CN117062620A - 用于消化道健康的组合物 - Google Patents

Abstract

本文尤其提供了组合物以及经由使用外源性施用的酸性磷酸酶或GDA1_CD39超家族的酶(如三磷酸腺苷双磷酸酶)来治疗和/或预防与由生态失调引起的消化道炎症相关的病症的方法。

Description

用于消化道健康的组合物

相关申请的交叉引用

本申请是2022年2月18日提交的国际申请号PCT/US2022/016924的371并且要求于2021年2月19日提交的美国临时专利申请号63/151，190和2021年12月14日提交的美国临时专利申请号63/289,439的优先权，将每篇文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。

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技术领域

本文尤其提供了组合物以及经由使用外源性施用的酸性磷酸酶或GDA1_CD39超家族的酶(如三磷酸腺苷双磷酸酶)来治疗和/或预防与由生态失调引起的消化道炎症相关的病症的方法。

背景技术

经过数百万年的进化，后生动物已经形成了与共生微生物群保持互利共生关系的机制。肠道微生物在维持人类健康和福祉方面起到关键作用(Marchesihe和Shanahan，CurrOpin Infect Dis[当代传染病观点]，20：508，2007；Blaut和Clavel，J.Nutr[营养学杂志]，137：751S，2007；Turnbaugh等人，Nature[自然]，444：1027，2006；Dethlefsen等人，TrendsEcol Evol[生态学与进化趋势]，21：517，2006；Lupp和Finlay，Curr Biol[当代生物学]，15：R235，2005；Backhed等人，Science[科学]，307：1915，2005；Mai和Morris，Jr.，J.Nutr[营养学杂志]，134：459，2004；Falk等人，Microbiol Mol Biol Rev[微生物学与分子生物学评论]，62：1157，1998)。黏膜相关细菌与黏液层和上皮细胞一起在肠腔与全身部位之间提供直接的选择性屏障，其允许吸收营养物质、水和电解质，同时抑制病原微生物或毒素的移位。微生物群合成维生素，解毒，还通过发酵以其他方式不可消化的食物组分(如纤维和淀粉)为上皮细胞提供额外的能量。共生生物还参与胃肠道免疫系统的成熟和维持，使肠上皮保持在“生理炎症”状态，该状态似乎对于快速应对潜在有害细菌至关重要。

然而，细菌产物如脂多糖(LPS；也称为内毒素)、细胞外ATP(exATP)、CpG DNA和鞭毛蛋白是在介导细菌诱导的炎症中发挥重要作用的关键组分。生态失调被定义为肠道微生物群正常稳态的失调，与多种炎性疾病病症的发病机理有关，这些炎性疾病病症包括但不限于抗生素相关性腹泻(AAD)、艰难梭菌(Clostridium diffficile)相关疾病(CDAD)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、甲状腺功能减退症、食物中毒、肥胖、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)和结直肠癌(Dethlefsen等人，Trends Ecol Evol[生态学与进化趋势]，21：517，2006；Schroeder，Am Fam Physician[美国家庭医生]，71：921，2005；Hurley和Nguyen，ArchIntern Med[内科医学档案]，162：2177，2002；Bartlett，NEngl J.Med[新英格兰医学杂志]，346：334，2002；McFarland，Dig Dis[消化疾病]，16：292，1998；Wistrom等人，J.Antimicrob Chemother[抗菌化学疗法杂志]，47：43，2001；Marteau等人，AlimentPharmacol Ther[消化药理学与治疗学杂志]，20，增刊4：18，2004；Seksik等人，Gut[消化道]，52：237，2003；Kleessen，Scand Gastroenterol[斯堪的纳维亚胃肠病学杂志]，37：1034，2002；Brenchley等人，Nat Med[自然-医学]，12：1365，2006；Mai和Morris，J.Nutr[营养学杂志]，134：459，2004；Seksik等人，Gut[消化道]，52：237，2003；Marteau等人，AlimentPharmacol Ther[消化药理学与治疗学杂志]，20，增刊4：18，2004；Kleessen等人，Scand JGastroenterol[斯堪的纳维亚胃肠病学杂志]，37：1034，2002；Pool-Zobel等人，Br J Nutr[英国营养学杂志]，87，增刊2：S273，2002)。

遗憾的是，人们对控制肠道微生物群正常稳态数量和组成的基本机制以及这些生物体对生态失调期间消化道炎症的介导的相应影响仍知之甚少。因此，需要可用于减少由生态失调和引起炎症的细菌产物(如LPS、exATP、CpG DNA和鞭毛蛋白)所导致的消化道炎症的方法以及组合物。

本文公开的主题解决了这些需求，并且还提供了另外的益处。

发明内容

本文尤其提供了组合物以及经由使用外源性施用的酸性磷酸酶或GDA1_CD39超家族的酶(如三磷酸腺苷双磷酸酶)来治疗和/或预防与由生态失调引起的消化道炎症相关的病症的方法。

因此，在一些方面，本文提供了组合物，这些组合物包含a)水解核苷酸三磷酸的酶，其中所述酶至少在约pH3.5至pH7有活性：以及b)肠溶包衣。在一些实施例中，该酶1)是GDA1_CD39超家族的成员：并且2)a)不是马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶；和/或b)不是哺乳动物核苷三磷酸二磷酸水解酶(NTPD酶)。在一些实施例中，该酶包含与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％或至少约60％同一的(如至少约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的)多肽。在一些实施例中，该多肽在对应于SEQ ID NO：9的编号的位置处包含氨基酸残基S204、F205、L206、G207、L208和G209。在一些实施例中，该酶是1)酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)并且；2)不是衍生自志贺氏菌属(Shigella)。在一些实施例中，该酶包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％或至少约66％同一的(如至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的)多肽。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该核苷酸三磷酸包含ATP。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，核苷酸二磷酸包含ADP。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该酶至少在约pH 4至约pH 5对ATP具有峰值比活性。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该酶在约pH 3.5至约pH 7以至少约500μmol/mg/min至约2700μmol/mg/min的比活性水解ATP。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该肠溶包衣用于1)口服施用；2)递送至肠黏膜；以及3)保护该酶在小于约2.5的pH下免于降解。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该肠溶包衣经配制用于直肠、口服或肠胃外施用。

在另外的方面，本文提供了一种编码本文公开的水解核苷酸三磷酸的任何酶的核酸，该核酸包括与编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6-24中的任一者的核酸至少约40％或至少约50％(如至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包括这些百分比之间的所有值))同一的核酸。

在另一方面，本文提供了一种包含本文公开的任一核酸的载体。在一些实施例中，该载体包含与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中的任一者至少约40％(如至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包括这些百分比之间的所有值))同一的多核苷酸(如合成多核苷酸)。

在又另外的方面，本文提供了一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含：本文公开的水解核苷酸三磷酸的任一酶(包括包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％或至少约60％同一的(如至少约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的)，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％或至少约66％同一的(如至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的)多肽的酶)；本文公开的任一核酸(如SEQ ID NO：25-43中的任一者或与SEQID NO：25-43中的任一者至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一的核酸)；和/或本文公开的任一载体。在一些实施例中，该多肽在对应于SEQID NO：9的编号的位置处包含氨基酸残基S204、F205、L206、G207、L208和G209。在一些实施例中，细胞是植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞、大肠杆菌(E.coli)细胞、耶氏酵母属(Yarrowia)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞或里氏木霉(Trichodermαreesei)细胞。

在其他方面，本文提供了一种用于减少或预防有需要的受试者的以消化道炎症为特征的障碍的方法，该方法包括向所述受试者施用本文公开的任一组合物(包括包含与SEQID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约66％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的多肽的组合物)。在一些实施例中，该多肽在对应于SEQ ID NO：9的编号的位置处包含氨基酸残基S204、F205、L206、G207、L208和G209。在一些实施例中，该障碍是选自由以下组成的组的胃肠(GI)道炎性疾病：炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎和坏死性小肠结肠炎。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，消化道由大肠组成。

在又其他方面，本文提供了一种用于促进一种或多种共生细菌向受试者的消化道中的植入的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本文公开的水解核苷酸三磷酸的酶(如与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约66％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的酶)的任一组合物以及一种或多种共生细菌的菌源。在一些实施例中，所述施用为口服施用。在一些实施例中，酶的所述施用为口服施用，并且该一种或多种共生细菌的菌源的施用为直肠施用。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述受试者已被诊断患有以消化道炎症为特征的障碍。在一些实施例中，该障碍是选自由以下组成的组的胃肠(GI)道炎性疾病：炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎和坏死性小肠结肠炎。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，消化道由大肠组成。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源包含益生菌。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源包含粪便微生物群移植物(FMT)。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该一种或多种共生细菌选自由以下组成的组：瘤胃联合乳杆菌(Ligilactobacillus ruminis)、人体普氏菌(Prevotella copri)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。

本文所述的方面和实施例中的每个能够一起使用，除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除。

在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。出于所有目的，本文所引用的所有专利、专利申请和其他出版物的公开内容通过引用以其全文特此并入。

附图说明

图1为描绘候选酶在一定pH范围内对ATP的比活性(以μmol/mg/min为单位)的折线图。

图2为描绘候选酶在一定pH范围内对ADP的比活性(以μmol/mg/min为单位)的折线图。

图3为描绘候选酶对不同核苷酸底物相对于ATP的相对活性的柱状图。

图4为描绘在pH 2孵育15min或60min后候选酶的残余活性的柱状图。

图5A和图5B描绘了未插管小鼠中的DAI得分——每天通过测量体重、评估粪便稠度和检测血便来评估结肠炎的疾病症状。使用临床疾病活动指数(DAI)对疾病严重程度进行评分，该指数按照先前所述使用以下参数进行计算：粪便稠度、便血的存在或不存在以及体重减轻。

图6A和图6B描绘了已插管小鼠中的DAI得分-每天通过测量体重、评估粪便稠度和检测血便来评估结肠炎的疾病症状。使用临床疾病活动指数(DAI)对疾病严重程度进行评分，该指数按照先前所述使用以下参数进行计算：粪便稠度、便血的存在或不存在以及体重减轻。

图7描绘了示出实例3中所讨论的治疗的实验设计的示意图。

图8描绘了示出使用以下参数的治疗组中的疾病活动指数(DAI)的柱状图：粪便稠度、便血的存在或不存在以及体重减轻。

图9描绘了示出治疗组中的结肠长度测量值的柱状图。

图10描绘了示出使用组织病理学分析所评定的治疗组中结肠中的局灶性增生的柱状图。

图11描绘了一系列柱状图，其示出用酸性磷酸酶结合人类微生物移植物(HMT)治疗的小鼠肠道中共生细菌的植入。

图12描绘了CRC22110三磷酸腺苷双磷酸酶和同源物的多蛋白质序列比对。

图13描绘了CRC22110和4BRA的成对蛋白质序列比对。

图14描绘了对嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)三磷酸腺苷双磷酸酶中的ATP水解活性至关重要的序列基序，该序列基序邻近PDB ID：4BRA结构中ANP分子(黑棒)所占据的活性位点。

图15描绘了使用Clustal W进行的多蛋白质序列比对，包括本研究中评估的细菌酸性磷酸酶、以及其他酸性磷酸酶：1D2T、KEY80034.1、AAK09393.1和AAF66599.1。

图16描绘了使用邻接方法MEGA X针对一组酸性磷酸酶序列所构建的序列的系统发生树，用以突出显示细菌酸性磷酸酶组。

图17描绘了酸性磷酸酶A类酶中与来自1D2T晶体结构的活性位点(由磷酸盐分子指示)相邻的、对于ATP降解活性至关重要的区域。

具体实施方式

ATP信号传导在诱导炎症中起关键作用。从微环境中酶促去除细胞外ATP可以提供一种治疗和/或预防炎症的解决方案。然而，该方法可能需要一种能够在低pH下发挥作用的酶，因为据报道，在发炎的胃肠道条件下会发生肠道pH降低。本文公开的发明提供了该问题的解决方案，该解决方案在过去报道的用于克服胃肠道中的炎症的方法中是不存在的。

因此，本发明至少部分地基于以下发现：以治疗有效量向受试者施用(例如，口服)酸性磷酸酶和/或GDA1_CD39超家族的酶(例如，三磷酸腺苷双磷酸酶)，能够治疗或预防与消化道生态失调或病原体感染相关联的炎症(例如，结肠炎或肠易激病(IBD))，能够促进有益共生细菌在消化道中的植入，并且从而能够安全、轻松地减轻消化道组织炎症的一种或多种症状，而副作用很小或没有副作用。

I.定义

术语“酸性磷酸酶"(EC 3.1.3.2)(也称为酸性磷酸单酯酶、磷酸单酯酶、甘油磷酸酶、酸性单磷酸酶、酸性磷酸水解酶、酸性磷酸单酯水解酶、子宫运铁蛋白、酸性核苷二磷酸磷酸酶、酸性磷酸酶(A类)或正磷酸单酯磷酸水解酶(酸性最佳))用于意指在小于约pH6.5、如小于约pH 4.0的pH时具有介导底物中磷酸酯键水解的pH最佳值的酶。酸性磷酸酶在消化期间从其他分子中释放附着的磷酰基。它可以进一步被归类为磷酸单酯酶。酸性磷酸酶储存在溶酶体中，并且当溶酶体与核内体融合时发挥作用，核内体在发挥作用时被酸化；因此，酸性磷酸酶具有酸性pH最佳值。该酶存在于许多动物和植物物种中。在一些实施例中，本文公开的组合物和方法中使用的酸性磷酸酶不是衍生自志贺氏菌属。在一些实施例中，本文公开的组合物和方法中使用的酸性磷酸酶不是衍生自哺乳动物。

如本文所用，“GDA1_CD39超家族”是指由在其蛋白质序列中具有共同基序的核苷三磷酸二磷酸水解酶(NTPD酶)构成的酶。该家族以两种蛋白质命名：酵母GDP酶(GDA1)和淋巴细胞活化抗原CD39。在一些实施例中，这些蛋白质是水解一系列NTP(包括细胞外ATP)的细胞表面酶。非限制性实例包括胞外ATP酶(ecto-ATPase)、三磷酸腺苷双磷酸酶、CD39和胞外ATP二磷酸水解酶(ecto-ATP/Dase)(Knowles，2011，Purinergic Signalling[嘌呤能信号传导]第7卷，第21-45页，其通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“三磷酸腺苷双磷酸酶”是指钙活化酶中的一种或多种(即属于EC.3.6.1.5类的蛋白质)，其具有ATP-二磷酸水解酶活性并且催化来自ATP的γ磷酸酯水解并且催化来自ADP的β磷酸酯水解。在所有真核生物和一些原核生物体中发现了三磷酸腺苷双磷酸酶，表明这些酶在不同物种中保留其作用。它们拥有独特的磷酸水解酶活性、核苷酸底物特异性、二价阳离子要求以及对抑制剂的敏感性。(参见，Plesner，Int.Rev.Cytol.[细胞学国际评论]，158：141(1995)；以及Handa和Guidotti，Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]，218(3)：916(1996))。在哺乳动物中，三磷酸腺苷双磷酸酶被认为主要作为对ATP和ADP具有特异性的细胞外水解酶发挥作用，该功能对于神经刺激后突触ATP分子的失活非常重要。(参见，Todorov等人，Nature[自然]，387(6628)：76(1997))。哺乳动物中的三磷酸腺苷双磷酸酶也被认为对于抑制ADP诱导的血小板聚集很重要。(参见，Marcus等人，J.Clin.Invest.[临床研究杂志]，99(6)：1351(1997))。重组三磷酸腺苷双磷酸酶可从New新英格兰生物实验室(England Biolabs)商购获得。在一些实施例中，本文公开的组合物和方法中使用的三磷酸腺苷双磷酸酶不是衍生自马铃薯。在其他实施例中，本文公开的组合物和方法中使用的三磷酸腺苷双磷酸酶不是衍生自哺乳动物。

“黏膜”是一种黏液分泌膜，其覆盖在与外界连通的所有体腔或通道表面。黏膜是一种潮湿的组织，其覆盖在许多器官(如肠道)和体腔(如鼻、口腔、肺、阴道、胆管、食道)表面并且分泌黏液(一种粘稠的液体)。黏膜或粘膜是保护体腔免受环境条件、病原体和有毒物质侵害的一种组织，并且通常是被分泌物(如肠、肺、鼻、口腔和阴道中的分泌物)浸透的潮湿组织。

如本文所用，“微生物(microorganism或microbe)”是指细菌、真菌、病毒、原生动物、和其他微生物或微观生物体。

如本文所用，术语“序列同一性”或“序列相似性”意指两个多核苷酸序列(候选序列和参考序列)在候选序列的长度上是相同的(即100％序列同一性)或相似的(即在逐个核苷酸的基础上)。在将候选序列与参考序列进行比较时，如与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，候选序列可包含添加或缺失(即，空位)。用于确定序列同一性的最佳序列比对可以使用本领域已知的任何数量的公开可获得的局部比对算法(如ALIGN或Megalign(DNASTAR公司))、或通过检查来进行。

如本文所用，关于参考序列的术语“百分比(％)序列同一性”或“百分比(％)序列相似性”定义为在对序列进行最佳比对并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多核苷酸序列中的残基相同的核苷酸残基的百分比。

如本文所用，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或correspondsto或correspond to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或者与蛋白质或肽中所列举的残基类似、同源或等同的氨基酸残基。

如本文所用，“预防(prevent、preventing、prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或排除障碍或病症和/或其伴随症状中的一种或多种的发生或复发、或阻止受试者获得或重新获得障碍或病症、或降低受试者获得或重新获得障碍或病症或其伴随症状中的一种或多种的风险的方法。

如本文所用，关于特定性状特点、特征、生物过程、或现象的术语“降低”或“减少”是指特定性状、特点、特征、生物过程、或现象的减少。性状、特点、特征、生物过程或现象可以降低5％、10％、1 5％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于100％。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”意指哺乳动物(例如，人)。在一些实施例中，受试者患有相关疾病、障碍或病症，包括但不限于抗生素相关性腹泻(AAD)、艰难梭菌相关性疾病(CDAD)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、甲状腺功能减退症、食物中毒、肥胖、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)。在一些实施例中，受试者易患疾病、障碍或病症。在一些实施例中，受试者显示出疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特点。在一些实施例中，受试者不显示疾病、障碍或病症的任何症状或特点。在一些实施例中，受试者是具有如下一种或多种特征的人，该一种或多种特征的特点是易感疾病、障碍或病症或有该疾病、障碍或病症风险。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是接受和/或已经接受诊断和/或疗法施用的个体。

如本文所用，“施用(administer或administering)”意指如通过饲喂或通过灌胃将一种或多种微生物菌株、外源性饲料酶和/或菌株以及外源性饲料酶引入受试者的行为。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”意指改善受试者的一项或多项指标的外源性酶的量。对受试者的一项或多项指标(如但不限于增加的体重增重、肠健康状态、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、或减少的病原体感染中的任何一项)的改善可如本文所述或通过本领域已知的其他方法进行测量。外源性酶也能够以一剂或多剂施用。

术语“肠健康状态”是指可能会受到例如传染原或非传染性原因(如次优饮食)的影响的消化道壁结构和形态的状态。“消化道壁结构和形态”或“消化道屏障完整性”可以指但不限于其特征为绒毛缩短、隐窝延长和炎性细胞(如但不限于CD3+细胞)的浸润的上皮损伤和上皮通透性。当使用评分系统(如由Teirlynck等人所述的评分系统(2011))评估时，与“正常”外观相比，后一损伤和炎症标志物也可以与消化道的“严重"肉眼可见的外观相关。

术语“共生细菌”是指由存在于被上皮细胞覆盖的体表上并且暴露于外部环境(胃肠道和呼吸道、阴道、皮肤等)的那些微生物体组成的微生物区系(正常微生物区系、土著微生物群)。这些细菌已被证明会影响免疫生理功能的调节，包括但不限于代谢、个体发生和病原体防御。共生细菌也被证明会促进对消化道病原体的抗性，这对于宿主和共生微生物群是互利的(Kahn等人，2019，Frontiers in Immunology[免疫学前沿]，10：1203；Hogenova等人，2004，Immune.Let.[免疫学快报]，93(2-3)：97-108，其通过引用并入本文以用于讨论共生细菌物种)。

术语“益生菌”是指活的或有活力的微生物，当其以有效量向受试者施用时，赋予受试者健康益处。例如，适合于向受试者口服或直肠施用的本文所述益生菌配制品中包含的益生菌可以改善受试者的胃肠道或消化道健康。如本文所用，术语“益生菌”涵盖活的微生物以及处于休眠状态的有活力的微生物，包括冷冻微生物、脱水或干燥的微生物、孢子、胞囊或处于代谢活性降低的各种状态的微生物，其可在暴露于合适的条件后重构。在一些实施例中，益生菌的微生物包含一种或多种共生细菌或由其组成。在其他实施例中，益生菌微生物衍生自粪便微生物来源(如从其他健康受试者的粪便获得微生物来源)。益生菌区别于已例如通过巴氏灭菌或热处理杀死的细菌组合物。在本文公开的方法的某些实施例中，还考虑到施用无活力的细菌组合物。

如本文所用，术语“植入”是指一种或多种细菌物种(如作为例如益生菌提供的共生细菌物种)在消化道内的定植或指一种或多种细菌物种(如作为例如益生菌或作为粪便移植物提供的共生细菌物种)的附着到受试者的肠上皮细胞的黏膜表面上。

某些范围在本文中以数值前加术语“约”呈现。术语“约”在本文用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有特别定义。

除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，单数术语“一个/一种(a/an)"和“该/所述(the)”包括复数指示物。

应进一步注意，可以撰写权利要求书以排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

仍需注意的是，如本文所用，术语“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”是指组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总组合物的小于30％重量的总量，并且不会影响或干扰一种或多种组分的作用或活性。

进一步注意到，如本文所用，术语“包含(comprising)”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，但是包含该一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或任选的一种或多种组分。

还要注意的是，如本文所用，术语“由......组成(consisting of)”意指包括且限于术语“由......组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由......组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。

在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同这样的较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同这样的较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

除非本文另外定义，否则本文所使用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语的其他定义可以在本说明书通篇出现。

II.组合物

A.酶

本文提供了具有磷酸酶活性的分离蛋白质。磷酸酶是一种使其底物去磷酸化的酶；即，它将磷酸单酯水解成磷酸根离子和具有游离羟基的分子。磷酸酶包括三磷酸腺苷双磷酸酶。该作用与磷酸化酶和激酶的作用正相反，磷酸化酶和激酶通过使用高能分子(比如ATP)将磷酸基团附着到其底物上。

术语“蛋白质”和“多肽”是指包含经由肽键连接的氨基酸的化合物并且可以互换使用。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生化命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature)(JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十种氨基酸中的任一种。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。给定多肽序列中的氨基酸位置可通过氨基酸的单字母代码后跟位置编号来命名。例如，将位置87处的甘氨酸(G)表示为“G087”或“G87”。

如本文所用，当叙述“氨基酸序列”时，它是指蛋白质或肽分子的氨基酸序列。“氨基酸序列”可以从编码蛋白质的核酸序列推导出。然而，术语如“多肽”或“蛋白质”并非意在将氨基酸序列限制为所推导的氨基酸序列，而是可包括所推导的氨基酸序列的翻译后修饰，如氨基酸缺失、添加和修饰(如糖基化和添加脂质部分)。另外，除非另有说明，否则使用非天然氨基酸如D-氨基酸来改善稳定性或药代动力学行为落入术语“氨基酸序列”的范围内。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白质序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。

关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的"是指在自然界中发现的任何物质(例如，蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组/工程化的核酸和蛋白序列、或野生型序列的修饰)。

在本文公开的组合物和方法中使用的磷酸酶至少在约pH3至pH7(如约pH3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7中的任一者)或pH 3.5至5.5、或pH 3.5至7、或pH 5至7具有活性。酶可为GDA1_CD39超家族的成员(不包括衍生自马铃薯的三磷酸腺苷双磷酸酶)或酸性磷酸酶。在一些实施例中，酶包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9(CRC22110)的全长氨基酸序列具有至少40％或至少60％序列同一性(如约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者)的氨基酸序列。在其他实施例中，酶包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：18(CRC21323)的全长氨基酸序列具有至少50％或至少66％序列同一性(如约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者)的氨基酸序列。

在本文公开的组合物和方法中使用的其他磷酸酶至少在约pH 3至pH 7(如约pH3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7中的任一者)或pH 3.5至5.5、或pH 3.5至7、或pH 5至7具有活性，并且是GDA1_CD39超家族的成员(不包括衍生自马铃薯的三磷酸腺苷双磷酸酶)。在一些实施例中，酶包含与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：1 2、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的一者或多者的全长氨基酸序列具有至少40％或至少60％序列同一性(如约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者)的氨基酸序列。

在另外的实施例中，在本文公开的组合物和方法中使用的磷酸酶1)至少在约pH 3至pH 7(如约pH 3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7中的任一者)或pH3.5至5.5、或pH 3.5至7、或pH 5至7具有活性；2)包含与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的一者或多者的全长氨基酸序列具有至少40％或至少60％序列同一性(如约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者)的氨基酸序列；并且3)在对应于SEQ ID NO：9的编号的位置处具有氨基酸残基S204、F205、L206、G207、L208和G209。

在本文公开的组合物和方法中使用的又一些另外的磷酸酶至少在约pH 3至pH 7(如约pH 3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7中的任一者)或pH 3.5至5.5、或pH 3.5至7、或pH 5至7具有活性，并且是酸性磷酸酶(A类)家族的成员。在其他实施例中，酶包含与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的全长氨基酸序列具有至少50％或至少66％序列同一性(如约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者)的氨基酸序列。

B.载体

术语“核酸”、“多核苷酸”和“核酸片段”在本文中可互换使用并且是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

包含编码本文公开的酸性磷酸酶多肽的核酸(如包含SEQ ID NO：25-43中的任一者的核酸)的DNA构建体可构建成使得其适合在宿主细胞中表达。由于遗传密码中已知的简并性，编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用常规技术进行设计和制备。也已知的是，取决于期望的宿主细胞，在尝试表达之前可能需要密码子优化。

可以将编码本公开的酸性磷酸酶多肽的多核苷酸结合到载体中。可以使用已知的转化技术(例如以下公开的那些)将载体转移至宿主细胞中。

合适的载体可以是可转化至宿主细胞中和/或在宿主细胞内复制的载体。例如，包含编码本文公开的酸性磷酸酶多肽的核酸的载体可以在细菌宿主、真菌或哺乳动物细胞中转化和/或复制，作为使载体繁殖和扩增的手段。也可以将载体适当地转化至表达宿主中，使得编码多核苷酸表达为功能性酸性磷酸酶。

有用的非限制性代表性载体是pTrex3gM(参见，公开的美国专利申请20130323798)、pTTT(参见，公开的美国专利申请20110020899)和p2JM103BBI(参见，Vogtentanz，Protein Expr Purif[蛋白质表达与纯化]，55：40-52，2007)，这些载体可以插入宿主的基因组中。可以用常规技术修饰载体pTrex3gM、pTTT和p2JM103BBI，使得它们包含并表达编码本发明的酸性磷酸酶多肽的多核苷酸。

表达载体通常包含控制核苷酸序列，如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因或一个或多个激活子基因。另外，表达载体可包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列能够将酸性磷酸酶多肽靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向特定宿主细胞区室。对于在控制序列的指导下进行表达，将酸性磷酸酶多肽的核酸序列以关于表达的适当方式可操作地连接到控制序列。

可以将编码本文公开的酸性磷酸酶多肽的多核苷酸可操作地连接到允许在宿主细胞中转录的启动子。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可衍生自编码与该宿主细胞同源的或异源的蛋白质的基因。用于定向编码酸性磷酸酶的DNA序列的转录(例如在细菌、真菌或哺乳动物宿主中)的启动子的实例包括aprE启动子(SEQ ID NO.3)、大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)淀粉酶基因(amyL)启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。

对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例包括衍生自编码以下的基因的那些：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶等。当编码酸性磷酸酶多肽的基因在细菌物种(如大肠杆菌)中表达时，可以从，例如，包括T7启动子和噬菌体λ启动子的细菌噬菌体启动子中选择合适的启动子。沿着这些思路，用于在酵母物种中表达的合适启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AOX1或AOX2启动子。在丝状真菌宿主细胞中的表达通常涉及cbh1，其是来自里氏木霉(T.reesei)的内源诱导型启动子。参见Liu等人(2008)Acta Biochim.Biophys.Sin(Shanghai)[生物化学与生物物理学报(上海)]40(2)：158-65。

编码序列可以与信号序列可操作地连接。编码信号序列的DNA可以是与待表达的目的酸性磷酸酶多肽基因天然相关联的DNA序列，或者可以来自与酸性磷酸酶的一部分衍生自的属或物种不同的属或物种。可以将包含DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列引入真菌宿主细胞，并且它们可以衍生自相同的来源。例如，信号序列可以是可操作地连接到cbh1启动子的里氏木霉cbh1信号序列。

表达载体还可以包含适合的转录终止子，并且在真核生物中，聚腺苷酸化序列可操作地连接到编码酸性磷酸酶的DNA序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地衍生自与启动子相同的来源。

载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的dal基因，或者赋予抗生素抗性(如例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可以包含曲霉属(Aspergillus)选择标记，如amdS、argB、niaD和xxsC，引起潮霉素抗性的标记，或者选择可以通过共转化(如本领域已知的)实现。参见，例如，公开的国际PCT申请WO91/17243。

编码对应于SEQ ID NO.1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24的蛋白质序列的合成基因可使用本领域已知的分子生物学方法生成。这些基因可被进一步克隆到合适的表达载体中，得到含有以下中的一者或多者的表达质粒：启动子(例如，aprE启动子(SEQ ID NO.3))；信号序列(例如，aprE信号序列(SEQ ID NO.4))；促进靶蛋白分泌的寡核苷酸(例如，编码肽Ala-Gly-Lys的寡核苷酸)；编码目的基因的成熟区的合成核苷酸序列(例如，与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中的任一者的合成寡核苷酸具有至少50％或至少66％序列同一性(如约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者)的合成寡核苷酸)；和/或终止子(如AprE终止子(SEQ ID NO.5))。表达质粒还可被进一步转化至合适的表达宿主细胞(如哺乳动物或细菌或真菌表达宿主细胞)中。

C.宿主细胞

将包含DNA构建体(如本文公开的任一DNA构建体)或表达载体(如本文公开的任一表达载体，例如包含编码SEQ ID NO：1-2或6-24中任一者的多肽的任一SEQ ID NO：25-43的多核苷酸的表达载体)的分离的细胞有利地用作酸性磷酸酶多肽的重组生产中的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一或多个拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便地用编码酶的DNA构建体转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定保持。可以根据常规方法，例如，通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。可替代地，可以用与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

合适的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌物种，如芽孢杆菌属(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(原嗜热脂肪芽孢杆菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)物种，如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)：明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。可替代地，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

合适的酵母宿主细胞可以选自生物技术相关的酵母物种，如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种、或者酵母属(Saccharomyces)的物种，包括酿酒酵母，或者属于裂殖酵母属的物种，如例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养型酵母物种菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。可替代地，宿主生物可以是汉逊酵母属(Hansenula)物种。

丝状真菌中合适的宿主细胞包括曲霉属的物种，例如，黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。可替代地，镰刀菌属(Fusarium)物种(例如，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))的菌株或根瘤菌属(Rhizomucor)物种(如米黑根毛霉)的菌株可以用作宿主生物。其他合适的菌株包括嗜热菌属(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。此外，木霉属物种(Trichoderma sp.)可以用作宿主。由真菌宿主细胞表达的酸性磷酸酶多肽可以被糖基化，即，将包含糖基部分。糖基化模式可以与野生型酸性磷酸酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可能改变酶和/或生物化学特性。

合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞。另外的宿主细胞可包括昆虫细胞，如S2细胞。

从表达宿主缺失基因是有利的，其中可以通过转化的表达载体治愈基因缺陷。已知方法可用于获得具有一种或多种失活基因的真菌宿主细胞。已克隆的、来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何基因均可以缺失，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。基因缺失可通过本领域已知方法通过将待失活的所需基因的形式插入质粒中来完成。

通用转化技术是本领域已知的。参见，例如Sambrook等人(2001)，同上。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725。对于曲霉属菌株的转化，还参考了Cao等人(2000)Science[科学]9：991-1001。可以用载体系统构建遗传稳定的转化体，由此编码酸性磷酸酶的核酸被稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择并纯化转化体。

产生本文公开的任一酸性磷酸酶多肽的方法可以包括在有利于产生该酶的条件下培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收该酶。

用于培养细胞的培养基可以是适合于使宿主细胞生长和获得酸性磷酸酶多肽的表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。

本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中，真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。

分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的酸性磷酸酶多肽的浓缩溶液或肉汤。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得酸性磷酸酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心后超滤、萃取或色谱法等。

有时可能需要浓缩包含酸性磷酸酶多肽的溶液或肉汤以优化回收。使用未浓缩的溶液或肉汤典型地会增加孵育时间，以便收集富集或纯化的酶沉淀。

D.酶组合物

在本文公开的方法中使用的任一种酶均可以被配制成组合物(例如，药物或营养组合物)。如已经提到的，本文所述的在根据本发明的酸性pH范围下具有磷酸酶活性的蛋白质可用于治疗和/或预防与消化道炎症相关的疾病。在一个实施例中，本发明提供了一种组合物，优选地药物组合物，该组合物包含根据本发明的蛋白质。所述药物组合物任选地包含药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。

组合物可以以任何形式存在，例如作为片剂、作为可注射流体或作为输注流体等。此外，根据本发明的组合物、蛋白质、核苷酸和/或载体可经由不同的途径(例如，静脉内、直肠、支气管或口服)施用。又另一种合适的施用途径是使用十二指肠滴注器。

在一个实施例中，所使用的施用途径是静脉内途径。对于本领域技术人员来说清楚的是，优选地递送有效量的根据本发明的蛋白质。作为起始点，可使用1-50,000U/kg/天。另一种合适的途径(例如，对于HPP)是皮下途径。如果使用静脉内施用途径，则可经由连续输注施加(至少持续一定时间量)根据本发明的蛋白质。

根据本发明的所述组合物可任选地包含药学上可接受的赋形剂、稳定剂、活化剂、载体、渗透剂、推进剂、消毒剂、稀释剂和防腐剂。合适的赋形剂是药物配制品领域公知的，并且可以由技术人员容易地发现和施加，参考文献例如Remmington′s PharmaceuticalSciences，Mace Publishing Company，Philadelphia Pa.，17th ed.1985[雷明顿医药科学，马克出版公司，宾夕法尼亚州费城市，第17版，1985]。

对于口服施用，蛋白质可例如以固体剂型如胶囊、片剂(例如，具有肠溶包衣)和粉末施用，或以液体剂型如酏剂、糖浆和混悬剂施用。酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶可与非活性成分和粉末状载剂(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等)一起包入明胶胶囊中。可添加以提供所希望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其他已知的所希望的特征的另外的非活性成分的实例是红氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食用白色墨水等。类似的稀释剂可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊两者均可被制造为缓释产品，以供用于在数小时内持续释放药物。压缩片剂可带有糖包衣或薄膜包衣以掩盖任何不愉快的味道并且保护片剂免受大气影响，或者带有肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。用于口服施用的液体剂型可含有色素和调味剂以提高患者接受度。

肠溶包衣阻止活性化合物从口服可摄取剂型中释放。根据组成和/或厚度，肠溶包衣在它们开始崩解之前在所需的时间内耐受胃酸并且允许酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶在胃下部、小肠或大肠中缓慢释放。一些肠溶包衣的实例公开于美国专利号5，225，202中(通过引用并入)。肠溶包衣的实例包括蜂蜡和单硬脂酸甘油酯；蜂蜡、虫胶和纤维素，任选地包含与聚甲基丙烯酸酯的中性共聚物；甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的共聚物或含有金属硬脂酸酯的聚甲基丙烯酸酯的中性共聚物(有关肠溶包衣的参考文献，参见：美国专利号4，728，512、4，794，001、3，835，221、2，809，918、5，225，202、5，026，560、4，524，060、5，536，507)。大多数肠溶包衣聚合物在pH 5.5及更高时变得可溶解，在pH值高于6.5时具有最大溶解度。肠溶包衣还可以包括包底衣和外衣步骤，例如旨在用于在下GI道中特异性递送的药物组合物，即在结肠中(pH 6.4至7.0，回肠pH 6.6)，与肠上段的pH相反，小肠的十二指肠的pH范围为7.7-8(添加胰液和胆汁后)。可以利用肠中的pH差异将肠包衣的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶组合物靶向消化道中的特定区域。它还允许选择在肠道中的特定pH下活性最高的特异性酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶。

除根据本发明的蛋白质可结合到药物组合物中的事实以外，此类酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶也可为营养组合物或营养制品的一部分。

根据本发明的蛋白质可被添加至营养物(如奶)中，但也可以在所述营养物内产生(例如通过分子工程)。此外，可制备片剂和/或胶囊，随后将其添加至营养物中或者可直接由人服用。

在又另一方面，本发明的特征在于包含有效治疗或预防有需要的受试者的消化道炎症的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的饮料和食品产品。饮料产品可含有1单位/毫升至10,000单位/毫升，例如1单位/毫升至200单位/毫升、200单位/毫升至500单位/毫升、500单位/毫升至1,000单位/毫升、1,000单位/毫升至5,000单位/毫升、或5,000单位/毫升至10,000单位/毫升。食品产品可含有1单位/克至10,000单位/克，例如1单位/克至200单位/克、200单位/克至500单位/克、500单位/克至1,000单位/克、1,000单位/克至5,000单位/克、或5,000单位/克至10,000单位/克。

III.方法

A.用于治疗以消化道炎症为特征的障碍的方法

本文提供了用于减少或预防有需要的受试者的以消化道炎症为特征的障碍的方法和组合物。不受理论的约束，据信施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶(如与SEQID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：1 3、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约66％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶)可通过去除肠道微生物产生的炎症源(通过例如在体腔中黏膜组织处对LPS原位解毒和/或去除exATP、CpG DNA和鞭毛蛋白)来减轻炎症。

在黏膜表面对LPS原位解毒和/或去除体内的exATP、CpG DNA和鞭毛蛋白的一个非限制性目的是预防或减少此类表面处的局部炎性反应。此外，同样不受理论的约束，如此解毒的LPS、exATP、CpG DNA和鞭毛蛋白不再能够穿过黏膜层，并因此不能进入循环，在循环中它将发挥其毒性作用和/或引起进一步的局部和/或全身性炎性反应。该方法包括使用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源。

酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源可为任何酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶，或者包含酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的任何组合物，以及能够在本发明的上下文中产生功能性酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的任何工具(means)，如编码酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的DNA或RNA核酸。编码酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的核酸可以被嵌入合适的载体(如质粒、噬菌粒、噬菌体、(逆转录)病毒、转座子、基因疗法载体以及能够诱导或赋予酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶产生的其他载体)中。另外，天然或重组微生物，如细菌、真菌、原生动物和酵母，可以用作本发明的上下文中的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于预防或减少消化道炎症(如由哺乳动物体腔黏膜衬里处的LPS毒性或exATP、CpG DNA和鞭毛蛋白的存在所介导或引起的炎症)的方法，该方法包括向黏膜层和/或消化道施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶(如与SEQID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约1 00％同一的，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约66％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶)源的步骤。对于法律规定治疗方法不能取得专利的那些司法管辖区，本发明同样涉及如上文中所定义的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的用途，或含有如上文中所定义的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的组合物的用途。酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源用于制造药物，该药物用于在黏膜层和/或消化道处递送酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶以预防或减少消化道组织的炎症。

特别地，上述在体腔(如消化道，例如大肠和/或小肠)的黏膜层处施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的方法适合于治疗或预防消化道炎症(例如，由消化道微生物组生态失调导致的LPS毒性或exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白的存在所引起的炎症)和相关疾病，尽管该方法也可以有利地作为旨在预防消化道炎症(例如，由消化道微生物组生态失调导致的LPS毒性或exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白的存在所引起的炎症)和相关疾病的预防性治疗用于健康受试者。根据本发明施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶以减少消化道炎症和黏膜层的有益效果将产生总体健康促进效应，无论所治疗的受试者的医疗状况如何。通过黏膜层的LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白流入的随后减少可以进一步增强健康促进效应。

LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白介导或诱导的疾病可以为由LPS、exATP、CpGDNA和/或鞭毛蛋白毒性引起的任何疾病、症状或症状组。LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白加剧的疾病可以为并非直接由消化道中的LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白引起的任何疾病或症状，而是其症状和临床特征可能被LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白加重的疾病，并且罹患此类疾病的受试者的临床状态因消化道中LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白的存在而恶化。

优选地，该方法旨在治疗LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白介导或加剧的疾病，如炎性肠病，特别是被诊断出患有克罗恩病和溃疡性结肠炎的患者。其存在是肠黏膜受损以及LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白流入或消化道移位增加的结果，并且引起或加剧肠道中的炎性反应。在肝硬化、酗酒、梗阻性黄疸和其他肝脏病症引起的急性胰腺炎和肝病中也观察到肠道细菌移位和LPS消化道移位。内毒素还已经牵涉到牙周病的发展，其中它渗透牙龈上皮/黏膜，引起局部炎性反应。在优选的实施例中，该方法包括口服施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源，以减少LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白毒性和/或LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白通过黏膜。

在一个非限制性实施例中，施用模式包括使用包含酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的药物组合物，其可以以日剂量方案递送以长期减少GI道内腔中的消化道炎症。优选地，药物组合物包含肠溶包衣以保护酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶免受胃液(pH 1.0至2.5)的有害影响，并且确保酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶在肠道黏膜处的有效递送。在另一个实施例中，药物组合物为包含在肠溶衣内的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源。

根据本发明待治疗的黏膜组织为覆盖在肠道体腔表面的黏膜组织。口服施用的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶在GI道的黏膜组织处递送，GI道包括食道、胃、小肠或肠(十二指肠、空肠、回肠)和大肠或结肠(盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠和肛门)。在本发明的范围内，覆盖口腔、胆管和胰腺表面的黏膜组织也是肠道的一部分并且可以根据本发明的方法进行治疗。

包含根据本发明的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的组合物特别适合于口服施用，以预防、治疗、减少、治疗或减轻胃肠道的炎性疾病。细菌衍生物质如LPS、exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白的流入可显著诱导和/或加剧胃肠道的炎性疾病。例如，并且不受理论的约束，通过施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源以减少肠内腔中有毒LPS的量将通过LPS的脂质A部分的解毒而导致受试者循环中有毒LPS的全身流入相应减少。在一个实施例中，口服施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源特别优选地用于预防或治疗以下胃肠道炎性疾病：克罗恩病、结肠炎、(坏死性)小肠结肠炎、溃疡性结肠炎、肝胆疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、肝纤维化、胆管炎症、胆道梗阻、胰腺炎、急性胰腺炎、腹膜炎和牙周病。

在本发明的另一个实施例中，向罹患胃肠道黏膜通透性增加的受试者口服施用酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源。GI道的黏膜通透性增加通常是肠道灌注减少或缺血的结果。缺血，即血流供氧不足，可能由心力衰竭、损伤、创伤或手术引起。不受理论的约束，肠缺血导致黏膜功能障碍，并因此增加来自消化道的有毒LPS(以及其他炎症来源，如exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白)的流入或移位，导致局部和全身性毒性和炎症。毒性和炎性反应甚至可进一步增强黏膜通透性，导致恶性循环。GI道的黏膜通透性增加可能是炎性肠病或GI道的其他病理状况的结果。口服施用根据本发明的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源将显著减少或消除肠腔内腔中的致炎因子(inflammatory agent)如LPS和/或exATP、CpG DNA和/或鞭毛蛋白的这种增加的流入。

本发明还提供包含酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的组合物，其中包括包含酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的药物和营养组合物。组合物可任选地包含药学上可接受的赋形剂、稳定剂、活化剂、载体、渗透剂、推进剂、消毒剂、稀释剂和防腐剂。合适的赋形剂是药物配制品领域公知的，并且可以由技术人员容易地发现和施加，参考文献例如Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia Pa.，17th ed.1985[雷明顿医药科学，马克出版公司，宾夕法尼亚州费城市，第17版，1985]。在优选的实施例中，包含酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶源的组合物适合于口服施用并且包含肠溶包衣以保护酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶免受胃液和低pH的不利影响。肠溶包衣和控释配制品在本领域中是众所周知的(参考文献如上所述)。本领域的肠溶包衣组合物可以包含与活性成分(如酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶)和其他赋形剂混合的水溶性肠溶包衣聚合物的溶液，其分散在水溶液中并且随后可以干燥和/或造粒。所形成的肠溶包衣可抵抗储存期间大气水分和氧气以及摄入后胃液和低pH对酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的攻击，同时容易在下肠道中存在的碱性条件下分解。

根据本发明的用于在黏膜组织处递送酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶以治疗和预防消化道炎症的含有酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶的组合物可包含微生物衍生(即来自细菌、古生菌、真菌或酵母)的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶真核酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶。

B.用于促进共生细菌向消化道中的植入的方法

本文还提供了一种用于促进一种或多种共生细菌向受试者消化道中的植入的方法。该方法需要至少向受试者施用本文公开的任一酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶组合物(如与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQID NO：16中的任一者的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约66％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶)以及一种或多种共生细菌的菌源。在一些实施例中，与在不存在本文公开的酸性磷酸酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶组合物的情况下施用一种或多种共生细菌的菌源时相比，该方法以更大程度(如程度增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％或更多(包括落入这些值之间的百分比))促进该一种或多种共生细菌向受试者消化道中的植入。共生细菌的非限制性实例包括瘤胃联合乳杆菌、人体普氏菌、唾液联合乳杆菌和长双歧杆菌。该一种或多种共生细菌的菌源可作为益生菌(例如，口服或直肠)或作为粪便微生物移植物(例如，以胶囊形式直肠或口服)施用。

一般而言，该一种或多种共生细菌的菌源(如益生菌组合物)包括细菌，如一种或多种细菌菌株。在本发明的一些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源被配制成冷冻干燥或冻干形式。例如，该一种或多种共生细菌的菌源可包括颗粒剂或明胶胶囊剂，例如硬明胶胶囊剂，其包含本文公开的细菌菌株。

在一些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源包含冻干细菌。细菌的冻干是本领域中一种成熟的规程。可替代地，含微生物的组合物可以包含活的活性细菌培养物。

在一些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源被包入胶囊内以使细菌菌株能够递送到肠。包入胶囊内保护该组合物在递送至靶位置之前免于降解，降解的途径例如为由于化学或物理刺激(如压力、酶活性或物理崩解，其可能是由pH变化触发的)而破裂。可以使用任何合适的包入胶囊内方法。示例性的包入胶囊内技术包括在多孔基质内的截留、固体载体表面上的附着或吸附、通过絮凝或用交联剂的自聚集、以及微孔膜或微胶囊的机械遏制。

该一种或多种共生细菌的菌源可口服施用并且可以是片剂、胶囊或粉末的形式。其他成分(例如，如维生素C或矿物质)可以作为氧清除剂和益生元底物被包括，以改善体内的递送和/或部分或全部定植和/或植入和/或存活。替代性地，该一种或多种共生细菌的菌源(如益生菌组合物)可以作为食品或营养产品(如奶或乳清基发酵乳制品)或作为药物产品口服施用。

该一种或多种共生细菌的菌源可被配制为益生菌。替代性地，该一种或多种共生细菌的菌源可被配制为无活力的细菌组合物，如经巴氏灭菌或热处理的细菌组合物。

一种或多种共生细菌的菌源包括治疗有效量的本文公开的细菌菌株(例如但不限于瘤胃联合乳杆菌、人体普氏菌、唾液联合乳杆菌和长双歧杆菌中的一种或多种)。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益效果。治疗有效量的一种或多种共生细菌的菌源可能足以导致递送至受试者的肠和/或部分或全部植入和/或定植于受试者的肠。

例如对于成年人而言，共生细菌的合适日剂量可以是约1x10³至约1X10¹¹个菌落形成单位(CPU)；例如，约1x10⁷至约1x10¹⁰CPU；在另一个实例中，约1x10⁶至约1x10¹⁰GPU；在另一个实例中，约1x10⁷至约1x10¹¹CPU；在另一个实例中，约1x10⁸至约1x10¹⁰CPU；在另一个实例中，约1x10⁸至约1x10¹¹CPU。在某些实施例中，细菌的剂量是至少10⁹个细胞/天，如至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²个细胞/天。

在某些实施例中，相对于组合物的重量，该一种或多种共生细菌的菌源含有约1x10⁶至约1x10¹¹CFU/g的量的细菌菌株；例如，约1x10⁸至约1x10¹⁰CFU/g。剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。在某些实施例中，相对于组合物的重量，细菌菌株的量是1x10³至约1x10¹¹个菌落形成单位/克。

在某些实施例中，任一该一种或多种共生细菌的菌源按以下剂量施用：在500mg与1000mg之间、在600mg与900mg之间、在700mg与800mg之间、在500mg与750mg之间或在750mg与1000mg之间。在某些实施例中，本文公开的任一含微生物的组合物中的冻干细菌按以下剂量施用：在500mg与100mg之间、在600mg与900mg之间、在700mg与800mg之间、在500mg与750mg之间或在750mg与1000mg之间。

通常，益生菌任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。益生元化合物通常是不可消化的碳水化合物，如低聚糖或多糖或糖醇，其不在上消化道中降解或吸收。已知的益生元包括如菊粉和反式低聚半乳糖等商业产品。

在某些实施例中，益生菌组合物被配制为包括益生元化合物，该益生元化合物的量为相对于组合物总重量的约1至约30重量％(例如5至20重量％)。碳水化合物可选自由以下组成的组：低聚果糖(或FOS)、短链低聚果糖、菊粉、低聚异麦芽糖、果胶、低聚木糖(或XOS)、壳寡糖(或COS)、人乳低聚糖、β-葡聚糖、阿拉伯树胶改性淀粉和抗性淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯胶纤维、角豆树、燕麦和柑橘纤维。在一个方面，益生元是短链低聚果糖(为简单起见，在本文下文示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c不是可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化获得并且包括结合三个葡萄糖分子的蔗糖分子。在另一个实施例中，益生元可包括一种或多种多酚(如植物多酚)。在一些实施例中，本文公开的任何益生菌可以与衍生自乳杆菌属和双歧杆菌属(如乳酸双歧杆菌(B.lactis)B420)的另外的益生菌一起配制。

该一种或多种共生细菌的菌源可进一步包含药学上可接受的赋形剂或载剂。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在药学领域是众所周知的。合适载体的实例包括但不限于乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括但不限于乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药物实践来选择。药物组合物可以包含或除了载体、赋形剂或稀释剂之外，任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂(如在到达小肠或大肠之前不会溶解或降解的耐胃肠溶包衣剂)或增溶剂。合适的粘合剂的实例包括但不限于淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖，无水乳糖，自由流动乳糖，β-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄著胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂可以提供于药物组合物中。防腐剂的实例包括但不限于苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

该一种或多种共生细菌的菌源可被配制为食品产品。例如，除了本发明的治疗效果外，食品产品还可以提供营养益处，如营养补充剂中。类似地，可以配制食品产品以增强本发明组合物的味道，或通过更类似于普通食品而不是药物组合物来使组合物更有消费吸引力。在某些实施例中，含微生物的组合物被配制为奶基产品。如本文所用，术语“奶基产品”意指具有不同脂肪含量的任何液体或半固体奶基或乳清基产品。奶基产品可以是例如牛奶、山羊奶、绵羊奶、脱脂奶、全脂奶、由奶粉和乳清重组而成的未经任何加工的奶，或加工产品，如酸乳、凝结奶、凝乳、酸性奶、酸性全脂奶、酪乳和其他酸性奶产品。另一个重要的组包括奶饮料，如乳清饮料、发酵奶、炼奶、婴儿或幼儿奶；调味奶、冰淇淋：含奶食品，如糖果。

在某些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源含有单种细菌菌株或物种，并且不含任何其他细菌菌株或物种。此类组合物可以仅包含微量或生物学上无关量的其他细菌菌株或物种。此类组合物可以是基本上不含其他生物物种的培养物。在某些实施例中，本发明的组合物由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种细菌菌株或物种组成。在某些实施例中，这些组合物由1至10种(如1至5种)细菌菌株或物种组成。

根据本文公开的方法使用的该一种或多种共生细菌的菌源可能需要或可能不需要上市许可。

在某些实施例中，该一种或多种共生细菌的菌源储存在约4℃或约25℃的密封容器中且将该容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，如以菌落形成单位测量的细菌菌株的至少80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年的时间段后仍然存在。

通过参照以下实例可以进一步理解本发明，这些实例是为了说明而提供的，而不是为了限制。

实例

实例1：酶候选物的表征

从NCBI数据库中鉴定出系统发生多样化的酶，如表1所示。这些酶经克隆、表达和纯化，用于酶测定，以确定它们水解ATP的能力。马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶(A6535)和CD39(SRP0623)购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)。

表1.克隆的酶的NCBI序列标识符

pH3至9时对ATP或ADP的酶活性：使用标准孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒(西格玛奥德里奇公司，目录号MAK307)测量候选酶将ATP或ADP降解为AMP和游离磷酸盐(Pi)的能力。酶反应在总体积为150μL的96孔板中进行，并且含有250μM底物、50mM缓冲液、5mM CaCl₂和不同浓度的酶。底物是ATP或ADP。缓冲液为甘氨酸(pH 3)、乙酸盐(pH 4、4.5、5)、bis-Tris(pH 5.5、6、6.5)或Tris(pH 7、8、9)。酶的浓度在约1μg/mL至1ng/mL之间变化，并且基于酶的活性进行调整，使得测定期间释放的磷酸盐的量符合测定的动态范围(5至100μM磷酸盐)。通过280nm处的吸光度并且使用预测的分子量和摩尔消光系数确定酶浓度，以计算浓度。通过添加15μL酶和135μL其他反应组分来引发酶反应，使得最终反应组成如先前所述。5min后，通过将80μL反应混合物与20μL孔雀石绿工作试剂混合，来停止反应。根据制造商的方案，通过将100份试剂A与1份试剂B混合，来制备孔雀石绿工作试剂。还将磷酸盐标准溶液(0至80μM)和不含酶的阴性对照反应物与孔雀石绿工作试剂混合。所有样品均一式两份进行测试。允许孔雀石绿反应混合物在室温下静置45至60min，并且测量620nm处的吸光度。最后，使用磷酸盐标准品的吸光度将每个样品的吸光度读数转化为磷酸盐浓度，并且从每个反应中减去阴性对照。以ATP或ADP作为底物，每分钟反应时间每毫克蛋白质所释放的磷酸盐微摩尔数(μmol/mg/min)显示在图1和图2中。

如图1和图2所示，CRC22110是活性最高的酶。马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶、CRC22110、CRC22105、CRC22112、CRC22383、CRC21328是GDA1_CD39超家族的成员。CRC21320是紫色酸性磷酸酶家族的成员。CRC21323和CRC21322是酸性磷酸酶(A类)超家族的成员。酸性磷酸酶具有约pH4.5的酸性pH最佳值，而来自GDA1_CD39超家族的酶具有接近中性pH的pH最佳值(pH6-8)并且在pH 5至7之间具有广泛的活性范围，其中有些酶甚至在pH9也保持活性。CRC21320具有较窄的pH范围，其中在pH7时为最佳值。

酶底物特异性：使用孔雀石绿测定法测试酶对不同核苷酸底物的活性。如上所述设置测定，其中采用下列修改。所测试的底物是ATP、ADP、CTP、CDP、UTP、UDP、GTP和GDP。使用pH 4.5的乙酸盐缓冲液对CRC21323和CRC21322进行测试。使用bis-Tris pH 7的缓冲液对CD39进行测试。所有其他酶均使用bis-Tris pH6.5的缓冲液进行测试。将吸光度转化为磷酸盐浓度后，相对于对ATP的活性设置每种酶的活性。

如图3所示，核苷酸三磷酸是比二磷酸更好的底物。大多数酶对UTP的活性与ATP相似，但CRC22105除外，它对UTP/UDP和CTP/CDP的活性显著降低。然而，每种酶具有略微不同的偏好。

酶耐酸性：通过将酶在50mM甘氨酸和5mM CaCl₂在pH 2的“酸性缓冲液”中孵育15分钟或60分钟并且将其活性与处于其最佳pH下的“对照缓冲液”中的酶进行比较，来测试候选酶在低pH下抗失活的能力。CRC21323和CRC21322的最佳缓冲液是含5mM CaCl₂的50mM乙酸盐(pH 4.5)。所有其他酶的最佳缓冲液是含5mM CaCl₂的50mM bis-Tris(pH 6.5)。在酸性甘氨酸缓冲液中孵育后，通过与等体积的中和缓冲液混合来中和酶混合物。CRC21323和CRC21322的中和缓冲液是100mM乙酸盐和10mM CaCl₂(pH 4.5)。其他酶的中和缓冲液是100mM bis-Tris和10mM CaCl₂(pH 6.5)。接下来，使用如……中所述的反应条件和孔雀石绿测定法与以下修改，来测试酸应激(acid-stressed)酶和对照酶从ATP释放磷酸盐的能力。测试的唯一底物是ATP。使用pH 4.5的乙酸盐缓冲液对CRC21323和CRC21322进行测试，但所有其他酶均在pH 6.5的bis-Tris缓冲液中进行测试。确定每个反应中磷酸盐的浓度后，通过将每种酶的酸应激结果除以对照酶磷酸盐浓度来计算在“酸性缓冲液”中孵育15或60min后每种酶的残余活性。

如图4所示，耐酸性实验表明，CRC21328和CRC22110对“酸性缓冲液”具有最大耐受性，因为它们在60min孵育后保持最大活性。马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶在15min后保持稳定，但在60min后似乎失去其大部分活性。尽管CRC21323和CRC21322是酸性磷酸酶家族的成员，但它们在该测定中最不稳定。

实例2：使用酸性磷酸酶来治疗化学诱导的DSS结肠炎小鼠模型中的IBD

炎性肠病(IBD)是一种复杂的多因素疾病，其致病因素包括基因突变至消化道内部和外部的微观和宏观环境。在各种IBD动物模型中，化学诱导的葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型因快速筛选候选化合物而众所周知。

根据先前发表的方法并且进行细微修改，在C57BL/6小鼠中诱导急性DSS结肠炎(Sann等人，2013，Life Sci.[生命科学]4月9日；92(12)：708-18)。在第一天至第五天，为小鼠喂食溶于饮用水中的3％(w/v)DSS。每隔一天提供新鲜DSS溶液。对照小鼠(第1组)仅喝蒸馏水。第4组至第8组通过经口灌胃接受候选酸性磷酸酶，并且第9组至第12组经由导管接受酶(表2)。DAI的计算方法如先前所述(Cooper等人，1993，Laboratory investigation,;ajournal of technical methods and pathology[实验室研究；技术方法和病理学杂志].69(2)：238-49)。

表2.实验设计

*第9组至第12组通过导管插入经由盲肠接受测试品。

BID：每天两次，间隔8小时。QD：每天一次

PO：经口灌胃

如图5A和图5B所示，与对照相比，在接受三磷酸腺苷双磷酸酶(改善37％)和CRC21323(改善43％)的小鼠中观察到DAI得分显著改善。与CRC02733相比时，还观察到CRC22110的DAI得分显著降低。

此外，与对照相比，观察到接受CRC221100的已插管小鼠的DAI得分显著改善(降低47％)。在接受CRC21323以及CRC22110与CRC21323的组合的组中，DAI得分降低了40％和25％(图6A和图6B)。

实例3：使用酸性磷酸酶来促进有益消化道细菌的植入

消化道炎症在许多障碍中起主要作用。它是一种复杂的多因素疾病，其致病因素包括基因突变至消化道内部和外部两者的微观和宏观环境。

Apc/minJ小鼠具有突变的结肠腺瘤性息肉病基因，并且更容易形成结肠炎和肿瘤。在该实例中，并且使用该模型，使6-7周龄的小鼠经受饮用水中的万古霉素、氨苄青霉素和新霉素的抗生素混合物(1mg/mL)7天，以诱导消化道炎性反应。对照小鼠(第1组和第2组)仅喝蒸馏水。第4组和第6组通过经口灌胃接受CRC22110 ay 10μg/剂酶，并且第5组和第6组通过灌胃接受人类微生物群移植物(HMT)。HMT是通过将来自健康人类供体的粪便样品接种到20ml YCFAC培养基中来制备的。培养物在37℃厌氧生长16小时。通过离心收集细胞，并且将其用PBS洗涤。将细胞重悬于10％甘油中，并且通过在YCFAC琼脂平板上铺板来估计细胞数量。

实验设计如表3和图7所示。

^a从第1天至第16天，酶每天口服(PO)给予两次

^b从第9天至第12天，HMT每天PO给予一次。对于第6组，将首先给予酶。

^c从第1天至第16天，第1组、第2组和第3组每天PO给予两次。第1组、第2组和第3组将在第9天至第12天接受额外PO，以匹配HMT剂量。

疾病严重程度：使用临床疾病活动指数(DAI)对疾病严重程度进行评分，该指数按照先前所述使用以下参数进行计算：粪便稠度、便血的存在或不存在以及体重减轻(Cooper等人，1993，Laboratory investigation；ajournal of technical methods andpathology[实验室研究；技术方法和病理学杂志].69(2)：238-49)。在第12天和第16天处死小鼠，测量结肠，并且制备组织用于组织病理学研究。将结肠固定在10％甲醛-盐水中。将苏木精和伊红染色剂(HE)染色的切片基于改编自以下文献的评分系统进行分级：Burich等人，2001，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol[美国生理学杂志-胃肠和肝脏生理学].281：G764-G778；以及Hausmann等人，2007，Clin Exp Immuno l[临床和实验免疫学].2007年5月；148(2)：373-81。执行组织学评分，并且确定所有组的炎性细胞浸润和组织损伤的综合得分。

如图8所示，与对照相比，在接受CRC22110的小鼠中观察到DAI得分显著改善(改善25％)。治疗后2天，粪便稠度和粪便潜血检验得分变化明显，体重无下降。疾病活动得分(DAI)达到最大值2-3。如图9所示，与对照相比，在接受CRC22110的小鼠中观察到结肠长度显著改善。进一步，如图10所示，组织病理学分析显示，在接受CRC22110的组中不存在对照组中所观察到的局灶性增生。增生性息肉是从组织中突出的额外细胞的生长。它们发生在身体已修复受损组织的区域，尤其是沿消化道的区域。接受CRC22110的组中不存在增生，表明该酶能够预防炎性条件下对GI道的损伤。

对植入的促进：每天从每只小鼠收集粪便样品。处理第13天的粪便样品并且进行16S测序以评估微生物组的结构。将第5组与第6组进行比较并且评估HMT的植入。HMT是通过将来自健康人类供体的粪便样品接种到20ml YCFAC培养基中来制备的。培养物厌氧生长16小时。通过离心收集细胞并且将其用PBS洗涤。将细胞重悬于10％甘油中，并且通过铺板来估计细胞数量。

如图11所示，在第6组中，接受CRC22110的动物显示出来自HMT的几种共生体的更好的植入。

实例4.酶候选物的克隆、表达和蛋白质制备

从NCBI(worldwwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/protein)或内部数据库中鉴定出已知具有ATP水解活性的酶家族的系统发生多样化的序列，并且注释为酶家族GDA1/CD39或酸性磷酸酶(A类)的成员。基于枯草芽孢杆菌的密码子偏好对目的基因序列进行密码子优化，并且使用本领域已知的技术产生编码各种酶的序列的合成基因(由上海捷瑞生物工程有限公司)。密码子优化的基因和预测的成熟酶的序列列于表4中。将基因克隆到表达载体p2JM103BBI中(Vogtentanz，Protein Expr Purif[蛋白质表达与纯化].55：40-52，2007)。密码子优化的核苷酸序列的表达使用在信号序列与目的基因的预测的成熟序列之间具有另外3个氨基酸(Ala-Gly-Lys)的aprE信号肽(SEQ ID NO：4)(以促进枯草芽孢杆菌中靶蛋白的分泌)，编码由aprE启动子(SEQID NO：3)驱动的预测的成熟多肽，并且被lat终止子(SEQ ID NO：5)终止。用每种相应的表达载体转化感受态枯草芽孢杆菌细胞，并且在补充有5ppm氯霉素的Luria琼脂平板上铺板。将菌落接种到含有LB培养基的烧瓶中，并且在37℃和200rpm振摇下生长5-6h。将种子培养物接种到含有矿物质(例如，硫酸钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、柠檬酸等)、一种或多种碳源(例如，葡萄糖)、复合氮源(例如，水解的大豆蛋白胨、酵母提取物)和缓冲组分(例如，MOPS、Tris等)的生产培养基中。培养物在32℃和250rpm振摇下生长24-40h。

一般纯化程序如下。通过离心收集培养物肉汤，浓缩并且补充以硫酸铵至最终浓度为1M，然后施加至疏水相互作用柱(例如，苯基FF、丁基FF)，该柱用含有1M硫酸铵的50mMTris pH 7.5预平衡。将柱用分步模式洗脱(0.75M、0.5M、0.25M、0.02M硫酸铵，H₂O，20％乙醇)，并且合并含有目的活性酶的级分，并且将缓冲液交换为20mM Tris pH 7.5。将合并的样品上样至阴离子交换色谱(例如，Q FF)上并且用梯度模式洗脱(0-0.5M NaCl)。基于SDS-PAGE分析和活性测试鉴定含有纯化的酶的级分，并且将它们合并。将纯化的样品在-20℃储存于含有20mM Tris pH7.5、150mM NaCl和40％甘油的缓冲液中，直至使用。

参考酶购自西格玛奥德里奇公司：马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶(目录号#A6535)、重组人CD39 His标签(目录号#SRP0623)和小牛肠碱性磷酸酶(目录号#P0114)。

实例5.另外的酶候选物的表征

针对ATP底物测定目的酶。如实例1中所述，以0.05ppm的浓度在50mM MES缓冲液pH6和pH 5中以0.1mM ATP作为底物测量ATP酶活性。使用商业马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶作为参考。测量620nm处的吸光度，并且从每个样品中减去空白样品(水)的吸光度。

结果示于表5中。

使用1mM ATP在含5mM CaCl2的50mM柠檬酸三钠/柠檬酸缓冲液中测定另外的目的酶的pH曲线。读取620nm处的吸光度，并且所有值均相对于最高值进行设置。使用商业马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶作为参考。在pH 3.5与pH 6.5之间测试的这些目的酶的相对活性示于表6中。

实例6.目的GDA1_CD39酶的序列分析

使用Clustal W以默认设置(在Geneious Prime软件工具中)对GDA1/CD39家族成员进行多蛋白质序列比对：CRC22110(SEQ ID NO：9)、CRC22605(SEQ ID NO：36)、CRC22606(SEQ ID NO：37)、WP_115720250.1(SEQ ID NO：48)和WP_170164129.1(SEQ ID NO：49)。横跨预测的成熟CRC22110蛋白质的序列的残基的比对示于图12中，其突出显示了这些同源酶之间的序列相似性。这组酶的同一性百分比示于表7中，其中包括来自嗜肺军团菌的三磷酸腺苷双磷酸酶(PDB ID：4BRA，SEQ ID NO：50)用于比较。

使用Clustal W对CRC22110(SEQ ID NO：9)和来自嗜肺军团菌的三磷酸腺苷双磷酸酶(PDB ID：4BRA，SEQ ID NO：50)进行成对蛋白质序列比对，以鉴定这些CD39酶所共有的保守区。比对示于图13中，其中位置根据4BRA的序列进行编号(考虑到比对所引入的序列空位)，并且它显示了序列同源性的痕迹，即使蛋白质序列显著不同(21％同一性)。图14中的图像是使用Pymol软件(版本2.4.1)针对嗜肺军团菌三磷酸腺苷双磷酸酶PDB ID：4BRA结构生成的，并且突出显示了对ATP水解活性至关重要的区域，该区域与ANP分子(黑棒)所占据的活性位点相邻。生成CRC22110的一系列单位点变体，以便评估CRC22110分子中该区域内相应残基的功能意义。与CRC22110野生型相比，测试变体对ATP底物的活性，并且相对活性结果示于表8中。对应于嗜肺军团菌三磷酸腺苷双磷酸酶(4BRA)的225、226、227、228、229和230的位置处的取代导致所有CRC22110变体中酶活性的丧失，这与以下假设一致：该保守区对于活性很重要，即使在三磷酸腺苷双磷酸酶在整体序列同一性方面差异很大时。

实例7.目的酸性磷酸酶(A类)的序列分析

为了评估细菌酸性磷酸酶之间的结构-功能关系，使用Clustal W软件以默认设置(在Geneious Prime中)进行多蛋白质序列比对。本研究评估的细菌酸性磷酸酶：CRC21323(SEQ ID NO：41)、CRC25082(SEQ ID NO：42)、CRC25084(SEQ ID NO：43)、CRC25085(SEQ IDNO：44)、CRC25089(SEQ ID NO：45)、CRC21322(SEQ ID NO：40)和CRC25100(SEQ ID NO：47)与来自蟑螂埃希菌(Escherichia blattae)的另一种细菌酸性磷酸酶(PDB ID：1D2T，序列AFJ47775.1(SEQ ID NO：51))进行比对，并且包括来自真核生物的另外三种不同的酶：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)KEY80034.1(SEQ ID NO：52)、智人(Homo sapiens)AAK09393.1(SEQ ID NO：53)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AAF66599.1(SEQ ID NO：54)用于比较。跨越预测的成熟CRC21323蛋白质的序列的残基的比对示于图15中，其中突出显示了同源细菌酶之间的序列相似性。这组酶的同一性百分比示于表9中。

细菌酸性磷酸酶显示出50％或更高的序列同一性。

图15中序列的系统发生树是使用邻接方法(MEGA X程序)构建的并且示于图16中，其中可以看出，细菌酶聚集在一个进化枝中。在来自蟑螂埃希菌的三磷酸腺苷双磷酸酶(PDB ID：1D2T)的3D结构中也可以看到在细菌酸性磷酸酶中具有高序列同一性的区域。如图17中所示，在使用Pymol(版本2.4.1)生成的图像中，活性位点袋附近的区域(由磷酸盐分子指示)形成柔性环和α螺旋，其位置指示ATP水解的关键功能。该区域内以及与之侧接的氨基酸序列在细菌酸性磷酸酶CRC21323、CRC25082、CRC25084、CRC25085、CRC25089、CRC21322、CRC25100和AFJ47775.1中显得高度保守。

序列

序列表

<110> 杜邦营养生物科学公司（DuPont Nutrition Biosciences ApS）

<120> 用于消化道健康的组合物

<130> NB41936-WO-PCT

<150> PCT/US2022/016924

<151> 2022-02-18

<150> US63/151,190

<151> 2021-02-19

<150> US63/289,439

<151> 2021-12-14

<160> 50

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 408

<212> PRT

<213> 厦门加西利亚单胞菌（Gallaecimonas xiamenensis）

<400> 1

Met Gly Trp Ile Arg Gly Leu Val Ala Leu Leu Leu Gly Leu Ala Trp

1 5 10 15

Ala Val Gln Ala Ala Asp Lys Pro Ala Cys Arg Ala Val Phe Asp Ala

20 25 30

Gly Ser Ser Gly Thr Arg Leu Phe Leu Tyr Val Gln Gln Glu Gly Gly

35 40 45

Trp Gln Pro Trp Pro Gly Ala Lys Leu Gly Ala Leu Ala Asp Pro Val

50 55 60

Arg Gln His Gln Gly Pro Lys Ala Met Ala Ala Leu Ala Ala Asp Leu

65 70 75 80

Ala Asn Ser Leu Glu Ala Leu Arg Gln Asp Gly Pro Thr Asn Ser Glu

85 90 95

Gly Gln Pro Arg Trp Gln Gly Phe Asp Trp Gln Gln Ala Cys Arg Leu

100 105 110

Gln Ser Val Ser Val Leu Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Ala Glu Gln

115 120 125

Gln Asp Pro Val Ala Ser Val Ala Leu Trp Gln Glu Val Gln Gln Ala

130 135 140

Leu Ala Gly Leu Leu Gly Pro Ala Val Ala Ile Asp Ala Arg Thr Leu

145 150 155 160

Thr Gly Phe Glu Glu Gly Phe Tyr Ala Trp Leu Ala Ala Arg Ala Arg

165 170 175

Leu Gly Arg Ser Asp Met Gly Ile Val Glu Met Gly Gly Ala Ser Ser

180 185 190

Gln Val Ala Phe Pro Cys Pro Ala Cys Asp Arg Ala Asp Asp Ala Val

195 200 205

Gln Gln Val Arg Leu Glu Gly Gln Thr Leu Asp Phe Tyr Ser Tyr Ser

210 215 220

Phe Leu Gly Leu Gly Gln Asp Glu Ala Pro Lys Val Leu Gly Val Pro

225 230 235 240

His Ala Cys Arg Tyr Gly Ala Gly Val Lys Asp Pro Asn Trp Gln Leu

245 250 255

Gly Gln Cys Gln Ala Gln Leu Pro Leu Thr Leu Gly Arg Ala Leu Lys

260 265 270

Asp Pro Tyr Asn Phe Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Arg Gln Val

275 280 285

Pro Thr Glu Lys Ala Gly Val Lys Asp Trp Leu Leu Thr Gly Ala Phe

290 295 300

Gln Tyr Asn Thr Pro Asp Gln Leu Asp Ser Cys Cys Leu Asn Gln Gly

305 310 315 320

Gln Cys Tyr Gln Pro Ser Thr Ala Cys Phe Arg Val Ala Tyr Leu Pro

325 330 335

Leu Tyr Leu Asp Ser Leu Gly Val Asp Pro His Ser Pro Asp Leu Asp

340 345 350

Val Ser Trp Thr Leu Gly Ala Val Leu Cys Arg Asn Glu Gln Cys Leu

355 360 365

Ala Pro Ser Lys Pro Pro Cys Arg Trp Arg Lys Ala Gly Cys Leu Ala

370 375 380

Pro Ser Val Gly Asp Gly Arg Pro Glu Gly Arg Pro Gly Gln Gln Pro

385 390 395 400

Gly Gly Val Gln His Arg Gln His

405

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）

<400> 2

Met Arg Leu His Phe Lys Lys Arg Val Ala Val Cys Ser Val Ala Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Ser Ala Ser Gly Ala Phe Ala Ala Gln Thr Pro Gly Phe

20 25 30

Leu Thr Pro Glu Thr Ala Pro Asp Ser Leu Gln Ile Leu Pro Pro Pro

35 40 45

Pro Ala Glu Asn Thr Thr Ala Phe Leu Asn Asp Lys Ala Ala Tyr Glu

50 55 60

Thr Gly Lys Thr Leu Lys Asp Ala Gln Arg Gln Ala Leu Ala Ala Ser

65 70 75 80

Asp Ala Asp Tyr Lys Asn Ile Ser Ala Ala Phe Ser Ala Ala Phe Gly

85 90 95

Glu Glu Ile Ser Pro Glu Lys Thr Pro Ala Leu Tyr Ala Leu Leu Gln

100 105 110

Gly Val Leu Gln Asp Ser His Asp Tyr Ala Met Arg Ala Ala Lys Asp

115 120 125

His Tyr Met Arg Val Arg Pro Phe Val Val Tyr Lys Asp Ser Thr Cys

130 135 140

Thr Pro Glu Lys Asp Lys Ser Met Ala Lys Thr Gly Ser Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Thr Glu Ile

165 170 175

Asn Pro Ala Arg Glu Thr Glu Ile Leu Lys Arg Gly Tyr Asp Phe Gly

180 185 190

Gln Ser Arg Val Val Cys Gly Ala His Trp Gln Ser Asp Val Asp Asn

195 200 205

Gly Arg Leu Met Gly Ala Ala Val Val Ala Ala Leu His Gly Asn Gln

210 215 220

Gly Phe Asn Asp Ala Leu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Phe Ala Lys Arg

225 230 235 240

<210> 3

<211> 607

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 3

aattctccat tttcttctgc tatcaaaata acagactcgt gattttccaa acgagctttc 60

aaaaaagcct ctgccccttg caaatcggat gcctgtctat aaaattcccg atattggtta 120

aacagcggcg caatggcggc cgcatctgat gtctttgctt ggcgaatgtt catcttattt 180

cttcctccct ctcaataatt ttttcattct atcccttttc tgtaaagttt atttttcaga 240

atacttttat catcatgctt tgaaaaaata tcacgataat atccattgtt ctcacggaag 300

cacacgcagg tcatttgaac gaattttttc gacaggaatt tgccgggact caggagcatt 360

taacctaaaa aagcatgaca tttcagcata atgaacattt actcatgtct attttcgttc 420

ttttctgtat gaaaatagtt atttcgagtc tctacggaaa tagcgagaga tgatatacct 480

aaatagagat aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattac 540

aataaattca cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aattttttta aaaggagagg 600

gtaaaga 607

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 4

gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgagcgc gcaggcagct ggtaaa 96

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）

<400> 5

cggatttcct gaaggaaatc cgttttttta 30

<210> 6

<211> 359

<212> PRT

<213> 嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）

<400> 6

Asp Thr Asn Pro Cys Glu Lys His Ser Cys Ile Ala Val Ile Asp Ala

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Arg Leu His Ile Tyr Ser Tyr Asp Thr Asp Asn

20 25 30

Thr Asn Thr Pro Ile His Ile Glu Glu Ile Trp Asn Lys Lys Ile Lys

35 40 45

Pro Gly Phe Ala Ser Ile Gln Pro Asn Ser Val Thr Ile Asp Ala Tyr

50 55 60

Leu Thr Met Leu Leu Ala Asp Ala Pro Ile His Asn Ile Pro Val Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Gln Ser Gln Gln Lys

85 90 95

Lys Tyr Tyr Asp Glu Leu Glu Tyr Trp Phe Arg Gln Gln Ser Gln Trp

100 105 110

Gln Leu Val Glu Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Asp Glu Ala Leu Phe

115 120 125

Asp Trp Leu Ala Val Asn Tyr Lys Leu Asp Thr Leu Lys Ser Val Gln

130 135 140

Asn Lys Ser Val Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile

145 150 155 160

Val Phe Pro Met Pro Lys Asn Ala Glu Ile Ser Lys His Asn Gln Val

165 170 175

Glu Leu Asn Ile Tyr Gly Gln Asn Ile Asn Leu Tyr Val His Ser Phe

180 185 190

Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Met Ser His Gln Phe Leu Asn Ser Pro

195 200 205

Ser Cys Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Glu Ser Gly Gln

210 215 220

Gly Asn Ala Pro Ser Cys Lys Glu Glu Val Thr Ser Leu Met Asn Ser

225 230 235 240

Val His Lys Val Asn Gln Gln Ile Gln Pro Leu Leu Ala Leu Asn Pro

245 250 255

Val Asn Glu Trp Tyr Ser Ile Gly Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Ser

260 265 270

Gln Leu Phe His Phe Glu Asn Ser Glu Leu Thr Asn Gln Ser Leu Leu

275 280 285

Gln Gln Gly Asp Asn Gln Ile Cys His Gln Gln Trp Asp Ile Leu Asn

290 295 300

Gly Gln Tyr Pro Asp Asp Glu Tyr Leu Tyr Gln Tyr Cys Leu Leu Ser

305 310 315 320

Ser Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Val Asp Gly Tyr Gly Ile Asn Pro Asn

325 330 335

Gln Thr Ile His Tyr Ile Pro Pro Glu Gln Asn Leu Asp Trp Thr Ile

340 345 350

Gly Val Val Leu His Arg Ala

355

<210> 7

<211> 366

<212> PRT

<213> 军团菌属物种（Legionella sp.）

<400> 7

Ile Glu Gln Asp Pro Cys Gln Glu Lys Gln Cys Met Ile Val Val Asp

1 5 10 15

Ala Gly Ser Thr Gly Ser Arg Leu His Phe Tyr Thr Tyr Asp Thr Asp

20 25 30

Glu Thr Asn Ser Pro Ile Asn Ile Glu Glu Ile Trp Ser Lys Arg Ile

35 40 45

Lys Pro Gly Ile Ser His Val Glu Ala Asn Arg Ser Ser Ile Asp Ala

50 55 60

Tyr Leu Val Thr Leu Leu Ala Gly Thr Pro His Ser Asn His Val Pro

65 70 75 80

Val Tyr Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Ala Ala Lys

85 90 95

Gln Lys Leu Ile Tyr Gln Glu Ile Lys Phe Trp Phe Ala Gln Gln Asn

100 105 110

Gln Trp Arg Leu Met Asp Ala Lys Thr Ile Tyr Gly Ser Gln Glu Ala

115 120 125

Leu Tyr Asp Trp Leu Ala Val Asn His Gln Leu Gly Thr Leu Gln Ser

130 135 140

Val Gln Thr Lys Ser Val Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val

145 150 155 160

Gln Ile Val Phe Pro Val Gln Asn Asn Pro Asp Leu Lys Asn Asn Thr

165 170 175

Leu Ala Glu Phe Asn Leu Tyr Gly Gln His Ile Arg Leu Ala Val Arg

180 185 190

Ser Phe Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Met Ser His Gln Phe Leu Asn

195 200 205

Tyr Ala Pro Cys Phe Ala Asn Asn Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu

210 215 220

Gly Glu Gly Asp Ala Leu Ser Cys Val Glu Glu Val Ala Ser Leu Met

225 230 235 240

Asn Gly Val His Ser Val Asn Lys Glu Ile Gln Pro Leu Leu Ala Ala

245 250 255

Asn Pro Val Asn Ile Trp Tyr Ala Ile Gly Gly Leu Ser Phe Leu Ala

260 265 270

Asp Asn Ser Val Ile His Phe Asn Asn Tyr Gln Leu Thr Asn Glu Gln

275 280 285

Leu Leu Gln Gln Val Asp Ser Lys Ile Cys His Gln Glu Trp Asp Val

290 295 300

Leu Asp Glu Gln Phe Pro Asn Glu Glu Tyr Leu Tyr Gln Phe Cys Leu

305 310 315 320

Leu Ser Ala Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Val Glu Gly Tyr Gly Leu Leu

325 330 335

Pro Asn Glu Thr Ile Asn Tyr Leu Pro Ser Ser Gln Asn Leu Asp Trp

340 345 350

Thr Ile Gly Val Val Leu Tyr Pro Arg Leu Thr Val Leu Gln

355 360 365

<210> 8

<211> 360

<212> PRT

<213> 法氏军团菌（Legionella fallonii）

<400> 8

Glu Asn Ala Ser Cys Asp Lys His Gln Cys Ile Thr Val Ile Asp Ala

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Arg Val His Ile Tyr Ala Tyr Asp Leu Asp Glu

20 25 30

Thr Asn Thr Pro Thr Asn Ile Asn Glu Ile Trp Thr Lys Lys Ile Lys

35 40 45

Pro Gly Phe Ala Thr Ile Asp Pro Asn Tyr Asn Thr Ile Asp Ala Tyr

50 55 60

Leu Thr Ile Leu Leu Ser Gly Ala Pro Thr Gln Gln Gly Pro Val Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Ala Ser Lys Gln Lys

85 90 95

Leu Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Trp Phe Thr Gln Gln Thr Gln Trp

100 105 110

His Phe Val Glu Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Glu Glu Ala Leu Tyr

115 120 125

Asp Trp Leu Ser Val Asn Tyr His Leu Gly Thr Leu Lys Ser Val Gln

130 135 140

Asn Lys Ala Ile Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile

145 150 155 160

Val Phe Pro Ile Gln Lys Asn Glu Asn Ile His Gly Arg Ser Gln Val

165 170 175

Glu Leu Asn Ile Tyr Gly Gln Arg Ile Asn Leu Phe Val His Ser Phe

180 185 190

Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Met Ser His Gln Phe Leu Asn Ser Thr

195 200 205

Ser Cys Phe Thr Asn Asp Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Glu Met Gly Leu

210 215 220

Gly Asn Ala Leu Ser Cys Glu Gln Glu Val Ser Ser Leu Met Asn Ala

225 230 235 240

Val His Gly Val Ser Lys Thr Ile Gln Pro Val Leu Ala Ala Asn Ser

245 250 255

Val Asp Ser Trp Tyr Ala Ile Gly Gly Leu Thr Asn Leu Ala Asp Asn

260 265 270

Lys Leu Phe Asn Phe Val Asn Gly Gln Leu Thr Asn Gln Ser Leu Ile

275 280 285

Glu Gln Ala Asp Ser Gln Ile Cys His Gln Gln Trp Ser Lys Leu Asp

290 295 300

Ala Gln Tyr Pro Asn Asp Asp Tyr Ile Tyr Gly Tyr Cys Leu Phe Ser

305 310 315 320

Ser Tyr Phe Tyr Ala Leu Met Val Asp Gly Tyr Gly Ile Ser Pro Glu

325 330 335

Gln Thr Val Asn Tyr Ile Ser Pro Ser Ile Asn Leu Asp Trp Thr Lys

340 345 350

Gly Val Val Leu His His Leu Ser

355 360

<210> 9

<211> 388

<212> PRT

<213> 厦门加西利亚单胞菌（Gallaecimonas xiamenensis）

<400> 9

Ala Asp Lys Pro Ala Cys Arg Ala Val Phe Asp Ala Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr Arg Leu Phe Leu Tyr Val Gln Gln Glu Gly Gly Trp Gln Pro Trp

20 25 30

Pro Gly Ala Lys Leu Gly Ala Leu Ala Asp Pro Val Arg Gln His Gln

35 40 45

Gly Pro Lys Ala Met Ala Ala Leu Ala Ala Asp Leu Ala Asn Ser Leu

50 55 60

Glu Ala Leu Arg Gln Asp Gly Pro Thr Asn Ser Glu Gly Gln Pro Arg

65 70 75 80

Trp Gln Gly Phe Asp Trp Gln Gln Ala Cys Arg Leu Gln Ser Val Ser

85 90 95

Val Leu Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Ala Glu Gln Gln Asp Pro Val

100 105 110

Ala Ser Val Ala Leu Trp Gln Glu Val Gln Gln Ala Leu Ala Gly Leu

115 120 125

Leu Gly Pro Ala Val Ala Ile Asp Ala Arg Thr Leu Thr Gly Phe Glu

130 135 140

Glu Gly Phe Tyr Ala Trp Leu Ala Ala Arg Ala Arg Leu Gly Arg Ser

145 150 155 160

Asp Met Gly Ile Val Glu Met Gly Gly Ala Ser Ser Gln Val Ala Phe

165 170 175

Pro Cys Pro Ala Cys Asp Arg Ala Asp Asp Ala Val Gln Gln Val Arg

180 185 190

Leu Glu Gly Gln Thr Leu Asp Phe Tyr Ser Tyr Ser Phe Leu Gly Leu

195 200 205

Gly Gln Asp Glu Ala Pro Lys Val Leu Gly Val Pro His Ala Cys Arg

210 215 220

Tyr Gly Ala Gly Val Lys Asp Pro Asn Trp Gln Leu Gly Gln Cys Gln

225 230 235 240

Ala Gln Leu Pro Leu Thr Leu Gly Arg Ala Leu Lys Asp Pro Tyr Asn

245 250 255

Phe Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Arg Gln Val Pro Thr Glu Lys

260 265 270

Ala Gly Val Lys Asp Trp Leu Leu Thr Gly Ala Phe Gln Tyr Asn Thr

275 280 285

Pro Asp Gln Leu Asp Ser Cys Cys Leu Asn Gln Gly Gln Cys Tyr Gln

290 295 300

Pro Ser Thr Ala Cys Phe Arg Val Ala Tyr Leu Pro Leu Tyr Leu Asp

305 310 315 320

Ser Leu Gly Val Asp Pro His Ser Pro Asp Leu Asp Val Ser Trp Thr

325 330 335

Leu Gly Ala Val Leu Cys Arg Asn Glu Gln Cys Leu Ala Pro Ser Lys

340 345 350

Pro Pro Cys Arg Trp Arg Lys Ala Gly Cys Leu Ala Pro Ser Val Gly

355 360 365

Asp Gly Arg Pro Glu Gly Arg Pro Gly Gln Gln Pro Gly Gly Val Gln

370 375 380

His Arg Gln His

385

<210> 10

<211> 358

<212> PRT

<213> 卫生十字军团菌（Legionella santicrucis）

<400> 10

Glu Ser Ala Glu Cys Thr Glu His Gln Cys Met Ala Val Val Asp Ala

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Arg Ala His Ile Phe Ala Tyr Asp Leu Asp Glu

20 25 30

Thr Asn Thr Pro Ser Gln Ile His Glu Ile Trp Ser Lys Lys Ile Lys

35 40 45

Pro Gly Leu Ala Thr Ile Glu Ala Asn Gln Asp Thr Ile Asp Ala Tyr

50 55 60

Leu Thr Ile Leu Phe Ser Gly Ala Pro Lys Gln Asn Ile Pro Val Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Thr Gly Gly Met Arg Leu Ile Pro Gln Thr Lys Gln Lys

85 90 95

Leu Tyr Tyr Lys Glu Ile Gln Asn Trp Phe Asn Gln Gln Ser Ile Trp

100 105 110

Gln Leu Ile Glu Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Asp Glu Ala Leu Tyr

115 120 125

Asp Trp Leu Ala Val Asn Tyr His Ile Gly Thr Leu Lys Ser Ser Thr

130 135 140

Thr Glu Pro Ile Gly Val Met Asp Ile Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile

145 150 155 160

Ala Phe Pro Ile Pro Lys Asp Val Glu Thr Asn Lys Ser Ser Gln Val

165 170 175

Glu Leu Asp Leu Tyr Gly Lys His Leu Asn Leu Phe Val His Ser Phe

180 185 190

Leu Gly Leu Gly Gln Asn Glu Val Thr His Gln Leu Leu Asp Thr Asn

195 200 205

Ser Cys Phe Ser Glu Gly Tyr Pro Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Gln

210 215 220

Gly Asp Ala Val Ile Cys Gln Gln Glu Val Ser Ser Leu Ile Asn Arg

225 230 235 240

Val His Lys Val Gln Ser Glu Val Gln Pro Thr Leu Ala Thr Asn Arg

245 250 255

Ile Thr Met Trp Tyr Ala Ile Gly Gly Leu Thr Asn Leu Val Glu Ser

260 265 270

Glu Pro Phe Gln Phe Gln Asn Asn Gln Ile Thr Asn Gln Asp Leu Leu

275 280 285

Gln Gln Ala Asn Ser Leu Ile Cys His Gln Gln Trp Glu Gly Leu Ser

290 295 300

Thr Gln Phe Pro Asp Asn Glu Tyr Ile Glu Ser Phe Cys Leu Leu Pro

305 310 315 320

Ala Phe Tyr Tyr Ala Leu Met Ile Asp Gly Tyr Gly Ile Ser Val Thr

325 330 335

Gln Pro Val Lys Tyr Ile Ser Pro Arg Glu Asn Leu Asp Trp Thr Thr

340 345 350

Gly Val Val Leu His His

355

<210> 11

<211> 358

<212> PRT

<213> 考特拉军团菌（Legionella quateirensis）

<400> 11

Ala Asp Asn Pro Cys Thr Asn His Gln Cys Ile Ala Val Ile Asp Ala

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Arg Leu His Val Phe Ser Tyr Asp Val Asp Glu

20 25 30

Thr Arg Ser Pro Ile Asn Ile Asn Glu Ile Trp Asn Lys Lys Ile Lys

35 40 45

Pro Gly Phe Ala Thr Ile Glu Pro Asn Ser Asn Thr Ile Asp Ala Tyr

50 55 60

Leu Thr Thr Leu Leu Ser Gly Ala Pro Asn Gln Gln Ile Pro Val Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Val Ser Lys Gln Lys

85 90 95

Lys Tyr Tyr Asp Glu Leu Gln His Trp Phe Ser Gln Gln Ser Gln Trp

100 105 110

Gln Leu Val Glu Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Asp Glu Ala Leu Tyr

115 120 125

Asp Trp Leu Ser Val Asn Tyr His Leu Gly Thr Leu Gln Lys Ser Leu

130 135 140

Asn Gln Ser Val Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile

145 150 155 160

Val Phe Pro Ile Gln Lys Asn Ser Glu Leu Asn Thr Arg Ser Gln Val

165 170 175

Glu Leu Asp Leu Tyr Gly Gln His Tyr Thr Leu Tyr Val Gln Ser Phe

180 185 190

Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Val Ala His Gln Phe Leu Asn Ser Ala

195 200 205

Pro Cys Phe Ser Asn Asp Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Glu Ser Gly Gln

210 215 220

Gly Asn Ala Ser Ala Cys Glu Gln Glu Val Ser Arg Leu Met Thr Glu

225 230 235 240

Val His Lys Val Asn Asn Val Ile Gln Pro Leu Leu Ala Ala Asn Pro

245 250 255

Val Asp Ser Trp Tyr Ser Ile Gly Gly Ile Ser Asn Leu Ala Asp Ser

260 265 270

Ser Leu Phe His Phe Glu Asn Ser Lys Leu Thr Asn Gln Asn Leu Leu

275 280 285

Gln Gln Ala Asp Ser Gln Val Cys His Gln Gln Trp Asp Ser Leu Asn

290 295 300

Ser Gln Phe Pro Asp Asp Glu Tyr Val Tyr Gln Tyr Cys Leu Phe Ser

305 310 315 320

Ala Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Val Asp Gly Tyr Gly Ile Val Pro Asp

325 330 335

Gln Ser Ile Asn Tyr Ile Pro Pro Ala Gln Asn Leu Asp Trp Thr Met

340 345 350

Gly Val Val Leu His His

355

<210> 12

<211> 358

<212> PRT

<213> 南极军团菌（Legionella antarctica）

<400> 12

Gly Thr Val Ser Cys Asn Glu His Gln Cys Ile Ala Val Ile Asp Ala

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Arg Ile His Val Tyr Ala Tyr Asp Met Asp Glu

20 25 30

Thr Asn Thr Pro Val His Ile Asn Glu Val Trp Thr Lys Lys Ile Lys

35 40 45

Pro Gly Phe Ala Thr Ile Glu Pro Asn Tyr Glu Ser Ile Glu Ala Tyr

50 55 60

Leu Val Thr Leu Leu Ser Gly Ala Pro Asn Gln Asp Ile Pro Val Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Ala Ser Lys Gln Lys

85 90 95

Leu Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Trp Phe Ser Gln Gln His Gln Trp

100 105 110

Arg Leu Ile Asp Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Glu Glu Ala Leu Tyr

115 120 125

Asp Trp Leu Ser Val Asn Tyr His Leu Asp Thr Leu Lys Ser Ile Gln

130 135 140

Asn Lys Ser Val Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile

145 150 155 160

Val Phe Pro Ile Gln Lys Asn Glu Glu Ile Asn Ser Asn Ser Gln Val

165 170 175

Glu Leu Asp Leu Tyr Gly His His Val Asn Leu Tyr Val His Ser Phe

180 185 190

Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Met Ser His Gln Phe Leu Asn Ser Val

195 200 205

Ser Cys Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Glu Ser Gly Arg

210 215 220

Gly Asn Ala Pro Ser Cys Lys Gln Glu Val Ser Ser Leu Met Asn Gly

225 230 235 240

Val His Gly Val Asn Lys Thr Ile Gln Pro Val Leu Thr Ala Asn Pro

245 250 255

Val Asp Thr Trp Phe Ala Ile Gly Gly Leu Thr Asn Leu Ala Asp Asn

260 265 270

Lys Leu Phe His Phe Glu Asn Gly Glu Leu Thr Asn Gln Asn Leu Met

275 280 285

Gln Gln Ala Asp Ser Gln Ile Cys His Gln Gln Trp Asp Lys Leu Asn

290 295 300

Ser Glu Phe Pro Asn Asp Asp Tyr Val Tyr Glu Tyr Cys Leu Leu Ser

305 310 315 320

Ala Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Val Asp Gly Tyr Gly Ile Tyr Pro Glu

325 330 335

Gln Thr Val Asn Tyr Val Ser Ser Ala Leu Asn Leu Asp Trp Thr Lys

340 345 350

Gly Val Val Leu His His

355

<210> 13

<211> 360

<212> PRT

<213> 军团菌属物种（Legionella sp.）

<400> 13

Gln Ser Ser Pro Cys Glu Lys Gln Gln Cys Ile Ala Ile Val Asp Ala

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Arg Leu His Ile Tyr Ala Tyr Asp Leu Asp Val

20 25 30

Thr Lys Thr Pro Ile His Ile Lys Glu Leu Trp Asn Lys Lys Ile Thr

35 40 45

Pro Gly Phe Ala Arg Ile Glu Ala Asn Thr Asn Thr Ile Asp Ser Tyr

50 55 60

Leu Thr Ile Leu Leu Ala Asp Ser Pro Ile Lys Lys Ile Pro Ile Tyr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Gln Met Lys Gln Lys

85 90 95

Lys Tyr Tyr Asp Glu Leu Ser Ser Trp Phe Lys Lys His Ser Glu Trp

100 105 110

Gln Leu Val Glu Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Glu Glu Gly Leu Tyr

115 120 125

Asp Trp Leu Ser Val Asn Tyr His Leu Gly Asn Phe Glu Ser Pro Thr

130 135 140

Asn Lys Ser Ile Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile

145 150 155 160

Val Phe Pro Ile Ala Glu Thr Pro Thr Ile Asn Asp Lys Ser Gln Ile

165 170 175

Gln Val Asn Leu Tyr Gly Arg His Tyr Asn Leu Tyr Val His Ser Phe

180 185 190

Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Met Ser His Gln Phe Leu Asn Ser Ala

195 200 205

Ser Cys Phe Val Asn Asn Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Gln

210 215 220

Gly Asn Ala Leu Ser Cys Glu Gln Glu Val Ser Ser Leu Met Asn Gln

225 230 235 240

Val His Gly Val Asn Gln Leu Ile Gln Pro Leu Leu Ala Ala Asn Pro

245 250 255

Val Asp Ser Trp Tyr Ser Ile Gly Gly Ile Ser Asn Leu Ala Asp Ser

260 265 270

Gln Phe Phe Asn Phe Gln His Ser Gln Leu Thr Asn Gln Asp Leu Leu

275 280 285

Glu Gln Ala Asp Ser Gln Ile Cys His Gln Gln Trp Glu Asp Ile Asn

290 295 300

Asn Gln Tyr Pro Asp Asp Asp Tyr Val Tyr Gln Tyr Cys Leu Phe Ser

305 310 315 320

Ala Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Val Asp Gly Tyr Gly Leu Tyr Pro Glu

325 330 335

Gln Thr Ile Asn Tyr Leu Pro Pro Gln Gln Asn Ile Asp Trp Thr Thr

340 345 350

Gly Val Val Leu His Gln Gln Arg

355 360

<210> 14

<211> 380

<212> PRT

<213> 副冰栖菌属物种（Paraglaciecola sp.）

<400> 14

Gln Ser Lys Lys Pro Cys Tyr Ile Val Tyr Asp Ala Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr Arg Leu Tyr Ile Tyr Glu Gln Leu Gly Ala Asn Leu Ile Ser His

20 25 30

Glu Gly Pro Lys Val Ser Ala Leu Ala Asp Pro Ile Arg Tyr Thr His

35 40 45

Gly Lys Asp Leu Ser Asp Leu Asp Thr Ile Thr Asn Glu Val Ala Ser

50 55 60

Ala Leu Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Pro Leu Glu Glu Gly Lys Pro

65 70 75 80

Lys Trp Ser Gly Phe Asp Trp Ser Lys Gln Cys Glu Ala Gln Ser Val

85 90 95

Lys Val Phe Ala Thr Ala Gly Met Arg Ile Ala Glu Gln Ile Asn Pro

100 105 110

Ala Asp Ser Leu Val Leu Trp Gln Thr Leu Ala Ser Lys Ile Asn Ala

115 120 125

Lys Val Gly His Asn Ile Lys Val Glu Ala Arg Thr Leu Thr Gly Phe

130 135 140

Glu Glu Gly Leu Phe Ala Trp Leu Ser Val Lys Asp Val Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Gly His Tyr Gly Met Val Glu Met Gly Gly Ala Ser Ser Gln Ile Thr

165 170 175

Phe Pro Cys Pro Gln Cys Ser Leu Ala Asn Asp Ala Val Lys Thr Val

180 185 190

Thr Val Asp Gly Lys Pro Ile Gln Ile Tyr Ser Tyr Ser Tyr Leu Gly

195 200 205

Leu Gly Gln Asn Glu Ala Pro Tyr Ser Leu Pro Phe Gly Val Ala Gly

210 215 220

Gln Val Pro Lys Ser Cys Ser Tyr Gly Val Gly Ala Asn Asn Pro Asp

225 230 235 240

Trp Thr Ile Ala Ser Cys Ala Val Glu Ile Pro Ile Thr Ala Lys Gly

245 250 255

Ser Asn Thr Asp Ile Ile Asp Pro Tyr Asn Tyr Thr Lys Thr Gly Thr

260 265 270

Lys Gly Thr Thr Asn Thr Leu Pro Ala Ala His Lys Asn Ile Pro Lys

275 280 285

Trp Leu Leu Met Gly Ala Phe Asn Tyr Ala Lys Glu Thr Asp Ile Asp

290 295 300

Asp Phe Cys Phe Asn Gln His Asp Gly Tyr Tyr Asn Ala Phe Thr Ala

305 310 315 320

Cys Phe Asn Pro Ile Tyr Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Leu Asn Ile

325 330 335

Gln Ala Glu Gln Ser Ser Lys Val Asp Val Ser Trp Thr Gln Gly Ala

340 345 350

Val Ile Cys Gln Ile Glu Asn Cys Leu Ala Thr Ile Thr Pro Pro Pro

355 360 365

Val Cys Arg Trp Met Lys Ser Gly Cys Leu Ala Tyr

370 375 380

<210> 15

<211> 370

<212> PRT

<213> 贝日阿托菌属物种（Beggiatoa sp.）

<400> 15

Glu Thr Asn Gly Pro Ala Ala Cys His Ile Val Tyr Asp Ala Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Thr Arg Leu Tyr Ile Tyr Glu Gln Gln Asp Lys Ala Trp Leu

20 25 30

Glu His Glu Gly Pro Lys Val Ser Ala Leu Ala Asp Pro Val Arg Glu

35 40 45

Ile Arg Gly Lys His Trp Lys Asp Ala Glu Ser Val Thr Ile Glu Val

50 55 60

Val Ser Ala Leu Asp Ser Ile Lys Gln Asp Gly Pro Val Lys Gly Asp

65 70 75 80

Lys Pro Ala Trp Lys Ala Phe Asp Trp Thr Lys His Cys Gln Ile Lys

85 90 95

Ser Ala Gly Val Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Ala Glu Gln Ala

100 105 110

Asn Lys Glu Arg Ser Val Thr Leu Trp Ala Ser Leu Lys Gln Lys Leu

115 120 125

Ala Ala Lys Leu Gly Pro Thr Val Asp Ile Glu Ala Arg Thr Leu Thr

130 135 140

Gly Tyr Glu Glu Gly Leu Tyr Ala Trp Leu Ala Val Arg Glu Gln Gln

145 150 155 160

Pro Asp Asp Ser Phe Ala Ile Ala Glu Met Gly Gly Ala Ser Ala Gln

165 170 175

Ile Thr Phe Pro Cys Ala Lys Cys Asp Glu Asn Asp Pro Asp Thr Lys

180 185 190

Thr Val Gln Leu Ser Gly Lys His Leu Gln Ile Tyr Ser Tyr Ser Phe

195 200 205

Leu Gly Leu Gly Gln Asp Glu Ala Ser His Ser Leu Gly Phe Pro Thr

210 215 220

Ser Cys Ala Asn Gly Ile Gly Thr Gln Gln Ser Gly Trp Lys Ala Gln

225 230 235 240

Asp Cys Ala Asn Gln Ile Gln Leu Thr Gly Ser Lys Gly Ile Arg Asp

245 250 255

Pro Tyr Asp Phe Asp Gly Glu Gln Arg Gly Ala His Glu Gln Pro Pro

260 265 270

Ile Ala Gln Ala Asp Ser Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Ala Phe Asn

275 280 285

Tyr Met Asn Ala Ser Asn Ile Glu Thr Tyr Cys Leu Lys Asp Pro Lys

290 295 300

Leu Ser Glu Glu Glu Ser Phe Cys Phe Arg Ser Ile Tyr Pro Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Glu Thr Leu Lys Ile Pro Val Asn Ser Pro Lys Met Asn Val

325 330 335

Ser Trp Thr Gln Gly Ala Val Ile Cys Lys Ala Asn Ser Cys Leu Glu

340 345 350

Ala Ala Thr Lys Thr Pro Pro Leu Cys Arg Trp Leu Asp Lys Gly Cys

355 360 365

Leu Pro

370

<210> 16

<211> 385

<212> PRT

<213> β-变形菌（Betaproteobacteria bacterium）

<400> 16

Glu Asp Ala Ala Arg Tyr Leu Ala Val Ile Asp Ala Gly Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ser Arg Leu His Leu Tyr Glu Arg Thr Ala Ala Glu Arg Ser Val Ala

20 25 30

Val Lys Gln Leu Phe Glu Ala Lys Ala Gly Glu Ala Leu Ser Ser Phe

35 40 45

Glu Arg Ser Pro Gly Asp Ala Gly Pro Arg Gly Ile Gln Pro Leu Leu

50 55 60

Glu Gln Leu Leu Asp Arg Leu Ala Leu Leu Asn Ile Glu Arg Ser Ala

65 70 75 80

Val His Val His Val Leu Ala Thr Ala Gly Met Arg Arg Leu Asp Ala

85 90 95

Asp Asn Pro Ala Ala Ala Gln Val Ile Tyr Gln Ser Val Arg His Thr

100 105 110

Leu Ser Ser Ala Gly Val Thr Ala Arg Arg Ile Glu Thr Leu Ser Gly

115 120 125

His Leu Glu Gly Val Tyr Ala Trp Val Asp Val Asn Asp Leu Ser Gly

130 135 140

Ala Leu Ala Ser Thr Pro Ala Gly Ala Thr Val Ala Val Ile Glu Val

145 150 155 160

Gly Gly Ala Ser Ala Gln Leu Ala Tyr Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly

165 170 175

Ala Pro Val Thr Ala Val Arg Leu Asn Gly Arg Ser His Gln Val Val

180 185 190

Ser Leu Thr Trp Leu Gly Leu Gly Gln Asp Glu Ala Arg Arg Ala Met

195 200 205

Leu Asn Ala Ala Arg Ser Arg Ser Asn Ala Asp Glu Glu His Cys Tyr

210 215 220

Pro Asp Asn Arg Lys Ala Ala Gly Gly Leu Ser Ala Phe Asp Ala Asp

225 230 235 240

Gly Ser Arg His Leu Val Ala Arg Gly Arg Phe Ser Phe Glu Gln Cys

245 250 255

Ser Glu Met Tyr Asp Ala Val Ile Arg Pro Phe Asp Leu Pro Pro Leu

260 265 270

Ala Thr Ala Ile Arg Gln Ser Arg Arg Pro Leu Val Gly Leu Ala Ser

275 280 285

Val Tyr Phe Ser Leu Ala Asp Trp Gln Val Ile Gly Gln Pro Gly Thr

290 295 300

Leu Ala Ser Thr Leu Arg Gly Gln Cys Glu Gly Glu Asp Ala Tyr Gly

305 310 315 320

Asp Lys Val Ile Gly Phe Ile Arg Arg Asp Pro Lys Asn Arg Phe Ala

325 330 335

Gln Thr Ala Cys Ala Asn Gly Thr Phe Ile His Ala Leu Leu Phe Gly

340 345 350

Pro Ala Gly Leu Arg Val Asp Pro Ala Gln Val Ser Ala Val Ala Arg

355 360 365

Ile Asn Gly Gln Pro Pro Ser Trp Ala Arg Gly Phe Ala Leu Leu Gly

370 375 380

Arg

385

<210> 17

<211> 219

<212> PRT

<213> 产气克雷伯菌（Klebsiella aerogenes）

<400> 17

Lys Glu Asn Lys Gly Phe Leu Asn Ala Asp Thr Ser Pro Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ile Leu Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asn Ser Val Ala Phe Leu Gln

20 25 30

Asp Lys Ala Asp Tyr Glu Thr Gly Arg Val Leu Lys Asn Lys Glu Arg

35 40 45

Thr Glu Leu Ala Ala Lys Asp Ala Asn Tyr Lys Asn Phe Gly Gln Ala

50 55 60

Phe Ser Glu Ala Phe Gly Met Val Ile Ser Ala Glu Arg Thr Pro Val

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Leu Leu Ser Glu Val Leu Gln Asp Ser His Asp Tyr Ala

85 90 95

Met Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Val Arg Pro Phe Val Leu

100 105 110

Tyr Lys Asn Pro Thr Cys Thr Pro Glu Lys Asp Asp Lys Met Ala Lys

115 120 125

Thr Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Ala Ala

130 135 140

Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Ala Arg Glu Thr Glu Ile Leu Lys

145 150 155 160

Arg Gly Met Asp Phe Gly Glu Ser Arg Val Val Cys Gly Ala His Trp

165 170 175

Gln Ser Asp Val Asp Ser Gly Arg Ile Met Gly Ala Ala Val Val Ala

180 185 190

Ala Leu His Ala Asn Pro Arg Phe Ala Asn Thr Leu Ser Glu Ala Lys

195 200 205

Lys Glu Phe Ala Ala Leu Ser Ala Lys Ser Glu

210 215

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）

<400> 18

Ala Gln Thr Pro Gly Phe Leu Thr Pro Glu Thr Ala Pro Asp Ser Leu

1 5 10 15

Gln Ile Leu Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn Thr Thr Ala Phe Leu Asn

20 25 30

Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Thr Gly Lys Thr Leu Lys Asp Ala Gln Arg

35 40 45

Gln Ala Leu Ala Ala Ser Asp Ala Asp Tyr Lys Asn Ile Ser Ala Ala

50 55 60

Phe Ser Ala Ala Phe Gly Glu Glu Ile Ser Pro Glu Lys Thr Pro Ala

65 70 75 80

Leu Tyr Ala Leu Leu Gln Gly Val Leu Gln Asp Ser His Asp Tyr Ala

85 90 95

Met Arg Ala Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Val Arg Pro Phe Val Val

100 105 110

Tyr Lys Asp Ser Thr Cys Thr Pro Glu Lys Asp Lys Ser Met Ala Lys

115 120 125

Thr Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Thr Ala

130 135 140

Leu Val Leu Thr Glu Ile Asn Pro Ala Arg Glu Thr Glu Ile Leu Lys

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Asp Phe Gly Gln Ser Arg Val Val Cys Gly Ala His Trp

165 170 175

Gln Ser Asp Val Asp Asn Gly Arg Leu Met Gly Ala Ala Val Val Ala

180 185 190

Ala Leu His Gly Asn Gln Gly Phe Asn Asp Ala Leu Ala Lys Ala Lys

195 200 205

Ala Glu Phe Ala Lys Arg

210

<210> 19

<211> 221

<212> PRT

<213> 自养草螺菌（Herbaspirillum autotrophicum）

<400> 19

Lys Gly Ala Ala Gly Phe Leu Asn Gly Gln Thr Ala Pro Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ile Leu Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asp Ser Val Ala Phe Gln Ala

20 25 30

Asp Lys Ala Gln Tyr Glu Thr Gly His Val Leu Arg Asp Pro Glu Arg

35 40 45

Val Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala Asp Tyr Arg Asn Phe Gly His Ala

50 55 60

Phe Ser Ala Ala Phe Gly Met Glu Ile Ser Ala Thr His Thr Pro Val

65 70 75 80

Leu Tyr Gln Leu Leu Thr Glu Val Leu Gln Asp Ser His Asp Tyr Ala

85 90 95

Met Lys Ala Ala Lys Asn His Tyr Lys Arg Val Arg Pro Phe Val Val

100 105 110

Tyr Lys Asp Pro Thr Cys Thr Pro Gly Gln Asp Glu Lys Met Ala Leu

115 120 125

Ser Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Ala Ala

130 135 140

Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Thr Glu Ile Leu Gln

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Ala Phe Gly Lys Ser Arg Val Ile Cys Gly Ala His Trp

165 170 175

Gln Ser Asp Val Asp Asn Gly Gln Leu Met Gly Ala Ala Val Val Ala

180 185 190

Ala Leu His Ser Asn Ser Gln Phe Ala Ala Ala Leu Asn Ala Ala Lys

195 200 205

Asn Glu Phe Ala Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asn Lys Lys

210 215 220

<210> 20

<211> 219

<212> PRT

<213> 蜜蜂不动杆菌（Acinetobacter apis）

<400> 20

Ala Asp Ser Asn Asn Ser Phe Leu Gln Leu Asn Gln Val Pro Asp Ser

1 5 10 15

Leu Lys Ile Val Pro Ala Pro Pro Ala Phe Asn Ser Val Asp Phe Leu

20 25 30

Arg Asp Lys Ala Ala Tyr Asp Gln Ala Arg Ser Leu Val Gly Thr Ala

35 40 45

Arg Trp Gln Gln Ala Ala Val Asp Ala Asp Leu Ser Asp Ala Asn Ile

50 55 60

Gly Lys Ser Phe Ser Glu Ala Phe Gly Val Glu Ile Ser Pro Thr Asn

65 70 75 80

Thr Pro Val Thr Tyr Glu Ile Leu Arg Lys Leu Arg Thr Asp Ala Gly

85 90 95

Gly Tyr Ala Thr Lys Thr Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Met Arg Pro

100 105 110

Phe Val Phe Phe Asn Ser His Thr Cys Thr Pro Asn Asp Glu Ala Ser

115 120 125

Leu Ser Lys Asn Gly Ala Tyr Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp

130 135 140

Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Glu Ile Arg Pro Asp Arg Gln Asn Glu

145 150 155 160

Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly

165 170 175

Val His Trp Gln Ser Asp Val Asp Ala Gly Arg Ile Thr Gly Ser Ala

180 185 190

Ile Val Ala Arg Leu His Ala Asp Lys Asp Phe Ala Lys Thr Leu Glu

195 200 205

Asp Ala Lys Arg Glu Ile Gln Lys Lys Ile Lys

210 215

<210> 21

<211> 219

<212> PRT

<213> 布氏不动杆菌（Acinetobacter boissieri）

<400> 21

Leu Glu Gln Ser Asn Ser Phe Leu Gln Leu Ala Gln Val Pro Asp Ser

1 5 10 15

Leu Ala Ile Val Pro Ala Pro Pro Ala Tyr Asn Ser Val Asp Phe Leu

20 25 30

Arg Asp Lys Ala Ala Tyr Asp Gln Ala Lys Ser Leu Val Gly Thr Glu

35 40 45

Arg Trp Lys Val Ala Ala Glu Asp Ala Asp Leu Ser Asp Ala Asn Ile

50 55 60

Gly Lys Pro Phe Ser Gln Ala Leu Gly Ile Glu Ile Ser Pro Gln Asn

65 70 75 80

Thr Pro Ile Thr Tyr Glu Ile Leu Arg Lys Leu Arg Thr Asp Ala Gly

85 90 95

Asn Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Leu Arg Pro

100 105 110

Phe Met Phe Phe Asn Ser His Thr Cys Thr Pro Asn Asp Glu Ala Asn

115 120 125

Leu Ser Lys Asn Gly Ala Tyr Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp

130 135 140

Ser Ser Ala Leu Val Leu Ala Glu Ile Arg Pro Glu Arg Gln Asn Glu

145 150 155 160

Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Glu Tyr Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly

165 170 175

Val His Trp Gln Ser Asp Val Asp Ala Gly Arg Ile Thr Gly Ser Ala

180 185 190

Ile Val Ala Arg Leu His Ala Asp Lys Ala Phe Thr Lys Met Leu Glu

195 200 205

Glu Ala Lys Gln Glu Ile Gln Arg Lys Thr Lys

210 215

<210> 22

<211> 218

<212> PRT

<213> 布氏副伯克霍尔德氏菌（Paraburkholderia bonniea）

<400> 22

Ala Gly Ser Asp Gly Phe Leu Thr Ala Glu Thr Ala Pro Ser Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ile Leu Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn Thr Val Ala Phe Leu Asn

20 25 30

Asp Lys Ala Asn Tyr Glu Ile Gly Arg Ser Leu Lys Asn Asp Ala Arg

35 40 45

Val Ala Leu Ala Ala Ser Asp Ala Asn Cys Lys Asn Ile Asn Ala Ile

50 55 60

Phe Ser Ser Ala Phe Gly Arg Glu Ile Ser Glu Glu Lys Thr Pro Lys

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Leu Leu Leu Gly Val Leu Gln Asp Ser His Asp His Ala

85 90 95

Met Lys Ser Ala Lys Asn His Tyr Met Arg Val Arg Pro Phe Val Met

100 105 110

Tyr Gly Asp Lys Thr Cys Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Met Lys Asn

115 120 125

Thr Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Ala Ala

130 135 140

Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Arg Thr Thr Glu Ile Leu Arg

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Asp Phe Gly Gln Ser Arg Val Val Cys Gly Ala His Trp

165 170 175

Gln Ser Asp Val Asp Asn Gly Arg Leu Met Gly Ala Ala Val Val Ala

180 185 190

Asp Leu His Asn Asn Asp Lys Phe Ile Lys Ala Leu Glu Ala Ala Lys

195 200 205

Ala Glu Phe Lys Glu Asn Thr Pro Gly Asn

210 215

<210> 23

<211> 220

<212> PRT

<213> 泛菌属物种（Pantoea sp.）

<400> 23

Leu Gln Ser Ser Gly Phe Leu Thr Ala Glu Thr Ala Pro Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ile Leu Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asn Ser Val Thr Phe Gln Ser

20 25 30

Asp Lys Ala Gln Tyr Glu Ala Gly His Val Leu Arg Asn Val Ala Arg

35 40 45

Thr Glu Leu Ala Ser Lys Asp Ala Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Gln Ala

50 55 60

Phe Ser Ala Ala Phe Gly Met Glu Ile Ser Glu Ser His Thr Pro Val

65 70 75 80

Leu Tyr His Leu Leu Ser Glu Val Leu Gln Asp Ser His Asp Phe Ala

85 90 95

Met Arg Gly Ala Lys Asp His Tyr Lys Arg Val Arg Pro Phe Val Ile

100 105 110

Tyr Lys Asp Ser Thr Cys Thr Pro Asp Lys Asp Lys Ser Met Ser Thr

115 120 125

Thr Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Ala Ala

130 135 140

Leu Ile Leu Ala Glu Ile Asn Pro Ser Arg Glu Thr Glu Ile Ile Arg

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Asp Phe Gly Glu Ser Arg Val Val Cys Gly Ala His Trp

165 170 175

Gln Ser Asp Val Glu Asn Gly Arg Ile Met Gly Ala Thr Val Val Ala

180 185 190

Ser Leu His Ala Asn Ala Lys Phe Ala Glu Leu Leu Ser Gln Ala Lys

195 200 205

Asn Glu Phe Ala Thr Leu Ser Ala Gln Asp Ser Lys

210 215 220

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> 环境样品

<400> 24

Gly Glu Asn Ser Gly Phe Leu Ser Pro Glu Thr Ser Pro Asn Ser Leu

1 5 10 15

Glu Ile Leu Pro Pro Pro Pro Ser Glu Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn

20 25 30

Asp Lys Ala Asn Tyr Asp Ile Gly His Thr Leu Lys Asn Glu Gly Arg

35 40 45

Leu Ala Gln Ala Val Ser Asp Ala Asn Tyr Lys Asn Leu Thr Asp Ala

50 55 60

Phe Ser Lys Ala Phe Gly Glu Thr Ile Ser Glu Gln Asn Thr Pro Ala

65 70 75 80

Leu Tyr Ser Leu Leu Gln Asn Val Leu Gln Asp Ser His Asp Phe Ala

85 90 95

Met Arg Ala Ala Lys Asp His Tyr Lys Arg Val Arg Pro Phe Val Ile

100 105 110

Tyr Lys Asp His Thr Cys Thr Pro Ala Glu Asp Thr Lys Met Ala Lys

115 120 125

Thr Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Ala Ser Phe Gly Trp Ala Thr Ala

130 135 140

Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Ala Arg Glu Thr Glu Ile Leu Lys

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Glu Phe Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Ala His Trp

165 170 175

Gln Ser Asp Val Asp Ser Gly Arg Ile Met Gly Ala Ala Val Val Ala

180 185 190

Ser Leu His Asn Asn Ser Asp Phe Ile Ser Ala Leu Ala Lys Ala Lys

195 200 205

Glu Glu Phe Arg Lys Lys

210

<210> 25

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 25

gatacgaatc cgtgcgaaaa acattcttgc atcgcagtta tcgatgcagg ctctacaggc 60

tctcgcttac atatctatag ctatgataca gataatacga atacaccgat ccatatcgaa 120

gaaatttgga ataaaaaaat taaaccgggc tttgcaagca tccaacctaa tagcgttacg 180

atcgatgcat atctgacgat gctgctggca gatgcaccga tccataatat tccggtttat 240

ttttatgcaa cggcaggcat gagacttctt cctcaaagcc aacaaaaaaa atattatgat 300

gaacttgaat attggtttcg ccaacaatca caatggcaac ttgttgaagc aaaaacgatc 360

acgggaaatg atgaagcact gtttgattgg ttagcagtta attataaact ggatacgctt 420

aaaagcgttc aaaataaatc agttggagtt atggatatgg gcggcgcaag cgttcaaatt 480

gtttttccta tgcctaaaaa tgcagaaatc tctaaacata atcaagttga acttaatatc 540

tatggacaaa atattaatct gtatgttcat agctttctgg gcctgggcca aacggaaatg 600

tcacatcaat ttcttaattc tccgtcttgc tttgcaaatg attatccgct gccggatggc 660

gaaagcggcc aaggcaatgc accgagctgc aaagaagaag ttacgtcact tatgaatagc 720

gttcataaag ttaatcaaca aatccaacct ttactggcac tgaatccggt taatgaatgg 780

tatagcatcg gaggcatctc taatttagca agctcacaac tgtttcattt tgaaaattca 840

gaactgacga atcaaagcct gcttcaacaa ggagataatc aaatttgcca tcaacaatgg 900

gatattctga atggacaata tccggatgat gaatatctgt atcaatattg cctgctgtct 960

agctattatt atgcactgat ggttgatggc tatggcatta atcctaatca aacgattcat 1020

tatatcccgc cggaacaaaa tttagattgg acgatcggcg ttgttcttca tcgcgca 1077

<210> 26

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 26

atcgaacaag atccgtgcca agaaaaacaa tgcatgattg ttgttgatgc aggctctaca 60

ggaagccgcc ttcattttta tacgtatgat acagatgaaa cgaatagccc gatcaatatc 120

gaagaaatct ggtctaaacg cattaaaccg ggcatctcac atgttgaagc aaatcgcagc 180

tctatcgatg catatcttgt tacgctgctg gcaggaacac ctcatagcaa tcatgttccg 240

gtttattttt atgcaacggc aggcatgcgc ttactgccgg cagcaaaaca aaaactgatc 300

tatcaagaaa ttaaattttg gtttgcacaa caaaatcaat ggagacttat ggatgcaaaa 360

acgatctatg gctcacaaga agcactgtat gattggttag cagttaatca tcaactgggc 420

acgttacaaa gcgttcaaac gaaaagcgtt ggagttatgg atatgggagg cgcatcagtt 480

caaatcgttt ttccggttca aaataatccg gatcttaaaa ataatacatt agcagaattt 540

aatctgtatg gccaacatat tcgcctggca gttcgcagct ttcttggctt aggccaaacg 600

gaaatgtcac atcaatttct gaattatgca ccgtgctttg caaataatta tccgctgccg 660

gatggctttc tgggcgaagg agatgcactg tcttgcgttg aagaagttgc aagcctgatg 720

aatggagttc atagcgttaa taaagaaatc caacctctgc tggcagcaaa tcctgttaat 780

atttggtatg caatcggcgg actgagcttt cttgcagata attcagttat ccattttaat 840

aattatcaac ttacgaatga acaacttctt caacaagttg attctaaaat ctgccatcaa 900

gaatgggatg ttttagatga acaatttcct aatgaagaat atctgtatca attttgcctg 960

ctgagcgcat attattatgc actgatggtt gaaggctatg gacttcttcc taatgaaacg 1020

attaattatt taccgtctag ccaaaattta gattggacga tcggcgttgt tctgtatcct 1080

cgcctgacgg ttttacaa 1098

<210> 27

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 27

gaaaatgcaa gctgcgataa acatcaatgc attacagtta tcgatgcagg aagcacgggc 60

tctcgcgttc atatctatgc atatgattta gatgaaacga atacaccgac gaatattaat 120

gaaatttgga cgaaaaaaat taaaccgggc tttgcaacga tcgatccgaa ttataatacg 180

atcgatgcat atcttacgat cctgctgtca ggcgcaccta cacaacaagg accggtttat 240

ttttatgcaa cagcaggcat gagactgctt ccggcatcta aacaaaaact gtattatcaa 300

gaacttcaac gctggtttac acaacaaacg caatggcatt ttgttgaagc aaaaacgatc 360

acgggaaatg aagaagcact gtatgattgg ctgagcgtta attatcattt aggcacgctt 420

aaatcagttc aaaataaagc aatcggagtt atggatatgg gaggcgcaag cgttcaaatc 480

gtttttccta ttcaaaaaaa tgaaaatatc catggccgct ctcaagttga acttaatatc 540

tatggccaac gcattaatct gtttgttcat agctttctgg gcttaggcca aacagaaatg 600

tcacatcaat ttctaaattc tacgtcttgc tttacgaatg attatcctct tccggatgga 660

gaaatgggac tgggcaatgc actgtcttgc gaacaagaag ttagctcact tatgaatgca 720

gttcatggag tttctaaaac gatccaaccg gttcttgcag caaatagcgt tgatagctgg 780

tatgcaatcg gcggccttac gaatctggca gataataaac tgtttaattt tgttaatggc 840

caactgacga atcaaagcct gattgaacaa gcagatagcc aaatctgcca tcaacaatgg 900

tctaaacttg atgcacaata tcctaatgat gattatatct atggctattg cctgttttct 960

agctattttt atgcactgat ggttgatggc tatggaatct caccggaaca aacggttaat 1020

tatatcagcc cgagcattaa tttagattgg acgaaaggag ttgttcttca tcatctgagc 1080

<210> 28

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 28

gcagataaac cggcatgccg cgcagttttt gatgcaggct catcaggaac gagactgttt 60

ctgtatgttc aacaagaagg cggctggcaa ccgtggccgg gcgcaaaact gggcgcactt 120

gcagatccgg ttcgccaaca tcaaggacct aaagcaatgg cagcattagc agcagatctt 180

gcaaattctc ttgaagcact tcgccaagat ggacctacga atagcgaagg ccaacctcgc 240

tggcaaggct ttgattggca acaagcatgc cgcttacaat ctgttagcgt tcttgcaacg 300

gcaggaatga gacttgcaga acaacaagat ccggttgcat ctgttgcact gtggcaagaa 360

gttcaacaag cactggcagg attactgggc cctgcagttg caatcgatgc acgcacactg 420

acgggctttg aagaaggatt ttatgcatgg ttagcagcac gcgcacgcct tggacgctct 480

gatatgggaa tcgttgaaat gggcggagca tcatctcaag ttgcatttcc gtgccctgca 540

tgcgatcgcg cagatgatgc agttcaacaa gttagacttg aaggccaaac gctggatttt 600

tatagctata gctttctggg attaggacaa gatgaagcac cgaaagtttt aggcgttcct 660

catgcatgcc gctatggagc aggagttaaa gatcctaatt ggcaattagg acaatgccaa 720

gcacaacttc ctcttacgtt aggccgcgca cttaaagatc cgtataattt tcaaggccaa 780

ggccaaggcg ggtatcgcca agttccgacg gaaaaagcag gagttaaaga ttggttatta 840

acgggcgcat ttcaatataa tacacctgat caattagata gctgctgctt aaatcaaggc 900

caatgctatc aaccgtctac ggcatgcttt cgcgttgcat atttacctct gtatcttgat 960

agccttggag ttgatcctca ttctcctgat ttagatgttt catggacact gggagcagtt 1020

ctgtgccgca atgaacaatg cctggcaccg tctaaacctc cgtgccgctg gagaaaagca 1080

ggctgcctgg caccgagcgt tggcgatgga cgcccggaag gaagaccggg acaacaaccg 1140

ggcggcgttc aacatagaca acat 1164

<210> 29

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 29

gaaagcgcag aatgcacgga acatcaatgc atggcagttg ttgatgcagg ctctacaggc 60

tctcgcgcac atatctttgc atatgatctg gatgaaacga atacgccgag ccaaatccat 120

gaaatttggt ctaaaaaaat taaaccgggc ctggcaacga ttgaagcaaa tcaagatacg 180

atcgatgcat atctgacgat cctgtttagc ggagcaccta aacaaaatat tccggtttat 240

ttttatgcaa cgggaggaat gagactgatt cctcaaacga aacaaaaact gtattataaa 300

gaaatccaaa attggtttaa tcaacaatct atctggcaac tgattgaagc aaaaacgatc 360

acgggcaatg atgaagcact gtatgattgg ttagcagtta attatcatat cggcacgctt 420

aaaagctcta cgacagaacc tatcggcgtt atggatattg gaggcgcatc agttcaaatc 480

gcatttccta tccctaaaga tgttgaaacg aataaaagca gccaagttga acttgatctg 540

tatggaaaac atcttaatct gtttgttcat tcttttctgg gactgggcca aaatgaagtt 600

acacatcaac ttctggatac gaatagctgc ttttcagaag gctatccgct gccgggaggc 660

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gttcataaag ttcaatcaga agttcaaccg acgcttgcaa cgaatcgcat tacaatgtgg 780

tatgcaatcg gcggcctgac gaatttagtt gaaagcgaac cgtttcaatt tcaaaataat 840

caaattacga atcaagatct gctgcaacaa gcaaatagcc ttatttgcca tcaacaatgg 900

gaaggactgt ctacacaatt tccggataat gaatatatcg aatccttttg cttacttccg 960

gcattttatt atgcacttat gatcgatggc tatggcatta gcgttacaca accggttaaa 1020

tatatctcac ctagagaaaa tttagattgg acgacaggcg ttgttcttca tcat 1074

<210> 30

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 30

gcagataatc cgtgcacgaa tcatcaatgc atcgcagtta tcgatgcagg ctctacaggc 60

tctcgcttac atgtttttag ctatgatgtt gatgaaacgc gctcacctat taatattaat 120

gaaatctgga ataaaaaaat taaaccgggc tttgcaacga tcgaaccgaa tagcaatacg 180

atcgatgcat atctgacgac actgctgtca ggagcaccga atcaacaaat cccggtttat 240

ttttatgcaa cggcaggcat gcgcctgctg ccggtttcta aacaaaaaaa atattatgat 300

gaacttcaac attggtttag ccaacaaagc caatggcaac ttgttgaagc aaaaacgatt 360

acgggaaatg atgaagcact gtatgattgg ctgagcgtta attatcattt aggaacgtta 420

caaaaatctc tgaatcaaag cgttggagtt atggatatgg gcggcgcaag cgttcaaatc 480

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tatggacaac attatacgct gtatgttcaa tcttttctgg gccttggcca aacggaagtt 600

gcacatcaat ttcttaattc agcaccgtgc ttttctaatg attatcctct tccggatgga 660

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gttcataaag ttaataatgt tatccaacct ctgctggcag caaatccggt tgatagctgg 780

tatagcatcg gaggcatctc taatcttgca gatagctcac tgtttcattt tgaaaattct 840

aaactgacga atcaaaattt acttcaacaa gcagatagcc aagtttgcca tcaacaatgg 900

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<210> 31

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 31

ggcacagtta gctgcaatga acatcaatgc atcgcagtta tcgatgcagg ctctacgggc 60

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<210> 32

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 32

caaagctcac cgtgcgaaaa acaacaatgc atcgcaattg ttgatgcagg ctctacgggc 60

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tatcttcctc cgcaacaaaa tatcgattgg acgacaggcg ttgttcttca tcaacaacgc 1080

<210> 33

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 33

caatctaaaa aaccgtgcta tattgtttat gatgcaggct ctagcggaac gagactgtat 60

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gcagatccta ttcgctatac acatggcaaa gatctgtcag atttagatac gatcacgaat 180

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<210> 34

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 34

gaaacgaatg gccctgcagc atgccatatt gtttatgatg caggctctag cggcacgaga 60

ctgtatatct atgaacaaca agataaagca tggttagaac atgaaggacc taaagtttca 120

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tggtttctga cgggcgcatt taattatatg aatgcatcta atatcgaaac gtattgcctt 900

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<210> 35

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 35

gaagatgcag cacgctatct ggcagttatc gatgcaggct catcaggctc tcgcttacat 60

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gttcatgttc atgttctggc aacggcagga atgagacgcc ttgatgcaga taatcctgca 300

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gaacattgct atccggataa tagaaaagca gcaggcggac tgagcgcatt tgatgcagat 720

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cgccctcttg ttggattagc aagcgtttat tttagcctgg cagattggca agttatcgga 900

caaccgggaa cactggcatc tacactgaga ggccaatgcg aaggagaaga tgcatatggc 960

gataaagtta ttggatttat tcgccgcgat cctaaaaata gatttgcaca aacagcatgc 1020

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<210> 36

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 36

aaagaaaata aaggctttct taatgcagat acgagcccgg atagcctggc aatcttacct 60

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cgcgttctta aaaataaaga acgcacggaa ctggcagcaa aagatgcaaa ttataaaaat 180

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ctgtatttac tgctgtctga agttttacaa gattcacatg attatgcaat gcgctctgca 300

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<210> 37

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 37

gcacaaacac cgggctttct tacacctgaa acggcaccgg atagccttca aattcttcct 60

ccgcctcctg cagaaaatac gacggcattt ctgaatgata aagcagcata tgaaacaggc 120

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ctgtatgcat tacttcaagg agttttacaa gattcacatg attatgcaat gagagcagca 300

aaagatcatt atatgagagt tagaccgttt gttgtttata aagattctac gtgcacgccg 360

gaaaaagata aatctatggc aaaaacaggc tcatatccgt caggacatgc atcttttgga 420

tgggcaacgg cactggttct gacagaaatc aatccggcac gcgaaacgga aatccttaaa 480

cgcggctatg attttggaca atctcgcgtt gtttgcggcg cacattggca atctgatgtt 540

gataatggcc gcttaatggg cgcagcagtt gttgcagcac ttcatggaaa tcaaggcttt 600

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<210> 38

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 38

aaaggcgcag caggctttct taatggacaa acggcacctg attcactggc aatcttacct 60

cctccgcctg cagaagatag cgttgcattt caagcagata aagcacaata tgaaacaggc 120

catgttctga gagatccgga acgcgttgaa caagcacgcc aagatgcaga ttatcgcaat 180

tttggacatg catttagcgc agcatttgga atggaaatct ctgcaacaca tacaccggtt 240

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aaaaatcatt ataaacgcgt tagaccgttt gttgtttata aagatcctac gtgcacaccg 360

ggccaagatg aaaaaatggc actgtcagga tcatatccga gcggacatgc atcttttggc 420

tgggcagcag cattagttct ggcagaaatt aatccggcac gccaaacgga aatccttcaa 480

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gataatggac aactgatggg cgcagcagtt gttgcagcac ttcattctaa tagccaattt 600

gcagcagcac ttaatgcagc aaaaaatgaa tttgcaggac ttcgcgcaca agataataaa 660

aaa 663

<210> 39

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 39

gcagattcta ataatagctt tcttcaactg aatcaagttc ctgatagcct taaaattgtt 60

ccggcacctc cggcatttaa ttcagttgat tttcttcgcg ataaagcagc atatgatcaa 120

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acaccggtta cgtatgaaat ccttcgcaaa cttagaacgg atgcaggagg ctatgcaacg 300

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acgatcggct ggtcatcagc acttatcctg gcagaaatta gaccggatcg ccaaaatgaa 480

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aaagattttg caaaaacact ggaagatgca aaacgcgaaa tccaaaaaaa aattaaa 657

<210> 40

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 40

cttgaacaat ctaatagctt tcttcaactg gcacaagttc ctgatagcct ggcaattgtt 60

ccggcacctc cggcatataa ttcagttgat tttctgagag ataaagcagc atatgatcaa 120

gcaaaatcac tggttggaac agaacgctgg aaagttgcag cagaagatgc agatctgagc 180

gatgcaaata tcggaaaacc gtttagccaa gcattaggca tcgaaatctc acctcaaaat 240

acaccgatta cgtatgaaat cctgcgcaaa cttcgcacgg atgcaggcaa ttatgcaacg 300

aaagcagcaa aagaacatta tatgagactt agaccgttta tgttttttaa tagccatacg 360

tgcacaccta atgatgaagc aaatctgtct aaaaatggcg catatccgtc aggacatacg 420

acgatcggct ggtctagcgc actggttctt gcagaaattc gcccggaacg ccaaaatgaa 480

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aaagcattta cgaaaatgtt agaagaagca aaacaagaaa tccaacgcaa aacgaaa 657

<210> 41

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 41

gcaggctctg atggatttct tacggcagaa acggcaccga gctcactggc aattcttcct 60

ccgcctccgg cagaaaatac ggttgcattt ctgaatgata aagcaaatta tgaaatcgga 120

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<210> 42

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 42

cttcaaagct caggctttct tacggcagaa acagcaccgg atagcctggc aatccttcct 60

ccgcctccgg cagaaaatag cgttacgttt caatctgata aagcacaata tgaagcagga 120

catgttcttc gcaatgttgc acgcacggaa ctggcatcta aagatgcaga ttataaaaat 180

tttggacaag catttagcgc agcatttgga atggaaatta gcgaatcaca tacaccggtt 240

ctgtatcatc tgctgtctga agttttacaa gatagccatg attttgcaat gagaggcgca 300

aaagatcatt ataaacgcgt tagaccgttt gttatctata aagattcaac gtgcacacct 360

gataaagata aatctatgtc tacgacgggc tcatatccgt caggccatgc atcttttggc 420

tgggcagcag cacttatcct ggcagaaatt aatccgagcc gcgaaacgga aattattcgc 480

cgcggctatg attttggaga atctagagtt gtttgcggcg cacattggca aagcgatgtt 540

gaaaatggac gcatcatggg agcaacagtt gttgcatcac ttcatgcaaa tgcaaaattt 600

gcagaactgc tgtctcaagc aaaaaatgaa tttgcaacac tgagcgcaca agattctaaa 660

<210> 43

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的核苷酸序列

<400> 43

ggagaaaatt caggctttct gtcaccggaa acgtcaccta atagcctgga aatccttccg 60

cctcctccga gcgaaggctc tatcgcattt ctgaatgata aagcaaatta tgacatcgga 120

catacactta aaaatgaagg acgccttgca caagcagtta gcgatgcaaa ttataaaaat 180

cttacggatg cattttctaa agcatttgga gaaacgatct ctgaacaaaa tacacctgca 240

ctgtatagct tacttcaaaa tgttcttcaa gatagccatg attttgcaat gcgcgcagca 300

aaagatcatt ataaacgcgt tagaccgttt gttatctata aagatcatac gtgcacaccg 360

gcagaagata cgaaaatggc aaaaacgggc tcatatccgt caggccatgc ttcttttggc 420

tgggcaacag cactggttct gtctgaaatt aatccggcac gcgaaacaga aatccttaaa 480

cgcggatatg aatttggaca atctagagtt atctgcggcg cacattggca atcagatgtt 540

gattcaggcc gcatcatggg agcagcagtt gttgcatctt tacataataa tagcgatttt 600

attagcgcac tggcaaaagc aaaagaagaa tttcgcaaaa aa 642

<210> 44

<211> 388

<212> PRT

<213> 红树林加利西亚单胞菌（Gallaecimonas mangrovi）

<400> 44

Met Phe Lys Arg Ala Val Val Val Cys Cys Ala Phe Phe Ala Leu Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ser Ala His Ala Ala Lys Pro Ala Cys Gln Met Val Phe Asp

20 25 30

Ala Gly Ser Ser Gly Thr Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Thr Gly His

35 40 45

Gly Trp Arg Glu Phe Ala Gly Pro Thr Ser Pro Ala Leu Ala Asp Pro

50 55 60

Val Arg Gly Ile Asn Gly Gln Thr Ala Asp Asp Ile Pro Lys Val Ala

65 70 75 80

Lys Ala Leu Gly Asp Ser Ile Lys Ala Phe Arg His Asn Gly Pro Lys

85 90 95

Gly Lys Glu Gly Lys Pro Ala Trp His Gly Tyr Asp Trp Gln His Arg

100 105 110

Cys Ala Leu Lys Ser Val Ser Val Leu Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu

115 120 125

Ala Glu Gln Gln Gln Leu Gly Leu Ser Gln Val Leu Trp Met Ala Val

130 135 140

Arg Gln Gln Val Gln Phe Ala Val Gly Pro Lys Val Arg Val Lys Ala

145 150 155 160

Arg Thr Ile Ser Gly Phe Glu Glu Gly Leu Tyr Gly Trp Leu Ser Leu

165 170 175

Thr Lys Ala Lys Lys Thr Leu Asn Ile Gly Met Val Glu Met Gly Gly

180 185 190

Ala Ser Ser Gln Val Ala Phe Pro Cys Leu Tyr Cys Arg His Asp Asp

195 200 205

Asp Ala Ile Arg Gln Ile Gln Ile Asp Gly Lys Thr Leu Pro Phe Tyr

210 215 220

Ser Tyr Ser Phe Leu Gly Leu Gly Gln Asp Glu Ala Ala Lys Val Tyr

225 230 235 240

Lys Leu Pro Lys Arg Cys Gln Tyr Gly Ile Gly Ala Val Ile Pro Gly

245 250 255

Trp Ser Leu Glu Gln Cys Ser Glu Arg Leu Leu Leu Thr His Asp Gly

260 265 270

Glu Leu Lys Asp Pro Tyr Asn Leu Asn Asp Lys Gly Arg Val Gly Arg

275 280 285

Arg Arg Asp Val Pro Val Ala Leu Ala Gln Val Ser Gln Trp Tyr Leu

290 295 300

Thr Gly Ala Phe Asn Tyr Leu Glu Ser Asp Gln Val Gln Arg Cys Cys

305 310 315 320

Leu Thr Lys Gly Ala Cys Tyr His Pro Gln Thr Ala Cys Phe Arg Ala

325 330 335

Ala Tyr Leu Pro Lys Tyr Leu His Asp Leu Gln Ile Pro Ala Ser Ala

340 345 350

Lys Pro Ala Lys Ser Asn Trp Thr Glu Gly Ala Met Ile Cys Gln Ser

355 360 365

Gln His Cys Leu Ala Lys Ala Lys Pro Gln Gln Cys Arg Trp Ser Lys

370 375 380

Phe Gly Cys Leu

385

<210> 45

<211> 382

<212> PRT

<213> 食五环芳烃加利西亚单胞菌（Gallaecimonas pentaromativorans）

<400> 45

Met Arg Pro Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Ser Pro Leu

1 5 10 15

Leu Ala Lys Pro Ala Cys Gln Leu Met Phe Asp Ala Gly Ser Ser Gly

20 25 30

Thr Arg Leu Phe Leu Phe Gln Gln Lys Gly Gly Gln Leu Val Ser Gln

35 40 45

Arg Gly Pro Lys Ile Ala Ala Leu Ala Asp Pro Val Arg Gly Ile Arg

50 55 60

Gly Lys Thr Ala Glu Asp Ile Pro Ala Thr Ala Met Ala Leu Ala Lys

65 70 75 80

Ala Leu Glu Asp Phe Arg His Asp Gly Pro Ala Gly Glu Gly Gly Lys

85 90 95

Pro Arg Trp Arg Gly Phe Asp Trp Arg Glu Arg Cys Arg Leu Gln Ala

100 105 110

Val Ser Val Leu Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Ala Glu Gln Glu Ala

115 120 125

Pro Gly Leu Ser Gln Thr Leu Trp Leu Ala Val Arg Gln Gln Leu Gln

130 135 140

Leu Val Val Gly Pro Lys Val Gln Val Glu Ala Arg Thr Leu Ser Gly

145 150 155 160

Phe Glu Glu Gly Leu Tyr Ala Trp Leu Ala Arg Tyr Gln Lys Arg Gln

165 170 175

Arg Arg Asp Phe Gly Ile Val Glu Met Gly Gly Ala Ser Ser Gln Val

180 185 190

Ala Phe Pro Cys Pro Ala Cys Ser Leu Asp Asp Asp Ala Leu His Gln

195 200 205

Val Val Ile Gly Gly Lys Ala Val Pro Phe Tyr Ser Tyr Ser Phe Leu

210 215 220

Gly Leu Gly Gln Asp Leu Ala Pro Gly Tyr Leu Gly Leu Pro Asp Pro

225 230 235 240

Cys Arg Phe Gly Ala Gly Lys Gly Asn Pro Arg Trp Arg Leu Ser Gln

245 250 255

Cys Gln Ala Gln Leu Leu Leu Thr Gln Gly Pro Ala Ile Arg Asp Pro

260 265 270

Ala Asn Tyr Gln Gly Gly Ile Lys Gly Thr Glu Arg Gln Val Pro Val

275 280 285

Ala Lys Ala Gly Val Asp Lys Trp Tyr Leu Thr Gly Ala Phe Lys Tyr

290 295 300

Leu Glu Ala Asp Gln Val Ala Arg Cys Cys Gln Gly Ser Gly Gln Cys

305 310 315 320

Tyr Gln Pro Glu Thr Ala Cys Phe Arg Ala Ala Tyr Leu Pro Leu Leu

325 330 335

Leu Glu Lys Leu Gly Val Pro Ala Thr Ala Lys Val Lys Asp Ser Ser

340 345 350

Trp Thr Leu Gly Ala Ala Leu Cys Arg Gln Glu Asn Cys Leu Ala Lys

355 360 365

Ala Gly Val Leu Ala Cys Arg Trp Ser Lys Asn Gly Cys Leu

370 375 380

<210> 46

<211> 368

<212> PRT

<213> 嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）

<400> 46

Met Asp Thr Asn Pro Cys Glu Lys His Ser Cys Ile Ala Val Ile Asp

1 5 10 15

Ala Gly Ser Thr Gly Ser Arg Leu His Ile Tyr Ser Tyr Asp Thr Asp

20 25 30

Asp Thr Asn Thr Pro Ile His Ile Glu Glu Ile Trp Asn Lys Lys Ile

35 40 45

Lys Pro Gly Phe Ala Ser Ile Gln Pro Asn Ser Val Thr Ile Asp Ala

50 55 60

Tyr Leu Thr Met Leu Leu Ala Asp Ala Pro Ile His Asn Ile Pro Val

65 70 75 80

Tyr Phe Tyr Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Pro Gln Ser Gln Gln

85 90 95

Lys Lys Tyr Tyr Asp Glu Leu Asp Tyr Trp Phe Arg Gln Gln Ser Gln

100 105 110

Trp Gln Leu Val Glu Ala Lys Thr Ile Thr Gly Asn Asp Glu Ala Leu

115 120 125

Phe Asp Trp Leu Ala Val Asn Tyr Lys Leu Asp Thr Leu Lys Ser Val

130 135 140

Gln Asn Lys Ser Val Gly Val Met Asp Met Gly Gly Ala Ser Val Gln

145 150 155 160

Ile Val Phe Pro Met Pro Lys Asn Ala Glu Ile Ser Lys His Asn Gln

165 170 175

Val Glu Leu Asn Ile Tyr Gly Gln Asn Ile Asn Leu Tyr Val His Ser

180 185 190

Phe Leu Gly Leu Gly Gln Thr Glu Met Ser His Gln Phe Leu Asn Ser

195 200 205

Pro Ser Cys Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Glu Ser Gly

210 215 220

Gln Gly Asn Ala Pro Ser Cys Lys Glu Glu Val Thr Ser Leu Met Asn

225 230 235 240

Ser Val His Lys Val Asn Gln Gln Ile Gln Pro Leu Leu Ala Leu Asn

245 250 255

Pro Val Asn Glu Trp Tyr Ser Ile Gly Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser

260 265 270

Ser Gln Leu Phe His Phe Glu Asn Ser Glu Leu Thr Asn Gln Ser Leu

275 280 285

Leu Gln Gln Gly Asp Asn Gln Ile Cys His Gln Gln Trp Asp Ile Leu

290 295 300

Asn Gly Gln Tyr Pro Asp Asp Glu Tyr Leu Tyr Gln Tyr Cys Leu Leu

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Ala Leu Met Val Asp Gly Tyr Gly Ile Asn Pro

325 330 335

Asn Gln Thr Ile His Tyr Ile Pro Pro Glu Gln Asn Leu Asp Trp Thr

340 345 350

Ile Gly Val Val Leu His Arg Ala Leu Glu His His His His His His

355 360 365

<210> 47

<211> 249

<212> PRT

<213> 蟑螂西姆惠尔氏菌 (Shimwellia blattae)

<400> 47

Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser

1 5 10 15

Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro

20 25 30

Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu

35 40 45

Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60

Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys

65 70 75 80

Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95

Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala

100 105 110

Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125

Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

130 135 140

Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys

145 150 155 160

Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

165 170 175

Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

180 185 190

Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205

Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala

210 215 220

Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys

225 230 235 240

Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys

245

<210> 48

<211> 414

<212> PRT

<213> 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）

<400> 48

Met Phe Thr Lys Lys Ser Leu Val Thr Leu Leu Gly Gly Leu Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Ala Gln Thr Ser Ser Glu Gln Tyr Pro Ser Leu Ser Glu Ile

20 25 30

Glu Ala Ala Gln Ala Thr Val Leu Pro His Ser Pro Val Ser Asn Val

35 40 45

Lys Gly Leu Ala Phe Asp Arg Phe Val Asn Ile Trp Leu Glu Asn Thr

50 55 60

Asp Phe Asp Lys Ala Ala Ala Asp Ala His Met Ser Ala Leu Ala Lys

65 70 75 80

Lys Gly Leu Leu Leu Thr Asn Phe Trp Ala Val Thr His Pro Ser Glu

85 90 95

Pro Asn Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Asp Thr Phe Gly Met Asp Asn

100 105 110

Asp Asn Phe Asn Gln Val Pro Ala Asn Val Ser Thr Ile Ala Asp Leu

115 120 125

Phe Asp Thr Lys Asn Ile Ala Trp Gly Glu Tyr Gln Glu His Leu Pro

130 135 140

Tyr Pro Gly Tyr Gln Gly Phe Arg Tyr Pro Glu Ser Gly Pro Asn Asp

145 150 155 160

Tyr Val Arg Lys His Asn Pro Ala Ile Leu Phe Asp Ser Val Thr Gln

165 170 175

Asp Ala Thr Arg Leu Arg Gln Ile Lys Asn Phe Thr Ser Phe Tyr Asp

180 185 190

Asp Leu Lys Asn His Arg Leu Pro Gln His Met Phe Ile Thr Pro Asn

195 200 205

Met Thr Asn Asp Ala His Asp Thr Asn Ile Thr Phe Ala Ala Thr Trp

210 215 220

Ser Trp Asn Phe Leu Ser Glu Leu Leu Glu Asn Asp Tyr Phe Thr Lys

225 230 235 240

Asp Thr Leu Ile Leu Leu Thr Phe Asp Glu Asn Gly Thr Tyr Lys Leu

245 250 255

Gly Asn Lys Ile Tyr Ser Ile Leu Leu Gly Gly Ala Val Pro Lys His

260 265 270

Leu Ile Gly Lys Glu Asp Asn Thr Tyr Tyr Asn His Tyr Ser Val Ile

275 280 285

Ala Ser Leu Ser Ala Asn Trp Gly Leu Pro Ser Leu Gly Arg Trp Asp

290 295 300

Cys Gly Ala Asn Leu Leu Ser Phe Ile Ala Glu Lys Thr Gly Tyr Val

305 310 315 320

Asn Trp Glu Val Asp Thr Ser Asn Leu Tyr Leu Asn His Ser Tyr Pro

325 330 335

Gly Pro Leu Ser Thr Ser Ser His Thr Pro Asn Trp Pro Val Pro Leu

340 345 350

Thr Lys Gly Ser Cys Ser Ala Gly His Gly Ile Leu Lys Ala Val Arg

355 360 365

Lys Thr Tyr Lys Asp Met Ala Pro Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Pro Val

370 375 380

Pro Tyr Asp Ala Ala Ser Lys Thr Asn Val Gly Val Lys Tyr Thr Arg

385 390 395 400

Lys Leu Val Ser Leu Leu Asp Gln Ser Leu Thr His Glu Tyr

405 410

<210> 49

<211> 426

<212> PRT

<213> 智人

<400> 49

Met Ala Gly Leu Gly Phe Trp Gly His Pro Ala Gly Pro Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Val Leu Pro Pro Arg Ala Leu Pro Glu Gly Pro Leu

20 25 30

Val Phe Val Ala Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ala Pro Leu Ala

35 40 45

Ser Tyr Pro Met Asp Pro His Lys Glu Val Ala Ser Thr Leu Trp Pro

50 55 60

Arg Gly Leu Gly Gln Leu Thr Thr Glu Gly Val Arg Gln Gln Leu Glu

65 70 75 80

Leu Gly Arg Phe Leu Arg Ser Arg Tyr Glu Ala Phe Leu Ser Pro Glu

85 90 95

Tyr Arg Arg Glu Glu Val Tyr Ile Arg Ser Thr Asp Phe Asp Arg Thr

100 105 110

Leu Glu Ser Ala Gln Ala Asn Leu Ala Gly Leu Phe Pro Glu Ala Ala

115 120 125

Pro Gly Ser Pro Glu Ala Arg Trp Arg Pro Ile Pro Val His Thr Val

130 135 140

Pro Val Ala Glu Asp Lys Leu Leu Arg Phe Pro Met Arg Ser Cys Pro

145 150 155 160

Arg Tyr His Glu Leu Leu Arg Glu Ala Thr Glu Ala Ala Glu Tyr Gln

165 170 175

Glu Ala Leu Glu Gly Trp Thr Gly Phe Leu Ser Arg Leu Glu Asn Phe

180 185 190

Thr Gly Leu Ser Leu Val Gly Glu Pro Leu Arg Arg Ala Trp Lys Val

195 200 205

Leu Asp Thr Leu Met Cys Gln Gln Ala His Gly Leu Pro Leu Pro Ala

210 215 220

Trp Ala Ser Pro Asp Val Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ile Ser Ala Leu

225 230 235 240

Asp Ile Gly Ala His Val Gly Pro Pro Arg Ala Ala Glu Lys Ala Gln

245 250 255

Leu Thr Gly Gly Ile Leu Leu Asn Ala Ile Leu Ala Asn Phe Ser Arg

260 265 270

Val Gln Arg Leu Gly Leu Pro Leu Lys Met Val Met Tyr Ser Ala His

275 280 285

Asp Ser Thr Leu Leu Ala Leu Gln Gly Ala Leu Gly Leu Tyr Asp Gly

290 295 300

His Thr Pro Pro Tyr Ala Ala Cys Leu Gly Phe Glu Phe Arg Lys His

305 310 315 320

Leu Gly Asn Pro Ala Lys Asp Gly Gly Asn Val Thr Val Ser Leu Phe

325 330 335

Tyr Arg Asn Asp Ser Ala His Leu Pro Leu Pro Leu Ser Leu Pro Gly

340 345 350

Cys Pro Ala Pro Cys Pro Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Ala Pro

355 360 365

Ala Arg Pro Pro Ala His Gly Val Ser Cys His Gly Pro Tyr Glu Ala

370 375 380

Ala Ile Pro Pro Ala Pro Val Val Pro Leu Leu Ala Gly Ala Val Ala

385 390 395 400

Val Leu Val Ala Leu Ser Leu Gly Leu Gly Leu Leu Ala Trp Arg Pro

405 410 415

Gly Cys Leu Arg Ala Leu Gly Gly Pro Val

420 425

<210> 50

<211> 472

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 50

Met Thr Ala Lys Arg Gly Ile Gly Arg His Glu Ser Leu Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ile Gln Arg His Arg Gly Ile Ile Leu Val Ile Ser Val Pro Ile Val

20 25 30

Leu Ile Gly Leu Val Leu Leu Leu Met Pro Gly Arg Ser Ile Ser Asp

35 40 45

Ser Val Val Glu Glu Tyr Ser Val His Asn Arg Lys Gly Gly Pro Asn

50 55 60

Ser Arg Gly Pro Lys Asn Tyr Ala Val Ile Phe Asp Ala Gly Ser Ser

65 70 75 80

Gly Ser Arg Val His Val Tyr Cys Phe Asp Gln Asn Leu Asp Leu Ile

85 90 95

Pro Leu Gly Asn Glu Leu Glu Leu Phe Leu Gln Leu Lys Pro Gly Leu

100 105 110

Ser Ala Tyr Pro Thr Asp Pro Arg Gln Ala Ala Asn Ser Leu Val Ser

115 120 125

Leu Leu Asp Lys Ala Glu Ala Ser Val Pro Arg Glu Leu Arg Pro Lys

130 135 140

Thr His Val Arg Val Gly Val Thr Ala Gly Leu Arg Thr Leu Gly His

145 150 155 160

Asp Ala Ser Glu Asn Ile Leu Gln Ala Val Arg Glu Leu Leu Arg Asp

165 170 175

Arg Ser Met Leu Lys Thr Glu Ala Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Gly

180 185 190

Thr Gln Glu Gly Ser Tyr Gln Trp Val Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Arg

195 200 205

Asn Leu Gly Lys Pro Tyr Ser Asp Thr Val Gly Val Val Asp Leu Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Val Gln Met Ala Tyr Ala Ile Ser Glu Glu Asp Ala Ala

225 230 235 240

Ser Ala Pro Lys Pro Leu Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Val Arg Glu Met

245 250 255

Tyr Leu Lys Gly Arg Lys Tyr Phe Leu Tyr Val His Ser Tyr Leu His

260 265 270

Tyr Gly Leu Leu Ala Ala Arg Ala Glu Ile Leu Lys Val Ser Glu Asp

275 280 285

Ser Glu Asn Pro Cys Ile Val Ala Gly Tyr Asp Gly Thr Tyr Lys Tyr

290 295 300

Gly Gly Lys Glu Phe Lys Ala Pro Ala Ser Gln Ser Gly Ala Ser Leu

305 310 315 320

Asp Glu Cys Arg Arg Ile Thr Ile Asn Ala Leu Lys Val Asn Asp Thr

325 330 335

Leu Cys Thr His Met Lys Cys Thr Phe Gly Gly Val Trp Asn Gly Gly

340 345 350

Arg Gly Gly Gly Gln Lys Asn Met Phe Val Ala Ser Phe Phe Phe Asp

355 360 365

Arg Ala Ala Glu Ala Gly Phe Val Asp Pro Lys Gln Pro Val Ala Thr

370 375 380

Val Arg Pro Met Asp Phe Glu Lys Ala Ala Lys Lys Ala Cys Ser Met

385 390 395 400

Lys Leu Glu Glu Gly Lys Ser Thr Phe Pro Leu Val Glu Glu Glu Asn

405 410 415

Leu Pro Tyr Leu Cys Met Asp Leu Val Tyr Gln Tyr Thr Leu Leu Ile

420 425 430

Asp Gly Phe Gly Leu Glu Pro Ser Gln Thr Ile Thr Leu Val Lys Lys

435 440 445

Val Lys Tyr Gly Asp Gln Ala Val Glu Ala Ala Trp Pro Leu Gly Ser

450 455 460

Ala Ile Glu Ala Val Ser Ser Pro

465 470

Claims (28)

1.一种组合物，其包含a)水解核苷酸三磷酸的酶，其中所述酶至少在约pH 3.5至pH 7有活性；以及b)肠溶包衣。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述酶1)是GDA1_CD39超家族的成员；并且2)a)不是马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶；和/或b)不是哺乳动物NTPD酶。

3.如权利要求3所述的组合物，其中所述酶包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9(CRC22110)的氨基酸序列至少40％同一的多肽。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述酶是1)酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)，并且2)不是衍生自志贺氏菌属(Shigella)。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述酶包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：18(CRC21323)的氨基酸序列至少50％同一的多肽。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸三磷酸包含ATP。

7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸三磷酸包含ADP。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述酶至少在约pH 4至约pH 5对ATP具有峰值比活性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述酶在约pH 3.5至约pH 7以至少约500μmol/mg/min至约2700μmol/mg/min的比活性水解ATP。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述肠溶包衣用于1)口服施用；2)递送至肠黏膜；以及3)保护所述酶在小于约2.5的pH下免于降解。

11.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述肠溶包衣经配制用于直肠施用。

12.一种核酸，其编码如权利要求1-11中任一项所述的酶。

13.一种载体，其包含如权利要求12所述的核酸。

14.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求1-11中任一项所述的酶、如权利要求12所述的核酸和/或如权利要求13所述的载体。

15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。

16.如权利要求15或权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞、大肠杆菌(E.coli)细胞、耶氏酵母属(Yarrowia)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞或里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。

17.一种用于减少或预防有需要的受试者的以消化道炎症为特征的障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-11中任一项所述的组合物。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述障碍是选自由以下组成的组的胃肠(GI)道炎性疾病：炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎和坏死性小肠结肠炎。

19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述消化道由大肠组成。

20.一种用于促进一种或多种共生细菌向受试者的消化道中的植入的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-11中任一项所述的组合物以及一种或多种共生细菌的菌源。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述施用为口服施用。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述酶的所述施用为口服施用，并且所述一种或多种共生细菌的菌源的施用为直肠施用。

23.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有以消化道炎症为特征的障碍。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述障碍是选自由以下组成的组的胃肠(GI)道炎性疾病：炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎和坏死性小肠结肠炎。

25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述消化道由大肠组成。

26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种共生细菌的菌源包含益生菌。

27.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种共生细菌的菌源包含粪便微生物群移植物(FMT)。

28.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种共生细菌选自由以下组成的组：瘤胃联合乳杆菌(Ligilactobacillus ruminis)、人体普氏菌(Prevotellacopri)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。