CN117045694A - 野马追或其提取物在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途 - Google Patents

野马追或其提取物在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了野马追或其提取物在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途。本发明野马追提取物可通过改善肠道菌群结构、增加益生菌、降低致病菌等维持正常的菌群平衡，从而达到预防或(和)治疗多种疾病的发生和发展的作用，通过益生菌调控可恢复肠道菌群的稳态；调节机体全身性的固有免疫、特异性免疫和适应性免疫反应，特别是在肠道和呼吸道粘膜免疫屏障方面起重要作用，从而增强机体免疫力。

Description

野马追或其提取物在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途
技术领域
本发明涉及野马追或其提取物的新用途，具体地，是在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途。
背景技术
野马追为菊科植物轮叶泽兰Eupatorium lindleyanum DC.的干燥地上部分，功能主治为化痰止咳平喘，用于痰多咳嗽气喘。其化学成分主要包括黄酮类、倍半萜、二萜类、三萜类、甾体类、挥发油及有机酸、氨基酸与微量元素等，其有效部位及单体在抗肿瘤、抗炎、呼吸系统、心血管系统等方面显示出重要的药用价值，临床上应用的制剂品种包括野马追片、颗粒剂、糖浆剂，还有以野马追为君药的复方野马追颗粒、胶囊等产品。现代药理研究表明，野马追可止咳、祛痰、平喘，对急性肺损伤、循环系统等疾病具有较好的疗效，同时可降血压、降血脂、预防动脉粥样硬化，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理作用。
申请号201310302612.1，发明名称：一种野马追提取物、制备方法及其应用，公开了一种野马追提取物及其的制备方法，该方法相对现有技术，总黄酮的转移率更高。同时总黄酮提供物对高血脂症和肝硬化病症，具有良好的活性。申请号201410222843.6，发明名称：野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用，公开了一种野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。本发明中野马追黄酮中含有棕矢车菊素和泽兰叶黄素。将野马追黄酮部位制备成动物用药，对小鼠体内给药，测定诱导性急性肺损伤小鼠的肺湿/干重比，肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量；检测肺组织匀浆中髓过氧化酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)含量；血清中补体C3和C3c含量；观测小鼠肺组织病理改变。结果表明，野马追黄酮部位具有抗急性肺损伤作用。申请号201410239824.4，发明名称：野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用，明公开了一种野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用结果表明含有野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K的野马追倍半萜部位具有抗急性肺损伤的活性。
目前尚无将野马追用于治疗肠道菌群紊乱的报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供了野马追或其提取物的新用途，具体地，是在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途。
野马追或其提取物在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途。
所述的药物是治疗肠道菌群紊乱导致的炎症性肠病、肠道肿瘤、肠易激综合征、非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、肝硬化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、全身炎症反应综合征、多器官功能障碍、肺源性心脏病、肥胖、糖尿病、高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化、冠心病、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化病、帕金森病、阿尔茨海默病、多系统萎缩病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、脊柱关节炎、痛风、自身免疫性疾病和免疫调节功能异常。
其中，所述的野马追为菊科植物轮叶泽兰Eupatorium lindleyanum DC.的干燥地上部分。
其中，所述的提取物为60-90％乙醇提取物。
进一步优选地，所述的提取物为70％乙醇提取物，所述提取物的提取工艺为：
野马追药材粉碎为粗粉，加入70％的乙醇回流提取，过滤后与滤液合并，再进行减压浓缩。
其中，所述的提取物还包括纯化工艺：将乙醇提取物，加水溶解，取上清液过聚酰胺树脂柱，过柱液再过D101大孔树脂柱，然后用水洗接近无色，弃去废液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，通过减压回收乙醇，而后浓缩，冷冻，干燥，与适量硅胶混匀，以0.5倍量无水乙醇为夹带剂，在压力35MPa、温度45℃条件下，二氧化碳超临界萃取2小时，即得。
其中，所述的提取物的质量检测方法为：采用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术UPLC-Q-TOF/MS，吸取样品200μL，以12000×g离心5min，取上层样品进样分析；
色谱条件如下：Kinetex C18色谱柱(2.6μm，2.1mm×100mm)，柱温设置为30℃，流动相使用A相：水相和B相：乙腈，内含0.1％甲酸，采用的梯度洗脱条件如下：1min时A：B(90：10)，7min时A：B(15：85)，11min时A：B(15：85)，11.5min时A：B(90：10)，15.1min stop，流速0.3ml/min；
质谱条件如下：采用电喷离子源ESI_Positive和ESI_Negative两种模式，利用动态背景扣除(DBS)触发信息关联采集模式(IDA)、喷射气压(GAS1)的方式进行扫描分析，条件如下：喷雾气压(Gas1)55Psi；干燥气压(GAS2)：55Psi；电离电压(IS)：-4500V；电离温度(TEM)：600℃；气帘气压(CUR)：25Psi；Positive模式碰撞电压(CE)：40V，动态电压CES：15V；Negative模式碰撞电压(CE)：-25V，动态电压CES：15V；UPLC-Q-TOF/MS数据采用Analyst1.6软件、Peakview 1.2TM进行处理。
其中，所述的野马追醇提取物中含有的主要成分为倍半萜类：野马追内酯A、野马追内酯B、野马追内酯E、野马追内酯F、野马追内酯H、野马追内酯J、野马追内酯K和野马追内酯M；黄酮类：金丝桃苷、三叶豆苷、黄芪苷、槲皮素、山奈酚、棕矢车菊素、泽兰叶黄素、泽兰黄素、木犀草素、异槲皮苷、线蓟素；香豆素类：东莨菪素、6,7-二甲氧基香豆素等；苯丙素类，如绿原酸、松柏醇；二萜类：
3-(hydroxymethyl)-1,14,15-trihydroxy-7,11,15-trimethyl-2,6,10-hexadecatrien-13-acetate；酚类：香草酸；及其他化学成分：浙贝素、梣皮树脂醇、对羟基苯甲醛、5-羟甲基糠醛、咖啡酸、腺苷。
本发明的有益效果是：
1、可通过改善肠道菌群结构、增加益生菌、降低致病菌等维持正常的菌群平衡，从而达到预防或(和)治疗多种疾病的发生和发展的作用。
2、通过益生菌调控可恢复肠道菌群的稳态。
3、调节机体全身性的固有免疫、特异性免疫和适应性免疫反应，特别是在肠道和呼吸道粘膜免疫屏障方面起重要作用，从而增强机体免疫力。
附图说明
图1野马追Positive和Negative模式下的BPC(Base Peak Chromatogram)图谱
图2三个组别大鼠肠道菌群Pan/Core物种分析(n＝5)
图3三个组别大鼠肠道菌群Rank-Abundance曲线(n＝5)
图4三个组别大鼠肠道菌群Alpha多样性Shannon指数(n＝5)
图5三个组别大鼠肠道菌群Beta多样性PCA分析(n＝5)
图6三个组别大鼠肠道菌群门、属水平物种组成分析：a)门水平b)属水平(n＝5)
图7三个组别大鼠肠道菌群属水平差异物种与急性肺损伤指标相关性分析(n＝5)
具体实施方式
实施例1本发明野马追的提取与纯化方法
野马追药材粉碎为粗粉，利用8倍体积70％的乙醇进行2次回流提取，每次2小时，过滤后与滤液合并，再进行减压，使乙醇循环利用。加20倍量水使溶解，取上清液过聚酰胺树脂柱，过柱液再过D101大孔树脂柱，然后用10倍体积水洗接近无色，弃去废液，继用8倍体积70％乙醇洗脱，收集洗脱液，通过减压回收乙醇，而后浓缩，冷冻，干燥，与适量硅胶混匀，以0.5倍量无水乙醇为夹带剂，在压力35MPa、温度45℃条件下，二氧化碳超临界萃取2小时。在4℃下储存，备用。
实施例2本发明野马追醇提取物成分鉴定
本部分研究首先通过现代提纯技术制备野马追醇提取物(EUP)，然后采用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF/MS)对EUP的主要化学成分进行鉴定分析。
1材料
1.1实验药材
野马追药材购自江苏淮安盱眙德峰中药材种植有限公司，经由重庆医科大学中医药学院何先元教授鉴定为野马追Eupatorium lindleanum DC.。
1.2试剂
1.3仪器与设备
UFLC-30AT超高效液相 日本SHIMADZU公司
TripleTOFTM 5600液质联用仪 美国AB SCIEX公司
Microfuge 22R离心机 美国Beckman Coulter公司
2方法
2.1野马追的提取与纯化
按实施例1的方法制备
2.2野马追醇提取物的主要化学成分分析
采用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF/MS)，吸取样品200μL，以12000×g离心5min，取上层样品进样分析。色谱条件如下，Kinetex C18色谱柱(2.6μm，2.1mm×100mm)，柱温设置为30℃，流动相使用A相：水相和B相：乙腈，内含0.1％甲酸，采用的梯度洗脱条件如下：1min时A：B(90：10)，7min时A：B(15：85)，11min时A：B(15：85)，11.5min时A：B(90：10)，15.1min stop，流速0.3ml/min。质谱条件如下：采用电喷离子源ESI_Positive和ESI_Negative两种模式，利用动态背景扣除(DBS)触发信息关联采集模式(IDA)、喷射气压(GAS1)的方式进行扫描分析，条件如下：喷雾气压(Gas1)55Psi；干燥气压(GAS2)：55Psi；电离电压(IS)：-4500V；电离温度(TEM)：600℃；气帘气压(CUR)：25Psi；Positive模式碰撞电压(CE)：40V，动态电压CES：15V；Negative模式碰撞电压(CE)：-25V，动态电压CES：15V。UPLC-Q-TOF/MS数据采用Analyst1.6软件、Peakview 1.2TM进行处理。
3结果
经上述方法获得野马追醇提取物500ml，样品浓度为6g生药/ml。UPLC-Q-TOF/MS分析结果显示，野马追醇提取物中含有的主要成分为倍半萜类，如野马追内酯A、野马追内酯B、野马追内酯E、野马追内酯F、野马追内酯H、野马追内酯J、野马追内酯K和野马追内酯M等(图1)；黄酮类，如金丝桃苷、三叶豆苷、黄芪苷、槲皮素、山奈酚、棕矢车菊素、泽兰叶黄素、泽兰黄素、木犀草素、异槲皮苷、线蓟素等；香豆素类，如东莨菪素、6,7-二甲氧基香豆素等；苯丙素类，如绿原酸、松柏醇等；二萜类，如3-(hydroxymethyl)-1,14,15-trihydroxy-7,11,15-trimethyl-2,6,10-hexa decatrien-13-acetate；酚类，香草酸；及其他化学成分，如浙贝素、梣皮树脂醇、对羟基苯甲醛、5-羟甲基糠醛、咖啡酸、腺苷等(附录表1)。
表1野马追主要成分
4小结
本部分研究获得的野马追醇提取物，采用UPLC-Q-TOF/MS技术，分析了醇提取物主要化学成分，解析出了目前多名研究者已经从野马追中分离到的各类成分。鉴定分析结果表明EUP中主要含有野马追内酯A、野马追内酯B、野马追内酯E、野马追内酯F、野马追内酯H、野马追内酯J、野马追内酯K和野马追内酯M等倍半萜内酯类成分
以下通过药效学试验证明本发明有益效果。
试验例1野马追醇提取物对大鼠肠道菌群的影响
一、预实验：
实验用药：野马追醇提取物的粗提物(野马追药材粉碎为粗粉，利用8倍体积70％的乙醇进行2次回流提取，每次2小时，过滤后与滤液合并，减压回收乙醇，得野马追醇提取物的粗提物)；
造模：按文献方法头建立肠道菌群紊乱动物模型(见：
李静，等，头孢克肟诱导肠道菌群紊乱动物模型的建立，食品工业科技，2017年05期)。
将本发明野马追醇提取物的粗提物施用于建立的动物模型，药效实验证明，本发明野马追醇提取物的粗提取具有调节肠道菌群功能。
二、野马追醇提取物对大鼠肠道菌群的影响
本实验采用16s RNA高通量测序技术，对Control组、LPS组和EUP组(18g生药/kg)的肠道菌群基本组成结构和群落多样性进行差异分析，进一步探究EUP对急性肺损伤大鼠的肠道菌群的影响。
1材料
1.1实验动物
6-8周龄SD全雄大鼠，60只，SPF级，体质量为200±20g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(渝)2022-072。动物饲养于重庆医科大学实验动物中心IVC第二动物房，每笼饲大鼠不多于5只，室温22.0～23.1℃，相对湿度52～60％，每12h明暗交替。期间大鼠饮食饮水自由，适应性喂养一周后开始正式实验。
1.2试剂
TransStart Fastpfu DNA Polymerase (AP221-02) 北京全式金
AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒 (AP-GX-50) 生物AXYGEN公司
TruSeqTM DNA Sample Prep Kit Illumina公司(15026486)
1.3仪器与设备
2方法
2.1动物分组、给药与模型建立
将60只SPF级、平均体重为200±20g的雄性SD大鼠，随机分为空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、地塞米松组(Dex)及野马追醇提取物低(EUP-L)、中(EUP-M)、高剂量组(EUP-H)，EUP的给药浓度分别为0.6、1.8、5.4g生药/mL，每组10只动物。按组别灌胃给予野马追相应药物和地塞米松，给药体积均为10mL/kg体重，每日1次，连续给药7天，其中空白对照组及模型对照组灌胃给予等剂量纯化水。除空白对照组外，其他组别大鼠于末次灌胃给药2h后手术暴露气管，缓慢滴注3mg/kg LPS诱导复制大鼠急性肺损伤模型。造模24h后各组大鼠称重并记录体质量，2％的戊巴比妥钠(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，通过颈椎脱臼处死大鼠后将其平卧位固定于超净操作台上，灌洗并回收大鼠的支气管肺泡灌洗液后，打开胸腔切断气管，取肺脏组织，冷生理盐水清洗干净，记录肺湿重，左下叶的肺组织置于4％的多聚甲醛溶液中固定，余下肺组织置液氮速冻，取盲肠内容物置液氮速冻，于-80℃保存备用。
2.2肠道菌群16srRNA高通量测序
A.DNA的抽提：对肠道内容物样本抽提全基因组的DNA，而后又利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
B.PCR的扩增
1)按指定的测序区域，设计并合成特异引物(含barcode)；
2)随机抽取有代表性的样品预实验，确保绝大多数样品都能在最小周期内，将适宜浓度的产物扩增出来。
3)以正式实验的条件分析全部样本，每份样本重复3次，用2％的琼脂糖凝胶电泳分析同一样本的PCR的多次混合产物，切胶并且回收其产物，Tris-HCl洗脱。
C.荧光定量：把电泳的初步结果作为参考，将PCR产物进一步定量，再根据各样本点测序量的要求进行检测，并且按对应比例进行。
D.Miseq文库的构建
1)把Illumina的官方接头序列利用PCR技术添加到目标区域的外端；
2)利用凝胶回收相关试剂盒进行切胶并且回收PCR的产物；
3)Tris/HCl缓冲体系洗脱，2％的琼脂糖电泳做检测；
4)利用氢氧化钠DNA变性，产生DNA的单链片段。
E.Miseq测序分析
1)通常，DNA片段接头的序列与包埋于芯片的碱基序列互补，并固定于芯片；
2)把DNA片段做为模板，芯片内固定好的碱基序列做为引物合成PCR反应，而后在芯片上进行待测的DNA片段的合成反应；
3)变性和退火完成后，芯片上的DNA片段另一端与其附近的另一引物互补，随之被固定，“桥(bridge)”形成；
4)进行PCR扩增，并产生DNA簇；
5)DNA扩增子以线性化趋势形成单链。
6)DNA聚合酶经改造后，以含4种不同荧光标记的dNTP为原料，合成一个碱基循环一次；
7)用激光扫描反应板表面，读取每一条模板序列经第一轮的反应所聚合的核苷酸种类；
8)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；
9)汇总每一轮收集到的荧光的信号强度结果，由此获得模板DNA的核苷酸序列。
F.生物信息学分析
由MiSeq测序所得到的PEreads经过样本拆分后，首先根据测序质量对双端Reads进行质控和过滤，同时根据两端Reads间的overlap关系拼接，获得质控拼接之后的优化数据。然后使用序列降噪方法(DADA2/Deblur等)处理优化数据，获得ASV(Amplicon SequenceVariant)代表序列和丰度信息。基于ASV代表序列及丰度信息，可以进行物种分类学分析、群落多样性分析，以及物种差异分析、相关性分析、系统发育的分析和功能预测分析等相关的统计学或者可视化分析。
2.3相关性分析
将急性肺损伤相关肠道菌群丰度数据进行Spearman相关性热图分析，认为P＜0.05有统计学差异，各指标之间的相关系数用热图展示。
3结果
通过收集大鼠盲肠内容物，利用Illumina MiSeq测序仪进行16s rRNA微生物学分析，并对原始数据进行ASV分析以研究EUP对LPS诱导的急性肺损伤大鼠肠道菌群的影响。
3.1测序深度分析
Pan/Core相关的物种分析常被用来描述物种总量的变化，以及样本量增加后核心物种的数量变化，本研究微生物生物多样性Pan/core物种曲线图表明，测序样本量充足(图2)。
3.2物种丰度分析
Rank-Abundance曲线多用来解释物种丰度和群落均匀度这两方面的多样性，即在水平方向曲线宽度＞100，表明物种丰富度较高；同时曲线较为平缓，表明群落中物种分布较均匀(图3)。
3.3Alpha多样性分析
Alpha多样性是对样本中的群落多样性进行分析。在Shannon指数图中，各组样本曲线达到2000时趋于水平，说明本研究肠道菌群α多样性丰富，当前样本生物多样性良好。并且结果显示，LPS组大鼠肠道菌群多样性降低，EUP预处理可以改善肠道菌群多样性。(图4)。
3.4Beta多样性分析
PCA分析(principal component analysis)，即主成分分析，结果显示对照组和LPS组肠道菌群组成差异明显，两组显著分离，说明急性肺损伤大鼠与正常大鼠肠道菌群结构组成存在较大差异。而EUP-M组与它们均有重叠，说明EUP预防给药后，肠道菌群组成有向正常组回调的趋势(图5)。
3.5群落组成分析
Control组、LPS组和EUP-M组3组共产生了1191个OTU，属水平的OTU总数为115个。而后我们分别在门水平和属水平分析了丰度前十位菌群在三组间的相对丰度差异。结果发现，在门水平上，与Control组相比较，LPS组肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetota)丰度增加；而与LPS组相比较，EUP-M组肠道菌群中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)丰度增加。在属水平上，与Control组相比较，乳酸菌(Lactobacillus)、Romboutsia、密螺旋体(Treponema)和梭状芽孢杆菌(Clostridium_sensu_stricto_1)是LPS组的优势菌；而与LPS组相比较，EUP-M组富集了unclassified_f_oscillospiraceae、Collinsella等有益菌(图6)。由此，可以推断，LPS诱导了急性肺损伤大鼠的肠道菌群失调，而EUP能够调节肠道菌群结构紊乱和数量异常。
3.6相关性分析
相关性分析结果如图7所示：Eubacterium_siraeum_group与肺系数、血清TNF-α含量显著正相关(P＜0.05)；Family_XIII_AD3011_group与血清IL-6含量显著正相关(P＜0.05)；Lachnospiraceae_UCG-006与肺W/D比、白细胞数量、BALF IL-1β含量、BALF IL-6含量、血清IL-1β含量、血清TNF-α含量负相关(P＜0.05)；unclassified_f_Anaerovoracaceae与血清TNF-α显著负相关(P＜0.001)等。此外，Norank_f__norank_o__RF39、Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1等菌属与急性肺损伤表型指标整体正相关，而unclassified_f_oscillospiraceae、Collinsella、norank_f__Muribaculaceae等呈负相关。以上结果表明，肺水肿、白细胞活化、炎症因子分泌等急性肺损伤的病理改变可能与肠道菌群的稳态有关，肠道菌群可能成为EUP发挥对急性肺损伤保护作用的一个重要层面。
4讨论
LPS诱导的急性肺损伤大鼠随着肺组织损伤和炎症发生，肠道菌群结构和组成也发生了明显变化，主要表现为物种多样性降低、抗炎相关菌属数量减少、促炎相关菌属数量增加以及乳酸菌、双歧杆菌等有益菌代偿性升高等。而野马追预处理后，急性肺损伤大鼠肠道菌群的丰富度、多样性和平衡性有回调趋势，且部分接近正常大鼠。根据该结果可以推断，EUP通过改善肠道菌群数量和组成，恢复肠道菌群多样性。
EUP通过增加unclassified_f_oscillospiraceae和Collinsella的相对丰度，减少Clostridium_sensu_stricto_1的数量，改善LPS诱导的急性肺损伤肠道菌群紊乱和炎症。

Claims (8)

1.野马追或其提取物在制备治疗肠道菌群紊乱的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗肠道菌群紊乱导致的炎症性肠病、肠道肿瘤、肠易激综合征、非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、肝硬化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、全身炎症反应综合征、多器官功能障碍、肺源性心脏病、肥胖、糖尿病、高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化、冠心病、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化病、帕金森病、阿尔茨海默病、多系统萎缩病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、脊柱关节炎、痛风、自身免疫性疾病和免疫调节功能异常。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的野马追为菊科植物轮叶泽兰Eupatorium lindleyanum DC.的干燥地上部分。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的提取物为60-90％乙醇提取物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的提取物为70％乙醇提取物，所述提取物的提取工艺为：
野马追药材粉碎为粗粉，加入70％的乙醇回流提取，过滤后与滤液合并，再进行减压浓缩。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的提取物还包括纯化工艺：将乙醇提取物，加水溶解，取上清液过聚酰胺树脂柱，过柱液再过D101大孔树脂柱，然后用水洗接近无色，弃去废液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，通过减压回收乙醇，而后浓缩，冷冻，干燥，与适量硅胶混匀，以0.5倍量无水乙醇为夹带剂，在压力35MPa、温度45℃条件下，二氧化碳超临界萃取2小时，即得。
7.根据权利要求4-6任意一项所述的用途，其特征在于：所述的提取物的质量检测方法为：采用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术UPLC-Q-TOF/MS，吸取样品200μL，以12000×g离心5min，取上层样品进样分析；
色谱条件如下：Kinetex C18色谱柱(2.6μm，2.1mm×100mm)，柱温设置为30℃，流动相使用A相：水相和B相：乙腈，内含0.1％甲酸，采用的梯度洗脱条件如下：1min时A：B(90：10)，7min时A：B(15：85)，11min时A：B(15：85)，11.5min时A：B(90：10)，15.1min stop，流速0.3ml/min；
质谱条件如下：采用电喷离子源ESI_Positive和ESI_Negative两种模式，利用动态背景扣除(DBS)触发信息关联采集模式(IDA)、喷射气压(GAS1)的方式进行扫描分析，条件如下：喷雾气压(Gas1)55Psi；干燥气压(GAS2)：55Psi；电离电压(IS)：-4500V；电离温度(TEM)：600℃；气帘气压(CUR)：25Psi；Positive模式碰撞电压(CE)：40V，动态电压CES：15V；Negative模式碰撞电压(CE)：-25V，动态电压CES：15V；UPLC-Q-TOF/MS数据采用Analyst1.6软件、Peakview 1.2TM进行处理。
8.根据权利要求4-6任意一项所述的用途，其特征在于：所述的野马追醇提取物中含有的主要成分为倍半萜类：野马追内酯A、野马追内酯B、野马追内酯E、野马追内酯F、野马追内酯H、野马追内酯J、野马追内酯K和野马追内酯M；黄酮类：金丝桃苷、三叶豆苷、黄芪苷、槲皮素、山奈酚、棕矢车菊素、泽兰叶黄素、泽兰黄素、木犀草素、异槲皮苷、线蓟素；香豆素类：东莨菪素、6,7-二甲氧基香豆素等；苯丙素类，如绿原酸、松柏醇；二萜类：
3-(hydroxymethyl)-1,14,15-trihydroxy-7,11,15-trimethyl-2,6,10-hexadecatrien-13-acetate；酚类：香草酸；及其他化学成分：浙贝素、梣皮树脂醇、对羟基苯甲醛、5-羟甲基糠醛、咖啡酸、腺苷。
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