CN117050181A - 对FcγRIIA具有特异性的结合分子及其使用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了FcγRIIA结合分子，例如，能够抑制FcγRIIA活性的人源化单克隆抗体，以及在例如治疗或预防炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱中使用FcγRIIA结合分子的方法。

Description

对FcγRIIA具有特异性的结合分子及其使用
背景技术
FcγR是一种细胞表面受体家族，其结合免疫球蛋白(IgG)亚型抗体的Fc部分。人Fcγ受体(FcγR)具有不同的功能、结合亲和力(affinity)和细胞分布1。
在人中，存在5种FcγR：高亲和力受体FcγRI(CD64)，其可以结合单体IgG；和低亲和力受体FcγRIIA(CD32A)，FcγRIIB(CD32B)，FcγRIIIA(CD16A)，和FcγRIIIB(CD16B)，其较弱地结合单体IgG，但是易与IgG的免疫复合物结合。认为FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA和FcγRIIIB具有激活性质，然而FcγRIIB主要是抑制。FcγRIIA和FcγRIIB是最密切相关的受体。负责与IgG相互作用的这些受体的胞外区域具有大于90％的序列同一性2。FcγRIIA和FcγRIIB细胞内信号转导区域中的序列差异介导不同的细胞响应。
FcγR介导数个细胞过程，包括抗原或病原体摄取，脱粒，抗原呈递和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，FcγR可与其他受体相互作用以影响特异性细胞因子的产生。使免疫系统失效(failure)以适当地限制FcγR的反应性可以在炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱的发展中其作用3。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种异质性自身抗体驱动的免疫复合物介导的自身免疫疾病。SLE患者的标志是存在直接针对核抗原的自身抗体，包括dsDNA，ssDNA，和核酸相关蛋白(例如，RNP、组蛋白、Smith、Ro)。皮肤、肺和肾中疾病临床表现与免疫复合物的沉积相关4。免疫复合物介导的FcγRIIA活化涉及在SLE的发病机制中起作用5。大约60％的SLE患者具有I型干扰素(IFN)基因签名，其在具有严重疾病活动的患者中最普遍。重要地，含有DNA和RNA的免疫复合物诱导浆细胞样树突细胞以FcγRIIA依赖性方式产生I型IFNα5,6,7。
抗-中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关血管炎(AAV)表示具有多系统临床表现的血管炎性疾病的异质性组8。AAV包括肉芽肿性多血管炎(GPA),显微镜下多血管炎(MPA)，坏死性新月体性肾小球肾炎(NCGN)和嗜酸性肉芽肿(EGPA)。AAV患者的标志是存在直接针对中性粒细胞胞质抗原的自身抗体。ANCA的靶抗原包括髓过氧化物酶(MPO)、蛋白酶3(PR3)、乳铁蛋白和其他。GPA主要与对PR3的抗体相关，而MPA和EGPA两者都与对MPO的抗体相关。ANCA不仅作为诊断标志物，还在疾病中起直接的致病作用。ANCA可以经由FcγRIIA诱导中性粒细胞的直接活化，而这可以导致血管损伤9。此外，ANCA还可以触发中性粒细胞胞外诱捕网(NET)、细胞因子和趋化因子的FcγRIIA依赖性诱导，而这可能引起炎症和自身免疫应答10。因此，FcγRIIA似乎在AAV的发展和病理学中起核心作用。
免疫性血小板减少症(ITP)是一种自身免疫性出血性疾病，其特征在于产生针对血小板抗原的自身反应性抗体。涂覆血小板表面的自身抗体通过网状内皮系统的吞噬巨噬细胞促进其清除。FcγR的库和细胞表达在小鼠和人之间不同，尽管FcγRII是人中最广泛表达的FcγR，但在小鼠中不存在。使用针对人FcγRIIA转基因和鼠活化FcγR缺陷的小鼠，证明了被动施用的抗-血小板抗体以FcγRIIA依赖性方式触发免疫性血小板减少症11。此外，在患有原发性ITP的患者中观测到单核细胞上显著较高的FcγRIIA/B比；用作ITP患者一线疗法的高剂量地塞米松治疗降低FcγRIIA/B比12。这些体外和体内数据表明，人FcγRIIA在ITP的发病机制中起重要作用。
中性粒细胞胞外诱捕网(NET)的形成被认为在宿主防御细菌感染中很重要17。相反地，NET的形成还与不利作用相关，如血栓形成，炎症和内皮功能障碍18,19,20。除了它们在ANCA相关血管炎中的致病作用，有证据表明NET可能导致败血症，血栓形成，急性肾损伤，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，肾小球肾炎，中毒性肝损伤，中风，动脉粥样硬化和I型糖尿病21,22。因为FcγRIIA在形成NET中起着关键作用10，阻断FcγRIIA可能在治疗NET相关疾病中具有有益作用。
可以体内引发抗体-药物抗体(ADA)以响应治疗性抗体。除了ADA对治疗性暴露的影响，在药物和ADA之间形成免疫复合物可以引起潜在有害的FcR介导的超敏反应23。因为FcγRIIA是负责免疫复合物介导的效应功能的主要活化FcγR，所以阻断FcγRIIA可能能够抑制ADA介导的不利作用。
本公开提供了特异性结合FcγRIIA的组合物，以及使用这样组合物的方法，如用于治疗或预防炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱。
发明内容
本发明的一些主要方面总结如下。其他方面述于本公开的发明详述、实施例、附图和权利要求。本公开各部分中的描述旨在与其他部分联合阅读。此外，本公开各部分中所述多种实施方式可以多种不同的方式组合，并且所有这样的组合旨在落入本发明的范围内。
本公开提供了FcγRIIA结合分子，例如，能够抑制FcγRIIA活性的人源化单克隆抗体，以及在例如治疗或预防炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱中使用FcγRIIA结合分子的方法。
在一方面，本发明提供了特异性结合FcγRIIA的分离的结合分子，其中，所述结合分子包含含有选自下述氨基酸序列的免疫球蛋白可变重链互补决定区2(VH-CDR2)：SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20。在一方面，本发明提供了特异性结合FcγRIIA的分离的结合分子，其中，所述结合分子包含含有选自下述氨基酸序列的免疫球蛋白可变轻链互补决定区1(VL-CDR1)：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。在特定方面，本发明的结合分子包含分别含有选自以下所述氨基酸序列的VH-CDR2和VL-CDR1：(i)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22；(ii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23；(iii)SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:24；(iv)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25；(v)SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:23；或(vi)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26。
本发明提供了特异性结合FcγRIIA的分离的结合分子，其中所述结合分子包含：(a)分别含有选自以下所述氨基酸序列的免疫球蛋白可变重链互补决定区2(VH-CDR2)和免疫球蛋白可变轻链互补决定区1(VL-CDR1)：(i)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22；(ii)SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:23；(iii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:24；(iv)SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:25；(v)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23；或(vi)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26；(b)含有SEQ ID NO:29的免疫球蛋白可变重链互补决定区1(VH-CDR1)；(c)含有SEQ ID NO:30或SEQID NO:45的免疫球蛋白可变重链可变互补决定区3(VH-CDR3)；(d)含有SEQ ID NO:31的免疫球蛋白可变轻链互补决定区2(VL-CDR2)；和(e)含有SEQ ID NO:32的免疫球蛋白可变轻链互补决定区3(VL-CDR3)。在一实施方式中，结合分子包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22。
在一实施方式中，结合分子包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，它们分别包含选自以下所述的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，(ii)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，(iii)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，(iv)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40，(v)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，和(vi)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。在一实施方式中，结合分子包含SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。
在另一方面，本发明提供了分离的结合分子，其与上述一种或多种结合分子竞争或交叉竞争。
在一些实施方式中，本发明的结合分子选自鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和它们的抗原结合片段。
在一些实施方式中，本发明的结合分子选自Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv片段、单链Fv(scFV)、sc(Fv)2、二硫键连接的(dsFv)、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体或单链抗体。
本发明的结合分子可以包含免疫球蛋白(Ig)重链恒定区。在一面中，恒定区是人IgG恒定区。
在具体实施方式中，恒定区包含在Kabat位置234、235和331处的氨基酸取代，其中：在Kabat位置234处的氨基酸被苯丙氨酸(F)取代，在Kabat位置235处的氨基酸被谷氨酸(E)取代，而在Kabat位置331处的氨基酸被丝氨酸(S)取代。
在一些实施方式中，恒定区包含相对于野生型人IgG恒定区在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的一个或多个氨基酸残基取代，其中氨基酸位置编号根据Kabat的EU索引。在具体实施方式中，恒定区包含在Kabat位置252、254和256处的氨基酸取代，其中：在Kabat位置252处的氨基酸被酪氨酸(Y)取代，在Kabat位置254处的氨基酸被苏氨酸(T)取代，而在Kabat位置256处的氨基酸被谷氨酸(E)取代。
本发明的结合分子可以包含免疫球蛋白轻链恒定区。在一些实施方式中，轻链恒定区是人κ恒定区。
在一方面，本发明的结合分子以解离常数(KD)约0.16nM的亲和力特异性地结合人FcγRIIA 131R，所述解离常数(KD)通过BIAcore试验测定。在另一方面，本发明的结合分子以解离常数(KD)约0.13nM的亲和力特异性地结合人FcγRIIA 131H，所述解离常数(KD)通过BIAcore试验测定。优选地，所述结合分子不与FcγRI、FcγRIIB或FcγRIII特异性结合。
本发明的结合分子可以与试剂偶联，例如，选自下述的试剂：抗微生物剂，治疗剂，前药，肽，蛋白质，酶，脂质，生物响应调节剂，药剂，淋巴因子，异源性抗体或其片段，可检测标记物，聚乙二醇(PEG)，毒素，和所述试剂中任两种或多种的组合。
本发明还提供了包含本发明结合分子的组合物。在一实施方式中，组合物是诊断试剂。
在其他实施方式中，本发明提供了用于在外周血单核细胞(PBMC)中抑制核糖体蛋白-免疫复合物(RNP-IC)介导的I型IFNα的方法，所述方法包括将所述PBMC与本发明的结合分子接触。还提供了用于抑制抗-中性粒细胞胞质抗体(ANCA)诱导的中性粒细胞活化的方法，所述方法包括将中性粒细胞与本发明的结合分子接触。
在一些方面，本发明提供了在对象中治疗或预防炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括向需要治疗的对象或向疑似患有所述疾病或紊乱的对象给予有效量的本发明的结合分子或组合物。疾病或紊乱优选自：ANCA相关血管炎(AAV)，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，膜性肾炎，免疫性血小板减少症(ITP)，类风湿性关节炎，多发性肌炎，皮肌炎，天疱疮，溶血性贫血，混合结缔组织疾病，舍格伦综合征，硬皮病，败血症，血栓形成，急性肾损伤，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，肾小球肾炎，毒性肝损伤，中风，动脉粥样硬化，I型糖尿病，自身抗体紊乱，和免疫-复合物介导的紊乱。在一些实施方式中，所述方法包括给予第二活性剂。
还提供了用于检测样品中FcγRIIA的方法，所述方法包括(a)将所述样品与本发明的结合分子接触，和(b)检测所述结合分子与FcγRIIA的结合，从而检测所述样品中的FcγRIIA。在某些情况下，所述方法为诊断方法。
在其他实施方式中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码本发明结合分子的核苷酸序列，任选地连接调节序列；用核酸分子转化的宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞；和包含核酸分子的载体。还提供了包含本发明的核酸分子、宿主细胞或载体的组合物。
本发明提供了制备特异性结合FcγRIIA的结合分子的方法，所述方法包括在适合生成所述结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞。在一些方面，所述方法还包括分离所述结合分子。
在一实施方式中，本发明提供了包括本发明核酸分子或结合分子的试剂盒
附图说明
图1A-1C显示了共有FcγRIIA猕猴(cynomolgus)序列和与人FcγRIIA的比对。图1A显示了猕猴FcγRIIA的共有氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。猕猴群中的单核苷酸多态性(SNP)以黑体示出。对应主要人类等位基因的次要等位基因标用下划线标出。阴影的残基表示>20％的次要等位基因频率(MAF)。图1B显示了人FcγRIIA(P12318；aa 1-317；SEQ IDNO:2)和猕猴FcγRIIA(SEQ ID NO:3)的比对。将与人类非同源的猕猴(cyno)氨基酸用阴影标出。将对应人类的次要猕猴等位基因的变异用下划线标出。图1C显示了共有FcγRIIA全长猕猴转录本(SEQ ID NO:4)。
图2显示了IV.3人源化的表位竞争试验数据。
图3显示了小鼠IV.3VH(SEQ ID NO:5)和VL(SEQ ID NO:8)与人源化IV.3(CamIV3VH(SEQ ID NO:6)和VL(SEQ ID NO:9))和选定的人种系序列(SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:10)的比对。
图4A-4B显示了人源化IV.3抗体组的表位竞争试验数据。图4A显示了人FcγRIIA131H的结合。图4B显示了人FcγRIIA 131R的结合。
图5A-5E显示了优化的IV.3Ab对人FcγRIIA结合具有特异性，但是对其他FcγR不具有特异性。图5A显示了人FcγRIIA的结合数据。图5B显示了FcγRIIB的结合数据。图5C显示了人FcγRI的结合数据。图5D显示了人FcγRIIIA-158F同种异型的结合数据。图5E显示了人FcγRIIIA-158V同种异型的结合数据。
图6显示了MEDI9600与静脉内免疫球蛋白(IVIG)竞争对FcγRIIA的结合。
图7A-7C显示了优化的IV.3Ab使来自人131H/H供体(图7A)、人131R/R供体(图7B)和猕猴(图7C)单核细胞表面的FcγRIIA内化。图7D显示了使用共聚焦显微分析通过MEDI9600使FcγRIIA内化。
图8A-8C显示了优化的IV.3Ab使用来自人131H/H供体(图8A)、人131R/R供体(图8B)和猕猴(图8C)的细胞阻断来自人和猕猴PBMC的RNP-IC诱导的IFN-α表达。
图9A-9G显示了MEDI9600(克隆32LO0352)特异性阻断抗-中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)诱导的中性粒细胞活化。
图10A-10C显示了MEDI9600保护小鼠免于抗-血小板抗体诱导的血小板减少症。
图11A-11C显示了通过MEDI9600的FcγRIIA阻断对中性粒细胞功能没有不利作用。
图12显示了单独用MEDI9600体外处理人全血对蛋白质表达概况没有作用。
图13A-13C显示了MEDI9600的单剂量药代动力学和探索性药效学研究。图13A显示了猕猴中单剂量后各时间点MEDI9600的血清浓度。来自猕猴的血细胞的流式细胞分析显示MEDI9600诱导单核细胞(图13B)和粒细胞(图13C)的FcγRIIA荧光强度剂量响应下降。
发明详述
本发明提供了结合FcγRIIA的分子。在一些实施方式中，这类分子是抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合FcγRIIA。也提供了相关的多核苷酸，含有抗-FcγRIIA结合分子的组合物，和制备抗-FcγRIIA结合分子的方法。还提供了使用新型抗-FcγRIIA抗体的方法，如治疗炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱的方法或诊断方法。
除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Ausubel等编著.(2015)Current Protocols inMolecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(约翰威立出版公司(John Wiley andSons))；Greenfield编著(2013)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Green和Sambrook编著(2012),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第四版，冷泉港实验室出版社)；Krebs等编著(2012)Lewin’s Genes XI(《勒温氏基因型XI》)(第11版，琼斯和巴特勒学习出版社(Jones&Bartlett Learning))；Freshney(2010)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》)(第六版，威利(Wiley))；Weir和Blackwell编著，(1996)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》),第I-IV卷(第五版，威利-布莱克威尔出版社(Wiley-Blackwell))；
Borrebaeck编著.(1995)Antibody Engineering(《抗体工程》)(第二版，牛津大学出版社)；Glover和Hames编著(1995)DNA Cloning:A Practical Approach(《DNA克隆：实用方法》),第I和II卷(第二版，IRL出版社)；Rees等编著.(1993)Protein Engineering:APractical Approach(《蛋白质工程：实用方法》)(第一版，IRL出版社)；Mayer和Walker编著(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(Academic Press),伦敦)；Nisonoff(1984)Introduction to Molecular Immunology(《分子免疫学导论》)(第二版，斯奈尔联合有限公司(Sinauer Associates,Inc.))；和Steward(1984)Antibodies:Their Structure andFunction(《抗体结合和功能》)(第一版，施普林格荷兰(Springer Netherlands))。
为了可以更好地理解本发明，首先定义某些术语。其它定义贯穿本公开全文。除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，The Dictionary of Cell and Molecular Biology(《细胞和分子生物学词典》)(第五版，J.M.Lackie编著，2013)，The Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology(《牛津生物化学和分子生物学词典》)(第二版，R.Cammack等编著，2008)和The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology(《生物医学和分子生物学简明词典》)(第二版，P-S.Juo,2002)可以向本领域技术人员提供本文所用一些术语的一般定义。
I.定义
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。术语“一个”(或“一种”)以及“一种或多种”和“至少一种”可以互换使用。
此外，本文所用“和/或”应被视作具体公开了两种特定特征或组分的每一种，伴随或不伴随另一种。因此，短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样，短语诸如“A、B、和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括：A、B、和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另有说明，氨基酸序列以氨基至羧基方向从左到右书写，而核酸序列以5’至3’方向从左到右书写。本文提供的标题不是本发明的各种方面或实施方式的限制，可以参考说明书整体理解本发明的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。
在任何用语言“包括”描述的实施方式中，也包括了“由……组成”和/或“基本由……组成”的其他类似实施方式。
本文中氨基酸由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的公知三字母符号或单字母符号表示。同样，核苷酸按其普遍接受的单字母代码指称。
“FcγRIIA”指Fc受体-γIIA。本领域已知人和猕猴(食蟹猴(Macacafasciculari))FcγRIIA的全长氨基酸和核苷酸序列(参见例如，图1)。术语“FcγRIIA”和“CD32A”在本公开中互换使用。术语“FcγRIIB”和“CD32B”在本公开中也互换使用，以及术语“FcγRIIIA”和“CD16A”、以及“FcγRIIIB”和“CD16B”、以及“FcγRI”和“CD64”在本公开中也分别互换使用。
术语“抗体”指这样的免疫球蛋白分子，其识别并通过免疫球蛋白分子可变区内至少一个抗原识别位点特异性结合靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。本文所用术语“抗体”涵盖多克隆抗体，单克隆抗体，多特异性抗体，如由至少两个完整的抗体产生的双特异性抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白；以及任何其它经修饰的包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子，只要抗体具有所需的生物活性。抗体可以是五类主要免疫球蛋白中的任何一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，基于对其重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的鉴定。不同类别的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚基结构和三维构型。存在两种类型的哺乳动物轻链：λ和κ。抗体可以是裸抗体，或与其它分子(例如毒素、放射性同位素等)偶联。
术语“抗原结合部分”指包含抗体互补决定可变区的完整抗体的部分。全长抗体的片段可以是抗体的抗原结合片段。抗原片段的示例包括但不限于，Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段，线性抗体，单链抗体(例如，ScFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”(mAb)指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的均一抗体群体。这与多克隆抗体相对，多克隆抗体通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆”可以用于完整的和全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)，单链(scFv)突变体，包含抗体部分的融合蛋白，和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”指通过包括但不限于下述任何数量的方式制备的抗体：杂交瘤，噬菌体选择，重组表达，转基因动物。
术语“人源化抗体”指源自非人(例如，鼠)免疫球蛋白的抗体，其经工程改造以包含最小的非人(例如，鼠)序列。通常，人源化抗体是这样的人免疫球蛋，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的残基所替代(Jones等,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FW)残基用来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种的抗体中对应的残基替代。
可以通过在Fv框架区中和/或在替代的非人残基内取代其他残基来进一步修饰人源化抗体，以完善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个或三个可变结构域的几乎全部，所述可变结构域包含对应非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的CDR区，然而，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体也可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。用于产生人源化抗体的方法的示例述于美国专利第5,225,539号和第5,639,641号。
术语“人抗体”表示由人产生的抗体或使用本领域任何已知的技术制备的具有这样氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应由人产生的抗体。人抗体的定义包括这样的完整或全长抗体，其包含至少一个人重和/或轻链多肽，例如，包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或多种物种。通常，轻链和重链的可变区对应源自具有所需特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区与源自其他(通常是人)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引起免疫应答。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合抗原，如FcγRIIA的生物活性的抗体。在某些方面，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。优选地，生活活性减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
术语“种系化”表示位于抗体中特定位置的氨基酸经突变回其在种系中的那些氨基酸。
“IgG1三突变体”或“IgG1-TM”抗体形式是人IgG1同种型，其在下铰链和CH2结构域内包含三个氨基酸取代L234F/L235E/P331S(Oganesyan等,Acta Crystallogr.DBiol.Crystallogr.64:700-704,2008)。TM引起对人FcγRI、FcγRII、FcγRIII和C1q的结合的显著降低，这导致具有低效应功能的人同种型。
术语“YTE”或“YET突变体”指IgG1 Fc中这样的突变，其导致对人FcRn结合增强并改善具有突变的抗体的血清半衰期。YTE突变体包含导入IgG1重链的3个突变M252Y/S254T/T256E(EU编号Kabat等(1991)热门免疫学蛋白质序列(Sequences of Proteins ofimmunological Interest)，美国公共卫生署，国立卫生研究院，华盛顿DC)的组合。同样参见美国专利第7,658,921号，其通过应用纳入本文。相较于相同抗体的野生型，YTE突变体已经显示出增加抗体的血清半衰期大约4倍(Dall’Acqua等,J.Biol.Chem.281:23514-24(2006)；
Robbie等,Antimicrob.Agents Chemother.57,6147-6153(2013))。同样参见美国专利号7,083,784，其通过引用全文纳入本文作参考。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。典型的抗体包含通过二硫键互相连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每一重链由重链可变区(本文简写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三种结构域CH1、CH2和CH3组成。每一轻链由轻链可变区(本文简写为VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由1个结构域C1组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一补体(Clq)的结合。
VH和VL区域还可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，其间间插更保守的被称为构架区(FR)的区。每条链中的CDR紧靠FW区保持在一起，与其他链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。每一VH和VL由三个CDR和四个FW组成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。
存在至少两种确定CDR的技术：(1)根据跨物种序列变异性的方法(Kabat等，免疫兴趣的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国公共卫生署，国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD)，(1991))；(2)根据抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等,J.Molec.Biol.273:927-948(1997))。此外，本领域有时候会使用这两种方法的组合来确定CDR。
如Kabat中的氨基酸位置编号指用于重链可变结构域或轻链可变结构域(约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)的编号系统。使用这个编号系统，所述实际线形氨基酸序列可以包含对应于可变结构域FW或CDR缩短、或插入的更少或其他氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含H2的残基52后的单氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FW残基82后的插入残基(如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。
表1
可以通过用“标准”Kabat编号序列比对抗体序列同源性区域就给定抗体测定残基的Kabat编号。Chothia指的则是结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。取决于环的长度，当使用Kabat编号管理时，ChothiaCDR-H1环的末端在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，那么环在32结束；如果仅存在35A，那么环在33结束；如果同时存在35A和35B，那么环在34结束)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被牛津分子科技公司(OxfordMolecular)的AbM抗体建模软件所使用，参见表1。
IMGT(免疫遗传学)也提供了用于免疫球蛋白可变区(包括CDR)的编号系统。参见例如Lefranc,M.P.等,Dev.Comp.Immunol.27:55-77(2003)。IMGT编号系统基于超过5,000个序列的比对，结构数据，高变环的表征，并且允许简单比较所有物种的可变和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1处于位置26-35，VH-CDR2处于位置51-57，VH-CDR3处于位置93-102，VL-CDR1处于位置27-32，VL-CDR2处于位置50-52，而VL-CDR3处于位置89-97。
如本说明书所使用，所述VH CDR序列对应经典Kabat编号位置，即VH-CDR1处于位置31-35，VH-CDR2处于位置50-65，而VH-CDR3处于位置95-102。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3还分别对应经典Kabat编号位置，即位置24-34、50-56和89-97。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合。
抗体对抗原的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)可以使用本领域已知的任何合适的方法通过实验确定，例如，流式细胞术，酶连接的免疫吸收试验(ELISA)或放射免疫试验(RIA)，或动力学(例如，或BIACORETM分析)确定。可以容易地进行直接结合试验以及竞争性结合试验(参见例如，Berzofsky等,“抗体-抗原相互作用(Antibody-Antigen Interactions),”载于Fundamental Immunology(《基础免疫学》)中,Paul,W.E.编著，拉文出版社(Raven Press):纽约N.Y.(1984)；Kuby,Immunology,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company):纽约N.Y.(1992))。如果在不同的条件下测量(例如，盐浓度、pH、温度)，测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可能不同。因此，亲和力和其他抗原-结合参数(例如，KD或Kd、Kon、Koff)的测量以本领域已知的标准化缓冲液以及抗体和抗原的标准化溶液进行。
除非另有表述，“效力”通常表示为以nM或pM计的IC50值。IC50是抗体分子的半抑制浓度。在功能试验中，IC50是将生物学反应从其最高值降低50％的浓度。在配体结合研究中，IC50是使受体结合的最大特异性结合水平降低50％的浓度。IC50可以通过任何数量本领域已知手段计算。
相较于参照抗体，本发明的抗体或多肽效力的倍数改善可以是至少约2倍，至少约4倍，至少约6倍，至少约8倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约70倍，至少约80倍，至少约90倍，至少约100倍，至少约110倍，至少约120倍，至少约130倍，至少约140倍，至少约150倍，至少约160倍，至少约170倍或至少约180倍或更多。
术语“抑制”、“阻断”和“遏制”可互换使用，并且指生物活性的任何显著的下降，包括完全阻断活性。例如，“抑制”可以指生物活性约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的下降。相应地，当将术语“抑制”或“遏制”用于描述例如对于FcγRIIA信号转导通路的作用时，该术语指FcγRIIA结合分子相对未处理的(对照)细胞在统计学上显著降低FcγRIIA诱导的细胞活化或信号转导的能力。表达FcγRIIA的细胞可以是天然产生的细胞或细胞系(例如，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，血小板)或者可以通过将编码FcγRIIA的核酸导入宿主细胞重组产生。在一实施方式中，例如，通过流式细胞术、Western印迹或本领域已知的其他试验所确定，FcγRIIA结合分子可以在表达FcγRIIA的细胞中抑制FcγRIIA介导的细胞活化或信号转导至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％或约100％。
“分离的”多肽、抗体、结合分子、多核苷酸、载体或细胞为不存在于自然界的形式。分离的多肽、抗体、结合分子、多核苷酸、载体或细胞包括已经纯化至不再以其存在于自然界的形式存在的程度的那些。在一些实施方式中，经分离的多肽、抗体、结合分子、多核苷酸、载体或细胞是基本纯的。本文所用术语“基本纯的”指大于75％的纯度，优选大于80％或90％的纯度，并且最优选大于95％。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人，家畜，农场动物，竞技动物和动物园动物，包括例如人，非人灵长类动物，狗，猫，豚鼠，兔，大鼠，小鼠，马，牛，熊等。
术语“药物组合物”指此类形式的制剂：所述形式允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含对待接受该组合物的对象具有不可接受的毒性的其他成分。这类组合物可以是无菌的，并且可以包括药学上可接受的运载体，如生理盐水。合适的药物组合物可以包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度和/或其他传统增溶或分散剂中的一种或多种。
本文所公开“有效量的”结合分子为足以进行具体所述目的的量。“有效量”可以根据既定目的凭经验和以常规方式确定。
本文中所用术语“标记物”指的是可检测的化合物或组合物，其直接或间接偶联至结合分子，从而产生“标记的”结合分子。标记物可以被其自身检测(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者，例如在酶促标记物的情况中，其可催化底物化合物或组合物的化学变化，所述化学变化可被检测。
术语例如“处理”或“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解”指的是治愈、减缓、减少已经诊断的病理病症或紊乱的症状，和/或截停已经诊断的病理病症或紊乱的进展的治疗性措施。因此，需要治疗的那些包括已经患有紊乱的那些。在某些实施方式中，根据本文所提供的方法，如果患者显示例如与疾病或紊乱相关症状全部、部分或瞬时缓解或减轻，对象成功地被“治疗”了炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱。
“预防”或“防止”指预防和/或延缓靶向的病症或紊乱进展的预防性的或预防用的措施。因此，需要预防的那些包括易于患有或疑似患有紊乱的那些。在某些实施方式中，如果患者(瞬时地或永久地)相比没有进行本发明所述方法的患者表现出例如与疾病或紊乱较少或更少的重度症状，或与疾病或紊乱相关的症状较晚发作，那么根据本文所提供的方法，成功地预防了炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或支化聚合物，其可包含修饰的氨基酸，并且非氨基酸可以将其打断。该术语也包括天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知其它修饰的多肽。在某些所述方法中，多肽可以单链或结合链的形式出现。
“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代的情况。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方式中，本发明结合分子的氨基酸序列中的保守取代不会消除结合分子和结合分子结合的抗原(即FcγRIIA)的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell等，Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:.412-417(1997))。
本文所用“多核苷酸”可以包括一个或多个“核酸”、“核酸分子”或“核酸序列”，并且指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。多核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶整合到聚合物中的任意底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和其类似物。之前描述适用于本文所提及的任何多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”指一种构建体，其能够向宿主细胞递送，并且在一些实施方式中在宿主细胞中表达感兴趣的一种或多种基因或序列。载体的示例包括但不限于，病毒载体，裸露DNA或RNA表达载台，质粒，粘粒或噬菌体载体，与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体，包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体，和某些真核细胞，如生产细胞。
在两个或多个核酸或多肽内容中的术语“相同的”或“同一性”指就最大对应性进行比较和比对(导入间隙，如果需要)时，相同或有特定百分数的相同核苷酸或氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或通过视觉检查测量。本领域已知的各种算法和软件可以用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。
序列比对算法的一个这样的非限制性示例是Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268(1990)中所述的算法，其在Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877(1993)中修饰并纳入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1991))。在某些实施方式中，可如Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所述使用缺口BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等,Methods inEnzymology,266:460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(基因泰克公司(Genentech)，加利福尼亚州南旧金山)或Megalign(DNASTAR公司)是可以用于比对序列的其他公众可及的软件程序。在某些实施方式中，两个核苷酸序列之间的相同性百分比使用GCG软件包中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或90，长度权重1、2、3、4、5或6)。在某些其他实施方式中，整合Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法的GCG软件包中的GAP程序可以用于确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。或者，在某些实施方式中，核苷酸或氨基酸之间的百分比同一性使用Myers和Miller(CABIOS 4:11-17(1989))算法确定。例如，使用ALIGN程序(2.0版本)和使用具有残基表的PAM120，缺口长度罚分12和缺口罚分4，可以确定百分比同一性。本领域技术人员可以确定通过特定比对软件进行最大比对的适当参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。
在某些实施方式中，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的百分比同一性“X”以100x(Y/Z)计算，其中Y是第一和第二序列比对中评为相同匹配的氨基酸残基的数量(通过视觉检测或特定序列比对软件比对)，而Z是第二序列中残基的总数。如果第一序列的长度长于第二序列，那么第一序列与第二序列的百分比同一性将会高于第二序列与第一序列的百分比同一性。
II.FcγRIIA结合分子
本发明提供了特异性结合FcγRIIA的FcγRIIA结合分子，即，抗-FcγRIIA抗体和其抗原结合片段。术语“FcγRIIA结合分子”或“结合FcγRIIA的结合分子”或“抗-FcγRIIA”指能够以足够的亲和力结合FcγRIIA的结合分子，从而使结合分子能够用作治疗剂或诊断试剂靶向FcγRIIA。例如通过放射免疫测定(RIA)、(将重组FcγRIIA用作分析物，而结合分子作为配体，反之亦然)、/>或本领域已知的其他结合试验所测量，“特异性结合FcγRIIA”的结合分子以小于结合分子与FcγRIIA的结合的10％的程度结合不相关的、非FcγRIIA蛋白。在某些实施方式中，结合FcγRIIA的结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM或≤0.1pM的解离常数(KD)。
本公开的示例性结合分子包括小鼠单克隆抗体IV.3的变体(Looney RJ.等,J.Immunol.136(5):1641(1986))，包括人源化的、优化的、种系化的(germlined)和/或其他形式的这些抗体，抗-FcγRIIA TM抗体，和血清半衰期优化的抗-FcγRIIA YTE抗体(例如，K44VHa-N56Q、K44VHa6-N56Q或K2Ha-N56Q)。本公开示例性的抗体包括克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355和32LO0356。“克隆32LO0352”和“MEDI9600”指相同的分子，并且该术语可在本文中互换使用。本发明还包括与本文所示FcγRIIA结合分子基本同源的变体或等同物。例如，它们可以包含保守氨基酸取代。
在某些方面，本公开提供了FcγRIIA结合分子，其可以特异性地结合相同的FcγRIIA表位作为包含克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356中任一项的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结合分子。术语“表位”指能够结合本发明结合分子的目标蛋白决定区。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。构象表位和非构象表位的区别在于：变性溶剂存在下，与构象表位的结合会丢失，而非构象表位的则不会。可以根据它们在标准FcγRIIA结合或活性试验中与结合分子如克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356交叉竞争的能力(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制结合)鉴定这类结合分子
因此，在一实施方式中，本发明提供了FcγRIIA结合分子，其与本发明的其他FcγRIIA结合分子竞争结合FcγRIIA，所述本发明的其他FcγRIIA结合分子诸如克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356中的一种。结合分子抑制例如克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356结合的能力证明，测试的结合分子可与克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356竞争结合FcγRIIA；根据非限制的理论，这样的结合分子可以与与之竞争的FcγRIIA结合分子结合FcγRIIA上相同或相关的(例如，在结构上相似的或在空间上接近的)表位。在一实施方式中，抗-FcγRIIA抗体或其抗原结合片段结合与克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO035、32LO0355或32LO0356中任一项相同的FcγRIIA上的表位。术语“竞争”表示结合分子与克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO035、32LO0355或32LO0356中任一项单向地竞争结合FcγRIIA。术语“交叉竞争”表示结合分子与克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO035、32LO0355或32LO0356中任一项双向地竞争结合FcγRIIA。
在一些实施方式中，FcγRIIA结合分子是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或其任何组合。在一些实施方式中，FcγRIIA结合分子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、迷你抗体、F(ab’)3、四抗体、三抗体、双抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
本文所提供的FcγRIIA结合分子除了VH和VL可以包括重链恒定区或其片段。在某些方面，重链恒定区是人重链恒定区，例如，人IgG恒定区，例如，人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，生成本发明的结合分子以包含改变的Fc区，其中已经在Fc中进行了一个或多个改变，从而改变结合分子的功能性和/或药代动力学特征。这类改变可能导致效应功能改变，免疫原性降低和/或血清半衰期增加。Fc区与许多配体相互作用，包括Fc受体、补体蛋白Clq和其他分子，如蛋白质A和G。这些相互作用对于各种效应功能和下游信号转导事件十分关键，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性毒性(CDC)。因此，在某些实施方式中，相较于在Fc区域不含有修饰的FcγRIIA结合分子，本发明的FcγRIIA结合分子对负责促进效应功能的Fc配体的亲和力下降或消除。在具体实施方式中，FcγRIIA结合分子没有ADCC活性和/或没有CDC活性。在某些方面，FcγRIIA结合分子不结合Fc受体和/或补体因子。在某些方面，FcγRIIA结合分子没有效应功能。本领域普通技术人员能够选择特定恒定结构域以优化所需效应功能。在一些实施方式中，结合分子属于IgG1亚型，并且任选地包括如之前定义部分所公开的TM形式(L234F/L235E/P331S)。
在某些方面，重链恒定区或其片段可以包括相对于野生型IgG恒定结构域的一个或多个氨基酸取代，其中相较于具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期，经修饰的IgG的半衰期增加。例如，IgG恒定区可以包含在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的一个或多个氨基酸残基取代，其中氨基酸位置编号根据Kabat的EU索引。在某些方面，IgG恒定结构域可以包含下述取代中的一个或多个：使用下述取代在Kabat位置252处的氨基酸：酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或苏氨酸(T)，使用苏氨酸(T)取代在Kabat位置254处的氨基酸，使用下述取代在Kabat位置256处的氨基酸：丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或苏氨酸(T)，使用亮氨酸(L)取代在Kabat位置257处的氨基酸，使用脯氨酸(P)在Kabat位置309取代氨基酸，使用丝氨酸(S)取代在Kabat位置311处的氨基酸，使用下述取代在Kabat位置428处的氨基酸：苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或丝氨酸(S)，使用下述取代在Kabat位置433处的氨基酸：精氨酸(R)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或谷氨酰胺(Q)，或使用下述取代在Kabat位置434处的氨基酸：色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸。更具体地，IgG恒定结构域可以包含相对于野生型人IgG恒定结构域的氨基酸取代，包括用酪氨酸(Y)取代在Kabat位置252处的氨基酸，用苏氨酸(T)取代在Kabat位置254的氨基酸，和用谷氨酸(E)取代在Kabat位置256处的氨基酸。在一些实施方式中，结合分子属于IgG1亚型，并且任选地包括如之前定义部分所公开的三突变体YTE。
本文所提供的FcγRIIA结合分子可以包括轻链恒定区或其片段。在某些方面，轻链恒定区是κ恒定区或λ恒定区，例如，人κ恒定区或人λ恒定区。
本文所提供的FcγRIIA结合分子可以具有有益的特征。例如，结合分子可以抑制、阻断或遏制各种FcγRIIA介导的活性，例如，浆细胞样树突细胞(DC)中免疫复合物诱导的I型干扰素表达，DC中免疫复合物诱导的细胞因子/趋势因子表达，免疫复合物诱导的血小板活化，免疫复合物诱导的抗原呈递，免疫复合物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网(NET)形成和中性粒细胞活化中的脱粒。
在某些方面，本文所提供的结合分子可以解离常数(KD)约100nM至约0.1nM的亲和力结合FcγRIIA，所述亲和力通过BiacoreTM试验或动力学排除试验(KinExA)3000平台测定。
在某些方面，抗-FcγRIIA抗体或其抗原结合片段可以这样的解离常数或KD特异性地结合FcγRIIA，例如，人FcγRIIA或猕猴FcγRIIA或其抗原性片段，所述解离常数或KD小于10–6M，小于10–7M，小于10–8M，小于10–9M，小于10–10M，小于10–11M，小于10–12M，小于10–13M，小于10–14M或小于10–15M，例如通过BiacoreTM或所测量。在特定方面，人源化的抗-FcγRIIA抗体MEDI9600可以约0.15nM的KD结合人FcγRIIA(131R)，可以约0.13nM的KD结合人FcγRIIA(131H)，并可以与约31.3nM的KD结合猕猴FcγRIIA，通过BIAcore试验测量。/>
在另一实施方式中，本发明的FcγRIIA结合分子以小于1×10–3s–1，或小于2×10– 3s–1的Koff结合FcγRIIA或其抗原性片段。在其他实施方式中，FcγRIIA结合分子以这样的Koff结合FcγRIIA或其抗原性片段，所述Koff小于10–3s–1、小于5×10–3s–1、小于10–4s–1、小于5×10–4s–1、小于10–5s–1、小于5×10–5s–1、小于10–6s–1、小于5×10–6s–1、小于5×10–7s–1、小于10–8s–1、小于5×10–8s–1、小于10–9s–1、小于5×10–9s–1或小于10–10s–1，例如通过BiacoreTM或所测量。在特定方面，人源化抗-FcγRIIA抗体MEDI9600可以约7.35x 10–4s–1的Koff结合人FcγRIIA(131R)，可以约3.37x 10–4s–1的Koff结合人FcγRIIA(131H)，并且可以约9.04x 10–2s–1的Koff结合猕猴FcγRIIA，如通过BIAcore试验所测量。
在另一实施方式中，本发明的FcγRIIA结合分子以这样的结合速率常数或Kon速率结合FcγRIIA或其抗原性片段，所述结合速率常数或Kon速率为至少105M–1s–1、至少5×10– 5M–1s–1、至少10–6M–1s–1、至少5×10–6M–1s–1、至少10–7M–1s–1、至少5×10–7M–1s–1、至少10–8M–1s–1或至少10–9M–1s–1，例如通过BiacoreTM或所测量的。在特定方面，人源化抗-FcγRIIA抗体MEDI9600可以约4.98x 106M–1s–1的Kon结合人FcγRIIA(131R)，可以约2.60x 106M–1s–1的Kon结合人FcγRIIA(131H)，可以约2.88x 106M–1s–1的Kon结合猕猴FcγRIIA，如通过BIAcore试验所测量的。
包括CDR序列的VH和/或VL氨基酸序列或其部分可以是，例如与本文所示序列85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似，和/或相对于本文所示序列包括0、1、2、3、4、5或多个取代，例如，保守取代，诸如相对于来自克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356中任一项的序列。具有与一VH区或VL区特定百分比相似性的VH和VL区的或者具有一个或多个取代的FcγRIIA结合分子可以通过诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)编码本文所述VH和/或VL区的核酸分子，然后测试编码的改变的结合分子对FcγRIIA的结合，并且任选地使用本文所述的功能性试验测试保留的功能获得。
本公开还提供了与异源性试剂偶联的FcγRIIA结合分子。在某些方面，试剂可以是抗微生物剂，治疗剂，前药，肽，蛋白质，酶，脂质，生物响应调节剂，药剂，淋巴因子，异源性抗体或其片段，可检测标记物，聚乙二醇(PEG)，和所述试剂中任两种或多种的组合。本文它处更详细描述了异源偶联抗-FcγRIIA抗体。
术语“结合抗体”包括抗体及其抗原结合片段。在某些方面，FcγRIIA结合分子为不是抗体的多肽。本领域已知用于鉴定和产生以高亲和力结合蛋白质靶标的非抗体多肽的多种方法。参见，例如，Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.18:295-304(2007)，Hosse等,Protein Science 15:14-27(2006)，Gill等,Curr.Opin.Biotechnol.17:653-658(2006),Nygren,FEBS J.275:2668-76(2008)，和Skerra,FEBS J.275:2677-83(2008)。在某些实施方式中，噬菌体展示技术可以用于鉴定和/或产生FcγRIIA结合多肽。在某些实施方式中，多肽包括选自下述类型的蛋白质支架：蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。
III.制备FcγRIIA结合分子
可采用杂交瘤法来制备单克隆抗-FcγRIIA抗体，所述方法例如由Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)所述的那些。使用杂交瘤法，将小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物免疫来引发淋巴细胞产生抗体，所述抗体会特异性地结合免疫抗原。淋巴细胞也可体外免疫。免疫后，使用例如聚乙二醇(PEG)将淋巴细胞分离并与合适的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞，然后将所述杂交瘤细胞从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出。然后，产生这样单克隆抗体的杂交瘤可以使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(《单克隆抗体原理与实践》),学术出版社,1986)在体外或在体内如动物腹水肿瘤中增殖，通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合试验(例如，RIA或ELISA)确定所述单克隆抗体直接特异性地针对所选抗原。然后，可从培养基或腹水流体纯化单克隆抗体。
FcγRIIA结合分子还可以使用重组DNA方法制备，例如，如美国专利第4,816,567号所述。在一些示例中，编码单克隆抗体的多核苷酸由成熟B细胞或杂交瘤细胞例如通过RT-PCR使用寡核苷酸引物来分离，所述寡核苷酸引物特异性地扩增编码抗体重链和轻链的基因，并且它们的序列使用传统过程确定。然后将编码重链和轻链或其抗原结合片段的分离的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，其中当转移到宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或否则不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中时，结合蛋白由宿主细胞生成。同样，重组FcγRIIA结合分子可以分离自表达所需物种CDR的噬菌体展示文库，如McCafferty等.(Nature,348:552-554(1990))；Clackson等.(Nature,352:624-628(1991))；和Marks等.(J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))所述。产生和表达包含编码FcγRIIA结合分子的核苷酸序列的核酸在下述部分进一步讨论。
编码结合分子的多核苷酸可以许多不同的方式使用重组DNA技术被进一步修饰以产生其他结合分子。在一些实施方式中，例如，小鼠单克隆抗体轻链和重链的恒定结构域可以进行以下取代：(1)取代例如人抗体的那些区域以产生嵌合抗体，或(2)取代非免疫球蛋白多肽的那些区域以产生融合抗体。在一些实施方式中，恒定区被短截或去除以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可以使用可变区的定点或高密度诱变以优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在某些实施方式中，FcγRIIA结合分子是人抗体或其抗原结合片段。可使用本领域已知的各种技术来制备人抗体。可以产生体外免疫的或由产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离永生化人B淋巴细胞(参见例如，Cole等,单克隆抗体与癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy),Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer等,J.Immunol.147(1):86-95(1991)；和美国专利第5,750,373号)。
FcγRIIA结合分子可以选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体，例如，如Vaughan等(Nat.Biotechnol.,14:309-314(1996))，Sheets等(Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.95:6157-6162(1998))，Hoogenboom等(J.Mol.Biol.227:381(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.222:581(1991))所述。用于生成和使用抗体噬菌体文库的技术也述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484和7,264,963；以及Rothe等,J.Mol.Biol.375:1182-1200(2007)中。
本领域已知亲和力成熟策略和链改组策略，并且可以用于产生高亲和力人抗体或其抗原结合片段(参见Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992))。
在一些实施方式中，FcγRIIA结合分子可以是人源化抗体或其抗原结合片段。本领域熟知并且可以使用用于工程改造、人源化或重修非人或人抗体的方法。经人源化、重修或相似工程改造的抗体可以具有来自非人(例如，小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物)来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基被常称为“输入”残基的残基所替代，所述“输入”残基通常取自已知的人序列的“输入”可变、恒定或其他结构域。如本领域已知，这类输入的序列可以用于降低免疫原性或降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲合力、特异性、半衰期或其他合适的特征，如本领域已知。通常，CDR残基直接，或主要参与影响FcγRIIA结合。因此，维持非人或人CDR序列的部分或全部，而可变和恒定区的非人序列可以用人或其他氨基酸替代。
抗体还可以任选地经人源化、重修、工程改造或人抗体工程改造，保留对FcγRIIA的高亲和力和其他有利的生物学特征。为了实现该目标，通过利用亲本、工程改造和和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化或工程改造的产物的过程，可以任选地制备人源化(或人)或工程改造的抗-FcγRIIA抗体和重修的抗体。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序阐明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示能够分析所述残基在候选结合分子序列中发挥功能的可能作用，即分析影响候选结合分子结合其靶标(如FcγRIIA)能力的残基。以此方式，可从共有和输入序列中选择框架(FW)残基并组合，从而获得所需抗体特征，例如对靶抗原的亲和力增加。
抗-FcγRIIA抗体或其抗原结合片段的人源化、重修或工程改造可以使用任何已知的方法进行，诸如但不限于下述：Jones等,Nature 321:522(1986)；
Riechmann等,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等,Science 239:1534(1988))，Sims等,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)，Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.151:2623(1993)，美国专利号5,639,641、5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567,7,557,189；7,538,195和and 7,342,110；国际申请号/US98/16280；
PCT/US96/18978；PCT/US91/09630；PCT/US91/05939；PCT/US94/01234；
PCT/GB89/01334；PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；国际专利申请公开号W090/14443；W090/14424；W090/14430；和欧洲专利公开号EP 229246。
抗-FcγRIIA人源化抗体和其抗原结合片段还可以在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备，所述人免疫球蛋白基因座能够在免疫后在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完全的人抗体库。该方法述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016。
在某些实施方式中，提供了抗-FcγRIIA抗体片段。已知产生抗体片段的各种技术。通常，这些片段源自完整抗体的蛋白水解消化。参见例如，Morimoto等,J.Biochem.Biophys.Meth.24:107-117(1993)；Brennan等,Science,229:81-83(1985)。在某些实施方式中，重组地产生抗-FcγRIIA抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段均能在大肠杆菌或其他宿主细胞内表达并从其分泌，因此能生成大量的这些片段。还可以从上述抗体噬菌体文库分离这类抗-FcγRIIA抗体片段。抗-FcγRIIA抗体片段还可以是线性抗体，如美国专利第5,641,870号所述。本领域技术人员明白产生抗体片段的其它技术。
根据本发明，可调整技术使之适应产生对FcγRIIA具有特异性的单链抗体(参见例如，美国专利号4,946,778)。此外，可调整方法使之适应Fab表达文库的构建(参见例如，Huse等，1989Science 246:1275-1281)，从而能够快速且有效地鉴定对FcγRIIA具有所需特异性的单克隆Fab片段。也可以通过本领域的技术产生抗体片段，包括但不限于：(a)通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化生成的F(ab’)2片段；(b)通过还原F(ab’)2片段的二硫键桥生成的Fab片段；(c)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成的Fab片段；和(d)Fv片段。
在一些方面，FcγRIIA结合分子可以经修饰以减少或消除效应功能。例如，这可以通过IgGl的Fc结构域中的三突变(TM)L234F/L235E/P331S实现。减少效应功能的其他突变是本领域已知的。参见例如，Armour等,Eur.J.Immunol.29:2613-2624,1999；Shields等,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001。
在某些方面，FcγRIIA结合分子可以经修饰以增加其血清半衰期。例如，这可以通过将补救受体结合表位通过适当区域的突变纳入结合分子实现，或通过将表位纳入其后将与结合分子在末端或中间融合的肽标签(例如，通过DNA或肽合成)实现，或通过YTE突变实现。本领域已知其他增加抗体或其抗原结合片段血清半衰期的方法，例如，偶联异源性分子如PEG。
异源偶联FcγRIIA抗体和其抗原结合片段也在本发明的范围内。异源偶联抗体有两个共价连接的抗体组成。例如，已经提出用这类抗体将免疫细胞靶向至不需要的细胞(参见例如美国专利号4,676,980)。预期可通过合成蛋白化学的已知方法来制备异源偶联抗-FcγRIIA抗体和其抗原结合片段，包括使用交联剂的那些方法。例如，可使用二硫交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的示例包括亚氨基硫醇和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸。
FcγRIIA结合分子可以经修饰以包含通常不是蛋白质一部分的其他化学部分。这类部分可以改善结合分子的特征，例如，溶解度、生物半衰期或吸收性。该部分还可以降低或消除结合分子任何不需要的副作用。可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第20版，1990，伊斯顿的马克出版公司(2000)中找到关于这些部分的概述。
在某些方面，本公开提供了包含本发明FcγRIIA结合分子的组合物(例如，药物组合物)，任选地还包含一种或多种运载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂。
IV.编码FcγRIIA结合分子的多核苷酸及其制备和表达
该公开提供了包含编码FcγRIIA结合分子(例如，特异性结合FcγRIIA的多核苷酸)的核酸序列的多核苷酸。例如，本发明提供了包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码抗-FcγRIIA抗体或编码这类抗体的抗原结合片段。本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因座DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方式中，可以分离多核苷酸。在某些实施方式中，多核苷酸可以是基本纯的。在某些实施方式中，多核苷酸可以是cDNA或源自cDNA。在某些实施方式中，可以重组地产生多核苷酸。在某些实施方式中，多核苷酸可以包含成熟多肽的编码序列，其在相同的阅读框中融合至多核苷酸，所述多核苷酸(例如)有助于多肽从宿主细胞表达和任选地分泌(例如，启动子或其他调节序列，用作控制多肽从细胞转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且前导序列可以被宿主细胞切割，以形成多肽的成熟形式。多核苷酸还可以编码结合FcγRIIA的前蛋白，其是加上额外的5'氨基酸残基的成熟蛋白。
本公开提供了包含编码FcγRIIA结合分子的核酸的分离的多核苷酸，所述分子包括来自VH和/或VL具有与本文所示氨基酸序列85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似的氨基酸序列，和/或相对于本文所示氨基酸序列包括0、1、2、3、4、5或多个取代，例如，保守取代，诸如来自克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355或32LO0356中任一项的序列。
在某些实施方式中，包含FcγRIIA结合分子编码序列的多核苷酸融合于与标记物序列相同的阅读框中，该标记物序列能例如用于纯化编码的多肽。例如，标记物序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以在细菌宿主的情况下提供纯化融合标记物的成熟多肽，或者当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，标记物序列可以是源自流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
还提供了多核苷酸变体。多核苷酸变体可以包含编码区、非编码区或两者中的改变。在一些实施方式中，多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失，但是不改变编码的多肽的活性或特性的改变。在一些实施方式中，由于遗传密码的简并性，多核苷酸变体由沉默取代产生。多核苷酸变体可以出于各种原因产生，例如，以优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子变成细菌宿主如大肠杆菌所优选的那些)。
本发明包括含有上述多核苷酸的载体。本文他处描述了这些合适的载体，并为本领域技术知晓。在一些实施方式中，包含编码VH结构域或其部分的核酸的多核苷酸以及包含编码VL结构域或其部分的核酸的多核苷酸可以位于单个载体内，或者可以处于不同的载体上。相应地，公开提供了包含上述多核苷酸的一个或多个载体。
在某些方面，本公开提供了组合物，例如药物组合物，其包含上述多核苷酸或载体，任选地还包含一种或多种运载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂。
本公开还提供了包含本文所示多核苷酸或载体的宿主细胞，其中在一些情况中，宿主细胞可以表达特异性地结合FcγRIIA的结合分子。这类宿主细胞可以用于制备FcγRIIA结合分子的方法中，其中该方法包括(a)培养宿主细胞，和(b)如果结合分子由宿主细胞分泌，从宿主细胞或从培养基分离结合分子。
在一些实施方式中，编码FcγRIIA结合分子的核苷酸序列可以通过化学合成使用寡核苷酸合成器构建。可以根据所需多肽的氨基酸序列设计这类寡核苷酸，并选择在其中将产生感兴趣重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。标准方法可以用于合成编码感兴趣的分离的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可以用于构建返回翻译的(back-translated)基因。此外，可以合成包含编码特定分离的多肽的核苷酸序列的核苷酸寡聚物。例如，可以合成然后连接编码所需多肽部分的数个小寡核苷酸。单个寡核苷酸通常包含5'或3'突出端用于互补组装。
一旦组装(通过合成，定点诱变或另一种方法)，可将编码结合分子的多核苷酸序列插入表达载体中，并可操作地连接适于在所需宿主中表达结合分子的表达控制序列。例如通过核苷酸测序、限制性作图和/或在合适的宿主中表达生物活性多肽，可以确认适当的组装。为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因可以与在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列可操作地连接或相关联。
在某些实施方式中，使用重组表达载体以扩增并表达编码FcγRIIA-结合分子的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码FcγRIIA结合分子多肽链的合成或cDNA衍生的DNA片段，可操作地连接于衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件。转录单元通常包含这样的组件：(1)在基因表达中具有调节作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)适当的转录和翻译起始和终止序列，如下文详述。这类调节元件可以包括操纵子序列以控制转录。可以另外纳入在宿主中复制(通常由复制起点赋予)以及选择基因的能力以促进转化体的识别。当DNA区域在功能上相互关联时，其可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导物)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子控制序列的转录，则启动子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以允许翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。意在用于酵母表达系统的结构元件包括前导序列，使得宿主细胞能够胞外分泌翻译的蛋白质。或者，在没有前导或运输序列的情况下表达重组蛋白的情况中，蛋白质可以包括N-末端甲硫氨酸残基。该残基可任选地后续从表达的重组蛋白切割以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将依赖于宿主的选择。可以采用多种表达宿主/载体组合。能够用于真核宿主的表达载体包括例如，包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。能够用于细菌宿主的表达载体包括已知细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9和它们的衍生物，较宽宿主范围质粒(wider host range plasmid)，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
适合用于表达FcγRIIA结合分子的宿主细胞包括原核生物，酵母，昆虫或在适当启动子的控制下的高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述哺乳动物起源建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。关于蛋白质产生，包括抗体产生方法的其他信息可以在例如美国专利公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501和国际专利公开号WO 04009823中找到。
可以优选采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养细胞来表达重组FcγRIIA结合分子。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为这类蛋白通常正确地折叠，适当地修饰并具有完整的功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括HEK-293和HEK-293T，猴肾细胞的COS-7系，述于Gluzman(Cell 23:175,(1981))，和其他细胞系，包括例如，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包括非转录的元件，诸如复制起点，与待表达基因连接的合适的启动子和增强子，和其他5'或3'侧接非转录序列，和5'或3'非转录序列，如必需核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，和转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白的杆状病毒系统参见Luckow和Summers(BioTechnology 6:47(1988))。
由转化的宿主提供的FcγRIIA结合蛋白可按照任何合适的方法纯化。这些标准方法包括色谱法(例如，离子交换，亲和力和尺寸柱色谱法)，离心，差异溶解度，或通过蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶可以附着于蛋白质，以允许通过适当的亲和柱进行简单的纯化。还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和x射线晶体学的技术来物理表征分离的蛋白质。
例如，使用市售的蛋白质浓缩滤器，例如阿米康(Amicon)或MP(MilliporePellicon)超滤单元，可以首先将来自分泌重组蛋白至培养基中的系统的上清液浓缩。浓缩步骤后，可以将浓缩物施用于合适的纯化基质。或者，可以采用阴离子交换树脂，例如，具有侧接二乙氨乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白质纯化中常用的其他类型。或者，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不溶性基质，其包含磺丙基或羧甲基。最终，可以采用应用疏水性RP-HPLC介质(例如具有侧接甲基或其他脂肪质基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以进一步纯化FcγRIIA结合分子。一些或所有前述纯化步骤以各种组合还可以用于提供均质重组蛋白。
例如，可以通过由细胞沉淀最初提取，然后进行一次或多次浓缩，盐析，水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤，分离在细菌培养中产生的重组FcγRIIA结合分子。可以采用高效液相色谱(HPLC)，用于最终纯化步骤。用于表达重组蛋白的微生物细胞可以通过任何方便的方法破坏，包括冻融循环，超声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂。
本领域已知用于纯化抗体并且其他蛋白质的方法，包括例如美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中所述的那些。
V.使用FcγRIIA结合分子的治疗方法
提供了使用FcγRIIA结合分子来治疗患有与不当FcγRIIA活化相关疾病或紊乱的患者的方法，诸如通过免疫复合物沉淀、免疫复合物介导的NETosis、ANCA诱导的FcγRIIA活化和抗-血小板抗体引发的FcγRIIA活化表征的疾病或紊乱。以下讨论了用FcγRIIA结合分子治疗各种疾病和紊乱的方法和诊断方法，所述FcγRIIA结合分子能够特异性地结合FcγRIIA并且拮抗FcγRIIA活性。
在一实施方式中，治疗或预防包括向对象或患者施用或给予FcγRIIA结合分子或包含FcγRIIA结合分子的组合物，或向由对象或患者分离的组织或细胞系施用或给予FcγRIIA结合分子，其中所述对象或患者患有疾病、疾病症状或有疾病倾向。该组合物优选药物组合物。
本文所提供的FcγRIIA结合分子能够用于治疗或预防某些炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱。炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱的示例包括但不限于，例如，抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)，ANCA相关性血管炎(AAV)或巨细胞动脉炎(GCA)血管炎，舍格伦综合征，炎性肠病(IBD)，寻常型天疱疮，狼疮性肾炎，牛皮癣，甲状腺炎，I型糖尿病，免疫血小板减少症(ITP)，强直性脊柱炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎，克罗恩病，重症肌无力，视神经脊髓炎(NMO)，系统性硬化症，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，强直性脊柱炎，异位性皮肤炎，葡萄膜炎，移植物抗宿主病(GVHD)，多肌炎，皮肌炎，膜性肾病，溶血性贫血，混合性结缔组织病，硬皮病，败血症，血栓形成，急性肾损伤，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，肾小球肾炎，中毒肝损伤，中风，动脉粥样硬化，IgG介导的过敏反应，抗药物免疫复合物介导的不良反应，以及其他自身抗体或免疫复合物介导的疾病。
可利用筛选技术评估对FcγRIIA结合分子给予的临床响应，如磁共振成象(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层成像(CT)扫描、流式细胞术或荧光活化细胞分选仪(FACS)分析、组织学分析、大体病理学分析和血液化学分析，包括但不限于可通过ELISA、ELISPOT、RIA、色谱等检测到的改变。此外，进行具有FcγRIIA结合分子的疗法的对象可以感受到与疾病或紊乱相关症状的改善。
本领域技术人员熟知或可以容易地确定制备和给予FcγRIIA结合分子至有需要的对象的方法。FcγRIIA结合分子的给予途径可以是，例如，经口、胃肠外、通过吸入或局部给予。本文所用的术语“胃肠道外”包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠和阴道给药。口服剂型包括，例如，胶囊、片剂、水性悬浮液和溶液。例如，鼻气溶胶或吸入剂型可采用苯甲醇或其他合适的防腐剂，吸收促进剂以增强生物可及性，和/或其他常规增溶剂或分散剂制备成盐水溶液。
通常，合适的药物组合物可以包括缓冲液，优选地表面活性剂，任选地稳定剂等。药学上可接受的运载体或稀释剂的形式和性质可根据其将要组合的活性成分的量、给予途径和其它熟知变量来描述。也可使用包含一种或多种FcγRIIA结合分子，如本发明的抗FcγRIIA抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的混合物。在其他方法中，FcγRIIA结合分子可以直接递送至不利细胞群的位点，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。在一实施方式中，直接通过导气管给予，例如，通过吸入或鼻内给予。
如本文所述，FcγRIIA结合分子可以治疗有效量给予，用于体内治疗FcγRIIA介导的疾病，诸如炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。本发明的药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请目的，“药学上有效的量”的FcγRIIA结合分子表示足以实现益处的量，例如，缓解疾病或病症的症状或检测底物或细胞。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见Remington's PharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》),第20版.,马克出版公司(Mack Publishing Co.),宾西马尼亚州伊斯顿(2000)。
可以单剂型、多剂型或在确立的时间段内的输注中给予组合物。也可调整给药方案，以提供最优所需响应(例如，治疗或预防性响应)。可与运载体材料组合以产生剂量形式的FcγRIIA结合分子的量将取决于许多因素，包括给药的方式，靶位点，患者的生理状态(即疾病的严重程度，病史，以及进行治疗个体的年龄、身高、体重、健康和身体状况)，治疗是预防性还是治疗性的，给予的其他药物，和患者是人还是动物。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。待给予的FcγRIIA结合分子的量可以通过一位本领域技术人员确定。可使用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。
本公开还提供了使用如本文所述的FcγRIIA结合分子治疗或预防炎性、免疫介导的、或自身免疫疾病或紊乱，例如，血管炎，如ANCA或GCA血管炎，免疫性血小板减少症，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎，舍格伦综合征，类风湿性关节炎，克罗恩病，重症肌无力，GVHD，ADA介导的不良反应，NETosis和NETosis相关疾病，包括败血症，血栓形成，急性肾损伤，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，肾小球肾炎，中毒性肝损伤，中风，动脉粥样硬化形成，I型糖尿病和IgG介导的超敏反应。
本公开还提供了如本文所述的FcγRIIA结合分子在制备用于治疗或预防炎性、免疫介导的、或自身免疫疾病或紊乱的药物中的用途，所述炎性、免疫介导的、自身免疫疾病或紊乱例如，血管炎，如ANCA或GCA血管炎，免疫性血小板减少症，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎，舍格伦综合征，类风湿性关节炎，克罗恩病，重症肌无力，GVHD，ADA介导的不良反应，NETosis和NETosis相关疾病，包括败血症，血栓形成，急性肾损伤，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，肾小球肾炎，中毒性肝损伤，中风，动脉粥样硬化形成，I型糖尿病和IgG介导的超敏反应。
VI.试验和诊断
本发明的FcγRIIA结合分子可以用于诊断FcγRIIA介导的疾病，如某些炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱，和/或用于诊断性监测蛋白质水平作为临床测试过程的部分，例如，以确定给定治疗方案的效力。这类方法通常涉及使用本文所述的FcγRIIA结合分子以测定FcγRIIA表达水平。述及“测定FcγRIIA表达水平”指对第一生物样品中的FcγRIIA水平以直接(例如，通过测量或估计绝对蛋白质水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平作比较)方式进行定性或定量测量或估计。可以测量或估计第一生物样品中的FcγRIIA表达水平，并与标准FcγRIIA水平作比较，该标准取自未患该疾病的个体所得的第二生物样品或通过未患该疾病的个体群的平均水平确定。在一些方面，测试样品相较于标准药品的蛋白质水平增加指示疾病或紊乱可以通过本发明的FcγRIIA结合分子治疗。本领域应当理解的是，一旦已知“标准”FcγRIIA水平，可以将其作为标准重复用于比较。
述及“生物样品”指由可能表达FcγRIIA的个体、细胞系、组织培养物或其它细胞来源获得的任何生物样品。从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法为本领域所知。
使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如参见Jalkanen,等,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen等,J.Cell Biol.105:3087-3096(1987))，本发明的FcγRIIA结合分子可以用于在生物样品中测定FcγRIIA蛋白质水平。可使用的免疫实验包括但不限于，使用如下技术的竞争和非竞争实验系统，如蛋白质印迹、放射性免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附试验)、ELISPOT、“夹心”免疫试验、免疫沉淀试验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体固定试验、免疫放射测定试验、荧光免疫试验、蛋白A免疫实验和免疫电子显微镜等示例。这类试验是本领域中常规和熟知的。本领域技术人员将能够通过进行常规实验确定针对各测定的操作性且优选的试验条件。
可通过将结合分子与可检测物质或标记物偶联以利于检测FcγRIIA。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形酮，荧光素(fluorescein)，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的一个示例是鲁米诺。生物发光材料的示例包括荧光素酶、萤光素(luciferin)和发光蛋白质。合适的放射性材料的示例包括125I、131I、35S或3H。
原位检测可以通过这样实现：从患者移出组织样本，例如，血液样品，并向其上施用标记的FcγRIIA结合分子，通过将标记的FcγRIIA结合分子覆盖于生物样品上进行施用。尽管使用这样的程序，但是既有可能监测FcγRIIA的存在，还可以检测其在检测的组织中的分布。使用本发明，本领域普通技术人员将容易地认识到，为了实现这样的原位检测，可以对各种各样的组织学方法(如染色过程)中的任意一种进行改变。
适合确定分离的FcγRIIA结合分子的结合特性的试剂和方法为本领域所知和/或可以商购。设计用于这类动力学分析的设备和软件可商购(例如，软件，GE医疗公司(GE Healthcare)；/>软件，Sapidyne仪器公司(Sapidyne Instruments))。
VII.包含FcγRIIA结合分子的试剂盒
本公开还提供了包括FcγRIIA结合分子的试剂盒，其可以用于进行本文所述的方法。在某些实施方式中，试剂盒在一个或多个容器内包含至少一种纯化的FcγRIIA结合分子。在一些实施方式中，试剂盒包含进行检测试验所需和足以进行检测试验的所有组件，包括所用控件，进行试验的说明，和用于分析和呈现结果的任何所需软件。本领域技术人员将容易地意识到，公开的FcγRIIA结合分子可以容易地纳入本领域所熟知的建立的试剂盒样式之一中。
本公开所引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。此外，对于本文所引用或提及的任何产品的任何制造商的说明或目录通过引用纳入本文。通过引用纳入本文本的文献或其中的任何教导可以用于本发明的实践中。并不承认通过引用纳入本文本的文件是现有技术。
下列非限制性实施例进一步说明了本发明。
实施例
本公开的实施方式可以通过参照下述非限制性实施例进一步限定，所述非限制性实施例具体描述了本公开的某些抗体的制备以及使用本公开抗体的方法。本领域技术人员清楚了解，在不背离本发明范围情况下可对材料和方法实施很多修改。
实施例1.抗-FcγRIIA鼠单克隆抗体的人源化和优化
克隆、表达、纯化来自人和猕猴的FcγRIIA和FcγRIIB。
编码来自人的CD32A、CD32B胞外结构域的cDNA分子使用数据库序列作为参照以引物延伸PCR克隆合成(参见，表2)。将序列克隆到在C末端融合6xHis_Flag标签的pEBNA哺乳动物表达载体(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，目录号A10898)(HHHHHHDYKDDDDK)(SEQID NO:18)。在FreeStyle 293F细胞中表达蛋白(赛默飞世尔公司，目录号R790-07)。将在上清液中表达的蛋白质使用Ni-NTA亲和力色谱纯化(Histrap HP柱(GE医疗公司，目录号17-5248-02))然后进行尺寸排阻色谱(Superdex 200柱(GE医疗公司，目录号17-1069-01))。
表2
蛋白质 氨基酸 访问号(Uniprot)
人CD32A 131H 34-217 P12318
人CD32A 131R 34-217 P12318 H131R
人CD32B 42-223 P31994
猕猴(食蟹猴)中的FcγRIIA共有序列
猕猴FcγRIIA中存在36个氨基酸与人FcγRIIA(UniProt P12318)是非同源的，导致88％的序列同一性(aa 1-317)。表3显示了非同源性氨基酸。
表3
对应人的猕猴次要等位基因的变异以粗体显示。
在猕猴群中鉴定了另外7个编码多态性，次要等位基因频率(MAF)为>20％。表4显示了单核苷酸多态性变异。
表4
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MAF>20％以粗体显示；对应主要人等位基因的次要等位基因以斜体字显示。
图1A-1C显示了共有猕猴序列和与人FcγRIIA的比对。
猕猴CD32A蛋白
根据IV3多肽周围的多态性制备猕猴CD32A的三种形式(Ramsland等,J.Immunol.187:3208-3217(2011))。这些蛋白质在GeneArt(生命技术公司)的HEK细胞中表达，并通过Ni-NTA亲和力色谱利用c末端6xhis标签纯化。
SEQ ID NO：11
＞人_CD32A_131H
SEQ ID NO：12
＞人_CD32A_131R
SEQ ID NO：13
＞人_CD32B
SEO ID NO：14
＞猕猴_CD32A_v1
SEQ ID NO：15
＞猕猴_CD32A_v2
SEQ ID NO：16
＞猕猴_CD32A_v3
SEQ ID NO：17
＞猕猴_CD32B
蛋白质修饰
使用EZ连接的磺基-NHS-LC-生物素(赛默科技公司/Pierce，目录号21335)通过游离胺将本文所用的IgG和修饰的蛋白质生物素化。将生物素试剂溶解于无水二甲基甲酰胺中，并用在D-PBS(达氏磷酸盐缓冲盐水)中的1M NaHCO3将基于PBS的蛋白质溶液调节至pH～8。使用EZ连接生物素-BMCC(Perbio/Pierce21900)通过游离的巯基将本文所用的CD32蛋白质生物素化。将生物素试剂溶解于无水二甲基甲酰胺，并与D-PBS蛋白溶液3：1混合。在所有情况下通过MALDI-TOF质谱分析法评估标记掺入，并使用D-PBS平衡的一次性SephadexG25柱通过缓冲液交换清除未反应的试剂。对于生物素化，使用从氨基酸序列计算的消光系数通过280nm吸光度确定最终蛋白质浓度。
IgG分子克隆和表达
将可变结构域转变成全免疫球蛋白G1(IgG1)抗体形式，基本如Persic等(Gene187(1):9-18(1997))所示并具有下述修改。在该表达载体中包括OriP片段，以促进CHO-瞬时细胞的使用以及允许附加型复制。将可变重链(VH)结构域克隆入含有人重链恒定结构域和调节元件的载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG1重链。包含3个突变的重链恒定结构域显示出显著地降低Fc效应功能(Oganesyan等,Acta Crystallographica Section D:Biological Crystallography64(6):700(2008))，以避免通过全长抗体的Fc部分的CD32A接合。类似地，将可变轻链(VL)结构域克隆入表达人轻链(κ)恒定结构域和调节元件的载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链。为获得IgG，将重链和轻链IgG表达载体转染入CHO-瞬时哺乳动物细胞(Daramola等.,Biotechnol Prog.
30(1):132-41(2014))。IgG经表达分泌入培养基。在纯化之前将收获物过滤，然后采用A蛋白层析纯化IgG。将培养物上清液加载于大小合适的A蛋白陶瓷柱(生物谱公司(BioSepra))上，用50mM Tris-HCl pH 8.0，250mM NaCl洗涤。利用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)将结合的IgG从柱上洗脱，加入Tris-HCl(pH 9.0)中和。利用Nap10柱(安玛西亚公司(Amersham)，目录号17-0854-02)将洗脱物质经缓冲液置换入PBS，利用基于IgG的氨基酸序列的消光系数，通过分光光度法测定IgG的浓度(Mach等,Anal.Biochem.200(1):74-80(1992))。采用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析纯化IgG的凝聚和降解纯度。
IV.3Ab的人源化
小鼠单克隆抗体IV.3首先述于1986(Looney RJ.等,J.Immunol.
136(5):1641)。杂交瘤细胞获得自ATCC，并且对IV.3的重链可变(VH)和轻链可变(VL)区段进行测序(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)。
小鼠mAb IV.3可变结构域的人源化通过将IV.3的重链和轻链互补决定区(CDR)移植于人种系框架(FW)来进行。IV.3的VH和VL结构域氨基酸序列与IMGT数据库中已知的人种系序列比对(Lefranc,M.P.等,Nucl.Acids Res.
37(数据库卷):D1006-D1012(2009))，并且通过序列相似性鉴定适当的人种系，包括匹配关键残基(游标区(Vernier zone)，经典残基和/或VH/VL界面残基)，免疫原性(种系频率)，稳定性和表达。对于IV.3抗体的VH结构域，选择的人种系为IGHV1-3*01/IGHJ4。对VL结构域，其是IGKV2-28*01/IGKJ2。
设计一系列嵌合可变重链和轻链具有一个或多个用等价选定的人FW替换的小鼠FW区。所有的CDR和FW区由Kabat限定。完整小鼠和嵌合IV.3可变区为CHO表达优化的密码子，并且通过基因合成(生命科技公司(Life Technologies))合成。这些随后被表达为如上所述的完全免疫球蛋白G1(IgG1)抗体，以产生部分和完全人源化IV.3变体的组。抗体在如实施例11所述的表位竞争试验中表征。简言之，使用同质时间分辨荧光(Cisbio国际公司(Cisbio International))检测IV.3IgG(肝细胞技术公司(Stemcell Technologies)，目录号01470)与生物素化人CD32A 131H的结合。IV.3和CD32A之间的荧光共振能量转移(FRET)分别使用DyLight 649偶联的抗-小鼠抗体和链霉亲和素铽穴状化合物(Terbium cryptate)(Cisbio国际公司，产品号610SATLB)检测。信号通过添加样品IgG破坏，所述样品IgG与IV.3竞争CD32A结合。IV.3的VH和VL链的完全人源化在该试验中与效力的10倍损失关联。将小鼠残基使用标准分子生物学技术导入回人轻链种系框架，其将效力恢复至小鼠IgG的5倍以内(突变Y36F)。获得的数据例示于图2。随后，去除VLCDR1(N28L)中潜在的脱氨基位点以降低制造过程中化学修饰的风险。图3示出比对亲本VH和VL链(IV.3)，最终人源化的VH和VL链(CamIV3)和选定的人种系序列。
优化CamIV3 Ab
使用标准分子生物学技术在CamIV.3的VH CDR2和VL CDR1的选择位置进行单个氨基酸取代。变体直接表达为IgG，并在如实施例11所述的IV.3表位竞争试验中定量和筛选上清液。将VH CDR2和VL CDR1中有益的个别突变组合，并表达和筛选IgG。选择6个优化的CamIV.3变体进行进一步分析：32LO0350、32LO0351、32LO035、32LO0354、32LO0355和32LO0356。NIP228IgG1TM用作阴性对照。图4示出这些变体在IV.3表位竞争试验中的活性。如表5所示，优化的变体与CamIV3仅在HCDR2和LCDR2序列上不同。
表5
IV.3与氨基酸区别以粗体表示。
IV.3、CamIV3、32LO0350、32LO0351、32LO0352(MEDI9600)、32LO0354、32LO0355和32LO0356共有的CDR序列示于表6(还参见图3)。
表6
CDR 序列 标号
HCDR1 NYGMN SEQ ID NO:29
HCDR3 DYGYDDPLDY SEQ ID NO:30
HCDR3 GDYGYDDPLDY SEQ ID NO:45
LCDR2 RMSVLAS SEQ ID NO:31
LCDR3 MQHLEYPLT SEQ ID NO:32
克隆32LO0350、32LO0351、32LO0352、32LO0354、32LO0355和32LO0356的VH和VL结构域的氨基酸序列示于表7。
表7
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IV.3和32LO0352对人和猕猴CD32A的亲和力
IV.3和32LO0352的亲和力通过BiacoreTM分析测量。简言之，人IgGl-TM(嵌合IV.3或32LO0352)在Cl-蛋白G芯片上捕获。将人CD32A_131Arg、人CD32A_131H或猕猴CD32A(形式3)的连续稀释(在log2步骤中25nM至0.3906nM)用作分析物。将数据与1：1朗格缪尔(Langmuir)解离模型拟合，并示于表8(2个独立实验的平均数据)。
表8
实施例2.优化IV.3Ab对人FcγRIIA(CD32A)结合的特异性
为了检测人源化的、优化的IV.3Ab的特异性，通过ELISA评估抗体与重组FcγRI、FcγRIIA-131H/H同种异型、FcγRIIB、FcγRIII–158F同种异型或FcγRIII-158V同种异型的结合。R347 Tm Ab用作人IgG1同种型对照，而抗体H2B6-Tm、3G8、16-115分别用作FcγRIIB、FcγRIII、FcγRIIA和FcγRI的阳性对照。这4个人源化、优化的IV.3克隆，即32LO0350、32LO0352、32LO0354和32LO0355表现出对人FcγRIIA(图5A)的高结合亲和力，但是不对其他FcγR(图5B-5E)。这些数据证明，人源化的、优化的抗体变体保持其对FcγRIIA的特异性。重要地是，尽管FcγRIIA和FcγRIIB胞外结构域中的相似性，这些抗体在该试验中结合FcγRIIA，而非FcγRIIB。
实施例3.MEDI9600(32LO0352)与静脉内免疫球蛋白结合竞争
为了确定MEDI9600是否具有竞争或非竞争作用模式，用IgG进行了结合竞争试验。通过流式细胞术评估MEDI9600与表达FcγRIIA的人中性粒细胞在静脉内免疫球蛋白(IVIG)存在或不存在的情况下的结合，这模拟了在全血中循环免疫球蛋白的生理浓度。如图6所示，MEDI9600以剂量依赖性方式结合表达人FcγRIIA的中性粒细胞。MEDI9600结合在中性粒细胞表面的人FcγRIIA的EC50值为0.03nM(图6)。在10mg/mL IVIG存在的情况下，MEDI9600结合在中性粒细胞表面的人FcγRIIA的EC50值为增加至3.34nM(图6)，这表明MEDI9600与免疫球蛋白竞争结合FcγRIIA。用人IgG1同种型R347-TM对照并未观测到结合(图6)。这些数据表明MEDI9600是配体-阻断抗体。
实施例4.优化的IV.3Ab在全血试验中内化人和猕猴FcγRIIA
鼠IV.3Ab已经显示出将内化FcγRIIA，并随后在溶酶体中降解受体13。因此，抗体结合后从细胞表明去除FcγRIIA可以用作受体内化的测量。我们在全血内化试验中验证这一作用模式并评估抗-FcγRIIA抗体的效力。该试验形式用于模拟生理条件下存在的竞争性免疫球蛋白水平和细胞组合物。之前已经显示，FcγRIIA的两种常见人多态性变体，131H和131R差异性地结合IgG亚型14。因此，也评估了抗体内化来自对131H和131R纯合的供体的FcγRIIA的能力。为了促进药理学和毒理学评估，还在来自猕猴的全血中评估了抗体内化来自单核细胞的FcγRII的能力。
嵌合和优化的抗体内化来自单核细胞表面的FcγRIIA，所述单核细胞来自人131H/H供体(图7A)和人131R/R供体(图7B)。优化的IV.3Ab表现出相较于来自131H/H和131R/R供体的亲本IV.3嵌合Ab从2倍至5倍的效力改善。相较于嵌合IV.3抗体对131H/H供体的0.19nM的EC50，优化的抗体的EC50范围在0.04nM至0.09nM，而相较于嵌合IV.3抗体对131R/R的0.20nM的EC50，优化的抗体的EC50范围在0.04nM至0.06nM(图7A、7B)。优化的抗体还内化来自猕猴的单核细胞表面上的FcγRIIA(图7C)。优化的抗体的效力比嵌合IV.3Ab高7倍以上。整体考虑，这些数据证明，优化的IV.3抗体变体中导入重链和轻链Fab区域的变化是有益的。FcγRIIA结合特异性被保留，鼠残基被去除，并且重要的改变使抗体的效力增强，高于并超过生理相关分析中的抗体的亲本型。
在其他实验中，MEDI9600介导的受体内化通过共聚焦显微分析确认。在0时间处，CD14(作为阴性对照)和FcγRIIA显示出细胞表面染色。然而，在于37℃孵育1小时后，几乎全部FcγRIIA内化被MEDI9600的结合刺激，而CD14保留在细胞表面(图7D)。
实施例5.优化的IV.3Ab阻断来自人和猕猴PBMC的RNP-IC诱导的IFNα表达
我们评估了抗-FcγRIIA抗体抑制核糖核蛋白免疫复合物(RNP-IC)介导的I型干扰素α(IFNα)产生的能力。用来自具有131H/H或131R/R单体型的健康供体的细胞以及来自猕猴的细胞检测抗体的活性。优化的IV.3Ab展现出相较于使用来自131H/H和131R/R供体的细胞的亲本IV.3抗体在RNP-IC诱导的I型IFNα试验中约2倍的效力增长(图8A、8B)。优化的抗体对131H/H供体的效力比人源化的CamIV.3抗体高约3-8倍(图8A)，对131R/R供体比CamIV.3高约5-12倍(图8B)。4个优化的抗体中的3个在使用猕猴细胞的RNP-IC诱导的IFNα试验也表现出比IV.3的亲本和人源化形式高的效力(图8C)。
这些优化的人抗-FcγRIIA抗体阻断免疫复合物介导的I型IFN诱导的效力增加与全血内化试验中抗体介导的FcγRIIA摄取中的改善一致。因为，IFNα似乎在SLE的发病机理中起重要作用，这些数据支持将这些人源化、优化的抗-FcγRIIA抗体用于SLE治疗。
实施例6.优化的IV.3Ab——克隆32LO0352(MEDI9600)特异性地阻断抗
-中性粒细胞胞质抗体(ANCA)诱导的中性粒细胞活化
中性粒细胞活化的标记物是活性氧物质的释放，其可以在亚铁细胞色素C还原试验中测量，或通过基于DH123试验的流式细胞术15测量。优化的IV.3Ab克隆32LO0352(MEDI9600)抑制ANCA诱导的中性粒细胞活化的能力在亚铁细胞色素C还原试验中首先检测。MEDI9600特异性地阻断ANCA-(抗-PR3 Ab和抗-MPO Ab)诱导的中性粒细胞产生活性氧物质(图9A、9B)。为了确定MEDI9600能否非特异性地影响中性粒细胞活化，用PMA在FcγRIIA抗体存在或不存在的情况下处理中性粒细胞。PMA诱导活性氧物质，但是用MEDI9600抑制FcγRIIA对PMA诱导的中性粒细胞活化没有作用(图9C)。这些数据证明MEDI9600特异性地阻断抗体介导的中性粒细胞活化诱导，然而中性粒细胞活化的其他机制可能不被该处理阻碍。
MEDI9600阻断ANCA诱导的中性粒细胞活化的能力还通过基于更灵敏的流式细胞术的DHR123试验评估。使用该试验形式，MEDI9600再次以剂量依赖性方式抑制抗-MPO和抗-PR3 Ab诱导的中性粒细胞活化，然而同种型对照抗体没有作用(图9D、9E)。前述实验都使用市售可得的抗-MPO和抗-PR3 Ab作为刺激物。为了验证优化的IV.3Ab抑制ANCA诱导的中性粒细胞活化的能力，从具有针对PR3或MPO的自身抗体的AAV患者的血清纯化IgG，并用作中性粒细胞的刺激物。使用基于流式细胞术的DHR123试验，MEDI9600显著地阻断通过AAV患者IgG引起的中性粒细胞活化(图9F、9G)。
整体考虑，这些数据表明MEDI9600抗-FcγRIIA Ab能够特异性地阻断抗-中性粒细胞胞质抗体(ANCA)诱导的中性粒细胞活化，并且支持使用人源化、优化的MEDI9600抗-FcγRIIA抗体治疗ANCA相关血管炎。
实施例7.优化的IV.3Ab(MEDI9600)保护小鼠免于抗-血小板抗体诱导的血小板减少症
使用转基因人FcγRIIA鼠-活化FcγR-缺陷小鼠，检测优化的IV.3Ab(MEDI9600)阻断抗-血小板抗体诱导的血小板减少症的功效，用抗-血小板抗体处理FcγRIIA转基因小鼠导致血小板的快速消耗(图10A)。优化的IV.3Ab(MEDI9600)的预防性剂量在该模型中显著地阻断血小板清除(图10B、10C)。重要地，用MEDI9600抑制血小板消耗与FcγRIIA在血小板上的内化相关。
整体考虑，这些数据表明人源化抗-FcγRIIA抗体——MEDI9600在体内抑制抗-血小板抗体诱导的血小板减少症，并且支持将该抗体用于免疫血小板减少症的治疗。
实施例8.通过MEDI9600阻断FcγRIIA对中性粒细胞功能没有不利作用
中性粒细胞通过感应感染和组织损伤在宿主防御，并且启动急性炎症反应起重要作用，所述急性炎症反应用作招募白细胞，清除感染，参与适应性免疫系统并促进修复。在暴露于损伤后，中性粒细胞快速地通过血管移动至组织损伤位点，根据源于病原体和受损的宿主细胞的化学信号。中性粒细胞通过与模式识别受体、互补受体和免疫球蛋白受体的相互作用直接与病原体接合，而这导致释放毒性物质，其杀伤病原体和/或通过吞噬作用清除病原体。因为中性粒细胞功能在宿主防御中十分重要，我们评估了EDI9600的FcγRIIA阻断对不同中性粒细胞功能的影响。
首先，我们检测了FcγRIIA的阻断在合成三酰化脂蛋白Pam3Sk4存在的情况下是否将影响中性粒细胞活化，所述三酰化脂蛋白Pam3Sk4是一种toll样受体2(TLR2)激动剂以及细菌脂蛋白酰化氨基末端的模拟物。抗-TLR2 Ab抑制Pam3Sk4-诱导的中性粒细胞活化，然而MEDI9600抗-FcγRIIA抗体和同种型对照IgG抗体对TLR2介导的中性粒细胞活化没有作用(图11A)。
接下来，我们检测了阻断FcγRIIA是否将影响IL-8诱导的中性粒细胞移动。IL-8诱导的中性粒细胞移动并不受MEDI9600或对照抗体影响(图11B)。
最后，我们检测了MEDI9600是否影响抗-Psl mAb介导的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的调理吞噬细胞杀伤实验(OPK)。抗-Psl mAb之前显示在中性粒细胞存在的情况下将介导铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的效力补体依赖性杀伤16。在该试验中使用发光铜绿假单胞菌以评估细菌杀伤。发光的水平与活细菌的水平关联。中性粒细胞用MEDI9600、抗-FcγRIIB Ab或抗-FcγRIII Ab预孵育，然后用发光细菌孵育2小时。MEDI9600在抗-Psl mAb Ps10096存在的情况下对中性粒细胞杀伤铜绿假单胞菌的能力具有最小作用，而FcγRIII的阻断明显抑制OPK活性(图11C)。这些数据表明，抗体介导的细菌临床耐药菌株的吞噬作用很大程度上独立于FcγIIA，并且该受体的阻断预计不会不利地影响中性粒细胞对细菌的吞噬作用。
整体考虑，这些数据表明，FcγRIIA阻断将不会不利地影响正常中性粒细胞功能，如趋化性，通过病原相关分子模式诱导的活化和吞噬作用。
实施例9.MEDI9600对来自全血的细胞的蛋白质诱导没有作用
抗体治疗的不利作用，如细胞因子风暴可以通过检查全血的蛋白质概况来检测。为了评价MEDI9600的影响，在5个正常健康供体中评估未刺激的全血以及通过MEDI9600、Ig-IC或RNP-IC刺激的全血的基因表达概况。Ig-IC或RNP-IC对蛋白质表达概况具有显著的影响，并且如所预期，未处理的和MEDI9600刺激的条件之间的表达概况没有差异(图12)。这些数据表明，MEDI9600在全血中不活化细胞，并且是良好安全性概况的指示。
实施例10.MEDI9600：猕猴中单剂量药代动力学和探索性药效学研究
该研究的目的是表征当以单剂量通过静脉内注射给予时猕猴中MEDI9600的药代动力学/药效学关系。该研究的结果用于预示药代动力学/药效学建模，其支持向人给予MEDI9600。
药代动力学是非线形的；C最大/剂量、AUC(0-∞)/剂量和半衰期的观察显示出它们随剂量增加的明显趋势(图13A)。对于猕猴中的人IgG1抗体，获自非房室分析的终末半衰期短于预期，给予1mg/kg的组仅为1.08-1.2天，对于给予100mg/kg的组增加至2.84-4.3天。然而，半衰期随剂量增加的趋势以及对药代动力学曲线的观察揭示药代动力学概况与靶标介导的抗体清除一致。对于100mg/kg的最高剂量，其具有较少来自靶标介导的清除的干扰，0.024-0.052L/kg的初始分布体积与血浆体积相似，如对人IgG1抗体所预期的。药代动力学可变性较低，对于早期样品的变异系数值约为20％或更少。当接近终末期时，药代动力学变得显著地多变。
以1、10或100mg/kg给予的MEDI9600单剂量在单核细胞和粒细胞诱导FcγRIIA荧光强度的剂量响应下降(图13B、13C)。该下降是完全可逆的，完全恢复首先在给予1mg/kg的动物中实现，然后是给予10mg/kg的动物，和给予100mg/kg的动物。单核细胞和粒细胞的FcγRIIA表达显示了用MEDI9600给药的剂量依赖性抑制，并且对于单核细胞和粒细胞是相似的。在30分钟的时间点观测到抑制，这表明给药的快速抑制。这种抑制对组1(1mg/kg)仅有部分，但似乎对组2和组3造成最大抑制，这通过在其最低点的这些剂量水平实现类似的抑制来判断。.经历几天到几周的剂量依赖性周期，FcγRIIA表达水平返回基线。值得注意的是，该快速抑制和较慢的恢复反映了MEDI9600的药代动力学概况。具体地，恢复到FcγRIIA表达基线与药代动力学暴露降低至低于1,000ng/ml的浓度相匹配；对于组1这出现于给药后大约7天，对于组2这出现于给药后大约14天，对于组3这出现于给药后大约49天，这表明FcγRIIA表达形式中药代动力学暴露和药效学响应之间牢固且直接的关系。
总而言之，经由静脉内注射以1、10或100mg/kg的剂量水平、2mL/kg的剂量体积给予雄猴MEDI9600一次。给予MEDI9600导致单核细胞和粒细胞上FcγRIIA表达的剂量依赖性抑制，然后缓慢恢复到基线水平，与MEDI9600药代动力学暴露的持续时间一致，这表明药代动力学暴露和药效学响应之间牢固的关系。
此外，还在研究期间评估了安全终点(safety end point)；MEDI9600的给予对D-二聚体浓度或对临床观测没有影响，包括定性食物消耗，体重，血液学，凝血和临床化学测试。注射位点处MEDI9600相关的瞬时红斑和水肿被认为是无害的。
实施例11.材料和方法
猕猴FcγRIIA测序
使用源自越南来源的单个动物的可及猕猴基因组序列草图设计引物(北京基因组研究所(Beijing Genome Institute),2011)。利用包括60个个体(20个中国，20个越南，20个毛里求斯)的蛋白质科学猕猴基因组DNA库对FcγIIA进行测序。使用凯杰公司(Qiagen)HotStar Taq主混合物进行PCR扩增，然后对PCR产物进行内部测序。原始序列比对，共有转录本构建(build)，SNP变体鉴定和与人FcγIIA(CCDS 44264/UniProt P12318)的比较使用SeqMan(Lasergene公司)和CloneManager软件完成。
使用内部猕猴基因组浏览器确认序列变异，所述内部猕猴基因组浏览器包含来自48个个体(16个中国、16个越南、16个毛里求斯)的全部外显子组序列数据。源自该内部数据 库的次要等位基因频率示于表4。使用来自6个个体的血液源性cDNA确认FcγIIA外显子排列。
Fcγ受体结合试验
在米迪缪尼公司(MedImmune)制造重组FcγRI，FcγRIIA-131H/H同种异型，FcγRIIB，FcγRIII–158F同种异型和FcγRIII-158V同种异型。抗-FcγRIII抗体(3G8)购自阿柏堪穆公司(Abcam)(马萨诸塞州剑桥)。抗-FcγRI Ab(16-115)购自抗体在线公司(antibody-online)(乔治亚州亚特兰大)。抗-FcγRIIB Ab和同种型对照R347-Tm在米迪缪尼公司(MedImmune)制造。
用2μg/ml的Fcγ受体(FcγRI，FcγRIIA-131H/H同种异型，FcγRIIB，FcγRIII–158F同种异型或FcγRIII-158V同种异型)过夜4℃涂覆Costar 96孔微孔板(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，宾夕法尼亚州)。用200μl的洗涤缓冲液(含有0.1％吐温20的PBS)洗涤板5次，用含有5％奶粉的PBS的阻断缓冲液于室温阻断1小时，并用洗涤缓冲液再洗涤5次。向孔加入三倍连续稀释的测试抗体或对照抗体(R347-Tm)，一式两份。将平板于室温孵育2小时，并用洗涤缓冲液洗涤5次。抗体与FcγR的结合这样检测，通过向孔添加50μl的山羊抗-人Fc-HRP(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，宾夕法尼亚州)并于室温孵育1小时，洗涤10次，并添加50μl TMB底物(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology)，马萨诸塞州)。用50μl 0.2M H2SSO4终止颜色反应，并使用分光光度计(分子设备公司(Molecular Devices)，加利福尼亚州)测量A405nm处的吸光度。
表位竞争试验
为了鉴定前导优化期间的IgG改善，使用利用同质时间分辨荧光(Cisbio国际公司)的表位竞争试验评估抗体样品，其中测量IV.3IgG与生物素化人CD32a 131H的结合(肝细胞科技公司(Stemcell Technologies)，01470)。
IV.3IgG与生物化人CD32a 131H的结合通过使用DyLight 649偶联的抗-小鼠检测抗体链霉亲和素铽穴状化合物(Cisbio国际公司，610SATLB)检测来测量IV.3和生物素化人CD32a 131H之间的FRET信号测量。该试验用于通过测量IV.3IgG和生物素化人CD32a 131H之间相互作用的抑制来鉴定粗制IgG样品中的改善。
在包含PBS(英杰公司(Invitrogen)14190-185)、0.2％BSA(西格玛公司(Sigma)A9576)和0.4M KF(BDH公司103444T)的试验缓冲液中配制IV.3IgG的8.0nM溶液。将5μl添加至试验平板(384黑色，浅孔，Costar，3676)以获得2.0nM的最终浓度。在试验缓冲液中制备DyLight 649偶联的抗-小鼠检测抗体的40nM溶液，并将5μl添加至试验平板以获得10nM的最终浓度。将5μl的各IgG样品使用MiniTrakTM(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))转移至试验平板。将含有4nM生物素化人CD32a 131H和2.67nM链霉亲和素铽穴状化合物的预混合溶液制备为4x母液。将5μl添加至试验平板以达到1nM生物素化人CD32a 131H和0.67nM链霉亲和素铽穴状化合物的最终浓度。通过审略生物素化人CD32a 131H限定各平板的非特异性结合孔(阴性对照)。然后将试验平板于室温下孵育3小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。
通过计算各样品665/620nm比，然后通过各样品的％ΔF值分析数据。
使用665/620nm比，用公式1对样品干扰进行校正。
公式1：
然后使用公式2计算各样品的％ΔF值。
公式2：
使用公式3计算％特异性结合。
公式3：
％特异性结合＝样品的％ΔF X 100
总结合对照的％ΔF
为了确认改善，粗制或纯化IgG样品在相同的试验中通过使用葛莱娜(Greiner)384孔V底平板(葛莱娜781280)在试验缓冲液中连续稀释样品评估。使用BravoTM(安捷伦(Agilent))将5μl各scFv稀释物一式两份转移至试验平板(384黑色，浅孔，Costar，3676)。然后如上所述添加试验试剂。
如之前所述，通过计算各样品665/620nm比，然后通过％ΔF值分析数据。665/620nm比用于校正样品干扰，如公式1所述。使用公式2计算％ΔF。使用等式3计算各条件的％特异性结合。
利用4-参数逻辑方程(公式4)，采用图垫公司Prism软件通过曲线拟合测定IC50值。
公式4：
Y＝底+(顶–底)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))
X是浓度的对数。Y是特异性结合。
Y从“底”开始，以S形上升到“顶”。
选择性和交叉反应性的HTRF结合试验
使用同质时间分辨荧光试验(Cisbio国际公司)评估前导抗体的选择性，其中测量IgG与生物素化人CD32b的结合。使用同质时间分辨荧光试验评估交叉反应性，其中测量IgG与猕猴CD32a和CD32b的结合。
通过使用链霉亲和素铽穴状化合物(Cisbio国际公司，610SATLB)和与XL665(Cisbio国际公司，61HFCXLB)检测试剂偶联的抗人Fc抗体测量IgG和生物素化CD32之间的FRET信号，评估纯化的IgG与生物素化CD32的结合。
制备由PBS(英杰公司14190-185)、0.2％BSA(西格玛公司A9576)和0.4M KF(BDH103444T)组成的试验缓冲液，并添加5μl至试验平板(384黑色，浅孔，Costar，3676)。CD32在试验缓冲液中稀释为4x工作母液。将人CD32b、猕猴CD32a和猕猴CD32b以20nM制备，并将5μl添加至试验平板以达到5nM的最终浓度。使用葛莱娜384孔V底平板(葛莱娜781280)在试验缓冲液中一式三份制备IgG的连续稀释，并将5μl各肽的稀释物使用BravoTM(安捷伦公司)转移至试验平板。分别将链霉亲和素铽穴状化合物和抗-人Fc IgG XL665在试验缓冲液中稀释至0.67nM和15nM(最终浓度)，并将5μl该预混合的溶液添加至试验平板。通过将样品IgG用5μl试验缓冲液替换来限定阴性对照。然后在室温下将试验于室温下温育3小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。
如之前所述，通过计算665/620nm比，然后通过％ΔF值分析数据(参见公式的表位竞争方案)。665/620nm比用于校正样品干扰，如公式1所述。使用公式2计算％ΔF。使用等式3计算各条件的％特异性结合。
Octet IgG定量
使用与OctetRED384系统(ForteBio公司)连接的蛋白质A生物传感器(ForteBio公司)对IgG样品定量。
25μl的样品与25μl试验缓冲液混合，所述试验缓冲液由PBS、0.02％吐温20、1mg/ml BSA(0.1％)组成。通过生物层干扰量度法(Bio-Layer Interferometry，BLI)测量样品中IgG与蛋白质A生物传感器结合的速率。使用已知浓度的对照IgG生成IgG标准曲线，并从500μg/ml的最高最终浓度的1/2稀释系列中制备12个点。Octet系统软件由具有已知浓度的标准计算结合速率以生成标准曲线。结合速率与标准浓度成比例。
使用OctetRED384系统提供的数据分析软件包分析数据。将数据上传到软件中，并且使用初始斜率和剂量响应–4PL(默认；未加权的)方程进行分析。由与标准曲线的比较计算未知的浓度。
使用IVIG的结合竞争试验
将人中性粒细胞重悬于阻断缓冲液[补充有10％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)]中，并转移至圆底96孔培养平板(0.5x106细胞/孔)。在10mg/mL静脉内免疫球蛋白(IVIG)存在或不存在的情况下，用递增浓度的荧光标记MEDI9600或R347-Tm对照抗体(从0.0003至66.67nM的范围)于4℃孵育细胞30分钟。孵育后，用冷PBS洗涤细胞，然后通过使用LSRII(BD公司；新泽西州富兰克林湖市)的流式细胞术评估结合细胞的抗体的平均荧光强度(MFI)。使用GraphPad Prism 6软件中的非线形拟合公式计算结合的EC50。
全血内化试验
为了通过共聚焦显微分析证明人单核细胞中MEDI9600介导的FcγRIIA内化，由收集到CPT管中的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)。首先用CD14-Alexa 488对PBMC染色，并将CD14阳性单核细胞分选。然后用MEDI9600-Alexa 647在冰上对细胞染色30分钟，洗涤1次并于室温孵育用于共聚焦显微分析。使用由莱卡DMI6000 B倒置显微镜组成的莱卡TCSSP5共焦系统(莱卡微系统公司(Leica Microsystems))进行细胞成像。在附图说明中指出的时间点获取图像，并使用LAS AF版本2.2.1莱卡应用套件软件(莱卡微系统公司)进行分析。
抗-FcγRIIA-Tm Ab介导的受体内化通过基于FACS的试验检测。将人或猕猴血液收集至肝素管。将未标记的抗-FcγRIIA或对照抗体的3倍稀释系列于37℃添加至50μl全血2小时。用FACS缓冲液(5％肽牛血清的PBS)洗涤全血，并用Ab混合物(CD14-PE、CD20-太平洋蓝和IV.3-Alexa 647)在冰上染色1小时。洗涤后，用1ml RBC裂解缓冲液(Biolegend公司(Biolegend)，加利福尼亚州)于室温孵育细胞3分钟，于150μl FACS缓冲液中洗涤并重悬。在FACS LSRII流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Bioscience)，加利福尼亚州)上测量人或猕猴单核细胞的FcγRIIA表面表达，并使用Flowjo软件进行分析。
核糖核蛋白-免疫复合物(RNP-IC)诱导的I型IFNα试验
FcγRIIA阻断对RNP-IC诱导的IFNα表达的影响通过ELISA检测。简言之，100μl人或猕猴PBMC(5x106细胞/m1)在组织培养烧瓶中孵育1小时。收集非粘附细胞，并且用从300μg/ml至0.001μg/ml以3倍稀释的抗-FcγRIIA Ab或其同种型对照(R347-Tm Ab)于37℃孵育该单核细胞耗尽部分。然后用100μl RNP-IC(1μg/ml RNP(生物介质公司(Biomeda))/2％抗-RNP抗体血清反应阳性SLE血清)处理细胞16小时。使用人IFNαELISA试剂盒(PBL试验科学公司(PBL Assay Science),新泽西州)测定细胞培养上清液中IFNα的浓度。
分离人中性粒细胞
将来自正常志愿者的外周血抽入含有肝素的真空管，并将血液在HBSS中1:1稀释。通过在lymphoprep密度梯度上离心分离中性粒细胞。通过RBC裂解缓冲液去除红细胞(Biolegend公司，加利福尼亚州)。使用人中性粒细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technologies)，加利福尼亚州)将中性粒细胞进一步富集。
使用亚铁细胞色素C还原试验检测超氧化物产生
通过亚铁细胞色素C还原试验测量由抗-中性粒细胞胞质抗体(ANCA)或乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)诱导的中性粒细胞超氧化物产生。简言之，分离的人中性粒细胞以4x 106细胞/ml悬浮于HBSS/20mM Hepes/无Ca2+、Mg2+缓冲液中，并用重组2ng/ml TNF-α(R&D系统公司(R&D Systems)，明尼苏达州)初免15分钟。为了评估FcγRIIA阻断的作用，在将中性粒细胞添加到96孔组织培养板之前，将其用10μg/ml MED19600于室温预孵育30分钟。用100μl的0.5％奶粉的HBSS/20mM Hepes于室温预处理96孔组织培养板1小时。用洗涤缓冲液(HBSS/20mM Hepes/无Ca2+、Mg2+缓冲液)洗涤平板3次。将50微升的2x细胞色素C缓冲液(0.2mM细胞色素C、1mM MgCl2、2mM CaCl2)添加到各孔，然后是10μl的刺激物(10μg/ml的抗-PR3 Ab，30μg/ml的抗-MPO Ab或20nM PMA)和50μl的中性粒细胞。然后立即将平板放入预热的酶标仪(37℃)，以37℃连续测量2小时OD(550nm和490nm)。
使用流式细胞术(DHR 123试验)检测超氧化物产生
通过流式细胞术测量由ANCA诱导的中性粒细胞超氧化物产生。将中性粒细胞(1x105/ml)重悬于具有1μg/ml二氢若丹明(dihydrohodamine)123(DHR)(生命科技公司，加利福尼亚州)的RPMI 1640缓冲液中。用10μg/ml MED19600、抗-FcγRIII Ab(Biolegend公司，加利福尼亚州)或同种型对照Ab于室温预孵育一些细胞30分钟。然后用30μg/ml抗-MPO Ab(阿柏堪穆公司(Abcam)，马萨诸塞州)、10μg/ml抗-PR3 Ab(阿柏堪穆公司，马萨诸塞州)或由健康志愿者或AAV患者血清纯化的80μg/ml IgG(组织溶液公司(Tissue Solutions)，UK)于37℃孵育30分钟，以200g离心，以5x106细胞/ml的密度重悬于冰冻的HBSS。通过LSRII流式细胞仪(BD生物科学公司，加利福尼亚州)测量平均荧光强度(M.F.I)，并使用Flowjo软件进行分析。
中性粒细胞迁移试验
使用具有5μm过滤器(神经探针公司(Neuro Probe)，马里兰州)的96孔Chemo TX系统评估中性粒细胞迁移。人IL-8(R&D系统公司，明尼苏达州)在包含1％BSA的RPMI 1640中稀释到20nM的最终浓度，并置于下部室。在相同培养基中洗涤细胞并悬浮。在将人中性粒细胞添加到上部室内之前，用10μg/ml MED19600或同种型对照抗体于37℃孵育该细胞30分钟。允许中性粒细胞迁移1小时。迁移至下部室的细胞通过流式细胞术计数。迁移指数是响应趋化试剂迁移的细胞数量与在其不存在情况下迁移的细胞数量的比。
中性粒细胞活化试验
将人血收集到EDTA管中，将50μl等份血液用抗-TLR2 Ab、MEDI9600或同种型对照Ab以10μg/ml于37℃孵育2小时。将50微升Pam3CSK4(英杰公司，加利福尼亚州)添加到全血至100ng/ml的最终浓度，并孵育45分钟。在FACS缓冲液(3％FBS的PBS)洗涤2次细胞，用CD11b-PE(Biolegend公司，加利福尼亚州)在冰上染色30分钟，并用FACS缓冲液洗涤。用裂解/修复缓冲液(BD生物科学公司，加利福尼亚州)裂解血红细胞。通过流式细胞术测量中性粒细胞中的CDllb表达。
调理吞噬杀伤(OPK)试验
如先前所述(DiGiandomenico等,J.Exp.Med.209:1273-1287(2012))，使用载体迷你-CTX-lac-lux构建发光铜绿假单胞菌。将铜绿假单胞菌菌株在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)过夜平板上于37℃生长至单菌落，然后将单菌落接种到10mL氨苄青霉素(LB)肉汤中，并生长到650nm处0.4的光密度(约5×10 8菌落形成单位[CFU]/mL)。1毫升细胞通过14,000x g离心沉淀，然后悬浮于OPK试验缓冲液，并进一步1:200稀释(大约2.5x106CFU/mL)。将细菌保持于冰上直到全部OPK组分的制备完成。
幼兔血清(BRS)(塞得兰公司(CedarLane)，加拿大安大略湖霍恩比)用作OPK试验的补体来源。用冰冷的蒸馏水复原1毫升冻干的BRS，然后在OPK试验缓冲液中制备1:10稀释物。将稀释的BRS持于冰上直到全部OPK组分的制备完成。
将MEDI9600(抗-FcγRIIA)、H2B(抗-FcγRIIB)或3G8(抗-FcγRIII)Ab添加到白色平底96孔板(每孔12.5μl)，然后添加12.5μl的原代中性粒细胞制备物。FcγR mAb和原代中性粒细胞的最终浓度分别为2μg/ml和2x107细胞/ml。室温孵育20分钟后，将抗-Psl抗体、稀释的补体和细菌的稀释物添加到各孔，并用透气密封膜覆盖平板。缺少抗-Psl mAb抗体的孔当作试验对照。将平板于37℃孵育120分钟，以250转数/分钟(rpm)振荡。孵育后，使用帕金埃尔默公司(Perkin Elmer)EnVision多标记酶标仪测量相对荧光素酶单位(RLU)。发光的量与培养基中存活细菌的频率直接关联。所有样品均一式两份进行。铜绿假单胞菌百分比杀伤使用下述公式计算：
％杀伤＝100-([RLU实验孔/RLU对照孔]x 100)
以使用曲线拟合分析的4参数逻辑、非线形回归模型的GraphPad Prism(version5)计算EC50值。
全血蛋白质组学评估
全血收集于肝素管。用抗-FcγRIIA Ab(30μg/ml)、RNP-IC(1μg/ml RNP/2％抗-RNP抗体血清反应阳性SLE血清)或Ig-IC(100μg/ml生物素化-NMGC Ab-链霉亲和素，2:1mol:mol比)于37℃孵育5毫升的血液16小时。以1300g离心10分钟后，收集血浆部分。使用RBM(Rules-Based-Medicine)发现MAP(德克萨斯州奥斯汀)测量超过200个蛋白质分析物。从5个独立供体产生数据：2个131H/H供体，2个131R/R供体和1个131H/R供体，这些覆盖了所有FcγRIIA多态性变体。
被动免疫血小板减少症动物模型
抗-FcγRIIA Ab对抗-血小板抗体诱导的血小板减少症的作用在被动免疫血小板减少症动物模型中测量。野生型和FcγRIIA转基因小鼠获自杰克逊实验室公司。大鼠抗-小鼠CD41(GpIIa)IgG1 Ab和对照大鼠IgG1 Ab购自BD生物科学公司。野生型和转基因小鼠在第0天腹腔内注射2μg的抗-CD41。在24小时之前用10mg/kg用MEDI9600预先处理一些小鼠。在第1天、第5天、第8天和第12天通过眼球后采血收集血液，使用Sysmex血液分析仪对血小板进行计数。通过流式细胞术确定血小板FcγRIIA表达。
MEDI9600：猕猴中单剂量药代动力学和探索性药效学研究
雄性猕猴被分配到组，并给予MEDI9600，如表9所示。经由静脉内注射向动物给药
表9
IV＝静脉内
a组3动物接受通过赞助者提供的测试物品(标称浓度为50mg/mL)，无需进一步调整剂量体积。
使用酶联免疫吸附实验(ELISA)(非GLP)定量确定猕猴血清中的MEDI9600
该方法利用间接ELISA形式以测量猕猴血清中MEDI9600的浓度。用已经固定于微滴定平板上的绵羊抗-人IgG(H+L)孵育标准、对照和测试样品。孵育后，洗掉未结合的材料，使用山羊抗-人IgG-(H+L)-HRP偶联物检测MEDI9600，并通过添加四甲基联苯胺(TMB)底物溶液显示。停止显色，并在450/650nm处测量颜色强度。
药效学－流式细胞术
在给药前阶段第12和20天；在给药后大约0.5小时、4小时、8小时和24小时；给药阶段第3、4、5和8天1次；和从这之后每周(根据给药阶段的第1天)经由股静脉从所有动物收集血液(大约1mL)用于流式细胞术。除非结合临床病理取样收集样品，动物不禁食。抗凝剂为柠檬酸葡萄糖。参数以表示为百分比(与总CD45+白血球细胞)和绝对值(细胞/μL)。使用中值和/或几何平均荧光强度值，以等效可溶性荧光(MESF)值计算的分子和荧光强度描述FcγRIIA表达水平。表10示出的淋巴细胞亚组使用流式细胞术定量。
表10
淋巴细胞亚组 表型
CD14+单核细胞a CD3-CD14+
CD32+单核细胞a CD3-CD14+CD32a+a
粒细胞a SSC/CD45+CD3-
CD32+粒细胞a SSC/CD45+CD3-CD32a+a
全部白血细胞 CD45+
注释：所有的群源自FSC/SSC和/或SSC/CD45门选。
对各表型，结果以相对百分比(与总CD45+白血球细胞％)和绝对值(细胞/μL)计算。
还使用C FcγRIIA的a中值和/或几何荧光强度值。
统计学分析
使用未配对斯氏t检验或非参数曼-惠特尼(Mann Whitney)检验分析两组之间差异的统计学显著性。当p<0.05时，将数据归为统计学显著。
参考文献
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22.Wang等中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的增加以及NETosis的增强与1型糖尿病患者(3细胞自身免疫)密切相关(Increased neutrophil elastase and proteinase3and augmented NETosis are closely associated with(3-cell autoimmunity inpatients with type 1diabetes).Diabetes 2014年12月；63(12):4239-48.
23.Krishna等生物疗法的免疫原性-抗药物免疫复合物的作用(Immunogenicityto Biotherapeutics-The Role of Anti-drug Immune Complexes).Front.Immunol.2016年2月2日；7:21.
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以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明的一般性质，通过应用本领域技术范围内的知识，他人无需过多实验即能很容易地在不背离本发明总体理念的前提下就各种应用改良和/或修改这些具体实施方式。因此，基于本文所列出的教导和指南，应理解为这些修改和改良落入所公开实施方式的等同形式的含义和范围内。应当理解本文中的措词和术语仅仅是描述性的而非限制性的，从而本说明书中的术语或措词可由本领域技术人员根据所述教导和指南解读。本发明通过下述权利要求进一步描述。

Claims (37)

1.一种特异性结合FcγRIIA的分离的结合分子，其中，所述结合分子包含：
a.分别包含选自以下所述氨基酸序列的免疫球蛋白可变重链互补决定区2(VH-CDR2)和免疫球蛋白可变轻链互补决定区：(i)SEQ ID NO:19和SEQID NO:22；(ii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23；(iii)SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:24；(iv)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25；(v)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23；和(vi)SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26；
b.包含SEQ ID NO:29的免疫球蛋白可变重链互补决定区1(VH-CDR1)；
c.包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:45的免疫球蛋白可变重链互补决定区3(VH-CDR3)；
d.包含SEQ ID NO:31的免疫球蛋白可变轻链互补决定区2(VL-CDR2)；和
e.包含SEQ ID NO:32的免疫球蛋白可变轻链互补决定区3(VL-CDR3)。
2.如权利要求1所述的结合分子，其包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22。
3.如权利要求1所述的结合分子，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，它们分别包含选自以下所述的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，(ii)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，(iii)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，(iv)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40，(v)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，和(vi)SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。
4.如权利要求3所述的结合分子，其包含VH区和VL区，它们分别包含氨基酸序列SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34。
5.一种分离的结合分子，其与前述权利要求中任一项所述的结合分子竞争或交叉竞争。
6.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其选自鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和它们的抗原结合片段。
7.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其选自Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv片段、单链Fv(scFV)、sc(Fv)2、二硫键连接的(dsFv)、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体或单链抗体。
8.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其包含免疫球蛋白(Ig)重链恒定区。
9.如权利要求8所述的结合分子，其中，所述恒定区是人IgG恒定区。
10.如权利要求9所述的结合分子，其中，所述恒定区包含在Kabat位置234、235和331处的氨基酸取代，其中：
a.在Kabat位置234处的氨基酸被苯丙氨酸(F)取代，
b.在Kabat位置235处的氨基酸被谷氨酸(E)取代，且
c.在Kabat位置331处的氨基酸被丝氨酸(S)取代。
11.如权利要求9或10所述的结合分子，其中，所述恒定区包含相对于野生型人IgG恒定区在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处氨基酸残基的一个或多个取代，其中氨基酸位置编号根据Kabat的EU索引。
12.如权利要求11所述的结合分子，其中，所述恒定区包含在Kabat位置252、254和256处的氨基酸取代，其中：
a.在Kabat位置252处的氨基酸被酪氨酸(Y)取代，
b.在Kabat位置254处的氨基酸被苏氨酸(T)取代，和
c.在Kabat位置256处的氨基酸被谷氨酸(E)取代。
13.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其包含免疫球蛋白轻链恒定区。
14.如权利要求1313所述的结合分子，其中，所述轻链恒定区是人κ恒定区。
15.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，以解离常数(KD)约0.15nM的亲和力特异性地结合人FcγRIIA 131R，所述解离常数(KD)通过BIAcore试验测定。
16.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，以解离常数(KD)约0.13nM的亲和力特异性地结合人FcγRIIA 131H，所述解离常数(KD)通过BIAcore试验测定。
17.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其不与FcγRI、FcγRIIB或FcγRIII特异性结合。
18.如前述权利要求中任一项所述的结合分子，其与选自以下所述的试剂偶联：抗微生物剂，治疗剂，前药，肽，蛋白质，酶，脂质，生物响应调节剂，药剂，淋巴因子，异源性抗体或其片段，可检测标记物，聚乙二醇(PEG)，毒素，和所述试剂中任两种或更多种的组合。
19.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的结合分子和运载体。
20.如权利要求19所述的组合物，其是诊断试剂。
21.一种用于在外周血单核细胞(PBMC)中抑制核糖体蛋白-免疫复合物(RNP-IC)介导的I型IFNα的方法，所述方法包括将所述PBMC与权利要求1-18中任一项所述的结合分子接触。
22.一种用于抑制抗-中性粒细胞胞质抗体(ANCA)诱导的中性粒细胞活化的方法，所述方法包括将中性粒细胞与权利要求1-18中任一项所述的结合分子接触。
23.一种在对象中治疗炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括向有需要治疗的对象给予有效量的权利要求1-18中任一项所述的结合分子或权利要求19所述的组合物。
24.一种在对象中预防炎性、免疫介导的或自身免疫疾病或紊乱的方法，所述方法包括向疑似患有所述疾病或紊乱的对象给予有效量的权利要求1-18中任一项所述的结合分子或权利要求19所述的组合物。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中，所述方法包括给予第二活性剂。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，所述疾病或紊乱为ANCA相关血管炎(AAV)，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，膜性肾炎，巨细胞动脉炎(GCA)血管炎，免疫性血小板减少症(ITP)，类风湿性关节炎，多发性肌炎，皮肌炎，天疱疮，溶血性贫血，混合结缔组织疾病，舍格伦综合征，硬皮病，自身抗体紊乱，免疫复合物介导的紊乱，ADA介导的不良作用，NETosis和NETosis相关疾病，包括败血症，血栓形成，急性肾损伤，急性肺损伤，慢性阻塞性肺病，肾小球肾炎，毒性肝损伤，中风，动脉粥样硬化，I型糖尿病和IgG介导的超敏反应。
27.一种用于检测样品中FcγRIIA的方法，所述方法包括(a)将所述样品与权利要求1-18中任一项所述的结合分子接触，和(b)检测所述结合分子与FcγRIIA的结合，从而检测所述样品中的FcγRIIA。
28.如权利要求27所述的方法，其是诊断方法。
29.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-18中任一项所述的结合分子的核苷酸序列。
30.如权利要求29所述的核酸分子，其操作性地连接调控序列。
31.一种载体，其包含权利要求29或权利要求30所述的核酸分子。
32.一种用权利要求29或权利要求30所述的核酸分子或权利要求31所述的载体转化的宿主细胞。
33.如权利要求32所述的宿主细胞，其为哺乳动物宿主细胞。
34.一种包含权利要求29或权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体、或权利要求32或权利要求33所述的宿主细胞的组合物。
35.一种制备特异性结合FcγRIIA的结合分子的方法，所述方法包括在适合生成所述结合分子的条件下培养权利要求32或权利要求33所述的宿主细胞。
36.如权利要求35所述的方法，还包括分离所述结合分子。
37.一种包括权利要求1-18中任一项所述的结合分子或权利要求29或权利要求30所述的核酸分子的试剂盒。
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