CN117050940A - 一种制备自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备自然杀伤细胞的方法，所述方法包括在补充了CHIR 99021的StemScale PSC悬浮完全培养基中培养多能干细胞，以形成胚状体（EB）。本发明通过在适当的培养条件下对诱导的多能干细胞（iPSC）进行体外培养，低成本、高效率地提供了造血干细胞和前体细胞，并进一步诱导分化成NK细胞，制备得到的NK细胞具有较好的细胞扩增和较高的杀伤力。

Description

一种制备自然杀伤细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种制备自然杀伤细胞的方法，具体一种由多能干细胞诱导形成自然杀伤细胞的方法，还包括由此形成的NK细胞、以及所述自然杀伤细胞用于治疗或缓解治疗或病毒感染的用途。
背景技术
自然杀伤（NK）细胞是大的颗粒淋巴细胞，具有杀死受感染细胞和肿瘤细胞的内在能力，无需人类白细胞抗原（HLA）限制，也无需事先进行抗原致敏。在人类中，NK细胞通常表征为CD56+CD3-淋巴细胞，并且根据CD56和CD16表达水平可大致分为两个亚群：CD56brightCD16-细胞和CD56dimCD16+细胞，其中CD16表达与NK细胞的成熟状态有关。
NK细胞刺激和效应子功能取决于两种不同类型受体（激活受体和抑制受体）的信号的整合。正常健康细胞在其表面表达MHC I类分子，这些分子充当抑制性受体的配体并有助于NK细胞的自我耐受。然而，病毒感染的细胞或肿瘤细胞丧失了表面MHC I类表达，导致NK细胞中的抑制信号降低。同时，与病毒感染或肿瘤发展相关的细胞应激，如DNA损伤反应、衰老程序或肿瘤抑制基因，会上调这些细胞中的激活性受体的配体。因此，来自NK细胞中的激活性受体的信号直接通过NK细胞介导的细胞毒性或间接通过促炎细胞因子的分泌而将平衡偏向NK细胞激活和靶细胞消除。
一旦被激活，NK细胞会释放预先形成的含有颗粒酶和穿孔素的溶细胞颗粒，以裂解被感染的细胞或肿瘤细胞。NK细胞脱粒也通过由CD16介导的抗原依赖性细胞毒性（ADCC）发生。激活后，NK细胞还分泌多种细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和趋化因子（CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CXCL8）。这些细胞因子可以调节其他先天和适应性免疫细胞的功能。
来自外周血和脐带血的同种异体原代NK细胞（分别为PB-NK或UCB-NK）已被证明是安全有效的细胞疗法，没有明显的毒性如细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性或移植物抗宿主病（GVHD）。然而，用于这些试验的PB-NK细胞和UCB-NK细胞是异质性的细胞产品，因每个供体而异，这限制了它们开发标准化细胞免疫治疗产品的潜力。
人类胚胎干细胞（hESC）和诱导的多能干细胞（iPSC）是开发多种细胞谱系（包括NK细胞）的理想起始细胞类型。研究表明，hESC/iPSC衍生的NK细胞（iNK）表现出强大的抗肿瘤和抗病毒活性，为这些疾病的标准化细胞治疗提供了一种可能的方案。iNK细胞功能强大，对血液肿瘤和实体瘤具有广泛的细胞毒活性。iNK细胞是均一的、可重复和无限的来源，可用于多剂量治疗，能够消除供体间的差异性。此外，对hESC和iPSC进行基因工程操作以衍生出具有改善的抗肿瘤活性或体内持久性的iNK细胞是可行且一致的。iNK细胞代表了一种有前途的过继性NK细胞免疫疗法的新方法，并且iNK细胞可以作为现成的细胞疗法提供，或与针对抑制性检查点受体的抗体结合以增强抗肿瘤反应。
目前，提高iNK细胞成熟度、功能和体内持久性仍然是该领域面临的挑战。传统上认为NK是一种先天免疫介导细胞，但近期发现NK细胞能够在病毒感染、半抗原暴露或短暂的细胞因子激活（如IL-12、IL-15和IL-18）后获得记忆样（ML）特征。记忆样NK有较高的成熟度，在用细胞因子再刺激或再次暴露于癌细胞后增强了IFN-γ的产生，这与CD94、NKG2A、NKG2C18的表达相关。表达CD19 CAR的记忆样NK细胞显示出对NK抗性淋巴瘤细胞系和主要靶点的强效杀伤。具体而言，发现IL-12、IL-15和IL-18诱导的记忆样NK细胞在小鼠异种移植模型中表现出优异的体内持久性，并发挥更大的抗白血病反应。总之，这些数据表明IL-12、IL-15和IL-18提高了NK成熟度，这与改善的抗肿瘤功能有关。然而，先前的研究主要针对源自外周血的记忆样NK。由于外周血作为NK细胞来源受限，本领域中迫切需要一种新的能够规模化地大量制备成熟NK细胞的方法。
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种能够规模化大量制备成熟NK细胞的方法，并能够使得到的成熟NK有较好的细胞扩增和较高的杀伤力。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种制备自然杀伤细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞分化成胚状体；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为NK细胞；
d. 扩增步骤c制备得到的NK细胞，得到成熟NK细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
优选地，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
优选地，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
优选地，所述HSPC具有CD34+表型。
优选地，步骤d所述扩增包括：
将步骤c制备得到的NK细胞加入含有IL12、IL15和IL18的培养基中培养，得到成熟NK细胞。
优选地，所述IL12、IL15和IL18的浓度均为5-50ng/ml。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的NK细胞，所述NK细胞具有CD45+/CD56+表型。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的NK细胞和药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的NK细胞、所述NK细胞、或所述药物组合物在制备用于治疗或预防免疫相关疾病的制剂中的用途。
优选地，所述免疫相关疾病包括肿瘤、病毒感染、移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病或白血病中的一种或多种；其中，所述病毒感染包括人类免疫缺陷病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒中的一种或多种。
发明的效果
本发明通过在适当的培养条件下对诱导的多能干细胞（iPSC）进行体外培养，低成本、高效率地提供了造血干细胞和前体细胞，并进一步诱导分化成自然杀伤细胞，为免疫相关疾病的预防和治疗打下了坚实的基础。
本发明的NK细胞制备方法可以从诱导的多能干细胞大规模地制备成熟的NK细胞，根据本发明的方法制备得到的成熟NK细胞具有较好的细胞扩增和较高的杀伤力。
附图说明
图1是诱导的NK细胞（iNK细胞）分化和扩增的示意图。从人iPSC生成中胚层胚状体（EB），造血EB，随后分化成iNK细胞。iNK扩增通过使用常规方法（仅IL-2）及IL-12&IL-15&IL-18联合激活方法。iNK扩增以1:1的比例用K562-bmIL-21-41BBL扩增。
图2为使用iPSC生产HSPC的分化方案示意图，利用细胞因子和添加时间的变化从iPSC产生HSPC。
图3为iPSC向HSPC分化过程中的细胞形态变化。显示了造血干细胞和祖细胞（HSPC）通过胚胎体从诱导型多能干细胞（iPSC）分化的时间线，箭头表示悬浮液中CD34+造血干细胞的出现。
图4为HSPC标志物的流式细胞术分析。A为用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表。HSPC细胞在条件6的第8天被鉴定为（CD235a-CD14-CD43+CD34+）。B为用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表；HSPC细胞在条件#6的第10天被鉴定为（CD235a-CD14-CD43+CD34+）。
图5显示了iPSC培养阶段代表性明场图像。
图6为CHIR99021的添加时间1天vs 2天的比较结果。
图7显示了细胞稳定性实验结果。
图8中A为显示了iNK细胞扩增第9天，在低附着的96孔板中扩增的iNK细胞的代表性图像，IL-12&IL-15&IL-18联合激活方法显示出比常规方法更好的扩增，比例尺=500µm。B为显示了来自两个细胞系的iNK细胞数的倍数变化的定量，IL-12&IL-15&IL-18联合活化方法显示出比常规方法更高的倍数变化。C为显示了从两个细胞系扩增后iNK细胞活性的定量，结果表明，IL-12&IL-15&IL-18联合活化方法显示出比常规方法更高的活性。
图9显示了流式细胞术分析结果。A为流式细胞术定量分析表明了在扩增第9天的iNK的CD56表达量，与常规方法相比，IL-12&IL-15&IL-18联合激活方法显著增加了CD56+iNK细胞的比例。B为流式细胞术定量分析表明了在扩增第9天的iNK的CD16表达量，与常规方法相比，IL-12&IL-15&IL-18联合激活方法显著增加了CD16+ iNK细胞的比例。CD16是诱导ADCC的有效信号，可作为NK激活标志物，数据表明，CD16+ iNK可能有助于增强ADCC。C为CD56和CD3的代表性流式细胞术分析图。D为CD16和CD56的代表性流式细胞术分析图。
图10显示了针对K562或MOLM13的胱天蛋白酶-3/7细胞毒性测定。与常规方法相比，IL-12&IL-15&IL-18联合激活方法显示出相似的细胞毒性。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
如本文所用，术语“一个/一种（a）”或“一个/一种（an）”是指一个/一种或多个/一种，例如，“一个/一种分子”应当理解为代表一个/一种或多个/多种 分子。因此，术语“一个/一种（a）”或“一个/一种（an）”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。
在本发明的权利要求书和说明书中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另有要求，否则“包含/包括（comprise）”一词或诸如“包含/包括（comprises）”或“包含/包括（comprising）”等变体以包含的意义使用，即规定存在所述特征，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或添加其他特征。
如本文所用，术语“约”涵盖给定数值的±25％幅度的范围值。在其他实施方案中，术语“约”涵盖给定数值的±20％、±15％、±10％或±5％幅度的范围值。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7-3.3克（即3克±10％）等的值。
类似地，虽然产生NK细胞的方法包括有序的、连续的事件，但事件的时机可以改变例如至少25％。例如，虽然在一个实施方案中可以将具体步骤公开为持续一天，但该事件可以持续多于或少于一天。例如，“一天”可包括约18至约30小时的时间段。在其他实施方案中，时间段可以按该时间段的±20％、±15％、±10％或±5％变化。指示为多天的时间段可以是“一天”的倍数，例如两天可以跨越约36小时到约60小时的时间段等。在另一个实施方案中，可以减少时间变化，例如，第2天是从第0天开始的48±3小时；第4天是从第0天开始的96±3小时，第5天是从第0天开始的120小时±3小时。
如本文所用，术语“多能干细胞”或“PSC”是指这样的细胞，其能够无限复制自身并分化成形成组织或器官的一部分或三个胚层（内胚层、中胚层或外胚层）中的任何一个的所有细胞。多能干细胞有两种主要类型：胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”或“ESC”是指从已完成体外受精治疗并具 有剩余胚胎的患者经同意捐赠的5-7天胚胎中分离的细胞。从人类胚胎中提取细胞的伦理问题在一定程度上阻碍了ESC的使用。 合适的人类PSC包括H1和H9人类胚胎干细胞。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指衍生自成体细胞的ESC样细胞。iPSC具有与ESC非常相似的特征，但避免了与ESC相关的伦理问题，因为iPSC不是衍生自胚胎。相反，iPSC通常衍生自已经“重编程”回多能状态的完全分化的成体细胞。该重编程步骤通常涉及以特定时间间隔和以某些浓度使用重编程因子。将成体细胞重编程回多能状态的一些示例性方法涉及使用施用于成体细胞培养物的RNA、蛋白质或其他小分子。或者，人类iPSC系也可商业获得。
合适的人类iPSC包括但不限于衍生自成纤维细胞的iPSC 19-9-7T、 MIRJT6i-mND1-4和MIRJT7i-mND2-0以及衍生自骨髓单核细胞的iPSC BM119-9。其他合适的iPSC可以从美国威斯康星州麦迪逊的Cellular Dynamics International获得。
如本文所用，由iPSC定向分化获得的EB称为“iEB”或诱导EB细胞。
如本文所用，由iPSC定向分化获得的HSPC称为“iHSPC”或诱导HSPC细胞。
如本文所用，由iPSC定向分化获得的NK细胞称为“iNK”或诱导NK细胞。
如本文所用，术语“分化”是指细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型的过程，特别是较少特化类型的细胞变成更特化类型的细胞。
如本文所用，术语“培养基（medium）”或其复数“培养基（media）”是指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。
PSC向NK细胞的分化通常在受控条件下进行，特别是当生成的NK细胞旨在按照良好操作规范（GMP）施用于人类个体时。该过程的初始步骤涉及在例如组织培养板或培养皿上或生物反应器内培养培养中的PSC。鉴于能够在临床级别扩大NK细胞生产以进行过继转移，生物反应器的使用特别有吸引力。然而，利用组织培养板或培养皿的方案也可以被适当扩大，用于过继NK细胞转移。
将PSC培养在特定培养基中。合适的基础培养基包括但不限于Iscove改良的Dulbecco培养基（Iscove’s Modified Dulbecco's Medium）/F12（IMDM/F12）、不含FGF2和TGF-β的TeSR1基础培养基（mTeSR1TM基础培养基，Stem Cell Technologies）；DF4S基础培养基，即Essential 8TM培养基（Life Technologies；也称为“E8”培养基）。细胞培养基可以补充其他生长因子，以提高PSC的克隆效率和单细胞存活。可以使用的示例性补充剂是CloneR（Stem Cell Technologies）。一旦PSC达到所需的汇合度，就可以收集细胞并接种和平板接种以形成胚状体。
尽管本发明公开的培养基可包括特定成分（例如形态发生素、小分子和造血细胞因子），但预期除了或替代所公开的那些成分之外，还可以使用具有相同、等同或相似特性的其他成分，这在本领域中是已知的。
如本文所用，术语“胚状体”（EB）是指由PSC组成的漂浮的三维聚集体。EB包括造血型EB，它是能够形成内皮祖细胞和血液祖细胞的EB。本领域已知生成EB的各种方法。例如，传统方法通常涉及生成PSC的单细胞悬浮液。然后可以将PSC培养在未包被的非组织培养处理的培养皿或微孔中，以防止PSC附着，从而在保持悬浮的同时促进细胞聚集。或者，可以将PSC培养在低附着培养皿或微孔中。较新的形成EB的方法涉及使用自旋聚集或生物反应器，从而提高效率和过程控制。ROCK抑制剂，例如Y-27632，也已被证明可以促进PSC聚集，从而导致EB的形成。EB具有类似于发育中胚胎的畸胎瘤样结构，并且EB的形成是建立从三个胚层中的任何一层分化为细胞（例如NK细胞）的常用平台。
如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”（HSPC）是指定型为造血谱系，但能够进一步造血分化的细胞，且包含多潜能造血干细胞（血胚细胞）、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞是多潜能干细胞，其产生所有血细胞类型，包含骨髓（单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞）和淋巴谱系（T细胞、B细胞、NK细胞）。
在某些实施方式中，以约10,000个细胞/cm2至约40,000个细胞/cm2 的初始密度，例如10,000个细胞/cm2、15,000个细胞/cm2、20,000个细胞 /cm2、25,000个细胞/cm2、30,000个细胞/cm2、35,000个细胞/cm2或40,000个细胞/cm2，对PSC平板接种，以生成EB。
一旦EB形成，就将EB培养在包含NK分化因子的分化培养基中，以促进分化为NK细胞。使用的EB数量取决于所用的组织培养板、组织培养皿或生物反应器的类型。例如，如果使用6孔板，则可以对约10-30个EB平板接种。然而，本领域技术人员将理解，根据所使用的组织培养板、组织培养皿或生物反应器的表面积，确定待平板接种的EB的最佳数量的方法是本领域已知的。
在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养基可以是不含异种物质的，并且掺入从天然来源，例如从胎盘或其他人组织中分离的人蛋白质，或者可以使用重组技术产生的人蛋白质。
在某些实施方式中，本文所述的所有蛋白质都是人类的。
在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养 基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。
在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。
在某些实施方式中，本文所述的所有蛋白质都是人重组蛋白质。
在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是重组人蛋白质。
本文所述的所有蛋白质是本领域技术人员已知的，并且本文所述的大部分蛋白质（如果不是全部）都可商业获得。
本领域技术人员将理解，根据具体情况，可以以固定或变化的间隔更换细胞培养基。当细胞保持在培养中时，可能会生成有毒代谢物，培养的细胞会不断利用养分，其数量在扩增阶段稳步增加。因此，可以用新鲜的细胞培养基代替旧的细胞培养基。
在某些实施方式中，可以约每2天、约3天、约4天、约5天、约6 天、约7天、约8天、约9天或约10天更换分化培养基或扩增培养基。
一旦NK细胞群变得更加成熟，和/或足够数量的PSC已经分化为NK细胞，就需要更多的培养基更换，以补充不断增长和成熟的NK细胞群。在一些实施方案中，该时间段为约10-20天。在这个阶段之后，可以约每1天、约2天或约3天更换分化培养基或扩增培养基。
培养物中NK细胞的数量可以通过本领域已知的多种方法确定。例如，可以使用流式细胞术或显微术。如果使用流式细胞术，细胞样品可以用通常与NK细胞相关的标志物染色，例如CD3、CD56、CD45、CD94、 CD122、CD127、CD16、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。
在某些实施方式中，细胞培养基中特定细胞因子、趋化因子、蛋白质、信号因子和生长因子的补充在限定的时间间隔内发生，之后停止这些因子的补充。
在某些实施方式中，在约5-20天后停止补充细胞培养基中特定细胞因子、趋化因子、蛋白质、信号因子和生长因子。例如，可以在约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13 天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20后天停止补充特定因子。
在某些实施方式中，在定义的间隔后停止补充一种或多种以下因子：IL-3、SCF、IL-7、IL-15、FLT3L和IL-2。
一段时间后，具有特定纺锤状或细长形态的扩增、漂浮的NK细胞开始出现在培养物中。通常，在培养15-50天左右观察到具有纺锤状或细长形态的NK细胞。在某些实施方式中，在培养约15天、约20天、约25 天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天后观察到具有纺锤状或细长形态的NK细胞。
NK细胞标志物和功能特性的验证可以使用本领域已知的许多试验进行。通常与NK细胞相关的细胞表面标志物包括CD3、CD56、CD45、CD94、CD122、CD127、CD16、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。成熟的NK细胞通过颗粒胞吐作用和细胞毒性蛋白、细胞因子和趋化因子的释放起作用，以诱导靶向细胞死亡。NK细胞介导细胞死亡的示例性机制是通过与胱天蛋白酶酶促级联、凋亡信号传导和炎症信号传导的相互作用。因此，可以通过测量诸如Fas配体（FasL）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、TNF相关的凋亡诱导配体（TRAIL）或其他细胞因子和趋化因子等蛋白质的表达水平，来测量NK细胞的成熟度和功能特性，包括细胞毒性和肿瘤杀伤能力。此外，某些标志物的细胞表面表达也是NK细胞归巢特性改善的标志。NK细胞功能特性的变化可以通过某些标志物或蛋白质表达水平的增加或降低来指示。此外，NK细胞功能特性的变化可以通过某些标志物或蛋白质的增加以及其他标志物或蛋白质的伴随降低来指示。
测定通过本发明的方法产生的NK细胞的细胞毒性的合适方法是，共培养NK细胞和作为靶细胞的肿瘤细胞系，例如K562、LN-18、U937、 WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1或U266肿瘤细胞等。然后可以例如用对肿瘤细胞特异的荧光标记标记肿瘤细胞。然后可以基于荧光标记表达的减少来评估共培养过程中的细胞毒性，这将指示肿瘤细胞凋亡或细胞死亡。适合给肿瘤细胞加标签的标记的实例包括羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）、mCherry或本领域已知的任何其他合适的荧光标记。或者，可以使用流式细胞术，例如通过Annexin-V（膜联蛋白V）或任何其他可固定的活力染料染色，进一步分析细胞凋亡和死细胞群。通常以特定的效应物:靶标比率进行NK细胞和肿瘤细胞的共培养。在某些实施方式中，该比率为约1:1至10:1。在某些实施方式中，该比率为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。用于测定ADCC的方法和试验也是本领域已知的，例如将NK细胞与靶细胞和合适的效应抗体例如NKp46一起孵育。ADCC试验及其试剂盒和试剂也可商业获得，例如Promega ADCC Bioassay。
如本文所用，术语“药物组合物”是指已配制成用于施用于个体的包含本文所述NK细胞或NK细胞群的组合物。优选地，所述药物组合物是无菌的。在某些实施方式中，所述药物组合物是无热原的。
NK细胞或NK细胞群将以符合良好医疗实践的方式配制、按剂量给药和施用。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的具体疾病的类型、正在治疗的具体个体、个体的临床状况、给药部位、给药方法、给药时间安排、可能的副作用和为医师所知的其他因素。其他考虑因素包括在体内使NK细胞的细胞毒性和持久性最大化。待施用的NK细胞或NK细胞群的治疗有效量将由这些考虑因素决定。
可以通过任何合适的方法将NK细胞或NK细胞群施用于个体，包括静脉内（IV）注射和皮下注射。也可以将NK细胞与诸如抗体等另外的治疗剂或旨在在体内增强先天NK细胞特性或NK细胞活性的修饰剂一起施用。也可以在将NK细胞施用于个体之前用修饰剂预处理或引发NK细胞，以在体内增强先天NK细胞特性或NK细胞活性。合适的引发剂或修饰剂的实例是IL-2或IL-15。还设想了其他合适的蛋白质构建体、激动剂、拮抗剂、调节剂或炎症因子。
NK细胞由于在诱发ADCC方面的效应物特性也可用于抗体癌症疗法，抗体癌症疗法利用诸如单克隆抗体等抗体靶向肿瘤细胞。实际上，NK细胞能够通过细胞毒性颗粒胞吐作用、TNF死亡受体信号传导和诸如干扰素-γ等细胞因子的释放来介导抗体依赖性肿瘤杀伤。
如本文所用，术语“有效量”是指NK细胞或NK细胞群有效治疗个体的疾病状况、疾病或病症的量。
如本文所用，术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”是指治疗性治疗和防预性（prophylactic）或预防性（preventative）措施，其中目的是预防或改善个体的疾病状况、疾病或病症，或减缓（减轻）个体的疾病状况、疾病或病症的进展。需要治疗的个体包括已经患有疾病状况、疾病或病症的个体以及待预防疾病状况、疾病或病症的个体。
如本文所用，术语“预防（prevent）”、“预防（preventation）”、“预防性（preventative）”或“防预性”是指防止疾病状况、疾病或病症的发生，或阻止、防御或抵挡住其发生，包括异常或症状。需要预防的对象可能易于发展所述疾病状况、疾病或病症。
如本文所用，术语“改善（ameliorate）”或“改善（amelioration）”是指包括异常或症状在内的疾病状况、疾病或病症的减少、减轻或消除。需要治疗的个体可能已经患有所述疾病状况、疾病或病症，或者可能易于患有所述疾病状况、疾病或病症，或者可能是待预防所述疾病状况、疾病或病症。
如本文所用，术语“个体”是指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物，特别是人类，或者可以是家畜、动物园动物或伴侣动物。尽管特别考虑本文公开的方法及其所得NK细胞或NK细胞群适合人类的医学治疗，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗诸如马、牛和羊等家畜，诸如狗和猫等伴侣动物，或诸如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物等动物园动物。
除非另有说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另有说明，本发明所述的室温为20℃～30℃。除非另有说明，本发明所使用的各种材料和试剂，可以使用本领域常规的方法获得，也可以通过商业渠道获得，具体如下所示：
StemScale PSC悬浮培养基：ThermoFisher, #A4965001
Y27632: Tocris，#1254
CHIR99021：Sigma，SML1046
Stemline II造血干细胞培养基：Sigma，# S0192
CTS™ NK-Xpander™培养基：ThermoFisher，# A5019001
青霉素-链霉素（P/S）：ThermoFisher，#15140122
GlutaMAX补充剂：ThermoFisher, #35050061
L-抗坏血酸：Sigma-Aldrich, #A4544
ITS-G：ThermoFisher，#41400045
BMP4：Miltenyi Biotec，# 130-111-167
FGF2：Miltenyi Biotec，# 130-093-564
VEGF：Miltenyi Biotec，# 130-109-396
SB431542：Tocris，#1614 / TB1614-GMP
SCF：Miltenyi Biotec，#130-096-695
DMEM/F-12 GlutaMAX：ThermoFisher，#10565018
F12 + GlutaMAX：ThermoFisher，#31765-035
热灭活人Ab血清：Sigma，#H3667
L-谷氨酰胺：ThermoFisher，#25030081
B-巯基乙醇：ThermoFisher，#21985023
亚硒酸钠：Sigma，#214485
乙醇胺：MP，#193845
IL-3：Miltenyi Biotec，#130-095-070
IL-7：Miltenyi Biotec，#130-095-362
IL-2：Miltenyi Biotec，#130-097-748
IL-15：Miltenyi Biotec，#130-095-764
IL-18：MBL，# B001-5
IL-12：Miltenyi Biotec，#130-096-705
FLT3L：Miltenyi Biotec，#130-096-477
DPBS：ThermoFisher，#14190-144
Accutase：Stem Cell Technologies，#07922
CellTraceTM Violet：Thermo-Fisher Scientific，#C34557
CellEvent®Caspase-3/7 Green检测试剂：Thermal Fisher Scientific，#C10423
本发明提供了一种制备自然杀伤（NK）细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为NK细胞；
d. 扩增步骤c制备得到的NK细胞，得到成熟NK细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
在某些实施方式中，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
在某些实施方式中，所述方法在制备的过程中无需滋养层。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述培养基选自StemScale PSC、Essential 8、KSR/FGF2、mTeSR、AKIT或B8中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述培养基为StemScale PSC。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.1-100µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.2-50µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.5-25µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为1-20µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为约约1 μM、约2 μM、约3 μM、约4 μM、约5 μM、约6 μM、约7 μM、约8 μM、约9 μM、约10 μM、约11 μM、约12 μM、约13 μM、约14 μM、约15 μM、约16 μM、约17 μM、约18 μM、约19 μM或约20 μM。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基含有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/mL BMP4、1-100 ng/mL FGF2和1-100 ng/mL VEGF。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中BMP4的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸和ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基含有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 μg/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/mL BMP4、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL FGF2、1-100 ng/mL VEGF和1-20 μM SB431542。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中BMP4的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中SB431542的浓度为约1 μM、约2 μM、约3 μM、约4 μM、约5 μM、约6 μM、约7 μM、约8 μM、约9 μM、约10 μM、约11 μM、约12 μM、约13μM、约14 μM、约15 μM、约16 μM、约17 μM、约18 μM、约19 μM或约20 μM。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基含有1% P/S、2mM GlutaMaX、50 μg/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL FGF2和1-100 ng/mL VEGF。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
在某些实施方式中，所述EB为iEB。
在某些实施方式中，所述HSPC为iHSPC。
在某些实施方式中，所述NK细胞为iNK细胞。
在某些实施方式中，所述HSPC具有CD34+表型。在某些实施方式中，所述步骤c包括：
（c1）将步骤b中形成的HSPC加入第一培养基中进行细胞培养；
（c2）将步骤（c1）培养得到的细胞加入第二培养基中进行细胞培养，得到NK细胞。
在某些实施方式中，所述第一培养基含有热灭活人AB血清、集落刺激因子、白细胞介素，其中所述集落刺激因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、multi-CSF（IL-3）、EPO、TPO、SCF和FLT3L中的一种或多种，所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-27中的一种或多种；
在某些实施方式中，所述第二培养基含有热灭活人AB血清、集落刺激因子、白细胞介素，其中所述集落刺激因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、multi-CSF（IL-3）、EPO、TPO、SCF和FLT3L中的一种或多种，所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-27中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述第一培养基中集落刺激因子为SCF和FLT3L。
在某些实施方式中，所述第一培养基中白细胞介素为IL-3、IL-7和IL-15。
在某些实施方式中，所述第一培养基还含有DMEM/F12+GlutaMAX、F12+GlutaMAX、P/S、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸和Retronectin中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述第一培养基含有56.6% DMEM/F12+GlutaMAX、28.3% F12+GlutaMAX、1-20%热灭活人AB血清、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、1μM β-巯基乙醇、5-50 ng/mL亚硒酸钠、50-200μM乙醇胺、20-100 mg/L抗坏血酸、1-50 ng/mL IL-3、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL IL-7、1-100 ng/mL IL-15、1-100 ng/mL FLT3L、1-100 μg/mL DLL4和1-100μg/mL Retronectin。
在某些实施方式中，所述第一培养基中IL-3的浓度为约1 ng/mL、约2 ng/mL、约3ng/mL、约4 ng/mL、约5 ng/mL、约6 ng/mL、约7 ng/mL、约8 ng/mL、约9 ng/mL、约10 ng/mL、约11 ng/mL、约12 ng/mL、约13 ng/mL、约14 ng/mL、约15 ng/mL、约16 ng/mL、约17 ng/mL、约18 ng/mL、约19 ng/mL、约20 ng/mL、约21 ng/mL、约22 ng/mL、约23 ng/mL、约24 ng/mL、约25 ng/mL、约26 ng/mL、约27 ng/mL、约28 ng/mL、约29 ng/mL、约30 ng/mL、约31 ng/mL、约32 ng/mL、约33 ng/mL、约34 ng/mL、约35 ng/mL、约36 ng/mL、约37 ng/mL、约38 ng/mL、约39 ng/mL、约40 ng/mL、约41 ng/mL、约42 ng/mL、约43 ng/mL、约44 ng/mL、约45 ng/mL、约46 ng/mL、约47 ng/mL、约48 ng/mL、约49 ng/mL或约50 ng/ mL。
在某些实施方式中，所述第一培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第一培养基中IL-7的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第一培养基中IL-15的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第一培养基中FLT3L的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第一培养基中DLL4的浓度为约1 μg/mL、约5 μg/mL、约10μg/mL、约15 μg/mL、约20 μg/mL、约25 μg/mL、约30 μg/mL、约35 μg/mL、约40 μg/mL、约45μg/mL、约50 μg/mL、约55 μg/mL、约60 μg/mL、约65 μg/mL、约70 μg/mL、约75 μg/mL、约80μg/mL、约85 μg/mL、约90 μg/mL、约95 μg/mL或约100 μg/mL。
在某些实施方式中，所述第一培养基中Retronectin的浓度为约1 μg/mL、约5 μg/mL、约10 μg/mL、约15 μg/mL、约20 μg/mL、约25 μg/mL、约30 μg/mL、约35 μg/mL、约40 μg/mL、约45 μg/mL、约50 μg/mL、约55 μg/mL、约60 μg/mL、约65 μg/mL、约70 μg/mL、约75 μg/mL、约80 μg/mL、约85 μg/mL、约90 μg/mL、约95 μg/mL或约100 μg/mL。
在某些实施方式中，所述第二培养基中集落刺激因子为SCF和FLT3L。
在某些实施方式中，所述第二培养基中白细胞介素为IL-7和IL-15。
在某些实施方式中，所述第二培养基还含有DMEM/F12+GlutaMAX、F12+GlutaMAX、P/S、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸和Retronectin中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述第二培养基含有56.6% DMEM/F12+GlutaMAX、28.3% F12+GlutaMAX、1-20%热灭活人AB血清、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、1μM β-巯基乙醇、5-50 ng/mL亚硒酸钠、50-200μM乙醇胺、20-100 mg/L抗坏血酸、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL IL-7、1-100 ng/mL IL-15、1-100 ng/mL FLT3L、1-100 μg/mL DLL4和1-100 μg/mLRetronectin。
在某些实施方式中，所述第二培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第二培养基中IL-7的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第二培养基中IL-15的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第二培养基中FLT3L的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述第二培养基中DLL4的浓度为约1 μg/mL、约5 μg/mL、约10μg/mL、约15 μg/mL、约20 μg/mL、约25 μg/mL、约30 μg/mL、约35 μg/mL、约40 μg/mL、约45μg/mL、约50 μg/mL、约55 μg/mL、约60 μg/mL、约65 μg/mL、约70 μg/mL、约75 μg/mL、约80μg/mL、约85 μg/mL、约90 μg/mL、约95 μg/mL或约100 μg/mL。
在某些实施方式中，所述第二培养基中Retronectin的浓度为约1 μg/mL、约5 μg/mL、约10 μg/mL、约15 μg/mL、约20 μg/mL、约25 μg/mL、约30 μg/mL、约35 μg/mL、约40 μg/mL、约45 μg/mL、约50 μg/mL、约55 μg/mL、约60 μg/mL、约65 μg/mL、约70 μg/mL、约75 μg/mL、约80 μg/mL、约85 μg/mL、约90 μg/mL、约95 μg/mL或约100 μg/mL。
在某些实施方式中，步骤（c1）中所述细胞培养是培养6-8天。
在某些实施方式中，步骤（c1）中所述细胞培养是培养约6天、约7天或约8天。
在某些实施方式中，步骤（c2）中所述细胞培养是培养8-10天，然后使用新鲜的第二培养基再培养8-10天。
在某些实施方式中，步骤（c2）中所述细胞培养是培养约8天、约9天或约10天，然后使用新鲜的第二培养基再培养约8天、约9天或约10天。
在某些实施方式中，步骤d所述扩增包括：
将步骤c制备得到的NK细胞加入含有IL12、IL15和IL18的培养基中培养，得到成熟NK细胞。
在某些实施方式中，所述IL12、IL15和IL18的浓度均为5-50ng/ml。
在某些实施方式中，所述步骤d包括将c步骤制备得到的NK细胞加入NK扩增培养基中进行细胞培养。
在某些实施方式中，所述步骤d包括将c步骤制备得到的NK细胞加入激活培养基中进行细胞培养，在NK细胞扩增第3天，将激活培养基更换为维持培养基。
在某些实施方式中，所述步骤d还包括在NK细胞扩增第6天，使用维持培养基进行一半的培养基更换。
在某些实施方式中，所述步骤d还包括在NK细胞扩增第9天，将NK细胞转移到24孔Grex中。
在某些实施方式中，所述步骤d还包括在NK细胞扩增第12天，使用维持培养基进行一半的培养基更换。
在某些实施方式中，所述步骤d还包括在NK细胞扩增第15天收获iNK细胞。
在某些实施方式中，所述激活培养基为NK Xpander培养基，补充有人AB血清、P/S、IL-15、IL-12、IL-18和IL-2。
在某些实施方式中，所述激活培养基补充有1-20%人AB血清、1% P/S、5-50 ng/mlIL-15、5-50 ng/ml IL-12、5-50 ng/ml IL-18和50 U/ml IL-2。
在某些实施方式中，所述IL-12的浓度为约5 ng/mL、约6 ng/mL、约7 ng/mL、约8ng/mL、约9 ng/mL、约10 ng/mL、约11 ng/mL、约12 ng/mL、约13 ng/mL、约14 ng/mL、约15ng/mL、约16 ng/mL、约17 ng/mL、约18 ng/mL、约19 ng/mL、约20 ng/mL、约21 ng/mL、约22ng/mL、约23 ng/mL、约24 ng/mL、约25 ng/mL、约26 ng/mL、约27 ng/mL、约28 ng/mL、约29ng/mL、约30 ng/mL、约31 ng/mL、约32 ng/mL、约33 ng/mL、约34 ng/mL、约35 ng/mL、约36ng/mL、约37 ng/mL、约38 ng/mL、约39 ng/mL、约40 ng/mL、约41 ng/mL、约42 ng/mL、约43ng/mL、约44 ng/mL、约45 ng/mL、约46 ng/mL、约47 ng/mL、约48 ng/mL、约49 ng/mL或约50ng/ mL。
在某些实施方式中，所述IL-15的浓度为约5 ng/mL、约6 ng/mL、约7 ng/mL、约8ng/mL、约9 ng/mL、约10 ng/mL、约11 ng/mL、约12 ng/mL、约13 ng/mL、约14 ng/mL、约15ng/mL、约16 ng/mL、约17 ng/mL、约18 ng/mL、约19 ng/mL、约20 ng/mL、约21 ng/mL、约22ng/mL、约23 ng/mL、约24 ng/mL、约25 ng/mL、约26 ng/mL、约27 ng/mL、约28 ng/mL、约29ng/mL、约30 ng/mL、约31 ng/mL、约32 ng/mL、约33 ng/mL、约34 ng/mL、约35 ng/mL、约36ng/mL、约37 ng/mL、约38 ng/mL、约39 ng/mL、约40 ng/mL、约41 ng/mL、约42 ng/mL、约43ng/mL、约44 ng/mL、约45 ng/mL、约46 ng/mL、约47 ng/mL、约48 ng/mL、约49 ng/mL或约50ng/ mL。
在某些实施方式中，所述IL-18的浓度为约5 ng/mL、约6 ng/mL、约7 ng/mL、约8ng/mL、约9 ng/mL、约10 ng/mL、约11 ng/mL、约12 ng/mL、约13 ng/mL、约14 ng/mL、约15ng/mL、约16 ng/mL、约17 ng/mL、约18 ng/mL、约19 ng/mL、约20 ng/mL、约21 ng/mL、约22ng/mL、约23 ng/mL、约24 ng/mL、约25 ng/mL、约26 ng/mL、约27 ng/mL、约28 ng/mL、约29ng/mL、约30 ng/mL、约31 ng/mL、约32 ng/mL、约33 ng/mL、约34 ng/mL、约35 ng/mL、约36ng/mL、约37 ng/mL、约38 ng/mL、约39 ng/mL、约40 ng/mL、约41 ng/mL、约42 ng/mL、约43ng/mL、约44 ng/mL、约45 ng/mL、约46 ng/mL、约47 ng/mL、约48 ng/mL、约49 ng/mL或约50ng/ mL。
在某些实施方式中，所述激活培养基补充有1-20%人AB血清、1% P/S、10 ng/mlIL-15、50 ng/ml IL-12、50 ng/ml IL-18和50 U/ml IL-2。
在某些实施方式中，所述维持培养基为NK Xpander培养基，补充有人AB血清、P/S、IL-2和IL-15。
在某些实施方式中，所述维持培养基补充有1-20%人AB血清、1% P/S、5-500 U/mlIL-2和1-100 ng/ml IL-15。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的NK细胞，所述NK细胞表现出IL-12、IL-15和IL-18中的一种或多种表达增加。
在某些实施方式中，所述NK细胞表现出NK细胞标志物或蛋白质约1％的增加、约2％的增加、约3％的增加、约4％的增加、约5％的增加、约6％的增加、约7％的增加、约8％的增加、约9％的增加、约10％的增加、约20％的增加、约30％的增加、约40％的增加、约50％的增加、约60％的增加、约70％的增加、约80％的增加、约90％的增加、约100％的增加或更多的增加。
在某些实施方式中，所述NK细胞表现出NK细胞标志物或蛋白质约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多倍的增加。
在某些实施方式中，所述NK细胞具有CD45+/CD56+表型。
在某些实施方式中，所述具有CD45+/CD56+表型的细胞比例>80%。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的NK细胞和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包含额外的治疗剂。
在某些实施方式中，所述额外的治疗剂是抗体。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的NK细胞、所述NK细胞、或所述药物组合物在制备用于治疗或预防免疫相关疾病的制剂中的用途。
在某些实施方式中，所述免疫相关疾病包括肿瘤、病毒感染、移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病或白血病中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述病毒感染包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）、单纯疱疹病毒（HSV）、巨细胞病毒（CMV）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）中的一种或多种。
实施例1：iPSC制备HSPC（条件#8）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki和GSK-3抑制剂CHIR 99021。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021。
24小时后（第2天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1% P/S、2mM GlutaMaX、50ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第3-4天），收获EB并用含有补充了1% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-72小时后（第5-7天），收获EB并用含有添加1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的StemlineII造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。在第8-10天，收获HSPC。
实施例2：iPSC制备HSPC（条件#4）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021（2X）。
24小时后（第2天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1% P/S、2mM GlutaMaX、50ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第3-4天），收获EB并用含有补充了1% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-72小时后（第5-7天），收获EB并用含有添加1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的StemlineII造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。在第8-10天，收获HSPC。
实施例3：iPSC制备HSPC（条件#6）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki和GSK-3抑制剂CHIR 99021。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021。
24-48小时后（第2-3天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1% P/S、2mMGlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第4-5天），收获EB并用含有补充了1% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-48小时后（第6-7天），收获EB并用含有添加1% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的StemlineII造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定。
实施例4-8：iPSC制备HSPC（条件#1-3、5、7）
实施例4-8（条件#1-3、5、7）的培养方式与实施例1基本相同，具体条件参见图2。
实施例9：分化方案效果对比
从形态学角度观察了在iPSC培养阶段（即图2的第0天）添加CHIR（条件6），结果如图5，可以看到，CHIR的添加使得在iPSC培养阶段及形成了iPSC球体再开始进行分化, 从而达到数量更多及均一性更好的球体进行下游的分化。
进一步尝试在iPSC诱导形成中胚层的阶段（即条件6的第1-3天），将CHIR99021的诱导时间延长为2d，结果如图6，可以看到CHIR99021只添加1天会相比于添加2天更助于从HE EB上释放出HPC细胞，对于细胞整体活性/成长也更有利。
针对条件6进行了4批次的稳定性实验，结果如图7所示，造血EB里的CD34细胞多为更早期的前体细胞（CD43-）,而已经从EB球释放出来的悬浮细胞可达到>50% CD34阳性，>90% CD43阳性，说明从EB球释放的悬浮细胞多为造血谱系祖细胞。
实施例10：HSPC制备iNK细胞
将实施例1-8中收获的HSPC和悬浮细胞培养物重悬于NK分化培养基1中，其中含有56.6% DMEM/F12+GlutaMAXTM-I、28.3% F12+GlutaMAXTM-I、1-20%热灭活人AB血清、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、1μM β-巯基乙醇、5-50 ng/mL亚硒酸钠、50-200μM乙醇胺、20-100mg/L抗坏血酸、1-50ng/mL IL-3、1-100ng/mL SCF、1-100 ng/mL IL-7、1-100 ng/mL IL-15、1-100ng/mL FLT3L。
在iNK细胞分化第8天，将培养物重悬于NK分化培养基2中，其中含有56.6% DMEM/F12+GlutaMAXTM-I、28.3% F12+GlutaMAXTM-I、1-20%热灭活人AB血清、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、1μM β-巯基乙醇、5-50 ng/mL亚硒酸钠，50-200μM乙醇胺，20-100 mg/L抗坏血酸，1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL IL-7、1-100 ng/mL IL-15、1-100 ng/mL FLT3L。
10天后（iNK细胞分化第18天），收集悬浮细胞，用新鲜的NK分化培养基2重悬。
10天后（iNK细胞分化第28天），监测培养物是否出现梭形iNK样细胞并评估其CD45/CD56表达。结果显示CD45+/CD56+细胞的比例>80%。
实施例11：iNK细胞的扩增、成熟和活性测试
在第28天对iNK细胞进行扩增。将3x104个iNK细胞和3x104个K562-mbII21-41BBL细胞（iNK细胞：饲养层之比为1：1）在96孔低附着板上在200µl NK扩增培养基中培养。NK扩增成熟培养基的组成如表1所示。将细胞在37℃、5%CO2中孵育。
表1：NK扩增培养基组成
培养基
常规方法 NK Xpander, 1-20%人AB血清，1% P/S, 5-500 U/ml IL-2
本发明的IL-12、IL-15、IL-18 活化方法 3天激活：NK Xpander、1-20%人AB血清、1% P/S、10 ng/ml IL-15、50 ng/ml IL-12、50 ng/ml IL-18、50 U/ml IL-2维持：NK Xpander、1-20%人AB血清、1% P/S、5-500 U/ml IL-2、1-100 ng/ml IL-15
在iNK细胞扩增第3天，激活培养基更换为维持培养基。在iNK细胞扩增第6天，用维持培养基进行了一半的培养基更换。在iNK细胞扩增第9天，将iNK细胞转移到24孔Grex中，并在第12天进行一半培养基更换。在iNK细胞扩增第15天收获iNK细胞。
进行Caspase测定以测试iNK细胞毒性。简而言之，靶细胞（K562或MOLM13）在37℃下用终浓度为5μM的PBS中的CellTraceTMViolet预染色20分钟。染色后，将细胞在完全培养基中洗涤，然后以指定的效应物与目标物（E:T）的比率与NK细胞培养物混合。短暂离心后，将共培养物在37℃下孵育3.5小时。之后，加入CellEvent®Caspase-3/7 Green检测试剂（Thermal Fisher Scientific，C10423）再培养30分钟，总孵育时间为4小时。然后通过流式细胞术分析细胞。
结果显示，IL-12、IL-15和IL-18的瞬时处理改善了NK扩增和成熟状态，如细胞数倍数变化和CD16表面标志物表达所示，这可能导致体内抗肿瘤功能增强。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (10)

1.一种制备自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞分化成胚状体；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为NK细胞；
d. 扩增步骤c制备得到的NK细胞，得到成熟NK细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC具有CD34+表型。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d所述扩增包括：
将步骤c制备得到的NK细胞加入含有IL12、IL15和IL18的培养基中培养，得到成熟NK细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述IL12、IL15和IL18的浓度均为5-50ng/ml。
7.一种根据权利要求1所述方法制备得到的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞具有CD45+/CD56+表型。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含根据权利要求7所述的NK细胞和药学上可接受的赋形剂。
9.一种根据权利要求1-6中任一项所述方法制备得到的NK细胞、根据权利要求7所述的NK细胞、或根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗或预防免疫相关疾病的制剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫相关疾病包括肿瘤、病毒感染、移植物抗宿主疾病、自身免疫疾病或白血病中的一种或多种；其中，所述病毒感染包括人类免疫缺陷病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒中的一种或多种。
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