CN117120603A - 用于生产由丝状真菌生产的具有低粘度的工艺酶组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产具有低粘度的工艺酶组合物的方法，适用于生产工艺酶组合物的遗传修饰的丝状真菌细胞，此类遗传修饰的丝状真菌用于生产具有低粘度的工艺酶组合物的用途以及通过此类方法生产的具有低粘度的工艺酶组合物。

Description

用于生产由丝状真菌生产的具有低粘度的工艺酶组合物的 方法
本发明涉及用于生产由遗传修饰的丝状真菌细胞生产的具有低粘度的工艺酶组合物的方法、适用于生产工艺酶组合物的遗传修饰的丝状真菌细胞、此类遗传修饰的丝状真菌细胞用于生产具有低粘度的工艺酶组合物的用途以及通过此类方法生产的具有低粘度的工艺酶组合物。
酶是许多商业产品和相应生产方法的重要组分。现代洗衣组合物含有各种不同的酶，例如纤维素酶，许多家畜饲料产品含有酶，并且酶也用于生产许多商业产品例如生产生物乙醇、塑料替代品/可生物降解的塑料或甚至食物产品。此类方法中用的酶通常称为“工业酶”或“工艺酶”。
为了获得所需最终产品的经济可行性，所用的工艺酶的高产率和低生产成本是必要的。当所需的商业最终产品是必须与源自廉价矿物油衍生的化学合成方法的低价格替代品竞争的散装产品时，这尤其适用。
众所周知，丝状真菌是各种技术上可行的酶的有效生产者。此外，丝状真菌能够在各种底物上生长。
然而，丝状真菌用于生产工艺酶的实施仍然不是非常普遍，因为此类真菌的发酵肉汤的高粘度通常需要耗时和成本消耗的措施，导致工艺酶组合物的生产成本过高。为了获得酶的高产率，期望真菌的强生长，然而，强生长导致发酵肉汤中真菌生物量的高含量。已知由大体上菌丝组成的真菌在本领域中已知可使得任何发酵底物成为高粘度组合物。当用呈现海绵状、粘滑外观的丝状真菌时，该效果显著地更明显。
高粘度引起许多问题，因为真菌在生长过程中需要通过通气持续供氧。此外，需要发酵罐冷却，特别是在工业规模生产中。两者仅可以通过不断的搅拌来保证-在一方面，在肉汤内均匀地分布气泡，并且在另一方面，促进与冷却装置的恒定热交换。肉汤的粘度越高，在反应器内实现有效搅拌需要消耗的能量越多。此外，必须将更多的空气压入反应器中，其导致压缩机和无菌过滤器单元内更高的能量消耗。因此，CAPEX和OPEX二者均随着发酵肉汤粘度的增加而增加。替代的措施-更少的细胞量生产-对于商业生产也不具有吸引力，因为其总是伴随着工艺酶生产的较低产率。
因此，本发明的发明人自己设定了任务，即开发用于生产由丝状真菌生产的具有低粘度的工艺酶组合物，同时保持酶的高产率的方法。
任务通过用于生产工艺酶组合物的方法得以解决，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至450g/L的发酵培养基；
(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
本发明方法的特别优点是用含有大量葡萄糖的任何种类的培养基实现了目标酶的高产率。丝状真菌分泌的大部分蛋白质是降解天然存在的聚合物(例如纤维素和半纤维素)的酶，并且葡萄糖的可利用性通常会阻止丝状真菌产生此类酶，因为其不是葡萄糖代谢所需要的。此外，不需要添加昂贵的诱导物质，例如葡低聚糖(gluco-oligosaccharide)或槐糖。因此，可以使用容易且便宜获得的各种不同的发酵底物。
在本发明中，术语“工艺酶组合物”应理解为由部分或完全发酵的培养基组成或含有部分或完全发酵的培养基，甚至可以含有原始培养基的组分以及在发酵过程中产生的任何化合物，例如酶。“工艺酶组合物”还可以含有发酵微生物(即丝状真菌)的部分或全部微生物生物量。
在本发明中，工艺酶组合物优选含有至少一种属于水解酶类的酶和/或至少一种属于氧化还原酶类的酶。在本发明特别优选的实施方式中，工艺酶组合物含有至少一种属于水解酶类的酶和/或至少一种属于氧化还原酶类的酶，其由至少一种丝状真菌细胞产生。在另一个特别优选的实施方式中，工艺酶组合物含有至少一种属于纤维素酶类的酶和/或至少一种属于半纤维素酶类的酶，其由至少一种丝状真菌细胞产生。
在本发明中，术语“属于水解酶类的酶”应理解为包含能够水解化学键的任何酶。属于水解酶类的酶在酶的EC编号分类中被分类为EC 3。根据本发明，术语“水解酶”包含纤维素酶、半纤维素酶、并且还可以包括果胶酶、氧化酶、几丁质酶、壳聚糖酶、转谷氨酰胺酶、戊聚糖酶、niringinases、柠檬苦素酶、内酯酶、核酸酶、脲酶、脂氧合酶、酯酶、α-葡聚糖酶、磷酸酶、异构酶、蛋白酶和辅助蛋白。
在本发明中，“属于水解酶类的酶”可以是丝状真菌的天然酶或源自不同微生物种类，特别是源自不同丝状真菌种类的异源酶，但也可以源自非丝状真菌或细菌。
本发明中用的术语“纤维素酶”是指能够将纤维素聚合物水解成较短的低聚物和/或葡萄糖的任何酶。工艺酶组合物中优选的纤维素酶包括纤维二糖水解酶(CBH)(EC3.2.1.-)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4).)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(GH61和CBM33)。
本发明中用的术语“半纤维素酶”是指能够降解或支持半纤维素降解的任何酶。工艺酶组合物中优选的半纤维素酶包括β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(EC3.1.1.-)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘露聚糖1,4-甘露二糖苷酶(EC3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、针叶树β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.150、151、155)、木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.131)、内切-木糖半乳聚糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-；GH28)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1,3-半乳糖苷酶(GH43)、-1,4,-内切半乳聚糖酶(EC 3.5.1.89；GH53)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)和β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)。
本发明中用的术语“果胶酶”是指能够降解或支持果胶降解的任何酶。在工艺酶组合物中优选的果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)、果胶乙酰基酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.-)、木糖聚半乳糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-)、果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)、β-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、β-1,3-半乳聚糖酶(EC3.2.1.90)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-半乳糖苷酶(EC 3.1.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC3.1.1.-)、α-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.51)、(β-岩藻糖苷酶)(EC3.2.1.38)、β-芹菜苷酶(EC3.2.1.-)、α-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.43)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(EC3.2.1.-)、β-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.31)、α-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)和α-木糖苷酶(EC3.2.1.x)。
本发明中用的术语“辅助蛋白”是指能够支持纤维素分解酶活性的任何酶。该术语是本领域技术人员众所周知的。在工艺酶组合物中优选的辅助蛋白包括扩张蛋白、膨胀素、松弛素和CIP蛋白(EC 3.1.1.-；CE15)。
本发明中用的术语“氧化还原酶”是指能够催化氧化和/或还原反应的任何酶。属于氧化还原酶类的酶在酶的EC编号分类中被分类为EC1。在工艺酶组合物中优选的氧化还原酶包括裂解多糖单加氧酶(LPMO)(AA9-11；分别为先前GH61和CBM33)(EC 1.14.99.53-56，1.14.99.B10)、木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、芳基醇氧化酶(EC 1.1.3.7)、乙二醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9,10)、纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)、过氧化氢酶(过氧化氢氧化还原酶)(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)、染料脱色过氧化物酶(EC 1.11.1.19)、漆酶(EC 1.10.3.2)、过氧化物酶(EC 1.11.1.x)和多功能过氧化物酶(EC 1.11.1.16)。
本发明中用的术语“酯酶”是指能够裂解酯键的任何酶。在工艺酶组合物中优选的酯酶包括乙酰酯酶、葡糖醛酸酯酶、阿魏酰酯酶、脂肪酶、角质酶和磷脂酶。
本发明中用的术语“α-葡聚糖酶”是指能够降解α-连接的寡糖和多糖的任何酶。在工艺酶组合物中优选的α-葡聚糖酶包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、葡聚糖酶、海藻糖酶、乳糖酶、转化酶和麦芽糖酶。
本发明中用的术语“磷酸酶”是指能够裂解磷酸酯键的任何酶。在工艺酶组合物中优选的磷酸酶包括肌醇六磷酸酶。
本发明中用的术语“异构酶”是指能够将化合物转变为异构结构的任何酶。在工艺酶组合物中优选的异构酶包括木糖异构酶、葡萄糖异构酶和阿拉伯糖异构酶。
本发明中用的术语“蛋白酶”是指能够切割肽键的任何酶。在工艺酶组合物中优选的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
本发明中提及的酶根据命名法进行分类，该命名法基于国际生物化学和分子生物学联合会的酶命名和分类(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)或基于碳水化合物-活性酶(http://www.cazy.org/)数据库。
根据本发明，术语“发酵培养基”应理解为是指本领域技术人员已知适用于本发明方法的任何发酵培养基。在本发明的方法中，发酵培养基含有5至550g/L葡萄糖，其中优选葡萄糖含量为5至450g/L、5至420g/L、8至400g/L和10至280g/L葡萄糖。进一步优选的葡萄糖范围为10至450g/L、40至400g/L和50至350g/L。葡萄糖还优选的范围为5至50g/L、6至40g/L或7至35g/L和50至450g/L、80至400g/L和100至380g/L。在发酵培养基中含有的葡萄糖可以源自本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何来源。在优选的实施方式中，葡萄糖源自玉米、甘蔗或甜菜，优选的来源是玉米糖浆、甘蔗或甜菜糖蜜及其混合物。
在本发明的优选的实施方式中，“发酵培养基”可以至少部分源自木质纤维素生物量的化学、机械和/或酶水解，并且优选包含木质纤维素生物量的预先机械和/或酸性预处理。源自木质纤维素生物量的化学、机械和/或酶水解的发酵培养基可以“原样”用，或者可以将另外的葡萄糖添加至发酵培养基中以获得所需的5至550g/L的发酵培养基的总葡萄糖含量。葡萄糖含量5至450g/L、5至420g/L、8至400g/L和10至280g/L也适用于本发明的方法。葡萄糖进一步优选的范围为10至450g/L、40至400g/L和50至350g/L。葡萄糖还优选的范围为5至50g/L、6至40g/L或7至35g/L和50至450g/L、80至400g/L和100至380g/L。
木质纤维素生物量的水解已经通过机械和酶水解或通过单独的酶水解而不添加任何有机酸和/或无机酸来进行。木质纤维素生物量的水解是本领域技术人员已知的，示例性方法例如描述于Vishnu等2012(Trends in bioconversion of lignocellulose:Biofuels,platform chemicals&biorefinery concept in bioconversion oflignocellulose:Biofuels,platform chemicals&biorefinery concept.Progress inEnergy and Combustion Science,2012年8月，第38卷(4)，522-550)和Prasad等2019(Bioethanol production from waste lignocelluloses:A review on microbialdegradation potential Chemosphere第231卷，2019年9月,第588-60页)中。
在本发明中，术语“木质纤维素生物质”应理解为包括本领域技术人员已知的包含木质纤维素的所有种类的生物质。根据本发明，特别优选的木质纤维素生物量包括木材，谷物秸秆，例如但不限于小麦秸秆、稻草秸秆、大麦秸秆、黑麦秸秆和燕麦秸秆和/或其壳和/或麸皮，甘蔗渣，燕麦壳，柳枝稷，纤维素，原纸浆(从纸浆和纸生产中获得)及其混合物。另外的组分可以包含以下组分中的一种或多种：纯化的纤维素、纸浆、乳清或糖蜜。特别适合根据本发明方法进行水解的木质纤维素生物量选自谷物秸秆、谷物麸皮、谷物壳、木材、甘蔗渣及其混合物。
在优选的实施方式中，木质纤维素生物量含有至少25wt.-％，优选至少40wt.-％，更优选至少70wt.-％，甚至更优选至少80wt.-％和最优选至少90wt.-％的木质纤维素。应理解，木质纤维素生物量还可以包含其他化合物，例如蛋白质性质材料、淀粉、糖，例如可发酵糖和/或不可发酵糖。
源自木质纤维素生物量水解的发酵培养基具有0.90至2.00kg/L，优选0.95至1.90kg/L，更优选1.00至1.50kg/L，和最优选1.05至1.35kg/L的高密度。
源自木质纤维素生物量水解的发酵培养基具有10至75wt.-％，优选10至70wt.-％，进一步优选20至65wt.-％、30至65wt.-％或40至60wt.-％的干物质含量，而10至20wt.-％和10至15wt.-％的干物质含量也是优选的。
在本发明的优选的实施方式中，发酵培养基还含有木糖，并且其中葡萄糖与木糖的比例选自1至3.5.，例如选自1至3、1至2.8、1至2.5或1至2.2的比例。进一步优选的比例是2.1、2.0、1.9和1.8。
在本发明的另一个优选的实施方式中，发酵培养基还含有乳糖，其中葡萄糖与乳糖的比例选自1至10，例如选自1至9、1至8.5、1至8或1至7。进一步优选的比例是3、4、5和6。
在本发明的优选的实施方式中，发酵培养基中没有添加葡低聚糖(gluco-oligosaccharide)，特别优选发酵培养基不含葡低聚糖。
在本发明的优选的实施方式中，发酵培养基中没有添加槐糖，特别优选发酵培养基不含槐糖。
在本发明的另一个优选的实施方式中，发酵培养基含有少于100g/L的纤维素和/或半纤维素，优选少于80g/L，更优选少于70g/L，甚至更优选少于60g/L，特别优选少于50g/L，和最优选少于40g/L的纤维素和/或半纤维素。在另一个优选的实施方式中，本发明的发酵培养基不含半纤维素。在本发明进一步优选的实施方式中，发酵培养基的纤维素含量选自0.01g/L至50g/L，优选0.1至40g/L，进一步优选1至30g/L和最优选1至20g/L。
在另一个优选的实施方式中，发酵培养基具有0.05至50.0g/L的氮含量。优选的氮含量选自0.1至45g/L、0.3至40g/L或0.5至30g/L的范围。在发酵培养基总体积小于100L(升)(例如0.1至小于100L)的小规模发酵的情况下，发酵培养基的氮含量优选选自0.05至2g/L，进一步优选0.3至1.2g/L和最优选0.5至1.0g/L的范围。在一个优选实施方式中，在不搅拌和不通气的反应器中进行小规模发酵。在发酵培养基的总体积为至少100L(例如100至10000000L)的大规模发酵的情况下，发酵培养基中的氮含量优选选自2.0至50g/L，进一步优选5.0至40g/L和最优选7.5至15.0g/L的范围。在一个优选实施方式中，在搅拌和/或通气的反应器中进行大规模发酵。氮可以以本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何形式加入，并且可以以硫酸铵、氨、尿素的形式加入，或者以复合氮源的形式加入，例如豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、蛋白胨、酵母提取物或其组合。在使用复合氮源的情况下，必须根据发酵培养基的所需氮含量来计算所需的复合氮源量。在本发明方法的步骤(a)和/或(b)之前或期间的任何时间，可以通过进料或向发酵培养基中添加总量来添加氮的量。因此，优选氮以25％(wt.-/wt.)氨溶液或40％(wt./wt.)尿素溶液的形式添加。
在本发明的另一个优选的实施方式中，发酵培养基含有0.5至80wt.-％糖蜜、玉米糖浆或其混合物，优选5至75wt.-％、15至70wt.-％、25至65wt.-％、35至60wt.-％、38至55wt.-％或40至52wt.-％。
在本发明方法的优选的实施方式中，发酵培养基的pH已被调节至选自pH 2.0至pH6.0的pH，其中特别优选pH 3.0至pH 5.5和pH3.5至pH 5.5以及pH 3.5至5.0。pH的调节可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和措施进行。在本发明的方法中，优选通过添加酸例如硫酸或乙酸、NaOH、H3PO4或氨来调节pH。
在本发明方法的优选的实施方式中，发酵培养基具有0.5至10.0g/L的磷酸氢钾含量、0.05至1g/L的硫酸镁七水合物含量、0.1至1g/L的氯化钙二水合物含量、1.5至4.5g/L的硫酸铵含量、0.005至0.1g/L的硫酸铁(II)七水合物含量、0.00001至0.001g/L的硫酸锰含量、0.001至0.01g/L的硫酸锌七水合物含量和/或0.0001至0.001g/L的硫酸铜五水合物含量。进一步优选的范围是1至8.0g/L的磷酸氢钾含量、0.1至0.8g/L的硫酸镁七水合物含量、0.3至0.8g/L的氯化钙二水合物含量、1.7至4.0g/L的硫酸铵含量、0.01至0.9g/L的硫酸铁(II)七水合物含量、0.0001至0.0008g/L的硫酸锰含量、0.002至0.008g/L的硫酸锌七水合物含量和/或0.0002至0.008g/L的硫酸铜五水合物含量。
根据本发明方法的步骤(a)“提供”发酵培养基可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何方法和任何手段进行。在一个优选的实施方式中，发酵培养基在分批或补料分批反应器中提供，该反应器优选配备搅拌装置和冷却装置。
根据本发明方法的步骤(b)，将其中SEQ ID NO:1已被破坏的至少一种丝状真菌细胞添加至发酵培养基中。至少一种丝状真菌细胞的添加可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何手段和措施进行。在一个优选的实施方式中，至少一种丝状真菌细胞的添加量为102至1010个细胞/克发酵培养基，优选103至108个细胞/克发酵培养基，最优选104至107个细胞/克发酵培养基。因此，至少一种丝状真菌细胞可以以干燥形式、分生孢子或含有剩余的预培养培养基的预培养基的形式添加。至少一种丝状真菌细胞还可以以完全培养的培养基(也称为主培养基)的形式添加。
在本发明中，术语“丝状真菌细胞”应理解为来自天然存在的和/或本领域技术人员已知的任何丝状真菌的任何细胞。该术语还包含天然来源或修饰的任何丝状真菌细胞。术语“修饰的”是指遗传和非遗传修饰的真菌。即，已经通过遗传方法(例如，转化)和非遗传方法(例如，化学诱变或辐射)修饰的真菌，这两种方法都是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方式中，至少一种丝状真菌细胞选自枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、毛壳属(Chaetomium)、裸胞壳属(Emericella)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、耙菌属(Irpex)、巨座壳属(Magnaporte)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、篮状菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)和栓菌属(Trametes)，其中特别优选木霉属和曲霉属，最优选里氏木霉(有性型：红褐肉座菌(Hypocrea jecornia))。
本发明的另一个优点是，在丝状真菌细胞来自木霉属物种的情况下，木霉属细胞产生增加量的至少一种天冬氨酸蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶在分解复合氮源方面发挥着重要作用，如豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、酵母提取物或蛋白胨。因此，由于复合氮化合物的可用性增加，大量的天冬氨酸蛋白酶将使木霉属真菌生长得更快，并在生产时间内产生更大量的工艺酶组合物。此外，可以将更大量的这些副产物或废物掺入生长培养基中，从而有助于本发明方法的可持续性。在现有技术中，没有或只有有限的量可以用作氮源，并且必须以化学合成的氨或尿素的形式补充另外的氮。适宜的生长培养基含有0.25至75g/L的至少一种复合氮源，所述复合氮源选自豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、酵母提取物、蛋白胨或其混合物。复合氮源的量将根据上述定义和发酵培养基所需的氮含量来计算。
在本发明的另一个优选的实施方式中，至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其能够表达至少一种异源水解酶或氧化还原酶，例如但不限于属于纤维素酶类、属于β-葡糖苷酶类或属于木聚糖酶类或属于裂解多糖单加氧酶类的酶。在此类优选的实施方式中，至少一种异源水解酶或氧化还原酶优选源自另一种丝状真菌，例如但不限于枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉菌属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。在一个特别优选的实施方式中，至少一种丝状真菌细胞是里氏木霉细胞，并且至少一种异源水解酶或氧化还原酶源自且至少一种异源水解酶源自枝顶孢属、阿耶罗菌属(Ajellomyces)、链格孢属(Alternaria)、蜜环菌属(Armillaria)、节皮菌属(Arthroderma)、曲霉属、生赤壳属(Bionectria)、平脐蠕孢属(Bipolaris)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、毛壳属、枝孢瓶霉属(Cladophialophora)、红腐菌属(Clohesyomyces)、炭疽霉属(Colletotrichum)，毛孢壳属(Coniochaeta)、梨孢霉属(Coniosporium)、间座壳属(Diaporthe)、褥盘孢属(Dothistroma)、裸胞壳属、附球菌属(Epicoccum)、外瓶霉属(Exophiala)、层孔菌属(Fomes)、着色霉属(Fonsecaea)、镰刀菌属、赤霉菌属(Gibberella)、蓝菌属(Grosmannia)、滑锈伞属(Hebeloma)、何德霉属(Hortaea)、腐质霉属、肉座菌属、炭团菌属(Hypoxylon)、耙菌属、棒束孢属(Isaria)、Kuraishia、白环蘑属(Leucoagaricus)、马杜拉分支菌属(Madurella)、梨孢菌属(Magnaporthe)、盘单隔孢属(Marssonina)、绿僵菌属(Metarhizium)、丛梗霉皮伞属(Moniliophthora)、毁丝霉属、链孢菌属、脉孢菌属、树粉孢属(Oidiodendron)、长喙壳菌属(Ophiostoma)、拟青霉菌属(Paecilomyces)、拟球腔菌属(Paraphaeosphaeria)、青霉菌属、厚毛平革菌属(Phanerochaete)、瓶霉属(Phialophora)、侧耳属(Pleurotus)、普可尼亚属(Pochonia)、假尾孢属(Pseudocercospora)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、核腔菌属(Pyrenophora)、踝节菌属(Rasamsonia)、啄枝孢霉属(Rhinocladiella)、根霉菌属、根球虫属(Rhizosphaera)、喙孢属(Rhynchosporium)、毛球腔菌属(Setosphaeria)、亚球壳属(Sphaerulina)、孢子丝菌属(Sporothrix)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、匍柄霉属(Stemphylium)、篮状菌属、蚁巢伞属(Termitomyces)、腥黑粉菌属(Tilletiaria)、虫壳属(Torrubiella)、栓菌属、木霉属、毛癣菌属(Trichophyton)、Uncinocarpus和/或黑腐皮壳属(Valsa)物种。
根据本发明，至少一种丝状真菌细胞是其中SEQ ID NO:1已被破坏的丝状真菌细胞。因此，“破坏”可以通过本领域技术人员已知的适用于破坏目的的任何手段和措施进行。术语“破坏”包含导致基因不再被转录或导致由基因编码的蛋白质不再产生或仅以失活形式产生的所有技术。
可在本发明中用的示例性方法是：
-从基因组中部分或完全去除基因、编码蛋白质的区域和/或启动子或基因表达所需的其他区域(＝“缺失”)
-改变编码区的DNA序列，使得产生缩短的蛋白质(＝终止密码子的生成)或具有改变的氨基酸序列的蛋白质，其不再执行未改变的蛋白质的功能(＝“突变”)
-修饰启动子的DNA序列或基因表达所需的其他区域，使得基因不再被转录(＝没有RNA，因此没有蛋白质产生)
-表达具有与靶基因互补序列的RNA。其导致两种RNA的杂交(＝互补序列的配对)，并导致该双链RNA的降解。结果，没有靶基因的RNA可用于蛋白质合成(＝RNA干扰)。
在本发明中，SEQ ID NO:1在序列方案中定义。
根据本发明的发明方法的步骤(c)的混合进行1分钟至10天，优选10小时至7天，进一步优选24小时至5天的时间段，优选在具有150至20000W/m3，更优选500至15000W/m3功率输入的不断搅拌下和在氧气控制条件下进行。平均溶解氧水平优选选自0.01％至80％，优选0.1％至50％，特别优选5％至30％和最优选12％至28％。在特别优选的实施方式中，溶解氧水平通过搅拌器或压缩空气流或内部反应器压力或这些措施中的两种或三种的组合来控制。此外，根据本发明方法的步骤(c)的混合在20至35℃的温度下，优选在21至34℃的温度下进行，其中选自22至33℃范围的温度也是优选的。
根据本发明的方法的步骤(c)的“混合”优选以分批模式(不连续)、补料分批模式或连续模式进行。最优选地，本发明方法以补料分批模式进行。
根据本发明方法的步骤(d)的“获得”优选通过在步骤(c)期间，在用于混合的时间段结束时，收获工艺酶组合物而未经进一步处理来进行。
在本发明的另一个优选的实施方式中，本发明的方法进一步含有步骤(e)：针对根据步骤d)的工艺酶组合物进行的纯化方法。根据步骤(e)的纯化可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何措施进行。合适的纯化方法选自过滤(超滤、微滤、纳滤、深度过滤、无菌过滤、压滤机)、离心、倾析、浮选、色谱分离、吸附、电渗析、萃取、沉淀、结晶、喷雾干燥、造粒、包衣、挤出或其组合。优选基于过滤器的固-液分离。进一步特别优选用压滤机。过滤后的残留物应具有20％(wt./wt.)，优选25％(wt./wt.)，特别优选30％(wt./wt.)并且最优选40％(wt./wt.)固体含量的最小固体含量。在根据本发明的方法涉及固-液分离作为纯化的情况下，根据本发明方法的步骤(d)获得的工艺酶组合物被认为是液体馏分。
在本发明方法的优选的实施方式中，方法进一步包括以下步骤：
(ai)根据步骤(a)的发酵培养基的灭菌。
因此，可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段或措施进行灭菌。在优选的实施方式中，通过过滤，例如但不限于膜过滤方法或通过超高温加热进行灭菌。两种或更多种灭菌方法的组合也是可能的，然而，特别优选仅应用超高温加热(也称为UHT)。UHT处理优选在100至155℃的温度下进行10至30秒的持续时间，更优选在120至140℃的温度下进行10至20秒的持续时间。
在另一方面，本发明涉及丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏。SEQ ID NO:1的破坏可通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和措施进行。在说明书中已经定义了可能的和优选的方法和措施。在优选的实施方式中，SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其他调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏。术语“丝状真菌细胞”已在说明书中定义。所有给出的定义均适用。
在优选的实施方式中，丝状真菌细胞是具有表达至少一种异源水解酶的能力的遗传修饰的丝状真菌细胞。此类遗传修饰的丝状真菌细胞已经在说明书中定义。在本发明特别优选的实施方式中，丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。
在另一方面中，本发明涉及根据如上定义的方法生产的工艺酶组合物。
在一个其他方面中，本发明涉及如上定义的丝状真菌细胞用于生产如上定义的工艺酶组合物的用途。
一般优选实施方式
在下文中，列出了本发明的一般优选实施方式，其不在任何方面限制本发明的范围和/或权利要求的范围。一般优选实施方式说明了通过丝状真菌里氏木霉生产工艺酶组合物的特别适宜的实施方式。
一般优选实施方式1
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式2
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基，并且其中发酵培养基还含有木糖，并且其中葡萄糖与木糖的比例选自1至3.5的范围；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式3
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基，并且其中发酵培养基不含纤维素、半纤维素、葡低聚糖和/或槐糖；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式4
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L和纤维素含量为0.01g/L至1g/L的发酵培养基；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式5
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/的发酵培养基；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其他调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式6
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基，并且其中发酵培养基不含槐糖和/或葡低聚糖；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式7
用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5g/L至550g/L或5g/L至450g/L的发酵培养基，其中发酵培养基可以至少部分地源自木质纤维素生物量的化学、机械和/或酶水解；
(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
一般优选实施方式8
里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。
一般优选实施方式9
里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列，并且其中至少一种异源酶序列源自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。
一般优选实施方式10
根据如一般优选实施方式1至7中任一项所定义的方法生产的工艺酶组合物。
一般优选实施方式11
如一般优选实施方式8或9中任一项所定义的丝状真菌细胞用于生产工艺酶组合物的用途。
一般优选实施方式12
如一般优选实施方式1至7中任一项所定义的用于生产工艺酶组合物的方法，其中所述生长培养基含有0.05至50g/L的氮，所述氮以至少一种复合氮源的形式添加，所述复合氮源选自以下：豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、酵母提取物、蛋白胨或其混合物。
一般优选实施方式13
如一般优选实施方式1至7和12中任一项所定义的用于生产工艺酶组合物的方法，其中所述生长培养基含有0.05至2g/L的氮，所述氮以至少一种复合氮源的形式添加，所述复合氮源选自以下：豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、酵母提取物、蛋白胨或其混合物，并且其中所述发酵培养基在0.1至小于100L的范围内。
一般优选实施方式14
如一般优选的实施方式1至7和12中任一项所定义的用于生产工艺酶组合物的方法，其中所述生长培养基含有2至50g/L的氮，所述氮以至少一种复合氮源的形式添加，所述复合氮源选自以下：豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、酵母提取物、蛋白胨或其混合物，并且其中所述发酵培养基在100至10000000L的范围内。
附图和实施例
通过以下附图和实施例描述本发明。因此要强调的是，附图和实施例并不限制本发明和权利要求的范围，而仅仅构成本发明、本发明的目的和通过本发明的方法实现的益处的进一步说明。
附图列表
图1：在培养基1的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的蛋白质浓度。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的上清液中的蛋白质浓度给出的。
图2：在培养基1的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养肉汤中的生物量浓度。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的培养肉汤中的生物量浓度给出的。
图3：在培养基1的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养肉汤的粘度。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的培养肉汤的粘度给出的。
图4：在培养基1的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养物上清液的SDS-PAGE凝胶。
图5：在培养基2的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的蛋白质浓度。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的上清液中的蛋白质浓度给出的。
图6：在培养基2的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养肉汤中的生物量浓度。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的培养肉汤中的生物量浓度给出的。
图7：在培养基2的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养肉汤的粘度。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的培养肉汤的粘度给出的。
图8：在培养基2的摇瓶中生长的pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-4和对比菌株M18.2b的培养基上清液的SDS-PAGE凝胶。
一般实施例
实施例描述了一种通过缺失核苷酸破坏里氏木霉SEQ1基因的方法，其导致移码并因此导致编码蛋白的截短。它们还显示了SEQ1基因破坏对里氏木霉蛋白质生产、生物量形成和培养液粘度的影响。
实施例1：SEQ1突变载体的构建
本领域技术人员已知的标准方法，例如由Sambrook和Russel(MolecularCloning–A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)或由Jansohn等(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)所描述的用于DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化、大肠杆菌转化、质粒增殖和纯化、通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段和从里氏木霉中分离基因组DNA的标准方法。连接非依赖克隆(LIC)基本上如由Aslanidis和deJong(1990,Nucleic Acid Res.18(20),6069)所描述的进行。所有限制性内切酶均购自NewEngland Biolabs，并按照制造商的说明书使用。使用来自Promega的SV凝胶和PCR Clean-Up系统对限制性消化、PCR扩增和凝胶纯化的DNA进行纯化。
通过将潮霉素B抗性标记物融合到SEQ1 5’和3’侧翼区并在pUC19衍生的质粒中克隆融合产物来构建SEQ1突变载体。侧翼区包含SEQ1编码区的一部分，其将包含核苷酸C1755(根据SEQ ID NO:1的位置)缺失的突变引入到SEQ1基因中。
根据制造商的说明书，使用引物SEQ1fl5fw(5’-AACGCCTTTCCTGTATCGTC-3’；SEQID NO:2)和SEQ1fl5rv(5’-TTGATCGCGTCAGCTTGTCGAATCTCCTCCACTAGTGCAAAGATCCTGGCAAGC-3’；SEQ ID NO:3)以及来自Thermo Scientific的phusion聚合酶(退火温度：63.4℃；延伸时间：1min 20sec，30次循环)，从作为模板的里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA中扩增SEQ1 5’侧翼区(约2.6kb)。
根据制造商的说明书，使用引物SEQ1fl3fw(5’-TCAGCTCTATTGGCTTGCCAGGATCTTTGCACTAGTGGAGGAGA TTCGACAAGCTG-3’；SEQ ID NO:4)和SEQ1fl3rv(5’-ATGTGTTGCTCAAGTGATGC-3’；SEQ ID NO:5)以及来自Thermo Scientific的phusion聚合酶(退火温度：62.4℃；延伸时间：1min 20sec，30次循环)，从作为模板的里氏木霉M18.2b(DSM19984)的基因组DNA中扩增SEQ1 3’侧翼区(约2.5kb)。
使用来自Thermo Scientific的phusion聚合酶以及引物fus1(5’-AAACCAGACAGACAGTCCTGCAGGCTCATCTGCTCTCATGGGT G-3’；SEQ ID NO:6)和fus2(5’-AGAGAGGAGAGACAGTCCTGCAGGGCTACAGTTGGCAAGATGT TC-3’；SEQ ID NO:7)纯化和融合PCR扩增的SEQ1 5’and 3’侧翼区。分别使用约100ng的两种模板以及20μM的引物fus1和fus2。PCR由10次如下的初始循环组成：在98℃下10sec、在68℃下30sec和在72℃下2min 15sec，然后冷却至10℃。然后，加入引物，随后在98℃下保持30sec，并进行30次如下循环：在98℃下10sec、在62.7℃下30sec和最初在72℃下1min 45sec及在72℃下孵育每循环延长5sec。PCR通过在72℃下保持10min并冷却至10℃而结束。
将约5.0kb长融合PCR产物纯化并克隆至PshAI-线性化pUC19-衍生的质粒(SEQ IDNO:8)中，其含有LIC接受位点而不是多克隆位点。在dTTP存在下用T4DNA聚合酶处理线性化载体。在dATP存在下使用T4DNA聚合酶处理融合PCR产物。如Aslanidis和de Jong所描述的，将T4DNA聚合酶处理的载体和融合PCR扩增子混合并退火。然后在化学感受态的大肠杆菌XL1蓝细胞(Agilent)中转化LIC测定物，将其接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素(LB Amp)的LB-Agar平板上，并在37℃下孵育24h。使用牙签从琼脂平板上挑取菌落，转移到液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)孵育24h。分离质粒DNA，并通过用SpeI的消化验证插入物的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，使用引物53SEQ-1(5’-TCATGAGCGGATACATATTTG-3’；SEQ ID NO:9)、53SEQ-2(5’-TTTTGCGATGATGGCCTAG-3’；SEQ ID NO:10)、53SEQ-3(5’-CAAAGACTCCAAAGACGAGC-3’；SEQ ID NO:11)、53SEQ-4(5’-TGCTAGATGAACAGATCGGC-3’；SEQID NO:12)和53SEQ-5(5’-GTCATGGAGGATTTACAGGC-3’；SEQ ID NO:13)，并且将具有正确序列的一个质粒命名为pSEQ1-5-3。
为了将LIC位点引入pSEQ1-5-3中，通过用SpeI消化将质粒线性化并纯化。然后，将寡核苷酸LICfw(5’-CTAGGTAACAAGACACAGCCCGGGCTCTTGTCTGTTAC-3’；SEQ ID NO:14)和LICrv(5’-CTAGGTAACAGACAAGAGCCCGGGCTGTGTCTTGTTAC-3’；SEQ ID NO:15)的10μM溶液各1μl在PCR管中混合，置于70℃温水中并冷却至室温(持续：约2h)。冷却后，通过以下方式用SpeI-消化的pSEQ1-5-3连接LICfw-LICrv混合物：混合2μl的LICfw-LICrv混合物、3μl纯化的SpeI消化的pSEQ1-5-3(约100ng质粒DNA)、1μl的10x T4连接酶Puffer(Promega)、1μl的PEG溶液(500g·l-1溶解在无核酸酶水中的聚乙二醇3350)，1μl的T4DNA连接酶(Promega)和2μl无核酸酶的水，并在20℃下孵育混合物1h。使用SV凝胶和PCR Clean-Up系统(Promega)纯化DNA，并且用50μl无核酸酶水洗脱。然后，将6μl的10x T4DNA聚合酶缓冲液添加到纯化的DNA溶液中，通过添加无核酸酶水将混合物的体积调整至60μl。然后，将装有60μl混合物的试管放入装有沸水的烧杯中，并冷却至室温(持续：约3h)。然后，将DNA用于转化化学感受态的大肠杆菌XL1蓝细胞(Agilent)。将转化体接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素(LB Amp)的LB-Agar平板上，并在37℃下孵育24h。使用牙签从琼脂平板上挑取菌落，转移到液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)孵育24h。分离质粒DNA，并通过用SrfI的消化验证插入物的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，使用引物53SEQ-5(5’-GTCATGGAGGATTTACAGGC-3’；SEQ ID NO:13)，并且将具有正确序列的一个质粒命名为pSEQ1-5-3-LIC。
由Thermo Scientific合成潮霉素B抗性标记物盒(SEQ ID NO:16)。根据制造商的说明书，使用来自Thermo Scientific的phusion聚合酶，用引物hygrfw(5’-AACAAGACACAGCCCTATAAC-3’；SEQ ID NO:17)和hygrrv(5’-AACAGACAAGAGCCCTATAAC-3’；SEQ ID NO:18)扩增约2.4kb长的盒(退火温度：60.3℃，延伸时间：40sec，30次循环)。在dTTP存在下用T4DNA聚合酶处理SrfI-线性化载体pSEQ1-5-3-LIC。在dATP存在下用T4DNA聚合酶处理PCR扩增的潮霉素B抗性标记物盒。如Aslanidis和de Jong所描述的，将T4DNA聚合酶处理的载体和插入物混合并退火。然后在化学感受态的大肠杆菌XL1蓝细胞(Agilent)中转化该测定，将其接种在含有100mg·l-1氨苄青霉素(LB Amp)的LB-Agar平板上，并在37℃下孵育24h。使用牙签从琼脂平板上挑取菌落，转移到液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)孵育24h。分离质粒DNA，并通过用SbfI的消化验证插入物的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，使用引物53SEQ-1(5’-TCATGAGCGGATACATATTTG-3’；SEQ ID NO:9)、53SEQ-2(5’-TTTTGCGATGATGGCCTAG-3’；SEQ ID NO:10)、53SEQ-3(5’-CAAAGACTCCAAAGACGAGC-3’；SEQ ID NO:11)、53SEQ-4(5’-TGCTAGATGAACAGATCGGC-3’；SEQID NO:12)和53SEQ-5(5’-GTCATGGAGGATTTACAGGC-3’；SEQ ID NO:13)、FullSEQ-1(5’-GGCGGAGCCTATGGAAAAAC-3’；SEQ ID NO:19)、FullSEQ-2(5’-TCCTCCTCCTACTCTCCATC-3’；SEQ ID NO:20)、FullSEQ-3(5’-GCTGGTATTGGTCATGTAGC-3’；SEQ ID NO:21)、FullSEQ-4(5’-GTTGGCCCAGAAACATCC-3’；SEQ ID NO:22)、FullSEQ-5(5’-AGATCCTATTGACCTCTCTGC-3’；SEQ ID NO:23)、FullSEQ-6(5’-CCCAGACCACCTGCACACTC-3’；SEQ ID NO:24)、FullSEQ-7(5’-GCAAGACCTGCCTGAAAC-3’；SEQ ID NO:25)、FullSEQ-8(5’-CTGGACCGATGGCTGTGTAG-3’；SEQ ID NO:26)和FullSEQ-9(5’-GGGAGAGAAATCAGCAGGTG-3’；SEQ ID NO:27)，并且将具有正确序列的一个质粒命名为pSEQ1M-HygR。
实施例2：将SEQ1突变体转化至里氏木霉
根据制造商的说明书，用SbfI消化载体pSEQ1M-HygR，并通过琼脂糖凝胶电泳和使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒来纯化突变盒(7.4kb)。基本上如等(1987)Gene61:155-164所述，用消化的载体转化里氏木霉M18.2b(DSM 19984)。在含有100mg·l-1潮霉素B和1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂板上选择转化体，并通过单一化进行纯化。纯化菌株的分生孢子储备液通过使其在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂板上生长，直至板被孢子覆盖来制备。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l-1)-Triton X-100(0.01g·l-1)溶液收获，用无菌水调节至OD600＝10，补充甘油至最终浓度为50g·l-1，并储存在-80℃下。
从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，分别用来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，以来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1MKO1fw(5’-GCATTGAGTTGAGCGCTAAC-3’；SEQ ID NO:28)和SEQ1MKOrv(5’-CCATGGTCGAACGGAAAC-3’；SEQ ID NO:29)(退火温度：61.8℃，延伸时间：55sec，30次循环)或者引物SEQ1MKO2fw(5’-TGTATCAAGCTAGGTGGGAG-3’；SEQ ID NO:30)和SEQ1MKOrv(5’-CCATGGTCGAACGGAAAC-3’；SEQ ID NO:29)(退火温度：61.5℃，延伸时间：55sec，30次循环)通过PCR验证SEQ1突变盒在预期基因座的整合。使用引物SEQ1MKO1fw和SEQ1MKOrv的2.7kb条带表明突变盒整合在SEQ1基因座处，而使用引物SEQ1MKO2fw和SEQ1MKOrv的2.6kb条带表明SEQ1基因座仍然是天然的(即，该条带不是预期的来自在预期基因座处具有整合pSEQ1M-HygR片段的转化体的基因组DNA)。来自菌株M18.2b的基因组DNA也作为对照进行测试。为了验证预期的突变已经被插入到SEQ1ORF中，用引物M1Seq-01(5’-GCCAATAGAGCTGAGAAGTG-3’；SEQ ID NO:31)和M1Seq-02(5’-TCTGAAGAGGGCTGAGAAAG-3’；SEQ ID NO:32)对用引物SEQ1MKO1fw和SEQ1MKOrv获得的扩增子进行测序。
在SEQ1ORF中含有来自pSEQ1M-HygR的突变的四个转化体命名为MSEQ1-1至-4。
实施例3：SEQ1缺失菌株在摇瓶中的生长
菌株MSEQ1-1至-4和M18.2b在摇瓶中于培养基1和培养基2中生长。培养基1含有(g·l-1)：
名称 浓度[g/l]
乙酸 0.34
钙 0.12
水溶性氯化物 0.15
铜 0.0001
脂肪(可溶于HCl) 0.001
糠醛 0.003
葡萄糖 6.5
甘油 0.009
HMF 0.006
铁 0.004
镁 0.048
锰 0.002
Na-D/L-乳酸盐 0.097
可溶性氮 0.85
磷 0.48
邻苯二甲酸盐 8.2
钾 3.2
钠 0.015
硫 0.86
木糖 3.6
锌 0.001
用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并高压灭菌(在121℃下20min)。
培养基2含有(g·l-1)：
用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并高压灭菌(在121℃下20min)。
在无菌罩下，将15mL培养基分配到50mL锥形摇瓶中。将菌株MSEQ1-1至-4和M18.2b的分生孢子储备液解冻，在无菌罩下，将75μl分生孢子悬浮液用移液管移至具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。每个菌株接种至少三个烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)孵育6天。6天后，将培养物倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220x g，4℃，15min)，并将上清液储存在4℃，同时将剩余的培养物用于测定生物量和粘度(参见下文)。
实施例4：培养物上清液和肉汤的表征：蛋白质浓度、SDS-PAGE、生物量、粘度
根据供应商的说明书，用Quick StartTMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株MSEQ1-1至-4和M18.2b的离心培养物上清液中的蛋白质浓度。测量结果如图1和图5所示。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的上清液中的平均蛋白质浓度给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1-1至-4比宿主菌株M18.2b产生显著更多的蛋白质。
对于生物量测定，将WhatmanTM过滤盘(P1)在60℃下干燥，直至其重量保持恒定24h，冷却至室温并称重。用那些干燥的过滤盘过滤菌株MSEQ1-1至-4和M18.2b的培养肉汤，并用至少十倍于肉汤体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的过滤盘干燥，直至其重量保持恒定24h。称重具有干燥菌丝体的过滤盘。然后通过从具有菌丝体的干燥过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养肉汤的体积，计算培养肉汤中的生物量浓度。测量结果如图2和图6所示。数值是相对于设定为1的宿主菌株M18.2b的上清液中的平均生物量浓度给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1-1至-4比宿主菌株M18.2b产生显著更少的生物量。
根据制造商的说明书，用具有Vane工具的Malvern Kinexus Lab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn:CUPnn)测量菌株MSEQ1-1至-4和M18.2b的培养肉汤的粘度。在20℃的温度和18.11RPM(“每分钟转数”)的转速下进行测量。粘度描绘在图3和图7中，并且相对于设定为1的菌株M18.2b的培养肉汤的粘度呈现。从这些数据显而易见，用MSEQ1-1至-4产生的培养肉汤的粘度显著低于宿主菌株M18.2b的粘度。
菌株MSEQ1-1至-4和M18.2b的离心培养物上清液的SDS-PAGE分析用本领域技术人员已知的方法(例如，Jansohn等(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)描述的)和Criterion XT系统(BioRad)进行。在每个泳道中装载等体积的培养物上清液。PrecisionPlus ProteinTMAll Blue Standards(BioRad)用作蛋白质尺寸对比。凝胶图像如图4和图8所示。
总结
总之，这些数据表明，SEQ1基因的破坏导致显著更有效的蛋白质生产，形成更多的蛋白质和更少的生物量，与培养基无关。此外，培养肉汤的粘度也显著降低。
序列表
SEQ ID NO:1
SEQ1天然基因
ATGAGTAGAAACCGTCGAGAGTCCCAAAATATCTTGGAGTCACTGCATTCAAGGTACGCGTGTATACGGCAAGTTCCACGGGCATATACAGCAAATTACCATATCCAAGTCCTTACATGGTAAACCCAATAGCAACCCTTTCTTTGCCCTTCAGGTTGTCCCGTCTCCGCGATGGTTTCAGGGTAAGGTGACGAACGGTACAGTAACAAAGACTCCAAAGACGAGCCCACGATCGGTGGAAGCAATGCGTCATGCTGAGTCATCGACGCCCCTCCGTGGGTAAACAGGCAATGCCCCGCCAACAGCCGTGAGAAGCAAAATAACATCATGACAGCTTCCAGCGCCTTGCTTTTGCTCTCCTGCACCGCTCCTCTCCCTCGTTGCAGCTATTCGCATTGTCCTACTCGAGGCTCGACGGCGGCCCGGCGCCCAAAATGTCCACGTACGTGACGCTATCGTCTACATCTCTCTGACGCTCTATACCTTACCTTGTCTCGTCTCCGTGTGTTCTTGTCTAACACGCTCACCTGCATCATGATGCACCTCACAGGCCAACCACCAATATCCTCAGCATCCCATTTCGCCGGTCGCTGCACCTGTCGCTGTCGACGACGATCCGACAGTACATCAACACCAAATATGACCAGCACCCGGACATGTTCCAGTATGACCTCGAGGCCATCGATGCGCTGCGCCGCGACGCCGTGAACGTGCGCGAGCCGCACCTGAGCGGCATCAAGAAGCTGCAGGTGTACGCGGGCCAGCTGGTGTGGATTGGCGGCAAGTTTCCGATTGATGTGCGTAGACGAAAGACGAGTAGGGGGAGGAGCAGGAGAAACAAGCGGACAAGATGCTGATGCTGCTAGATGAACAGATCGGCGCCGAGTTCACCTGGTACCCGGCCCTTGGCTACCACACCGACCGGCCGATGGCGCGCAACAACCTCAAGTACGAGCTCATGAATGTCCTCTACAACCTCGCCGCCTTGTACTCTCAGCTTGCCCTCAACACGCCCCGCGGCGATACCGAGGGTCTCAAGTCCGCCGCCAACTACTTTTCCCTAGCCGCCGGCGTCCTCTCCCACATTCAGAAAGCCGTGCTTCCCGAGCTGCGCATGTCCGACCCGCCCGACGACATGGACCACAACACTCTCGAATCGCTGTTGCAGCTGTTTCTGGCACAGAGCCAGGAGTGCTTCTGGCAGAAGGCAGTCATGGACGGTTACAAGGACGCCTCGATCGCAAAGCTGGCTGCGAGGGTCTCTGACCTGTACAACCTGGCGGCCGAGGCTGCGGTGAACAGCGAGGCCATTAGTAGTGCCTGGATACATCACATGAACGCGAAGCACCACCACTTTGCAGCAGCTGCCCAGTATCGTGCTGCCTGCGATTGCTTGGAGAAGAGAAGGTACGGCGAGGAGATTGCGCGGCTGAAAGATGCCGTCATCTGTGCTAATGACGGTATTAAGGAGGGCCGGGTTGCCCCCTTGAACAAGACGGTCATGGAGGATTTACAGGCCTTGAAGCGAAAGCTGGAAGAGGATCTGAAGAGGGCTGAGAAAGACAATGACCTCATCTTTCTTAGTACGTTGCTCCGCCTCGTCAACTTACGCAAAGATTGTCCCCAAAGCTGACAGCCACCAACAGATCCTATACCCCCAAAGGCAGAACTGAAGATCCTGGAGAGAGCCAACATGGCTGTTGCTCGAACGCCCCCCCAGGTAGCCAATCCGCTTGACTACCTAGGTGACCATGCCGAGCTTGGACCGGCACTGTTCTCTAAGCTGGTCCCGTTCTCGGTGCATGTTGCTATTTCCATCTACGAGGAGCGCAGAGATCGGCTGGTCAACCAAAACATCATTCAAGAGCTGGAGAACCTGACCGACAAGATCCACACACTTCTCAGCTCTATTGGCTTGCCAGGATCTTTGCAAGCGTTGGAGAAGCCTCTCGGCCTCCCACCTAGCTTGATACAACACGCGGAGGAGATTCGACAAGCTGACGCGATCAACAAGATCCAGAGGAGCTTCGCCGACATCGAAAAGCTGCGGGCCAACGACTGGGCGATTTTCGAGGAGGGAAAAGCAGCGCTGGCCGCTGAAGAGGAGGAAGACGAGCAGCTACGGAGGAAATACGGCACCAGCCGTTGGCGGCGCCCCGAGAGCCAAGCAGACCCCAACGGCGCGAAGTTCTGGGCCGCCATTAACGAGATAGGAGGCTATTTCCAGAATAGCGCAAGTAGCGACGAGGCGGTTCGAGACAAGTTCATGGCGAACAAAGATTTGTTGGAGATCCTGTCAGGGTCAAACCAGTCTCTGATGAACTACGTGCCCTCGAGCGCCCCCGTGGAAACCTCGGGTGACCTCAAGGCAGCTGTTGGGCGGTTGCGGAGCGTGTACAATGATGTTCTGCGGATGGAGAGTAGGAGGAGGAAAAAGGCTGAGAGCCTGAGGGAGGCAGCGCGGCGCGATGACATCAAGCCCGATATTCTCAAGGAGGCGGCTCGCCTGGAGCGAGCATATCCCTCAACGCCTCTGCAGACAGTTCACTTTGAGGAGTTTTTCGAAAAGCGACTGGATAAGCTGTACGAGCCAGAGCTCGAGGCCGTCGAAAAGGAAGCACAGGACCAAGAGAATCTGCTGACCCTGCTAGAGCGCGCAAACAGGGAGTTTGAGGCTCAGAAGCGCCTCATTGACGCCAAAGGGCACCGTGATCGCGAGCAAGTGCTGCAGAAGCTCAATGGCGCGTACTTCAAGTACAAGGAGATTGTGGCCAACCTGGAGGTGGGGAGAAAGTTCTATAACGACCTGAATAGGATAGTTGCACATGGCTTCCGTGATGCCGTCAAAGCATGGGTGGCGGAGCGGCGACTCGAGGCCAAGAGACTGGAAGAGTATGTTGTTTGCTTGGTAAAAAGCTCCATATCGGACTCCTTGCTGACGCTGTCCTAGGGAACTTAATATGCCGCCGCTCTCGGCTCTCAACATCAACCATCCGCAGCCTGTTCAAAACCCACCATCCGGTTTCGACGCTCAGCCTGTGGCTCACCAACCTGTCCAGCAGCTACATGACCAATACCAGCCTGCATACCAGCAGCAGACCTACCAGCAACCCTCATATCAACAGCAGCCGCTGCAAGCACAACAACAGTATCATCAGCCACAGCCAACACCACAACAACAGCCTGTCTATGCCAGACAGGCCGTTCAGAGTCCGGCCGAGGCTTCAATACAATCGTGGGCCGGAGGCCAAACGCAGCCGCCACTTCCGCAACAGAAACCGTCACAGCCTGGGCAACAACCAAATCAATCGGCTGGAACGTGGAATCCTGCCATGGGCATCAAGTTTGGAGGGCCATCGGCTGGTGGATCGTCTGGTCAGGAAGGAACATGGACCGCCGGTTCAGGGATTAGATTTGGCTGA
SEQ ID NO:2
SEQ1fl5fw
AACGCCTTTCCTGTATCGTC
SEQ ID NO:3
SEQ1fl5rv
TTGATCGCGTCAGCTTGTCGAATCTCCTCCACTAGTGCAAAGATCCTGGCAAGC
SEQ ID NO:4
SEQ1fl3fw
TCAGCTCTATTGGCTTGCCAGGATCTTTGCACTAGTGGAGGAGATTCGACAAGC
SEQ ID NO:5
SEQ1fl3rv
ATGTGTTGCTCAAGTGATGC
SEQ ID NO:6
fus1
AAACCAGACAGACAGTCCTGCAGGCTCATCTGCTCTCATGGGTG
SEQ ID NO:7
fus2
AGAGAGGAGAGACAGTCCTGCAGGGCTACAGTTGGCAAGATGTTC
SEQ ID NO:8
LIC接受载体
TTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACTAAACCAGACAGACAGCTGTCTCTCCTCTCTAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCA
SEQ ID NO:9
53SEQ-1
TCATGAGCGGATACATATTTG
SEQ ID NO:10
53SEQ-2
TTTTGCGATGATGGCCTAG
SEQ ID NO:11
53SEQ-3
CAAAGACTCCAAAGACGAGC
SEQ ID NO:12
53SEQ-4
TGCTAGATGAACAGATCGGC
SEQ ID NO:13
53SEQ-5
GTCATGGAGGATTTACAGGC
SEQ ID NO:14
LICfw
CTAGGTAACAAGACACAGCCCGGGCTCTTGTCTGTTAC
SEQ ID NO:15
LICrv
CTAGGTAACAGACAAGAGCCCGGGCTGTGTCTTGTTAC-3’
SEQ ID NO:16
潮霉素B抗性标记物
TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGACGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCTAGGCGCGCCATGAGCTCGTTAACAAGACACAGCCCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATAACGGTGAGACTAGCGGCCGGTCCCCTTATCCCAGCTGTTCCACGTTGGCCTGCCCCTCAGTTAGCGCTCAACTCAATGCCCCTCACTGGCGAGGCGAGGGCAAGGATGGAGGGGCAGCATCGCCTGAGTTGGAGCAAAGCGGCCCGGCCGCCATGGGAGCAGCGAACCAACGGAGGGATGCCGTGCTTTGTCGTGGCTGCTGTGGCCAATCCGGGCCCTTGGTTGGCTCACAGAGCGTTGCTGTGAGACCATGAGCTATTATTGCTAGGTACAGTATAGAGAGAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGGAAAAAAGGTGAGGTTGAAGTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCAACCACTGACGGCTGCCGGCTCTGCCACCCCCCTCCCTCCACCCCAGACCACCTGCACACTCAGCGCGCAGCATCACCTAATCTTGGCTCGCCTTCCCGCAGCTCAGGTTGTTTTTTTTTTCTCTCTCCCTCGTCGAAGCCGCCCTTGTTCCCTTATTTATTTCCCTCTCCATCCTTGTCTGCCTTTGGTCCATCTGCCCCTTTGTCTGCATCTCTTTTGCACGCATCGCCTTATCGTCGTCTCTTTTTTCACTCACGGGAGCTTGACGAAGACCTGACTCGTGAGCCTCACCTGCTGATTTCTCTCCCCCCCTCCCGACCGGCTTGACTTTTGTTTCTCCTCCAGTACCTTATCGCGAAGCCGGAAGAACCTCTTAACCTCTAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCCACGTCTGTCGAGAAGTTCCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTCAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCACCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGATGCATGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGTGTGGTTCCCGGTTGGCGGAGTCTTTGTCTACTTTGGTTGTCTGTCGCAGGTCGGTAGACCGCAAATGAGCAACTGATGGATTGTTGCCAGCGATACTATAATTCACATGGATGGTCTTTGTCGATCAGTAGCTAGTGAGAGAGAGAGAACATCTATCCACAATGTCGAGTGTCTATTAGACATACTCCGAGAATAAAGTCAACTGTGTCTGTGATCTAAAGATCGATTCGGCAGTCGAGTAGCGTATAACAACTCCGAGTACCAGCGAAAGCACGTCGTGACAGGAGCAGGGCTTTGCCAACTGCGCAACCTTGCTTGAATGAGGATACACGGGGTGCAACATGGCTGTACTGATCCATCGCAACCAAAATTTCTGTTTATAGATCAAGCTGGTAGATTCCAATTACTCCACCTCTTGCGCTTCTCCATGACATGTAAGTGCACGTGGAAACCATACCCAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGGGCTCTTGTCTGTT
SEQ ID NO:17
hygrfw
AACAAGACACAGCCCTATAAC
SEQ ID NO:18
hygrrv
AACAGACAAGAGCCCTATAAC
SEQ ID NO:19
FullSEQ-1
GGCGGAGCCTATGGAAAAAC
SEQ ID NO:20
FullSEQ-2
TCCTCCTCCTACTCTCCATC
SEQ ID NO:21
FullSEQ-3
GCTGGTATTGGTCATGTAGC
SEQ ID NO:22
FullSEQ-4
GTTGGCCCAGAAACATCC
SEQ ID NO:23
FullSEQ-5
AGATCCTATTGACCTCTCTGC
SEQ ID NO:24
FullSEQ-6
CCCAGACCACCTGCACACTC
SEQ ID NO:25
FullSEQ-7
GCAAGACCTGCCTGAAAC
SEQ ID NO:26
FullSEQ-8
CTGGACCGATGGCTGTGTAG
SEQ ID NO:27
FullSEQ-9
GGGAGAGAAATCAGCAGGTG
SEQ ID NO:28
SEQ1MKO1fw
GCATTGAGTTGAGCGCTAAC
SEQ ID NO:29
SEQ1MKOrv
CCATGGTCGAACGGAAAC
SEQ ID NO:30
SEQ1MKO2fw
TGTATCAAGCTAGGTGGGAG
SEQ ID NO:31
M1Seq-01
GCCAATAGAGCTGAGAAGTG
SEQ ID NO:32
M1Seq-02
TCTGAAGAGGGCTGAGAAAG

Claims (18)

1.一种用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L的发酵培养基；
(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；
(d)获得工艺酶组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将根据步骤(a)的所述发酵培养基的pH调节至选自pH 2.0至6.0的pH。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还含有木糖，并且其中葡萄糖与木糖的比例选自1至3.5的范围。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还含有乳糖，并且其中葡萄糖与乳糖的比例选自1至10的范围。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基中未添加葡低聚糖。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基中未添加槐糖。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(ai)根据步骤(a)的发酵培养基的灭菌。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基具有0.5至10.0g/L的磷酸氢钾含量、0.05至1g/L的硫酸镁七水合物含量、0.1至1g/L的氯化钙二水合物含量、1.5至4.5g/L的硫酸铵含量、0.005至0.1g/L的硫酸铁(II)七水合物含量、0.00001至0.001g/L的硫酸锰含量、0.001至0.01g/L的硫酸锌七水合物含量和/或0.0001-0.001的硫酸铜五水合物含量。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基具有0.05至50.0g/L的氮含量。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自：枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化还原酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(e)对根据步骤d)的所述工艺酶组合物进行纯化方法。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞是木霉属丝状真菌细胞，并且其中所述发酵培养基含有0.05至50g/L的氮，所述氮以复合氮源的形式添加，所述复合氮源选自以下：豆粕、玉米浆、啤酒糟、湿酒糟(WDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、酵母提取物、蛋白胨或其混合物。
14.丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏。
15.根据权利要求14所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其他调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏。
16.根据权利要求14或15所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化还原酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。
17.根据权利要求1至13中任一项所定义的方法生产的工艺酶组合物。
18.根据权利要求14至16中任一项所定义的丝状真菌细胞用于生产工艺酶组合物的用途。
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