CN117043351A - 用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的方法 - Google Patents

用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的方法，用于产生全肉汤酶组合物的遗传修饰的丝状真菌细胞，此类遗传修饰的丝状真菌细胞用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的用途，以及通过此类方法产生的丝状真菌全肉汤酶组合物。

Description

用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉 汤酶组合物的方法
本发明涉及用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的方法，用于产生全肉汤酶组合物的遗传修饰的丝状真菌细胞，此类遗传修饰的丝状真菌细胞用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的用途，以及通过此类方法产生的丝状真菌全肉汤酶组合物。
含木素纤维素(或木质纤维素)生物质的水解产物作为用于生产各种物质例如酶、乳酸、脂肪酸、异丁醇、丁二醇、琥珀酸、衣康酸以及乙醇的有价值的底物越来越受到关注。源自此类方法的乙醇通常被称为“生物乙醇”或“生物燃料”。所需物质的生产通常通过涉及能够产生所需终产物的酵母、细菌或真菌的发酵过程进行。
此类方法的一个主要缺点是木质纤维素生物质底物本身。通常称为“木质纤维素底物”的所有生物质含有相当量的木质素(至多40重量％)、纤维素(至多55重量％)和半纤维素(至多55重量％)。由于其来源(木材或杂草植物衍生的生物质)，细胞壁的结构也显著不同于将影响底物水解的大多数其他植物物种的那些。水解可以通过应用化学品例如酸来实现，但通常通过酶的消化来进行，其不会用例如由化学处理产生的盐来污染水解产物。
那些聚合物的必要水解分解涉及使用几种纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和氧化还原酶。为了避免昂贵地补充单一特异性酶，这种水解分解通常通过应用所谓的“全肉汤酶组合物”来进行，其由能够产生底物水解所必需的所有酶的微生物例如丝状真菌产生。然后，所得的葡萄糖和纤维寡糖可以在使用普通的面包酵母时容易地发酵为所需的终产物，例如乙醇。
为了获得经济可行性，所需终产物的高产率以及所产生的全肉汤酶组合物的高产率是必要的。这特别适用于当终产物是生物乙醇时，其必须与市场上的普通且廉价的源自矿物油的燃料产物竞争。由纤维素和半纤维素以高产率产生单糖远比由含糖或含淀粉作物例如甘蔗或玉米得到糖要困难得多(Van Dyck和Pletschke,2012)。因此，尽管木质纤维素生物质的成本远低于糖和淀粉作物的成本，但从此类材料获得糖以发酵成为例如生物乙醇的成本通常被认为太高而在工业上不可行。为此，关键是解决木质纤维素生物质转化为水解产物中涉及的问题。
一个问题是真菌，特别是丝状真菌的发酵肉汤的高粘度，其是产生全肉汤酶组合物所需的。为了获得高的酶产率，需要真菌的强生长，然而，强生长伴随着发酵肉汤中真菌生物质的高含量。已知由例如菌丝组成的真菌在本领域中已知能使任何发酵底物成为高粘度组合物。当使用呈现海绵状、粘稠外观的丝状真菌时，该效果显著更明显。
高粘度引起许多问题，因为真菌在生长过程中需要通过通气持续供氧。此外，需要冷却发酵罐，特别是在工业规模产生中。两者仅可以通过恒定搅拌来保证-在一方面在肉汤内均匀地分布气泡，并且另一方面促进与冷却装置的恒定热交换。肉汤的粘度越高，在反应器内实现有效搅拌需要消耗的能量越多。此外，被压入至反应器的空气越多，导致压缩机和无菌过滤器单元内的能量消耗也越高。因此，CAPEX和OPEX两者都随着发酵肉汤粘度的提高而增加。替代措施-较少细胞物质产率-对于商业产生也不具有吸引力，因为这总是伴随着较低的全肉汤酶产率。
由于木质纤维素生物质是已经提供几种挑战的底物，当将此类方法应用于商业规模产生时，必须避免任何进一步的成本增加。
因此，本发明的发明人自己设定了开发一种用于产生具有低生物质形成和高蛋白质产率，同时保持肉汤中酶的高产率的丝状真菌全肉汤酶组合物的方法。此外，粘度应显著降低。
该任务已经通过用于产生全肉汤酶组合物的方法解决，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质的水解的发酵培养基，其具有5至450g/L的葡萄糖含量、2至300g/L的木糖含量、1至2kg/L的密度和10至75重量％的干物质含量；
(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞在20至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
在本发明中，术语“全肉汤”应理解部分或全部发酵培养基组成或含有部分或全部发酵培养基，并且甚至可以含有原始培养基的组分，但也可以含有发酵过程中产生的任何化合物。“全肉汤”还可以含有发酵微生物的部分或全部微生物生物质。
在本发明中，术语“全肉汤酶组合物”应理解为含有至少一种酶的本文定义的任何全肉汤。该至少一种酶可以已经被添加到全肉汤中，可以是原始发酵培养基的部分，但也可以在根据本发明的生产过程中产生。“全肉汤酶组合物”还可含有两种或更多种此类酶的混合物。
在本发明中，全肉汤酶组合物优选含有至少一种属于水解酶类的酶。在本发明特别优选的实施方案中，全肉汤酶组合物含有至少一种属于由至少一种丝状真菌细胞产生的水解酶类的酶。在另一个也特别优选的实施方案中，全肉汤酶组合物含有至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于由至少一种丝状真菌细胞产生的半纤维素酶类的酶。
在本发明中，术语“属于水解酶类的酶”应理解为包含能够水解化学键的任何酶。属于水解酶类的酶在酶的EC编号分类中被分类为EC 3。根据本发明，术语“水解酶”包含纤维素酶、半纤维素酶，并且还可涵盖果胶酶、氧化酶和辅助蛋白。
如本发明中使用的术语“纤维素酶”是指能够将纤维素聚合物水解成更短的低聚物和/或葡萄糖的任何酶。在全肉汤酶组合物中优选的纤维素酶包括纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.-)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4))、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(GH61和CBM33)。
如本发明中使用的术语“半纤维素酶”是指能够降解或支持半纤维素降解的任何酶。全肉汤酶组合物中优选的半纤维素酶包括β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(EC3.1.1.-)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘露聚糖1,4-甘露二糖苷酶(EC3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、松柏苷β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.150、151、155)、木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.131)、内切-木糖半乳聚糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-；GH28)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1,3-半乳糖苷酶(GH43)、-1,4,-内切半乳聚糖酶(EC 3.5.1.89；GH53)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)和β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)。
如本发明中使用的术语“果胶酶”是指能够降解或支持果胶降解的任何酶。全肉汤酶组合物中优选的果胶酶包括聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶乙酰基酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李糖聚半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.-)、木糖聚半乳糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-)、果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)、β-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、β-1,3-半乳聚糖酶(EC3.2.1.90)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-半乳糖苷酶(EC 3.1.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC3.1.1.-)、α-岩藻糖苷酶(apiosidase)(EC3.2.1.51)、(β-岩藻糖苷酶)(EC3.2.1.38)、β-洋芹糖苷酶(EC3.2.1.-)、α-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.43)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(EC3.2.1.-)、β-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.31)、α-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)和α-木糖苷酶(EC3.2.1.x)。
如本发明中使用的术语“辅助蛋白”是指能够支持纤维素分解酶活性的任何酶。该术语是本领域技术人员众所周知的。全肉汤酶组合物中优选的辅助蛋白包括扩张蛋白(Expansin)、溶胀素(Swollenin)、松弛素(Loosinin)和CIP蛋白(EC 3.1.1.-；CE15)。
如本发明中使用的术语“氧化酶”是指能够催化氧化反应的任何酶。全肉汤酶组合物中优选的氧化酶包括裂解多糖单加氧酶(LPMO)(AA9-11；分别为先前GH61和CBM33)(EC1.14.99.53-56，1.14.99.B10)、木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC1.11.1.13)、芳基醇氧化酶(EC 1.1.3.7)、乙二醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9,10)、纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)、过氧化氢酶(过氧化氢氧化还原酶)(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)、染料脱色过氧化物酶(EC 1.11.1.19)、漆酶(EC1.10.3.2)、过氧化物酶(EC 1.11.1.x)和多功能过氧化物酶(EC 1.11.1.16)。
本发明中提及的酶根据基于国际生物化学与分子生物学联合会的酶命名法和分类(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)或基于碳水化合物-活性酶(http://www.cazy.org/)数据库的命名法分类。
在本发明中，属于水解酶类的至少一种酶的量优选为1至45重量％(相对于全肉汤酶组合物的重量)，进一步优选为1至25重量％，特别优选为1至20重量％，还优选为2至15重量％、2至14重量％、3至12重量％，最优选为5至11重量％。
在本发明中，术语“源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基”可以是至少部分或优选完全通过木质纤维素生物质材料的化学、机械和/或酶促水解制备的任何培养基，并且优选包括木质纤维素生物质的预先机械和/或酸预处理。在本发明方法的优选实施方案中，水解通过机械和酶促水解或通过不添加任何有机酸和/或无机酸的单独的酶促水解进行。木质纤维素生物质的水解是本领域技术人员已知的，示例性方法例如描述于Vishnu等人2012(Trends in bioconversion of lignocellulose:Biofuels,platform chemicals&biorefinery concept in bioconversion of lignocellulose:Biofuels,platformchemicals&biorefinery concept.Progress in Energy and Combustion Science，2012年8月，第38(4)卷，522-550)和Prasad等人2019(Bioethanol production from wastelignocelluloses:A review on microbial degradation potential Chemosphere第231卷，2019年9月，第588-60页)。
在本发明中，术语“含木质纤维素的生物质”应理解为包含本领域技术人员已知为包含有木质纤维素的所有种类的生物质。根据本发明的特别优选的含木质纤维素的生物质包括木材、玉米(穗轴、秸秆、玉米粒和/或全植株)、谷物秸秆例如但不限于小麦秸秆、稻草秸秆、大麦秸秆、黑麦秸秆和燕麦秸秆和/或其外壳和/或麸皮、甘蔗渣、燕麦壳、柳枝稷、纤维素、原纸浆(从纸浆和纸产生获得)及其混合物。另外的组分可以包括以下组分中的一种或多种：纯化的纤维素、纸浆、乳清或糖蜜。特别适合根据本发明方法进行水解的木质纤维素生物质选自谷物秸秆、谷物麸皮、谷物壳、木材、甘蔗渣及其混合物。
在优选的实施方案中，含木质纤维素的材料含有至少5重量％，优选至少7重量％，进一步优选至少10重量％，还优选至少25重量％，更优选至少40重量％，特别优选至少70重量％，甚至更优选至少80重量％和最优选至少90重量％的木质纤维素。应理解，含木质纤维素的材料还可包含其它化合物，例如蛋白质材料、淀粉、糖，诸如可发酵糖和/或不可发酵糖。
在本发明的方法中，发酵培养基含有5至450g/L葡萄糖和2-300g/L木糖，其中葡萄糖含量优选为5至420g/L、8至400g/L和10至280g/L，其中木糖含量优选为3至280g/L、3至270g/L和4至260g/L。进一步优选的葡萄糖范围为10至450g/L、40至400g/L和50至350g/L，而进一步优选的木糖范围为10至280g/L、30至250g/L和50至220g/L。进一步优选的是葡萄糖与木糖的比率选自9至1或5至1的范围，例如选自3至1、4.0至1.5、3.5至1.5或3.0至1.5的范围。选自2.5至1.0的范围内的比率是最优选的，因为在水解过程中已经从木质纤维素生物质释放最大量的葡萄糖和木糖，使得全肉汤酶组合物的产率能够更高。
源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基具有0.90至2.00kg/L，优选0.95至1.90kg/L，进一步优选1.00至1.50kg/L和最优选1.05至1.35kg/L的高密度。
源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基的干物质含量为10至75重量％，优选10至70重量％，进一步优选20至65重量％，30至65重量％或40至60重量％，而10至20重量％和10至15重量％的干物质含量也是优选的。
根据本发明方法的步骤(a)的发酵培养基的“提供”可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何方法和任何手段进行。在优选的实施方案中，源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基在分批或补料分批反应器中提供，其优选配备有搅拌装置和冷却装置。
在本发明方法的优选实施方案中，发酵培养基的糠醛含量为小于0.5g/L，优选小于0.2g/L，进一步优选小于0.1g/L，还优选小于0.05g/L和最优选选自0.001mg/L至0.5g/L或0.01mg/L至0.25g/L的范围。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，发酵培养基的羟甲基糠醛含量为小于0.5g/L，优选小于0.2g/L，进一步优选小于0.1g/L，还优选小于0.05g/L和最优选选自0.001mg/L至0.5g/L或0.01mg/L至0.25g/L的范围。
在另一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.05至5重量％的氮。进一步优选的范围是0.08至5重量％、0.1至5重量％和0.5至5重量％。氮可以以本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何形式添加，并且可以以硫酸铵、氨、尿素或其组合的形式添加。氮的量可以通过在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间的任何时间向发酵培养基中进料或添加总量来添加。因此，优选氮以25％(重量/重量)氨溶液或40％(重量/重量)尿素溶液的形式添加。
在另一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.5至350mg/L的FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4。FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4的量可以通过在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间的任何时间向发酵培养基中进料或添加总量来添加。因此，优选的是FeSO4的添加量为0.5至35mg/l，和MgSO4的添加量为200至350mg/l。
在本发明方法的特别优选的实施方案中，在本发明方法期间的任何时间均不向源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基中添加单糖和/或二糖，特别是不添加葡萄糖、果糖或木糖。
在本发明方法的优选实施方案中，将发酵培养基的pH调节至选自pH 2.0至pH 6.0范围的pH，其中特别优选pH 3.0至5.5和pH 3.5至5.5以及pH 3.5至5.0的范围。pH的调节可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和方法进行。在本发明的方法中，优选通过添加酸如硫酸或乙酸、NaOH、H3PO4或氨来调节pH。
在本发明方法的优选实施方案中，该方法进一步包括步骤(ai)通过蒸发、膜过滤、薄层蒸发、降膜或下游蒸发浓缩发酵培养基，以将发酵培养基的重量降低2至6倍，其中发酵培养基的重量降低2.5至6倍、3至6倍、3.5至6倍和4至6倍也是优选的。因此，发酵培养基重量的降低主要是由于原始发酵培养基含水量的减少而实现的。因此，通过在进行步骤(b)之前仅将部分培养基浓缩并将浓缩的和未浓缩的培养基共混，或通过将全部发酵培养基分别浓缩至所需的终含量、所需的重量减少，来实现发酵培养基重量的降低。
在本发明方法的进一步优选实施方案中，源自木质纤维素生物质的发酵培养基的有机酸含量小于5重量％，无机酸含量小于6重量％，无机盐含量小于3重量％和/或阿拉伯糖含量小于1重量％，其中以下含量是特别优选的：0.5至2.5重量％的有机酸、0.5至5重量％的无机酸、0.2至2.5重量％的无机盐和/或0.05至0.75重量％的阿拉伯糖。因此，还特别优选水溶性氯化物的含量低于0.5重量％、乙酸的含量低于35g/L和/或Na-D/L-乳酸盐的含量低于15g/L。
根据本发明方法的步骤(b)，向发酵培养基中添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏。在本发明的另一个实施方案中，向发酵培养基中添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11被破坏。至少一种丝状真菌细胞的添加可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何手段和措施进行。在优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞以每g发酵培养基102至1010个细胞的量，优选103至108个细胞的量和最优选104至107个细胞的量添加。因此，至少一种丝状真菌细胞可以以干燥形式、分生孢子或预培养物的形式添加，其含有预培养培养基的其余部分。还可以添加完全培养的培养基(也称为主培养物)形式的至少一种丝状真菌细胞。
在本发明中，术语“丝状真菌细胞”应理解为来自天然存在的和/或本领域技术人员已知的任何丝状真菌的任何细胞。该术语还包含天然来源的或修饰的任何丝状真菌细胞。术语“修饰的”是指遗传和非遗传修饰的真菌。即已经通过遗传方法(例如转化)和非遗传方法(例如化学诱变或辐射)修饰的真菌，这两种方法都是本领域技术人员已知的。在优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞选自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属(Emericella)、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属(Irpex)、巨座壳属(Magnaporte)、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属，其中特别优选木霉属和曲霉属，最优选里氏木霉(有性型：Hypocrea jecornia)。在本发明的另一个优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其能够表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白，优选属于β-葡糖苷酶类、木聚糖酶类、β-木糖苷酶类和/或裂解多糖单加氧酶类的酶。
在此类优选的实施方案中，至少一种异源水解酶优选源自另一种丝状真菌，例如但不限于枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉菌属、根霉菌属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。在特别优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞是里氏木霉细胞，且至少一种异源水解酶源自枝顶孢属、阿耶罗菌属、链格孢属、蜜环菌属、节皮菌属、曲霉素、生赤壳属、平脐蠕孢属、拟腊菌属、毛壳属、枝孢瓶霉属、红腐菌属(Clohesyomyces)、刺盘孢属，毛孢壳属、梨孢霉属、间座壳属、褥盘孢属、裸胞壳属、附球菌属、外瓶霉属、层孔菌属、着色霉属、镰刀菌属、赤霉菌属、蓝菌属(Grosmannia)、滑锈伞属、何德霉属、腐质霉属、肉座菌属、炭团菌属、耙菌属、棒束孢属、Kuraishia、白环蘑属、马杜拉菌属(Madurella)、巨座壳属、盘二孢属、绿僵菌属、丛梗霉皮伞属、毁丝霉属、脉孢菌属、脉孢菌属、树粉孢属、长喙壳菌属、拟青霉菌属、拟球腔菌属(Paraphaeosphaeria)、青霉菌属、原毛平革菌属、瓶霉属、侧耳属、普可尼亚属、假尾孢属、假裸囊菌属、核腔菌属、Rasamsonia、啄枝孢属、根霉菌属、根球虫属、喙孢属、毛球腔菌属、亚球壳属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、蚁巢伞属、腥黑粉菌属、虫壳属、栓菌属、木霉属、毛癣菌属、Uncinocarpus和/或黑腐皮壳属物种。
根据本发明，至少一种丝状真菌细胞是其中SEQ ID NO：1被破坏的丝状真菌细胞。因此，破坏可通过本领域技术人员已知的适用于破坏目的的任何手段和措施进行。
术语“破坏”特别包括导致基因不再被转录或导致基因编码的蛋白质不再产生或仅以失活形式产生的所有技术。在优选的实施方案中，除了SEQ ID NO：1之外，SEQ ID NO：11也被破坏。
可在本发明中用的示例性方法是：
-从基因组中部分或完全去除基因、编码蛋白质的区域和/或启动子或基因表达所需的其它区域(＝“缺失”)
-改变编码区的DNA序列，使得完全不产生编码的蛋白质，或仅产生缩短的蛋白质(＝生成终止密码子)或具有改变的氨基酸序列的蛋白质，其不再执行未改变的蛋白质的功能(＝“突变”)
-启动子或基因表达所需的其它区域的DNA序列的修饰，使得基因不再被转录(＝没有RNA，因此没有蛋白质产生)
-表达具有与靶基因序列互补的序列的RNA。这导致两种RNA的杂交(＝互补序列的配对)，和导致该双链RNA的降解。结果，没有靶基因的RNA可用于蛋白质合成(＝RNA干扰)。
在本发明中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11在序列方案中定义。
应理解，说明书中定义的任何实施方案和优选的实施方案适用于其中仅SEQ IDNO：1被破坏的丝状真菌细胞，但也适用于其中除了SEQ ID NO：1之外，SEQ ID NO：11被破坏的丝状真菌细胞。
根据本发明的方法的步骤(c)的混合进行1分钟至10天，优选10小时至7天，进一步优选24小时至5天的时间段，优选在具有150至20000W/m3，更优选500至15000W/m3功率输入的恒定搅拌下和在氧控制条件下进行。平均溶解氧水平优选选自0.01％至80％，优选0.1％至50％，特别优选5％至30％，最优选12％至28％。在特别优选的实施方案中，溶解氧水平通过搅拌器或压缩空气流或内部反应器压力或这些措施中的两种或三种的组合来控制。此外，根据本发明方法的步骤(c)的混合在20至35℃的温度下，优选在21至34℃的温度下进行，其中选自22至33℃范围的温度也是优选的。
根据本发明方法的步骤(c)的“混合”优选以分批模式(不连续)、补料分批模式或连续模式进行。最优选地，本发明方法以分批模式进行。
根据本发明方法的步骤(d)的“获得”优选通过在步骤(c)期间应用于混合的时间段结束时在未经进一步处理情况下收获的全发酵肉汤来进行。然而，在替代实施方案中也可以实施根据本发明方法的步骤(e)的固-液分离。根据步骤(e)的固-液分离通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何措施进行，例如但不限于过滤、压榨、膜分离、浮选、沉淀、倾析和离心或其组合。优选的是基于过滤器的固-液分离。进一步特别优选使用压滤器。过滤后的残留物应具有20％(重量/重量)，优选25％(重量/重量)，特别优选30％(重量/重量)，并且最优选40％(重量/重量)固体含量的最小固体含量。用于根据步骤(e)的分离的另一种方法是通过例如使用倾析器离心。在根据本发明的方法涉及固液分离的情况下，根据本发明方法的步骤(d)获得的全肉汤酶组合物被认为是液体部分。
在本发明方法的优选的实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：
(aii)根据步骤(a)的发酵培养基或根据步骤(ai)的浓缩的发酵培养基的灭菌。
因此，可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段或措施进行灭菌。在优选的实施方案中，通过过滤，例如但不限于膜过滤方法或通过超高温加热进行灭菌。两种或更多种灭菌方法的组合也是可能的，然而，特别优选仅应用超高温加热(也称为UHT)。UHT处理优选在100至155℃的温度下进行10至30秒的持续时间，更优选在120至140℃的温度下进行10至20秒的持续时间。
在另一方面，本发明涉及丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏。术语“其中SEQID NO：1被破坏”涉及任何丝状真菌细胞，其中不再含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1不再起作用和/或其中丝状真菌细胞的基因组含有破坏的SEQ ID NO：1基因。SEQ ID NO：1的破坏可通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和措施进行。在说明书中已经定义了可能的和优选的方法和措施。在优选的实施方案中，SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏。术语“丝状真菌细胞”已在说明书中定义。给出的所有定义均适用。
在优选的实施方案中，除了SEQ ID NO：1的破坏外，SEQ ID NO：11也被破坏。在说明书中已经定义了可能的和优选的方法和措施。
应理解，说明书中定义的任何实施方案和优选实施方案适用于其中仅SEQ ID NO：1被破坏的丝状真菌细胞，但也适用于其中除了SEQ ID NO：1之外，SEQ ID NO：11被破坏的丝状真菌细胞。
在优选的实施方案中，丝状真菌细胞是具有表达至少一种异源水解酶的能力的遗传修饰的丝状真菌细胞。在特别优选的实施方案中，丝状真菌细胞含有至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。相应的异源酶序列可以源自本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何真菌或微生物。在优选的实施方案中，异源酶序列源自另一丝状真菌物种。
在另一方面，本发明涉及根据如上定义的方法制备的全肉汤酶组合物。
在进一步的方面，本发明涉及如上定义的全肉汤酶组合物用于水解木质纤维素生物质的用途。在说明书中对“水解”和“木质纤维素生物质”的定义适用。
一般优选实施方案
在下文中，列出了本发明的一般优选实施方案，其不在任何方面限制本发明的范围和/或权利要求的范围。一般优选实施方案说明了通过丝状真菌里氏木霉产生全肉汤酶组合物的特别合适的实施方案。
一般优选实施方案1
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基，其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L和干物质含量为30至65重量％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案2
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案3
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％和pH为3.5至5；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得含有至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶的全肉汤酶组合物，其由该至少一种里氏木霉细胞产生。
一般优选实施方案4
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L和干物质含量为30至65重量％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案5
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案6
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％和pH为3.5至5；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得含有至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶的全肉汤酶组合物，其由该至少一种里氏木霉细胞产生。
一般优选实施方案7
用于产生如一般优选实施方案1至6中任一项所定义的全肉汤酶组合物的方法，其中里氏木霉细胞通过遗传方法(例如转化)和/或非遗传方法(例如化学诱变或辐射)进一步遗传修饰，并且其中该进一步遗传修饰的里氏木霉细胞能够表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白。
一般优选实施方案8
里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏，并且其中里氏木霉细胞是遗传修饰的里氏木霉细胞，其中里氏木霉细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。
一般优选实施方案9
如一般优选的实施方案8所定义的里氏木霉细胞，其中至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列源自枝顶孢霉属物种、假尾孢属物种和/或踝节菌属物种，并且其中至少一种木聚糖酶编码序列源自层孔菌属物种，其中至少一种β-木糖苷酶编码序列源自曲霉属物种，并且其中至少一种裂解多糖单加氧酶编码序列源自曲霉属物种、木霉属物种或肉座菌属物种。
一般优选实施方案10
根据如一般优选实施方案1至7中任一项所定义的方法产生的全肉汤酶组合物，其含有至少一种由如一般优选实施方案8或9所定义的遗传修饰的里氏木霉细胞产生的异源β-葡糖苷酶，并且含有这些里氏木霉细胞的全部或部分。
一般优选实施方案11
如一般优选实施方案8或9所定义的遗传修饰的里氏木霉细胞用于产生如一般优选实施方案10所定义的用于水解木质纤维素生物质的全肉汤酶组合物的用途。
一般优选实施方案12
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基，其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L和干物质含量为30至65重量％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案13
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案14
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％和pH为3.5至5；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得含有至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶的全肉汤酶组合物，其由该至少一种里氏木霉细胞产生。
一般优选实施方案15
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L和干物质含量为30至65重量％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案16
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
一般优选实施方案17
用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供发酵培养基，其源自选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、稻草、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆的木质纤维素生物质的水解；其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65重量％、氮含量为0.05至5重量％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％和pH为3.5至5；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏；
(c)在20℃至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得含有至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶的全肉汤酶组合物，其由该至少一种里氏木霉细胞产生。
一般优选实施方案18
用于产生如一般优选实施方案12至17中任一项所定义的全肉汤酶组合物的方法，其中里氏木霉细胞通过遗传方法(例如转化)和/或非遗传方法(例如化学诱变或辐射)进一步遗传修饰，并且其中该进一步遗传修饰的里氏木霉细胞能够表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白。
一般优选实施方案19
里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏，并且其中里氏木霉细胞是遗传修饰的里氏木霉细胞，其中里氏木霉细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。
一般优选实施方案20
如一般优选实施方案19所定义的里氏木霉细胞，其中至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列源自枝顶孢霉属物种、假尾孢属物种和/或踝节菌属物种，并且其中至少一种木聚糖酶编码序列源自层孔菌属物种，其中至少一种β-木糖苷酶编码序列源自曲霉属物种，并且其中至少一种裂解多糖单加氧酶编码序列源自曲霉属物种、木霉属物种或肉座菌属物种。
一般优选实施方案21
根据如一般优选实施方案12至18中任一项所定义的方法产生的全肉汤酶组合物，其含有至少一种由如一般优选实施方案19或20所定义的遗传修饰的里氏木霉细胞产生的异源β-葡糖苷酶，并且含有这些里氏木霉细胞的全部或部分。
一般优选实施方案22
如一般优选实施方案19或20所定义的遗传修饰的里氏木霉细胞用于产生如一般优选实施方案21所定义的用于水解木质纤维素生物质的全肉汤酶组合物的用途。
附图和实施例
通过以下附图和实施例描述本发明。因此要强调的是，附图和实施例并不限制本发明和权利要求的范围，而仅仅构成本发明、本发明的目的和通过本发明的方法实现的益处的进一步说明。
附图列表
图1：在水解培养基1中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1、2和-3以及参比菌株M18.2b的培养物上清液中的蛋白质浓度。值是相对于宿主菌株M18.2b的上清液中的蛋白质浓度(其设定为1)给出的。
图2：在水解培养基1中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1、2和-3以及参比菌株M18.2b的培养物肉汤中的生物质浓度。值是相对于宿主菌株M18.2b的培养物肉汤中的生物质浓度(其设定为1)给出的。
图3：在水解培养基1中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1、2和-3以及参比菌株M18.2b的培养物肉汤的粘度。值是相对于宿主菌株M18.2b的培养物肉汤的粘度(其设定为1)给出的。
图4：菌株MSEQ1SEQ11-1至3和参比菌株M18.2b的培养物上清液中的蛋白质浓度。值是相对于宿主菌株M18.2b的上清液中的蛋白质浓度(其设定为1)给出的。
图5：菌株MSEQ1SEQ11-1至3和参比菌株M18.2b的培养物肉汤中的生物质浓度。值是相对于宿主菌株M18.2b的培养物肉汤中的生物质浓度(其设定为1)给出的。
图6：菌株MSEQ1SEQ11-1至3和参比菌株M18.2b的培养物肉汤的粘度。值是相对于宿主菌株M18.2b的培养物肉汤的粘度(其设定为1)给出的。
总体
实施例描述了通过产生早期终止密码子灭活里氏木霉SEQ1基因(序列为SEQ IDNO：1)，并显示了SEQ1基因灭活对里氏木霉的蛋白质产生、生物质形成和培养培养物肉汤粘度的影响，以及SEQ1和SEQ11(序列为SEQ ID NO：11)基因的破坏对里氏木霉的蛋白质产生、生物质形成和培养物肉汤粘度的影响。
本领域技术人员已知的，和例如由Sambrook和Russel(Molecular Cloning-Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约)或由Jansohn等人(Gentechnische Methoden，Elsevier，München)所描述的标准方法用于DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化、大肠杆菌转化、质粒增殖和纯化、通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段和从里氏木霉和构巢裸胞壳(Emericella nidulans)分离基因组DNA。非连接依赖性克隆(LIC)基本上如由Aslanidis和de Jong(1990,Nucleic Acid Res.18(20),6069)所述进行。
实施例1：SEQ1突变载体的构建
由Thermo Fisher Scientific合成质粒pSEQ1M(SEQ ID NO：2)，其含有用于将突变G1271T(根据SEQ ID NO：1的位置)引入SEQ1基因中的侧翼区和用于将克隆的标记基因插入到pUC19-衍生质粒中的LIC位点。
根据制造商的说明书，质粒pSEQ1M使用SrfI(New England Biolabs)消化，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
潮霉素B抗性盒(HygR)(SEQ ID NO：3)由Thermo Scientific.HygR合成。根据制造商的说明书，使用Thermo Scientific的DNA作为模板、引物为SEQ1MKOfw(5’-GATGGCTGTGTAGAAGTAC-3’；SEQ ID NO：6)和SEQ1MKOrv(5’-CTGTATAGACGAGTTTCTTC-3’；SEQID NO：7)及Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶(退火温度：68.5℃，延伸时间：40秒，30个循环)通过PCR扩增HygR。使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.4kb)。
使用非连接依赖性克隆(LIC)将PCR-扩增的HygR标记与线性化的pSEQ1M融合。在dTTP的存在下，使用T4 DNA聚合酶处理线性化的载体。在dATP存在下，使用T4 DNA聚合酶处理PCR扩增的HygR标记基因。如引用的文献中所述，将T4 DNA聚合酶处理的载体和标记基因混合并退火。然后将测定物转化到化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞(Agilent)中，接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB-Agar板(LB-Amp)上，并在37℃温育24小时。使用牙签从琼脂板上挑取菌落，转移至液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)温育24小时。分离质粒DNA，通过使用XmnI消化验证插入片段的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ1M-HygR。
实施例2：将SEQ1突变载体转化至里氏木霉中
根据制造商的说明书，载体pSEQ1M-HygR使用XmnI(New England Biolabs)消化，并且突变盒(6.3kb)通过琼脂糖凝胶电泳和用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。基本上如等人(1987)Gene 61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76所述，使用消化的载体转化里氏木霉M18.2b(DSM 19984)。在含有100mg·l-1潮霉素和1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂板上选择转化体，并通过单一化进行纯化。纯化菌株的分生孢子储备液通过在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂板上将其生长直至板被孢子覆盖来制备。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l-1)-Triton X-100(0.01g·l-1)溶液收获，调节至OD600＝10，补充50g·l-1甘油并储存在-80℃下。
从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，使用Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶、转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1MKOfw(5’-GATGGCTGTGTAGAAGTAC-3’；SEQ ID NO：6)和SEQ1MKOrv(5’-CTGTATAGACGAGTTTCTTC-3’；SEQ ID NO：7)(退火温度：62.2℃，延伸时间：1分钟15秒，30个循环)通过PCR验证SEQ1突变盒在预期基因座处的整合。具有引物SEQ1MKOfw和SEQ1MKOrv的2.3kb条带表明突变盒在SEQ1基因座处的整合。还测试了菌株M18.2b的基因组DNA作为对照。为了验证预期的突变被插入到SEQ1 ORF中，根据制造商的说明书，使用Thermo FisherScientific的phusion聚合酶、转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1MSeqfw(5’-CAGTGACTAGCTGTGATATG-3’；SEQ ID NO：8)和SEQ1MSeqrv(5’-TCAGTCGTATTCTCCTTG-3’；SEQID NO：9)(退火温度：64.1℃，延伸时间：60秒，30个循环)通过PCR扩增相应区域。使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化2.0kb扩增子，并使用引物MSeq-01(5’-TGGAAGACGTTTCGACCG-3’；SEQ ID NO：10)测序。
在SEQ1 ORF中含有来自pSEQ1M-HygR的突变的两个菌株命名为MSEQ1-1和-2。
实施例3：SEQ1突变菌株在摇瓶中的生长
菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b在摇瓶中于水解产物培养基1中生长。水解产物培养基1含有(g·l-1)：
/>
用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并高压灭菌(在121℃下20分钟)。
在无菌罩下，将15ml培养基分配到50ml锥形摇瓶中。将菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的分生孢子储备液解冻，在无菌罩下，将75μl分生孢子悬浮液移液至具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)温育6天。6天后，将培养物倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg，4℃，15分钟)，并将上清液储存在4℃下，同时将剩余的培养物肉汤用于测定生物质和粘度(参见下文)。
实施例4：培养物上清液和肉汤的表征：蛋白质浓度、生物质、粘度
根据供应商的说明书，使用Quick StartTMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的离心培养物上清液中的蛋白质浓度。测量结果显示在图1中，并且相对于菌株M18.2b的培养物上清液中的蛋白质浓度(其设定为1)呈现。
对于生物质测量，将WhatmanTM过滤盘(P1)在60℃下干燥，直至其重量保持恒定24小时。使用那些干燥的过滤盘过滤菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的培养物肉汤，并用至少十倍肉汤体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的过滤盘干燥，直至其重量保持恒定24小时。称重具有干燥菌丝体的过滤盘。然后通过从具有菌丝体的干燥过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养物肉汤的体积，来计算培养物肉汤中的生物质浓度。测量结果显示在图2中，并且相对于菌株M18.2b的培养物肉汤中的生物质浓度(其设定为1)呈现。
根据制造商的说明书，菌株MSEQ1-1和-2以及M18.2b的培养物肉汤的粘度使用具有Vane工具的Malvern Kinexus Lab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn:CUPnn)测量。在20℃的温度下和18.11RPM(“每分钟转数”)的转速下进行测量。粘度描绘在图3中，并且相对于菌株M18.2b的培养物肉汤的粘度(其设定为1)呈现。
实施例5：SEQ11突变载体的构建
通过将构巢裸胞壳amdS基因融合至SEQ11 5’和3’侧翼区，并将融合产物克隆至pUC19-衍生的质粒中构建SEQ11突变载体。SEQ9的序列是SEQ ID NO：11。
根据制造商的说明书，使用里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA作为模板、引物SEQ11M5fw(5‘-GACTCTCTATCTGCATCAAC-3‘；SEQ ID NO：12)和SEQ11M5rv(5‘-TGACCTGGAAAGCTTTCAATGTAGAGGTAGACTAGTCAAAGAAGACATCACGAC-3‘；SEQ ID NO：13)和ThermoFisher Scientific的phusion聚合酶(退火温度：64.8℃，延伸时间：1分钟25秒，30个循环)通过PCR扩增SEQ11 5’侧翼区。使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.7kb)。
根据制造商的说明书，使用里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA作为模板、引物SEQ11M3fw(5‘-CGCATGGTGGGCGTCGTGATGTCTTCTTTGACTAGTCTACCTCTACATTGAAAGC-3‘；SEQ ID NO：14)和SEQ11M3rv(5‘-GATTACCTGTCAAGTCTATG-3‘；SEQ ID NO：15)和ThermoFisher Scientific的phusion聚合酶(退火温度：62.4℃，延伸时间：1分钟25秒，30个循环)通过PCR扩增SEQ11 3’侧翼区。使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.7kb)。
使用Phusion聚合酶(Thermo Fisher Scientific)和与聚合酶一起提供的缓冲液和dNTP溶液通过PCR融合SEQ11 5’和3’侧翼区。将100ng纯化的SEQ9 5’PCR扩增子、100ng纯化的SEQ9 3’扩增子、10μl 5x Phusion HF缓冲液、1μl 10mM dNTP溶液、1U Phusion聚合酶和PCR级别水至终体积48μl混合。首先将混合物在98℃下温育30℃，然后进行10个循环的在98℃下10秒、在65℃下30秒和在72℃下2分钟40秒，然后冷却至10℃。然后添加1μl的引物SEQ11Mnestfw(5’-GACAGTCCTGCAGGAGTCACTGCCTTTGAAAG-3’；SEQ ID NO：16)的20μM溶液和1μl的引物SEQ11Mnestrv(5’-GACAGTCCTGCAGGTGTAAGGATAAAGGACGAC-3’；SEQ ID NO：17)的20μM溶液，将混合物在98℃下温育30秒，然后进行30个循环的在98℃下10秒、在66.2℃下30秒和在72℃下1分钟20秒。在72℃下的温育时间每个循环增加5秒。最后，将混合物在72℃下温育10分钟，然后冷却至10℃。使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(5.2kb)。
根据制造商的说明书，使用SbfI(New England Biolabs)消化纯化的SEQ11 5’-3’侧翼区融合产物，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
根据制造商的说明书，使用SbfI(New England Biolabs)消化质粒pUC19(NewEngland Biolabs)，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
根据制造商的说明书，使用“Mighty Mix”DNA连接试剂盒(Takara)，使用5比1的插入片段/载体摩尔比连接sbfi消化的SEQ11 5’-3’侧翼融合产物和pUC19。将连接混合物转化到大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中，并接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB-琼脂板上。在37℃下温育20小时后，从板上挑取菌落，并用于接种3ml含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃下温育20h后，分离质粒DNA，并用sbfi消化以鉴定含有插入片段的克隆。含有插入片段的质粒命名为pSEQ11-5’-3’。
根据制造商的说明书，质粒pSEQ11-5’-3’使用SpeI(New England Biolabs)消化，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。将各自1μl的10μM的寡核苷酸LIC1fw(5’-CTAGGAGTTCTGCCTTGGGTTTAAACGAGAGAAAGACTC-3’；SEQ ID NO：18)和LIC1rv(5’-CTAGGAGTCTTTCTCTCGTTTAAACCCAAGGCAGAACTC-3’；SEQ ID NO：19)溶液混合，放入PCR循环仪中，并经2h的过程从70℃冷却至20℃。然后将寡核苷酸混合物与750ng纯化的、SpeI-消化的pSEQ11-5’-3’、1μl 10x T4连接酶缓冲液(Promega)、1μl 500g/lPEG3350、1μl T4 DNA连接酶(5U/μl；Thermo Fisher Scientific)和2μl的PCR-级别水混合。将混合物在20℃下温育1h，使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化，并将DNA在50μl PCR-级别水中洗脱。向该溶液中补充6μl的Taq聚合酶缓冲液(Promega)，并添加PCR-级别水至终体积为60μl。然后将混合物转化到大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中，并接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB琼脂板上。在37℃下温育20小时，从板上挑取菌落，并用于接种3ml含100mg·l-1氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃下温育20h后，分离质粒DNA，并根据制造商的说明书，用Pmei和Sspi(New England Biolabs)消化以鉴定含有插入片段的克隆。含有插入片段的质粒命名为pSEQ11-5’-3’-LIC。
根据制造商的说明书，质粒pSEQ11-5’-3’-LIC用PmeI(New England Biolabs)消化，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
根据制造商的说明书，使用来自构巢裸胞壳菌株CBS124.59的基因组DNA作为模板，引物SEQ11MamdSfw(5’-GTTCTGCCTTGGGTTTAGGATGTACGACGTATATCC-3’；SEQ ID NO：21)和SEQ11MamdSrv(5’-GTCTTTCTCTCGTTTATGATGTCTATTGGAAGAAAACTTGG-3‘；SEQ ID NO：22)和Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶(退火温度：56.9℃，延伸时间：1分钟45秒，30个循环)扩增包括启动子和终止子的构巢裸胞壳amdS基因(SEQ ID NO：20)。使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(3.4kb)。
如Aslanidis和de Jong(1990,Nucleic Acid Res.18(20),6069)所述，使用非连接依赖性克隆(LIC)将PCR-扩增的amdS基因与PmeI-消化的pSEQ11-5’-3’-LIC融合。在dATP存在下，使用T4 DNA聚合酶处理线性化载体。在dTTP存在下，用T4 DNA聚合酶处理PCR扩增的amdS。将T4 DNA聚合酶处理的载体和amdS混合并退火。然后将测定物转化到化学感受态大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中，并接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB琼脂板上，并在37℃下温育24h。使用牙签从琼脂板上挑取菌落，转移到含有100mg·l-1氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃下振荡(250RPM)温育24小时。分离质粒DNA，通过用SbfI消化验证插入片段的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，并将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ11M-amdS。
实施例6：SEQ11突变载体转化至里氏木霉中
根据制造商的说明书，使用sbfi(New England Biolabs)消化载体pSEQ11M-amdS，并通过琼脂糖凝胶电泳和来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化突变盒(8.6kb)。基本上如等人(1987)Gene 61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76所述，使用消化的载体转化里氏木霉MSEQ1-1。转化体在乙酰胺选择板(含有(以g·l-1计)：乙酰胺0.6、CaCl2*2H2O 0.3、琼脂诺布尔15、CsCl 2.5、FeSO4*7H2O0.005、CuSO4*5H2O 0.0001、葡萄糖20、KH2PO4 15、MgSO4*7H2O 0.3、MnSO4*H2O 0.0016、山梨醇182,ZnSO4*7H2O 0.0014；调节至pH 5.5)上选择，并通过单一化进行纯化。通过在30℃下于马铃薯葡萄糖琼脂板上生长直至板被孢子覆盖来制备纯化菌株的分生孢子储备液。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l-1)-Triton X-100(0.01g·l-1)溶液收获，调节至OD600＝10，补充50g·l-1甘油，并储存在-80℃下。为了确定分生孢子滴度，将储备液的等分试样解冻，在马铃薯葡萄糖肉汤中适当稀释，并接种在含有1g·l-1的Triton X-100的马铃薯葡萄糖琼脂上。将板在30℃下温育4天，然后对板上的菌落进行计数。
从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，使用来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶、来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ11MKO1fw(5’-ACTCTCTATCTGCATCAAC-3’；SEQ ID NO：23)和SEQ11MKO1rv(5’-GATCCCCGATTTCTTTGG-3’；SEQ ID NO：24)(退火温度：56.9℃，延伸时间：1分钟20秒，30个循环)和引物SEQ11MKO2fw(5’-TGATGTGCTTGATATTGGGC-3’；SEQ ID NO：25)和SEQ11MKO2rv(5’-CTCCATCGCTCAACTATGTG-3’；SEQ ID NO：26)(退火温度：57.5℃，延伸时间：1分钟15秒，30个循环)通过PCR验证SEQ11突变盒在预期基因座的整合。使用引物SEQ11MKO1fw和SEQ11MKO1rv的3.9kb条带表明突变盒在SEQ11基因座的整合，从而取代了SEQ11编码区，而SEQ11MKO1fw和SEQ11MKO1rv(1.2kb扩增子)扩增了被pSEQ11M-amdS取代的SEQ11基因的一部分，因此仅当SEQ11基因仍然存在时给出条带。还测试了来自菌株MSEQ1-1的基因组DNA作为对照。
在SEQ11基因座整合了来自pSEQ11M-amdS的突变盒，并由此取代(并因此破坏)SEQ11基因的三种MSEQ1-1衍生的菌株命名为MSEQ1SEQ11-1至-3。
实施例7：SEQ1SEQ11突变菌株在摇瓶中的生长
菌株MSEQ1SEQ11-1至-3和M18.2b在摇瓶中在水解产物培养基1中生长。水解产物培养基1含有(g·l-1)：
/>
使用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并通过高压灭菌(在121℃下20分钟)进行灭菌。
在无菌罩下将15ml培养基分配到50ml Erlenmeyer摇瓶中。将菌株MSEQ1SEQ11-1至-3和M18.2b的分生孢子储备液解冻，在无菌罩下，将相当于2.5×105个分生孢子的分生孢子悬浮液用移液管移至具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)温育6天。6天后，将培养物倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg，4℃，15分钟)，并将上清液储存在4℃，同时将剩余的培养物肉汤用于测定生物质和粘度(参见下文)。
实施例8：培养物上清液和肉汤的表征：蛋白质浓度、生物质、粘度
根据制造商的说明书，使用Quick StartTMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株MSEQ1SEQ11-1至-3和M18.2b的离心培养物上清液中的蛋白质浓度。测量结果显示在图4中。值是相对于菌株M18.2b的上清液中的蛋白质浓度(其设定为1)给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1SEQ11-1至-3比菌株M18.2b产生显著更多的蛋白质。
对于生物质测定，将WhatmanTM过滤盘(P1)在60℃下干燥，直至其重量保持恒定24h，冷却至室温并称重。使用那些干燥的过滤盘过滤菌株MSEQ1SEQ11-1至-3和M18.2b的培养物肉汤，并用至少十倍肉汤体积的去离子水洗涤菌丝体。然后将具有菌丝体的过滤盘在60℃下干燥直至其重量保持恒定24小时。称重具有干燥菌丝体的过滤盘。然后通过从具有菌丝体的干燥过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养物肉汤的体积来计算培养物肉汤中的生物质浓度。测量结果显示在图5中。值是相对于菌株M18.2b的培养物肉汤中的生物质浓度(其设定为1)给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1SEQ11-1至-3比菌株M18.2b产生显著更少的生物质。
根据制造商的说明书，使用具有Vane工具的Malvern Kinexus Lab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn：CUPnn)测量菌株MSEQ1SEQ11-1至-3和M18.2b的培养物肉汤的粘度。测量是在20℃的温度下和18.11RPM(“每分钟转数”)的转速下进行的。粘度描绘在图6中，并且相对于菌株M18.2b的培养物肉汤的粘度(其设定为1)呈现。从这些数据显而易见，使用MSEQ1MSEQ11-2至-3产生的培养物肉汤的粘度显著低于菌株M18.2b的粘度。
总结
总之，这些数据证明SEQ1基因的破坏导致更有效的蛋白质产生、形成更多的蛋白质和更少的生物质。此外，SEQ1破坏菌株中培养物肉汤的粘度也显著降低。通过破坏SEQ11基因甚至可以进一步提高这些效果。两种破坏显示出协同效应。
序列表
SEQ ID NO：1
SEQ1天然基因
SEQ ID NO：2
pSEQ1M
/>
/>
/>
SEQ ID NO：3
潮霉素B抗性标记
/>
SEQ ID NO：4
SEQ1MHygRfw
SEQ ID NO：5
SEQ1MHygRrv
SEQ ID NO：6
SEQ1MKOfw
SEQ ID NO：7
SEQ1MKOrv
SEQ ID NO：8
SEQ1MSeqfw
SEQ ID NO：9
SEQ1MSeqrv
/>
SEQ ID NO：10
MSeq-01
SEQ ID NO：11
SEQ11天然基因
/>
/>
SEQ ID NO：12
SEQ9M5fw
SEQ ID NO：13
SEQ9M5rv
SEQ ID NO：14
SEQ9M3fw
SEQ ID NO：15
SEQ9M3rv
SEQ ID NO：16
SEQ9Mnestfw
SEQ ID NO：17
SEQ9Mnestrv
SEQ ID NO：18
LIC1fw
SEQ ID NO：19
LIC1rv
SEQ ID NO：20
amdS
/>
/>
SEQ ID NO：21
SEQ9MamdSfw
SEQ ID NO：22
SEQ9MamdSrv
SEQ ID NO：23
SEQ9MKO1fw
SEQ ID NO：24
SEQ9MKO1rv
SEQ ID NO：25
SEQ9MKO2fw
SEQ ID NO：26
SEQ9MKO2rv
/>
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至450g/L、木糖含量为2至300g/L、密度为1至2kg/L和干物质含量为10至75重量％；
(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏；
(c)将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞在20至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物，
其中，所述丝状真菌细胞选自里氏木霉物种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将根据步骤(a)的发酵培养基的pH调节至选自pH2.0至6.0的pH。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中葡萄糖与木糖的比率为1.0至3.5。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(ai)：通过蒸发、膜过滤或薄层蒸发来浓缩所述发酵培养基，以将所述发酵培养基的重量降低2倍至6倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(aii)根据步骤(a)的发酵培养基或根据步骤(ai)的浓缩的发酵培养基的灭菌。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的发酵培养基具有小于0.5g/L的糠醛含量。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的发酵培养基具有小于0.5g/L的羟甲基糠醛(HMF)含量。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(e)根据步骤(c)的发酵培养基的固-液分离以获得固体部分和液体部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.05重量％至5重量％的氮。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.5至350mg/L的FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中SED ID NO：11被破坏。
13.丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏，其中，所述丝状真菌细胞选自里氏木霉物种。
14.根据权利要求13所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：11被破坏。
15.根据权利要求13或14所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏。
16.根据权利要求13或15中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是具有表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白的能力的遗传修饰的丝状真菌细胞。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的丝状真菌细胞用于产生全肉汤酶组合物的用途。

Claims (23)

1.用于产生全肉汤酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供源自木质纤维素生物质水解的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至450g/L、木糖含量为2至300g/L、密度为1至2kg/L和干物质含量为10至75重量％；
(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏；
(c)将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞在20至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得全肉汤酶组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将根据步骤(a)的发酵培养基的pH调节至选自pH2.0至6.0的pH。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中葡萄糖与木糖的比率为1.0至3.5。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(ai)：通过蒸发、膜过滤或薄层蒸发来浓缩所述发酵培养基，以将所述发酵培养基的重量降低2倍至6倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(aii)根据步骤(a)的发酵培养基或根据步骤(ai)的浓缩的发酵培养基的灭菌。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的发酵培养基具有小于0.5g/L的糠醛含量。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的发酵培养基具有小于0.5g/L的羟甲基糠醛(HMF)含量。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(e)根据步骤(c)的发酵培养基的固-液分离以获得固体部分和液体部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.05重量％至5重量％的氮。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.5至350mg/L的FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自里氏木霉物种。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中SED ID NO：11被破坏。
15.丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1被破坏。
16.根据权利要求15所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：11被破坏。
17.根据权利要求15或16所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：11通过缺失、突变、启动子或任何其它调控序列的修饰、生成终止密码子或RNA干扰被破坏。
18.根据权利要求15或17中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是具有表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白的能力的遗传修饰的丝状真菌细胞。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞选自里氏木霉物种。
21.根据权利要求1至14中任一项所述的方法产生的全肉汤酶组合物。
22.根据权利要求15至20中任一项所述的丝状真菌细胞用于产生全肉汤酶组合物的用途。
23.根据权利要求21所述的全肉汤酶组合物用于水解木质纤维素生物质的用途。
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