护。这些结果共同表明：Pl-CPP可以被研发为治疗人类青光眼的神经保护剂。

例13

进行第十三个实验，以便确定P1-CPP是否能够抑制通过神经营养因子剥夺而产生的RGC死亡的人类视网膜外植体模型中的RGC损失。

在死后12小时内获得离体人类视网膜外植体(n＝3个供体)，进行神经营养因子剥夺，并用12.5μg/mL P1-CPP或载体对照培养七天(7dev)。未遭受神经营养因子剥夺的视网膜外植体被用作对照组(0dev)。然后用RBPMS(一种RGC标记物)对外植体进行染色，并使用ImageJ对存活的RGCs进行计数。如图13A的条块图所表示并且在图13B的共聚焦显微镜图像中可看见的更多数量的RBPMS⁺细胞所示，相对于载体对照组细胞，对受到神经营养因子剥夺的RGCs进行为期七天的P1-CPP处理，显著(p＜0.005)减少了外植体中的RGC损失。这些结果显示，P1-CPP处理降低了人类视网膜外植体中神经营养因子剥夺介导的RGC损失。

例14

在由升高的眼内压导致青光眼的啮齿动物模型(莫里森大鼠青光眼模型)中，进行第十四个实验，以确定受P1-CPP处理影响的分子通路。

升高挪威棕色大鼠的眼睛中的眼内压，然后向大鼠的玻璃体内注射2μg(每只眼)的P1-CPP或载体对照，每周一次，共注射2周。未经处理的天真大鼠被用作阴性对照。对大鼠实施安乐死，并通过改进的免疫抗体包被筛选法(immunopanning)分离出原代成年RGCs。使用Trizol/柱法分离总RNA，并使用Illumina平台进行RNA测序。得到的FASTQ文件被上传到Galaxy，以用FASTQC、RNASTAR、特征计数和DESeq2进行分析。然后使用凯杰(Qiagen)的生物通路分析软件(Ingenuity Pathway Analysis)(IPA)对DESeq2的结果进行评估，以确定显著上调和下调的通路。

对IOP升高2周后分离的大鼠RGCs进行的RNA测序分析表明，与载体处理组相比，用Pl-CPP处理的RGCs具有数种差异表达通路，包括6,343个显著上调的基因和5,960个显著下调的基因。Pl-CPP处理后显著上调的通路和分子过程包括：吞噬体形成、神经元中CREB信号、催产素信号、长期突触抑制、运动性、磷脂酶、TREM1信号、p38 MAPK信号、GPCR传感和类二十烷信号(图14A)。值得注意的是，与天真组相比，IOP处理组RGCs和载体处理组RGCs显示出CREB信号通路的多种成分(包括Creb-1,c-RAF,MEK1/2,ERK1/2和p90RSK)的表达减少。正如图14B所示的CREB通路中前12个差异表达基因的热图所示，Pl-CPP处理阻止了这种减少。定量PCR进一步证实了通过RNA测序获得的结果，显示出与载体处理组的Creb-1表达相比，Pl-CPP处理组大鼠中Creb-1的表达增加(图14C)。

鉴于这些数据，P1-CPP在啮齿动物模型中治疗青光眼的潜在作用机制包括促存活CREB信号通路的激活、吞噬体形成和长期突触抑制以防止细胞死亡和视力下降。

尽管上文对各种代表性实施例和实施方式进行了一定程度的特定性描述，但本领域技术人员可以对所公开的实施例进行多种修改，而不会偏离说明书和权利要求书中所阐述的本发明主题的精神或范围。在一些例子中，在本文直接或间接阐述的方法中，以一种可能的操作顺序描述了各个步骤和操作，但是本领域技术人员会认识到，可以重新安排、替换或取消这些步骤和操作，而不必然脱离本公开的精神和范围。上面描述中所包含的全部内容或者附图中所显示的全部内容，应当被解释为仅仅是说明性的，而非限制性的。可以进行细节或结构上的改变，而不会脱离由附属权利要求书所限定的本公开的精神。

Claims

1.一种对受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状进行治疗、降低其风险、预防或减轻的方法，所述方法包括：

向受试者的眼睛玻璃体内施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括源自生物活性热休克蛋白的至少一种多肽，

其中，所述热休克蛋白包括Hsp20，并且

其中，所述至少一种多肽与细胞穿透肽缀合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞穿透肽具有与VPTLK至少80％相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种多肽具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种多肽具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³至少90％相同的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在眼科手术过程期间或手术后施用所述组合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况是青光眼。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况包括：黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱落或视网膜色素变性。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况是由以下引起的：兴奋性毒性损伤、物理损伤、化学损伤、神经营养因子剥夺、氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、轴突运输失败或其组合。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况包括：人类视网膜神经节细胞损失、高眼压、视神经变性、病理性细胞凋亡或蛋白质聚集。

10.一种用于对受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状进行治疗、降低其风险、预防或减轻的系统，所述系统包括：

治疗有效量的组合物，所述组合物包括源自生物活性热休克蛋白的至少一种多肽，

其中，所述热休克蛋白包括Hsp20，

其中，所述至少一种多肽与细胞穿透肽缀合；以及

构造成将所述组合物施用于受试者的玻璃体内注射装置。

11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述细胞穿透肽具有与VPTLK至少80％相同的氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的系统，其中，所述至少一种多肽具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹至少90％相同的氨基酸序列。

13.根据权利要求10或11所述的系统，其中，所述至少一种多肽具有与⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³至少90％相同的氨基酸序列。

14.权利要求10至13中任一项所述的系统，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况为青光眼。

15.根据权利要求10至13中任一项所述的系统，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况包括：黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜脱落或视网膜色素变性。

16.权利要求10至15中任一项所述的系统，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况包括：视网膜神经节细胞损失、视网膜内皮细胞损失、视网膜毛细血管细胞损失、高眼压、视神经变性、病理性细胞凋亡和蛋白质聚集。

17.一种药物组合物，包括：

源自Hsp20的至少一种多肽，其中，所述至少一种多肽与细胞穿透肽缀合；以及

药学上可接受的载体，

其中，所述药物组合物被配制成用于对受试者的视网膜疾病、损伤或状况的至少一种症状进行治疗、降低其风险、预防或减轻，并且

其中，所述药物组合物被配制成用于玻璃体内给药。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述细胞穿透肽具有与VPTLK至少80％相同的氨基酸序列。

19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其中，所述至少一种多肽具有与G⁷³HFSVLLDVK(乙酰基)HFSPEEIAVK⁹¹或⁷³DRFSVNLDVKHFSPEELKVKV⁹³至少90％相同的氨基酸序列。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的药物组合物，其中，所述视网膜疾病、损伤或状况为青光眼。