CN117051014A - 一种燕子花抗寒基因myb97的克隆及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种燕子花抗寒基因MYB97及其应用，属于植物基因工程育种领域。本发明基于植物基因克隆技术从燕子花中分离、克隆出MYB97基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在此基础上构建酵母表达载体pGBKT7‑IlMYB97，经转录激活试验验证发现该蛋白具有转录激活活性，转录激活域位于蛋白的C端；构建过表达载体并利用叶盘转化法将上述基因导入烟草中，获得转基因植株，通过对低温处理和冷冻处理前后的表型分析，结果表明非转基因的植株的抗寒性明显低于转燕子花MYB97基因的植株，表明燕子花MYB97基因是潜在的抗寒育种基因。本发明提供的燕子花MYB97可以为耐寒育种基因资源开发利用提供参考，也为鸢尾属植物耐寒性研究提供理论基础。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种燕子花抗寒基因MYB97的克隆方法及其应用。
背景技术
鸢尾属植物燕子花花型奇特，花色典雅是著名的园艺观赏植物，多用来培育耐水湿、抗寒的园艺品系和品种。燕子花(Iris laevigata)作为北方园林绿化中重要的多年生花卉，不仅具有美丽的外型，还具有很强的耐寒性，可生存在中国最北端寒冷地区——漠河，对于东北地区园林植物应用具有重要价值，也是抗寒机理研究及抗寒基因挖掘珍贵的植物研究材料。
研究表明，MYB转录因子家族参与植物的生长发育及各种逆境胁迫应答，对于该家族的基因功能挖掘也在不断深入。在燕子花中发掘抗寒基因，可为抗寒育种研究及燕子花抗寒机理解析提供参考。目前，在筛选燕子花抗寒转录因子的过程中，获得一条可能与低温应答相关的R2R3型MYB转录因子MYB97，但缺乏对其抗寒功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种燕子花抗寒基因MYB97的克隆方法、载体构建及其应用。
本发明的目的之一在于提供一种燕子花MYB97基因及其编码的蛋白。该基因ORF区为1251bp，编码415个氨基酸，将燕子花MYB97基因序列登录至Gen Bank，登录号为OP484854。
本发明的目的之二在于提供上述燕子花MYB97基因的表达蛋白，蛋白分子量为45.68kDa。
本发明的目的之三在于获得含有燕子花MYB97基因的烟草转化植株。
本发明的目的之四在于提供上述燕子花MYB97基因在提高植物抗寒性中的应用。
本发明的目的将通过以下技术方案实现：
本发明所述的燕子花抗寒基因MYB97的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明所述的燕子花抗寒基因MYB97编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明含有所述的燕子花抗寒基因MYB97的重组表达载体或重组菌。
所使用的过表达载体为pCAMBIA1300-GFP载体，将上述基因序列插入到pCAMBIA1300-GFP载体的多克隆位点BamHⅠ和SalⅠ之间，改造得到相应的重组表达载体。
构建酵母表达载体pGBKT7-IlMYB97，经转录激活试验验证该蛋白具有转录激活活性，转录激活域位于蛋白的C端。
构建所述的燕子花抗寒基因MYB97的过表达载体，并将其通过稳定遗传转化的方式转化到模式植物中，应用于植物响应低温胁迫、冷冻胁迫过程中的调控作用，筛选获得抗寒性提高的植物。
所述模式植物为烟草。
本发明采用的是叶盘法侵染烟草，并获得转基因植株。
本发明对比转燕子花MYB97基因烟草与对照组在低温和冷冻胁迫下的耐冷性表型、根系生长情况，植株生长特性。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明基于植物基因克隆技术，从燕子花中分离、克隆出的抗寒基因MYB97，在此基础上构建了过表达载体并转化到模式植物烟草中，获得高表达的转基因植株，通过对低温处理和冷冻处理下对MYB97基因进行功能验证，发现非转MYB97基因的植株的抗寒性明显低于转MYB97基因的植株，结果表明具有转录激活活性的燕子花MYB97基因可提高植物抗寒性，MYB97基因是潜在的抗寒育种基因。
附图说明
图1是燕子花MYB97基因的克隆琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道M为DL2000 Marker，泳道1、2为IlMYB97基因克隆PCR结果。
图2是燕子花MYB97重组菌液PCR扩增片段电泳图，其中M为DL2000 Marker；泳道1-10为MYB97重组大肠杆菌。
图3是酵母转录激活检测，a：转化pGBKT7的酵母菌；b：转化pGBKT7-IlMYB97的酵母菌；c：转化pGBKT7-IlMYB97-N的酵母菌；d：转化pGBKT7-IlMYB97-C的酵母菌。
图4是转燕子花MYB97基因烟草的不同株系的表达量分析图，IlMYB97-1-IlMYB97-9是9株转基因烟草阳性苗。
图5转燕子花MYB97基因烟草种子冷冻处理生长情况图，对转MYB97基因烟草种子及对照经-20℃处理0h、48h、96h后，转基因烟草种子的萌发、生长情况优于野生型和空载。
图6是转燕子花MYB97基因烟草低温处理下的表型变化图，OE1、OE3、OE4是基因表达量较高的转基因烟草株系，在4℃胁迫下的转基因烟草植株的生长状态均强于对照。
图7是转燕子花MYB97基因烟草冷冻处理下的表型变化图，在-2℃胁迫下的转基因烟草植株的生长状态均强于对照。
图8是转燕子花MYB97基因烟草在冷冻处理后根系表型图，转基因烟草在4℃冷诱导下的根系构型与对照发生明显差异。
图9是转燕子花MYB97基因烟草表型变化图。
具体实施方式
通过以下详细说明可以对本发明进一步进行描述。所提供的实施例仅用以解释本发明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：燕子花MYB97基因克隆
采用OminiPlant RNA Kit(Dnase I)(康为世纪，中国)试剂盒提取燕子花总RNA，以提取的总RNA为模板，通过PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)(Takara，日本)试剂盒反转录为cDNA。
利用Primer 5设计燕子花MYB97基因克隆特异性引物，以上述得到的燕子花cDNA稀释10倍为模板，按照以下反应扩增出MYB97基因的ORF区，特异性引物序列如下：
IlMYB97-F1:5’-ATGTTACGTAACACAACACAC-3’
IlMYB97-R1:5’-ACACTGATGATGCAGATGGAC-3’
目的基因片段进行PCR克隆，50μL反应体系如下：
1μL模板cDNA，5μL dNTP(2mM)，5μL 10×PCR Buffer for KOD，3μL MgCl2(25mM)，上下游引物各2μL，1μL KOD-Plus-Neo(1U/μl)和31μL ddH2O。
加样操作在冰上进行，加样完成后混匀并使用2500rpm低速离心，按以下程序放置于PCR仪进行扩增反应：
95℃5min；95℃30s，56℃45s，72℃90s，循环35次；72℃10min。
经PCR反应得到扩增产物(图1)，用1％的琼脂糖凝胶电泳(140V，12min)检测，在凝胶成像系统中观察条带情况。
将跑完胶的胶块放置于紫外透射仪下，切下符合目的基因序列长度的条带，使用胶回收试剂盒(OMEGA)按照说明书回收纯化目的条带。
将4μL胶回收产物连接至1μL pEASY-Blunt Zero Cloning Vector(全式金)载体，将反应液轻柔吸打几次后使用PCR仪控温反应，条件为：30℃，10min。
将上述连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海唯地)，具体的操作步骤如下：
将大肠杆菌Trans1-T1感受态冰浴融化(处于冰水混合物状态时转化效率最高)；
感受态融化后，将5μL连接产物加入50μL感受态中，轻柔拨打离心管混匀，冰浴30min；
42℃水浴热激30s，立即置于冰浴2min；
加入提前37℃预热的LB液体培养基500μL，放入振荡培养箱中，37℃，200rpm振荡培养大肠杆菌1-1.5h；
5000rpm，1min离心菌液，弃掉上清液，保留100μL左右的浓缩菌液，涂布于含有100mg/L Amp的LB平板培养基，37℃倒置培养12-14h(倒置)。
当培养基上长出菌后，在LB固体平板上挑选阳性克隆10-20个单克隆菌株于30μLLB液体培养基的离心管中，37℃，200rpm，振荡培养1h；然后以振荡培养的菌液为模板，以pEASY-Blunt Zero Cloning Vector配套的通用引物M13F和M13R为检测引物，按照下列反应体系配制PCR反应液，验证插入目的基因大小。
20μL反应体系：包括2μL菌液模板，2μL ddH2O，上下游M13引物各0.5μL，5μL Es-Taq Master Mix。
PCR反应条件为：95℃10min；94℃30s，56℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10min。
PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，保留与目的条带长度一致的菌液，吸取200-500μL的菌液送去生物公司测序，得到测序结果后，使用DNAMAN软件将测序结果与原序列进行比对，并将剩余序列正确的菌液取300μL与等量的60％甘油混匀储存在-80℃冰箱备用，同时吸取200μL左右的菌液加入10ml的液体LB培养基过夜摇菌，增殖大肠杆菌单位体积数量，之后使用质粒提取试剂盒提取质粒备用。
质粒提取的具体操作步骤参照质粒提取试剂盒(TIANGEN，中国)说明书。
实施例2：燕子花MYB97基因的植物过表达载体的构建
利用同源重组的方法，将去掉终止密码子的燕子花MYB97基因ORF区构建到植物表达载体GV1300的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到重组植物表达载体GV1300-IlMYB97-GFP。载体构建使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(诺唯赞,中国)同源重组试剂盒，按照说明书进行，载体同源臂序列的特异性引物(下划线部分为BamH I和Sal I酶切位点)如下：
IlMYB97-BamHⅠ-F：5’-TTGATACATATGCCCGTCGACATGTTACGTAACACAACACAC-3’
IlMYB97-SalⅠ-R：5’-CCCTTGCTCACCATGGATCCACACTGATGATGCAGATGGAC-3’
将重组后的载体转大肠杆菌测序，涂板经Kana筛选后利用菌液PCR验证(图2)，引物为载体通用引物，将条带正确的菌液送至生物公司测序，测序结果与目标序列一致。
实施例3：燕子花MYB97基因酵母表达载体的构建及鉴定
同源重组构建pGBDT7-IlMYB97载体，将去掉终止密码子的燕子花MYB97基因ORF区构建到pGBDT7载体的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点之间。载体构建使用ClonExpress IIOne StepCloning Kit(诺唯赞,中国)同源重组试剂盒，按照说明书进行，载体同源臂序列的特异性引物(下划线部分为NdeⅠ和Sal I酶切位点)如下：
IlMYB97-NdeⅠ-F：5’-AGAGGAGGACCTGCATATGATGTTACGTAACACAACACAC-3’
IlMYB97-BamHⅠ-R：5’-CGCTGCAGGTCGACGGATCCACACTGATGATGCAGATGGAC-3’
IlMYB97-C-NdeⅠ-F：5’-AGAGGAGGACCTGCATATGCACCGCCCCCCGCC-3’
IlMYB97-N-BamHⅠ-R：5’-CGCTGCAGGTCGACGGATCCGCGCTGGAGGACGCC-3’
将pGBKT7、pGBKT7-IlMYB97载体质粒分别转化至Y2HGold酵母感受态中采用醋酸锂法转化酵母具体步骤如下：
取10μL鲑鱼精Carrier DNA10μg/μL冰上融化后，控温98℃，5min，冰浴5min，该过程重复两次；
取100μl Y2HGold感受态细胞冰浴融化，随后依次加入预冷的目的质粒2-5μg，处理后的Carrier DNA，PEG/LiAC 500μL并吹打混匀；
将混匀后的反应液30℃控温，时间为30min，每15min翻转离心管6-8次混匀；
30℃控温结束后立刻置于42℃控温，15min，每隔7.5min反转离心管6-8次混匀；
离心集菌，离心条件为5000rpm，40s，离心后弃上清液，使用ddH2O 400μL重悬菌体，然后再次离心30s，弃上清液；
在超净工作台中使用ddH2O 50μL重悬菌体，涂布于对应的缺陷培养基上，28℃倒置培养2-7d。
转录激活检测：将转化完成带有BK空载和BK-IlMYB97载体的酵母菌分别涂布于SD/-Trp/X-α-gal平板上，28℃倒置培养2-7d后观察酵母菌生长状况(图3)。
实施方案4：燕子花MYB97基因遗传转化烟草
通过冻转法将重组质粒GV1300-IlMYB97-GFP转入到根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，转化步骤参照说明书。
采用叶盘法将转化重组质粒GV1300-IlMYB97-GFP植物过表达载体的农杆菌遗传转化烟草，具体方法如下：
烟草无菌苗的获得：将野生烟草种子进行脱毒处理，使用75％的乙醇浸泡1min，无菌水冲洗3次，2％的NaClO浸泡10min，无菌水冲洗5次，再将其均匀点种在MS培养基上；
侵染液的制备：将带有重组质粒的农杆菌加入至50mL含有50mg/L Kana和30mg/LRif的液体YEP中，28℃，200rpm振荡培养，当菌液OD600值达到0.6-0.8左右时，4500rpm离心15min，弃上清液，用50mL的1/2MS液体培养基(PH5.7-5.8)悬浮菌体沉淀，即为侵染液；
叶片预培养：挑选健康的烟草叶片，切成1cm2大小的方形叶片，放置在预培养培养基中暗培养2-3d；
将预培养后的外植体放入侵染液中浸泡10分钟，期间不断摇晃锥形瓶，使菌液与外植体充分接触，结束后用无菌滤纸吸干表面多余液体，待叶片表面残留菌液基本晾干后放回预培养培养基上，28℃黑暗条件下，共培养2d；
共培养后将叶片换至含有30mg/L Hyg筛选培养基进行抗性芽筛选。待愈伤组织上长出不定芽时，将不定芽切下移至生根培养基中，诱导生根。
转基因阳性植株鉴定：待不定芽生根后，将幼苗移至土中，切下叶片提取DNA，方法参照植物DNA提取试剂盒，使用通用引物和目的基因克隆引物鉴定目的基因是否整合到烟草基因组中。收取阳性植株的种子为T0代，将T0代的种子放入到含有30mg/L Hyg的MS培养基中筛选T1代烟草，直至筛选至T2代(图3)。
高表达转基因烟草株系的筛选：选择T1代的转基因烟草，每个株系各取三株经DNA提取鉴定后的阳性苗为样品，然后提取RNA，合成cDNA，根据基因序列设计荧光定量引物，选择NtActin作为内参基因，使用2×Universal SYBR Green FAST Qpcr Mix试剂盒进行qRT-PCR，每个样品3个技术重复，所有操作在冰上进行，选取三个高表达株系OE1、OE3、OE4进行后续实验(图4)。qRT-PCR反应引物序列如下：
IlMYB97-qPCR-F：5’-ACGAGGACAACGGAGTGGAAC-3’
IlMYB97-qPCR-R：5’-AGTCCTGTTCCATCTGAGCGTC-3’
NtActin F：5’-ACCTCTATGGCAACATTGTGCTCAG-3’
NtActin R：5’-CTGGGAGCCAAAGCGGTGATT-3’
qRT-PCR反应体系为：10μL 2×Universal SYBR Green FAST Qpcr Mix，2μLcDNA，上下游引物各0.4μL，8μL ddH2O.
程序为两步法：95℃，3min(预变性)；95℃，5s(变性)；60℃，30s(退火)；其中变性，退火循环34次。
实施例5：T2代转基因烟草冷胁迫处理及表型观察
(1)转基因烟草种子冷冻的处理：将野生型(WT)、空载、OE1、OE3、OE4的烟草种子在4℃条件下春化2d后，在-20℃下进行冷冻胁迫，时间梯度为0h、48h、96h，将胁迫后的种子消毒处理后，种植于与1/2MS培养基上，观察生长情况(图5)。
(2)转基因烟草低温胁迫、冷冻胁迫处理：消毒后的烟草种子种于1/2MS培养基中，放置在植物组织培养室中培养3周后，移至花盆中(草炭土：蛭石3：1)培养，四周后放入低温气候箱中。低温处理：4℃处理0d、1d、3d、5d、7d，观察准基因烟草的生长状况(图6)；冷冻处理：4℃冷驯化1d，-2℃2h冷冻，冷冻恢复处理：将冷冻处理过后的烟草植株放入正常培养条件下恢复3d，观察准基因烟草的生长状况(图7)。
(3)转基因烟草幼苗根系观察：将转基因烟草小苗移入蛭石中，一周浇一次营养液，培养至植株高度为3cm左右的幼苗，从中选择长势一致的烟草植株进行4℃低温处理一周，再放置于正常光照下恢复生长一周后，观察植株根系生长情况(图8)。
(4)转基因烟草幼苗植株表型观察：为探究燕子花MYB97基因对烟草生长发育的影响，通过对转基因烟草地上部分植物体表型进行观察。发现野生型烟草与转基因烟草相比，株高更高，转基因烟草叶片倾斜向上，株型姿态更为挺拔，而野生型的叶片轻微下垂，燕子花MYB97基因可能影响了叶片的极性发育(图9)。
SEQ ID NO：1
>MYB97
SEQ ID NO：2
Claims (10)
1.一种燕子花抗寒基因MYB97，其特征在于，所述的MYB97基因的核苷酸序列如列表中SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的燕子花抗寒基因MYB97，其特征在于，该基因ORF区为1251bp。
3.权利要求1所述的燕子花抗寒基因MYB97的表达蛋白，其氨基酸序列如列表中SEQ IDNO.2所示。
4.含有权利要求1所述的燕子花抗寒基因MYB97的重组克隆载体、重组植物表达载体、重组酵母表达载体或重组生物工程菌。
5.根据权利要求4所述的与燕子花MYB97基因相关的生物材料，其特征在于：
所述的克隆载体为pEASY-Blunt Zero Cloning Vector(全式金)载体。
6.根据权利要求4所述的与燕子花MYB97基因相关的生物材料，其特征在于：
所述植物表达载体为GV1300。
7.根据权利要求4所述的与燕子花MYB97基因相关的生物材料，其特征在于：
所述酵母表达载体为pGBKT7。
8.根据权利要求4所述的与燕子花MYB97基因相关的生物材料，其特征在于：
所述生物工程菌为根癌农杆菌GV3101。
9.权利要求1所述的基因在提高植物抗寒性中的应用，其特征在于：
所述受体植物为烟草。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，构建所述燕子花MYB97基因的过表达载体，并将其通过稳定遗传转化的方式转化到受体植物中，得到转基因植物，应用于植物响应低温胁迫和冷冻胁迫过程中的调控作用，筛选获得抗寒性提高的植物。
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| GENBANK: "MYB97 transcription factor, partial [Iris laevigata]，GenBank: WGF83060.1", GENBANK, 23 April 2023 (2023-04-23) * |
| J YANG: "Comparative analysis of R2R3-MYB transcription factors in the flower of Iris laevigata identifies a novel gene regulating tobacco cold tolerance", PLANT BIOLOGY, vol. 24, no. 6, 2 July 2022 (2022-07-02) * |
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