CN117043315A - 用于由所培养的细胞提取细胞衍生产物的生物反应器和方法以及纳米结构化纤维素产品 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的生物反应器，所述生物反应器包括：容器；用于将细胞培养基输入容器的入口，用于从容器中输出包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口，所述容器包括或连接到隔室，所述隔室包含构造成接收细胞的纳米结构化纤维素，所述隔室包括第一分离表面，所述第一分离表面将所述纳米结构化纤维素与所述出口隔开，并且允许包含细胞衍生产物的细胞培养基行进通过第一分隔表面。本公开还提供一种用于从所培养的细胞中分离细胞衍生产物的方法以及一种纳米结构化纤维素产物。

Description

用于由所培养的细胞提取细胞衍生产物的生物反应器和方法 以及纳米结构化纤维素产品

技术领域

本申请涉及生物反应器和从所培养细胞中分离细胞衍生产物的方法。更具体来说，本申请涉及采用纳米结构化纤维素作为细胞培养基质的生物反应器和方法。

背景技术

活细胞将囊泡释放到局部环境中，称为胞外囊泡(EV)。通常存在有三个主要的子类EV：微囊泡、凋亡体和外泌体。微囊泡直接从细胞膜上脱落，并且其直径为50至1000nm。凋亡体来源于垂死的细胞，其直径为50至4000nm。外泌体是从多囊泡体(MVB)而不是从细胞膜释放的，其直径为20至150nm。外泌体可能含有RNA、DNA和蛋白质分子。外泌体是在细胞之间传递生物活性蛋白质和一般物质的通讯载剂。

EV可以作为细胞信号传导的中介体，因为其能够传递RNA和蛋白质的说明线索(instructional cue)，这可用于医疗目的。还有证据表明，EV可能刺激再生或调节病理条件，因此EV可以在治疗方法中用作新的潜在治疗剂。EV还可以用作疾病(如癌症)的诊断生物标志物，例如基于独特miRNA谱和与病理效应相关的其他碳(carbo)。基于其会传播感染特异性元素的事实，其也可以用作传染病的生物标志物。此外，EV可以用作例如治疗癌症的靶向药物递送载剂。

然而，并不存在产生临床相关量的EV的实际制造工艺。除非能够获得高效且有成本效益的生产方法，否则很难实现用于人工生产EV的现实治疗用途。特别是希望扩大细胞培养方法，并生产外泌体作为大规模干细胞培养物。目前，这些都是为治疗应用递送产品的限速步骤。

发明内容

已经发现了如何在生物反应器中的细胞培养中使用纳米结构化纤维素(如纳米原纤维纤维素)作为细胞培养的基质来高效生产细胞衍生产物，以及如何从细胞中分离细胞衍生产物并由此收获细胞衍生产物。

本申请提供一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的生物反应器10，所述生物反应器包括：

-容器12；

-用于将细胞培养基输入容器的入口14，

-用于从容器中输出包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口16，

-所述容器12包括或连接至隔室18，所述隔室包括构造成接收细胞的纳米结构化纤维素，所述隔室包括第一分离表面20，其将纳米结构化纤维素与出口隔开，并且允许包含细胞衍生产物的细胞培养基行进通过所述第一分离表面20。

本申请还提供一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的方法，所述方法包括：

-提供生物反应器，

-提供细胞培养基，优选无血清、无动物来源、无饲养细胞和/或无异种细胞培养基，

-提供细胞，

-在包含纳米结构化纤维素的隔室中孵育细胞以形成细胞衍生产物，并且任选地混合纳米结构化纤维素和细胞，

-让细胞衍生产物从细胞扩散到细胞培养基中，

-从生物反应器中收获包含细胞衍生产物的细胞培养基，优选通过用于提取包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口进行收获，从而将细胞衍生产物与孵育的细胞分离。

本申请提供一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的纳米结构化纤维素产品，所述产品包括中值孔尺寸为0.1-10μm²(例如，0.3-2.0μm²)的纳米结构化纤维素水凝胶。

本申请提供由用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的方法获得的胞外囊泡。

在独立权利要求中表征了主要实施方式。在从属权利要求中公开了各种实施方式。除非另有明确说明，否则本文公开的实施方式和实施例相互自由组合。

纳米结构化纤维素可以是纳米原纤维纤维素或纳米晶体纤维素。这些不同的材料能够提供具有不同和/或可调节性质且适合不同用途的产品、生物反应器和方法。

纳米原纤维纤维素或纳米晶体纤维素在作为水凝胶存在时，能够形成细胞的亲水性间质基质，该基质无毒、是生物相容的且可生物降解。基质可以酶促降解，例如通过添加纤维素酶进行。另一方面，水凝胶在生理条件下是稳定的，并且不需要通过使用额外的试剂进行交联。水凝胶的性质(例如孔隙率和渗透性)可以通过调节纳米结构化纤维素的化学和/或物理性质来控制。

包含纳米结构化纤维素(如纳米原纤维纤维素)的水凝胶的某些有利性质包括柔韧性(flexibility)、弹性和可重塑性，例如，这使得能够使用各种生物反应器来培养和处理材料，例如通过入口或出口进行输送和混合。水凝胶具有最佳弹性、刚度、剪切应力、机械粘附性和孔隙率，也可用作3D和2D细胞存储或培养基质。细胞可以粘附或包埋在所使用的水凝胶的基质中。水凝胶还在生产期间保护细胞。

由于水凝胶包含大量水，因此其还显示出对分子的良好渗透性。一些实施方式的水凝胶还提供了高保水能力和分子扩散速度性质。

本文所述的纳米结构化纤维素水凝胶可用于医学和科学应用，其中包含纳米结构化纤维素的材料与活物质接触。如本文所述的包含纳米结构化纤维素的产品与生物高度生物相容并且提供了若干有利效果。不囿于任意具体理论的束缚，认为水凝胶包含非常亲水的纳米结构化纤维素，纳米结构化纤维素具有极高比表面积，因此具有高保水能力，当施用于细胞时在细胞与包含纳米结构化纤维素的水凝胶之间提供有利的湿润环境。纳米结构化纤维素中的大量游离羟基形成了纳米结构化纤维素与水分子之间的氢键，并且实现凝胶形成以及纳米结构化纤维素的高保水能力。纳米结构化纤维素水凝胶含有大量的水，并且其还能够实现流体和/或物质(特别是活性形式的生物活性物质)的迁移。令人惊讶地发现，尽管纳米结构化纤维素中存在大量的游离羟基，但是该材料没有与细胞产生的生物物质发生有害的相互作用，由此可以从纳米结构化纤维素中释放生物物质进行提取。

纳米结构化纤维素可在细胞衍生产物生产中用作细胞基质，由此提供保护细胞和帮助细胞维持细胞活力的环境。形成的基质(可以被称作间质基质(interstitialmatrix))物理上类似ECM，提供可具有所需孔尺寸的网状基质。纳米结构化纤维素(特别是纤维素纳米原纤维(cellulose nanofibril))的网络尺寸非常接近胶原纳米原纤维的天然ECM网络。这为细胞提供了结构支撑，并提供了互连孔网络来实现高效的细胞迁移、营养物向细胞的转运和来自细胞的细胞衍生产物的转运。纳米结构化纤维素可以经受住连续生物反应器系统中所使用的流体，并且将细胞维持在纳米结构化纤维素基质中，例如维持在它们所在的位置和维持所需状态，例如维持干细胞为所需的未分化状态。由此能够在生产期间全程获得相同的细胞衍生产物。

此外，纳米结构化纤维素是非基于动物的材料，因此是无异源性的(xeno)，所有没有疾病转移或排异的风险。特别是当涉及人体细胞时，形成的体系除了纤维素和可能存在的少量添加剂之外可以仅包含人体衍生组分，所以其不含任何异源动物或者微生物来源的材料。

纤维素纳米原纤维和纳米晶体的荧光背景可忽略不计。采用本文所述材料能够获得用于细胞的透明多孔基质，并且，相比于同类产品，本文所述材料更容易处理。

由于异源反应即便有也是温和的，纤维素具有生物相容性，对于干细胞应用而言尤其安全，没有已知毒性。它还是生物耐用性的；纤维素再吸收慢，因为细胞不能合成降解纤维素所需的纤维素酶。

本文方案特别适用于体内刺激，例如刺激生物制品分泌，如EV分泌，以及探索生物制品的持续生产。例如，许多培养用于外泌体的细胞是贴壁依赖性的，因此可以容纳细胞的NFC水凝胶、微珠等实体或形式特别适合用于培养外泌体分泌细胞。对于其他类型的细胞衍生产物而言同样如此，例如分泌或排泄的生物物质。在一个方案中，维持纳米结构化纤维素和细胞的混合物，同时收获富含细胞衍生产物的培养基，收获速度与添加新培养基的速率相同。可以使用渗透性或半渗透性结构(例如，膜或过滤器)将纳米结构化纤维素和细胞与富含细胞衍生产物的培养基分离。细胞衍生产物(例如，胞外囊泡)可通过使用任何合适的方法来收获，例如基于其尺寸，例如采用尺寸排阻色谱，和/或功能分子(例如结合EV表面蛋白的生物分子)。

本纳米结构化纤维素材料能够控制胞外囊泡的性质，例如，活性和尺寸分布，例如以获得更窄尺寸分布的囊泡。可以获得具有基本均匀尺寸的细胞产物，这使得其能够更可控地分离并在应用中使用。研究发现，所获得的细胞产物是体内样的并且是高功能的，并且可以用于高效处理其他细胞。

本文材料和组织方式实现了以促进高效生长和细胞培养物生产的形式来培养细胞。细胞例如可以聚集体(例如，球状体)形式生长，这对于细胞培养物生产目的而言可能是有利的。球状培养物可以在纳米结构化纤维素水凝胶中维持数周甚至数月，由此实现生物反应器中细胞的高效利用。使用纳米结构化纤维素作为间质基质可以防止或降低细胞或细胞球状体的不合乎希望的聚集，并且有助于维持所需的细胞表型和所生产的细胞衍生产物的广谱性。

此外，纳米结构化纤维素保护细胞以及细胞衍生产物，在过程期间减少生物反应器中流体动力剪切力相关问题，这在细胞衍生产物是囊泡或类似脆弱结构时尤其重要。可以以这样的形式提供纳米结构化纤维素，其促进液体流动和物质(例如，细胞培养产物，还有营养物、代谢物或对于过程具有影响的其他物质)扩散。

可以通过使用规模化技术使培养表面积最大化，例如搅拌槽反应器中的微载体或固定床或中空纤维生物反应器中培养。烧瓶中的双隔室培养也是可行的。

附图简要说明

图1显示隔室中包含纳米原纤维纤维素的生物反应器的实例。

图2显示隔室中包含纳米原纤维纤维素的生物反应器的实例。

图3显示隔室中包含纳米原纤维纤维素的生物反应器的实例。

图4显示了在0.5重量％下测得的天然纳米原纤维纤维素的确定的原纤维直径和孔尺寸。

图5显示了在0.5重量％下测得的阴离子纳米原纤维纤维素的确定的原纤维直径和孔尺寸。

图6显示了在细胞培养烧瓶中实施的生物反应器的实例。

图7显示了包括用于固定细胞的单独固定床反应器的生物反应器的实例。

图8显示(A)四天后APC和HDF球状体形成的代表性图像。APC和HDF用DiI染色并分别在0.2％和0.4％NFC内培养。使用荧光显微镜来观察球状体ll的形成。尺：100μm。(B)培养四天后HDF球状体形成的实时成像视频截图。将3×10⁵个细胞/100μl培养基与1ml的NFC(对于APC和HDF，分别为0.2％和0.4％)在6孔超低附着板的孔中混合。悬浮液在37℃中孵育30分钟，然后在水凝胶顶部缓慢添加1ml培养基。

图9显示了通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)从APC 2D(A)和3D(B)培养物中分离的外泌体的尺寸分布测量(显示了模式值)。将3×10⁵个细胞/孔作为初始细胞密度接种在6孔板中。在2D的70％融合度后和3D的5天后，分离外泌体。(C)外泌体的浓度(颗粒个数/ml)。显示了来自2D和3D培养物的APC外泌体的平均值±SE(n＝3)。**P<0.01

图10显示了来自2D和3D APC培养物的PHK67标记的外泌体的(A)荧光显微镜图像和(B)定量分析。基于PKH67标记的外泌体的绿色荧光强度进行定量。将100μl来自2D和3D培养物的各分离的外泌体用PKH67染料染色，然后插入96孔板的孔中。获取样品的荧光图像，并使用ImageJ软件测量荧光强度。对所有图像使用最大投影强度。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。比例尺＝10μm。***P<0.001。

图11显示了通过TEM(A)和(B)蛋白质印迹分析对来自2D和3D APC培养物的分离的外泌体的表征。通过蛋白质印迹法来检测外泌体标记物(包括CD81、CD9和Hsp70)，(C)使用BCA试剂盒测定来自2D和3D APC培养物的分离的外泌体浓度(n＝3)。***P<0.001。

图12显示(A)在处理24小时后、随后进行共聚焦显微镜观察的分别通过2D和3DHDF的2D和3D-APC-Exos(100微克/毫升)摄取的代表性图像。比例尺＝100μm。(B)用3D-APC-Exo(100μg/ml)处理24小时期间，通过3D HDF球状体的外泌体摄取的代表性图像，然后进行共聚焦显微镜观察。比例尺＝200μm。(C)通过3D HDF获取的3D-APC-Exo的定量。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。6小时后的外泌体摄取被认为是数据标准化的对照。***P<0.01。D)处理24小时后内化的PHK67标记的外泌体的定量分析。基于PKH67标记的外泌体的绿色荧光强度进行定量。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。2D HDF+2D APC-Exo被认为是数据标准化的对照处理。**P<0.01，***P<0.01。

图13显示了通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)从生物反应器(A)和NFC-生物反应器培养物(B)中分离的外泌体的尺寸分布测量。将25×10⁶个细胞作为初始细胞密度接种在生物反应器中。10天后分离外泌体。(C)外泌体的浓度(个颗粒/ml)。显示了来自生物反应器和NFC-生物反应器培养物的APC外泌体的平均值±SE(n＝3)。***P<0.001

图14显示了来自生物反应器和NFC-生物反应器培养物的PHK67标记的外泌体的(A)荧光显微镜图像和(B)定量分析。基于PKH67标记的外泌体的绿色荧光强度进行定量。将100μl的各分离的外泌体用PKH67染料染色，然后插入96孔板的孔中。获取样品的荧光图像，并使用ImageJ软件测量荧光强度。对所有图像使用最大投影强度。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。比例尺＝10μm。***P<0.001。

图15显示了通过TEM(A)和(B)蛋白质印迹分析对来自生物反应器和NFC-生物反应器培养物的分离的外泌体的表征。通过蛋白质印迹法来检测外泌体标记物(包括CD81、CD9和Hsp70)。(C)分别在治疗24小时后通过HDF的来自生物反应器(左栏)和NFC-生物反应器(右栏)(100μg/ml)摄取的分离的外泌体的代表性图像，然后进行共聚焦显微镜观察。比例尺＝100μm。

图16显示了通过四种细胞培养方法对APC增殖的量化，所述方法包括2D(板中的正常细胞培养)、3D(使用NFC的细胞培养)、生物反应器培养和与NFC结合的生物反应器培养。对于各时间点，将数据标准化为2D培养的结果。将数据表示为平均值±平均值标准误差(n＝5)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图17显示了使用BCA试剂盒通过四种细胞培养方法由APC产生的外泌体生产的量化，所述方法包括2D(板中的正常细胞培养)、3D(使用NFC的细胞培养)、生物反应器培养和与NFC结合的生物反应器培养。对于各时间点，将数据标准化为2D培养的结果。将数据表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

在该说明书中，除非另有特别说明，否则百分数值是基于重量(w/w)。如果给出任何数值范围，则该范围也包括上限值和下限值。开放式术语“包括”还包括封闭式术语“由……组成”作为一种选择。除非另有特别说明，本文公开的直径指最小直径，并且可以表示为平均或数均直径并且可以在显微镜下确定。

本文所述的材料和产品可以是医学和/或科学材料和产品，例如生命科学材料和产品，并且可以用于涉及诸如本文所述的活细胞和/或生物活性材料或物质的方法和应用中。

本文的方法和装置可用于生产和/或分离、隔离和/或收获细胞衍生产物。由细胞获取细胞衍生产物，即细胞提供或产生细胞衍生产物。细胞衍生产物可包括囊泡，如胞外囊泡，例如外泌体，但是其也可以包含其他适用的细胞衍生产物，例如大分子，细胞器、病毒和/或病毒样颗粒，以及获自细胞的类似物质和/或实体。这些可以视为生物活性物质。本文公开的方法主要在胞外囊泡(尤其外泌体)的背景下进行阐释，但是实施方式和实施例也可以应用于其他细胞衍生产物。

细胞衍生产物可以包括或者是胞外囊泡(EV)。存在获得EV的两种主要途径：生物流体和细胞培养物。使用细胞培养调节的培养基环境进行EV生产，例如外泌体生产，能够提供更可控的环境。

现有技术的主要技术限制是需要控制反应器内的环境参数，使得细胞和所获得细胞衍生产物(例如胞外囊泡，例如外泌体)的表型不会改变。

在本文的方法和体系中，提供三维细胞体系，其能够孵育和/或培养细胞以产生细胞衍生产物。三维细胞体系会刺激体内细胞衍生产物如胞外囊泡的分泌，因此期望使用三维(3D)细胞体系。因此，相较于2D体系，3D细胞体系产生的细胞衍生产物的数量更高。例如，三维球状体体系增加了间充质干细胞的外泌体分泌。据观察，相较于2D体系衍生的EV，3D体系衍生的EV在分泌动力学和信号分子含量(RNA和DNA)方面表现出显著不同的特征。然而，以有效且可靠的方式实施这种三维细胞培养不容易，特别是在生物反应器等环境中。即使使用3D体系，因剪切应力所致的细胞水平上的表型改变的风险也是一个问题。

细胞活力和健康状况可以通过该体系进行监测，并通过培养基和/或细胞与纳米结构化纤维素的目前稳定流入，以及用于分析和下游应用的细胞衍生产物和废物的等量稳定流出来实现。

需要细胞衍生产物、细胞和/或任何其他材料如细胞培养材料的保存、分离、收获和回收。注意，在培养和进一步步骤(包括分离、收获和回收)期间，保持和保护细胞及细胞衍生产物的结构，特别是囊泡型产物或其他脆弱大分子的结构很重要。这是通过使用本文公开的材料、体系和方法来实现的。

本文方法可用于提供可规模化的大规模细胞体系，例如干细胞体系，以及用于EV(如外泌体)上游生产的方法。这能够提供稳定且强效的产品，用于大量的治疗应用。这通过保持纳米结构化纤维素和细胞的混合物并能够收获富含细胞衍生产物的培养基的方法来实现。这可以以等于添加新培养基的速率来完成。实施方式的方案在实践中刺激体内样外泌体分泌，即持续的外泌体上游生产。本文所公开和讨论的方法和细胞体系旨在于通过孵育细胞来生产感兴趣的细胞衍生产物，而且还涉及细胞培养物和细胞培养。因此，术语“细胞培养物”和“细胞体系”可以互换使用。

扩大细胞培养以产生外泌体的另一个限制是对用于最佳细胞生长的动物血清的持续严重依赖。例如，胎牛血清(FBS)富含内源性外泌体，并且如果在细胞培养前不进行去除，源自FBS污染物的工艺相关杂质可能会进入最终产品，从医疗产品的监管角度来看，这是完全不利的。因此，需要无异源培养基成分，前提是其保持相当的细胞特性和外泌体产品属性，可以预期具有治疗级别。

纳米结构化纤维素是无异源产品，因此非常适合临床级细胞衍生产物的生产。细胞可以有效地固定在作为载体材料的纳米结构化纤维素中，并进行长时间培养，从而允许高效生产，还允许释放感兴趣的细胞衍生产物。例如，间充质干细胞(MSC)是用于药物递送的外泌体的高效大规模生产者。发明人已经表明，纳米结构化纤维素(如NFC)非常适合用于MSC培养。

纳米结构化纤维素水凝胶也是非常合适用于该3D球状体培养的材料。发现了如何利用纳米结构化纤维素实施生物反应器，并克服了本文讨论的问题。

本文公开的方法可以通过使用本文实施的生物反应器来进行，该生物反应器可以是包括容器和任何其它部件和物质(例如本文公开的部件和物质)的生物反应器体系。用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的生物反应器可以包括：

-容器，

-用于将细胞培养基输入容器的入口，

-用于从容器中输出包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口，

-所述容器包括或连接至隔室，所述隔室包括构造成接收细胞或含有细胞的纳米结构化纤维素，所述隔室包括第一分离表面并任选地包括用于气体交换的其他分离表面，所述第一分离表面将纳米结构化纤维素与出口隔开，并且允许包含细胞产物的细胞培养基行进通过所述第一分离表面。

容器可以是任意合适的容器，并且容器的尺寸、体积和/或形状可以根据培养的大小、细胞的类型、细胞衍生产物的类型、纳米结构化纤维素的类型和/或类似性质来选择。容器可以是能够进行3D细胞培养的器皿、反应器、瓶子、烧瓶、细胞培养板、袋等。可以使用一个或多个容器，例如可以平行设置两个或更多个容器。三维细胞培养(3D细胞培养)是指细胞设置在所有三维中的细胞培养，其旨在区别于传统的2D培养，其中，细胞按层设置和培养，例如在培养皿或类似表面上进行。3D细胞培养通常通过使用塑料支架来实现，但在本方法中，细胞培养在包含纳米结构化纤维素或由纳米结构化纤维素组成的基质中进行。已发现，由纳米结构化纤维素形成的纳米结构化纤维素水凝胶或实体特别适合于培养细胞用于细胞衍生产物，从而可以高效生产细胞衍生产物，并且还可以从细胞培养物中释放、分离和收获细胞衍生产物。

用于将细胞培养基输入到容器或隔室中的入口可以不同于用于从容器中提取包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口。入口和/或出口可以形成为容器中的物理入口和/或出口，例如形成、嵌入或者连接到容器或者隔室中的管、阀、孔或者它们的组合。入口和/或出口可以连接到或可连接到管、软管或将液体和/或固体介质输送到容器、反应器和/或隔室和/或从容器、反应器和/或隔室输送液体和/或者固体介质的其他合适方式。液体流(例如细胞培养基，其可以包含其他物质，如纳米结构化纤维素和/或细胞衍生产物)可以设置为进入入口和/或离开出口，优选通过使用用于输送液体的装置和/或用于提供液体流的装置进行，例如通过使用泵或类似装置进行。这能够连续生产细胞衍生产物。当提供液体流如培养基时，细胞可以培养和/或保持在能够稳定生产生物制品的状态。在没有流动的情况下，细胞可能处于静止状态，其中，细胞和细胞所产生的产物将降解和/或改变，因此产生将不稳定，并且细胞衍生产物的谱将随时间变化。

容器可以包括用于纳米结构化纤维素的隔室，或者包括纳米结构化纤维素的隔室，或者容器可以例如通过使用合适的连接装置如管、软管等连接进行分离的隔室。该隔室可以被称为第一隔室，并且它可以连接到第二隔室和/或另一隔室或其它部件，例如入口和/或出口。第一隔室可以包括纳米结构化纤维素的固定床。第二隔室可以是通过第一分离表面和任选通过一个或多个其他表面与第一隔室隔开的隔室。第二隔室设置成接收来自第一隔室的分离的细胞衍生产物，并且出口可以直接连接至第二隔室。

构造成接收细胞的纳米结构化纤维素是指如本文所公开的纳米结构化纤维素，所述纳米结构化纤维素是适合于接收细胞的形式。更具体地，纳米结构化纤维素应能够以这样的方式接收细胞，使得其能够结合、粘附、包埋、封装、保护、支撑和/或维持细胞，如本文所讨论的。例如，纳米结构化纤维素可以构造为接收细胞以包埋它们，优选地，以不释放细胞的方式。这样的纳米结构化纤维素可以具有合适的孔隙率、原纤维尺寸(例如直径和/或比率)、纳米结构类型、浓度、改性程度(例如化学、酶和/或机械改性程度)和/或类型(例如原纤化程度)、一种或多种流变性质和类似性质，或它们的组合。

包含纳米结构化纤维素的隔室可以在一个或多个表面上包含细胞培养凝胶的涂层，例如包含琼脂糖、胶原或透明质酸或其衍生物的凝胶。包含纳米结构化纤维素的隔室可以在一个或多个表面上涂覆一层这样的凝胶，例如浓度为0.3-1.0％(w/w)，例如约0.5％(w/w)的凝胶。凝胶层的厚度可以为0.1-3mm，例如0.1-1mm。这样的凝胶层可以用于例如细胞培养瓶中，并且它可以帮助将细胞固定在纳米结构化纤维素中，增强气体和物质的流动，并且还可以以其他方式增强该过程。在一个具体实例中，凝胶包括琼脂糖或其衍生物，或者是琼脂糖凝胶或其衍生物。

在一个实施方式中，包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室是相对于容器的单独单元。在一个实施方式中，包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室在容器内。包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室可以是或包括固定床反应器，或者固定床反应器可以包括包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室。

该隔室包括第一表面20，其可以被称为暴露表面或分离表面，例如第一分离表面，并且其设计成将包含来自细胞的细胞衍生产物的细胞培养基提供到出口和/或另一隔室。因此，第一表面设置成允许细胞培养基和细胞衍生产物通过，但优选防止细胞和纳米结构化纤维素通过，特别是防止隔室中所提供形式的纳米结构化纤维素通过。第一表面可以是屏障，或者其可以充当屏障，例如选择性屏障，可以将纳米结构化纤维素和/或细胞保持在隔室中。屏障可以是过滤器，或者可以充当过滤器。如果感兴趣的话，第一表面的性质可以设置为仅特定地使细胞衍生产物通过。第一表面可以是刚性的或柔韧的。第一表面设计和/或包括用于控制(例如限制或选择)物质从第一隔室流动到出口的装置。这可以通过提供具有选择性性质(例如选择性渗透性)的膜、过滤器、网状物或类似结构或层来实现。膜可以是(精细的)多孔膜，特别是低附着膜，例如超低附着膜，其可以包括抑制细胞、生物分子或本方法中使用的其他材料的非特异性附着的材料，例如作为涂层。例如，可以提供渗透的和/或半渗透的多孔膜，其对于位于第一隔室中的细胞和/或纳米结构化纤维素是不可渗透的。然而，(所需的)细胞衍生产物可以通过膜，通常在液体如细胞培养基中，因此其可以与细胞分离，并输送到不同的隔室和/或出口，然后回收。也可以采用具有类似性质的合适过滤器。可替换地，第一表面可以包括纳米结构化纤维素的表面，其可以提供所述选择性性质，例如选择性渗透性。该特定纳米结构化纤维素表面也可以提供作为额外的选择性表面。例如，这可以通过提供具有适当浓度、孔隙率和/或粘度的纳米结构化纤维素水凝胶来获得，该水凝胶可以通过提供、使用和/或制备具有选定性质的纳米结构化纤维素来获得，如浓度、原纤化程度、孔隙率、化学成分和/或其他改性程度，这可以通过机械、化学和/或酶促方式获得。

在一个实施方式中，第一表面包括对包含细胞衍生产物的细胞培养基可渗透、并且对细胞和纳米结构化纤维素是不可渗透的结构，该结构可以是层，例如膜、过滤器或网状物。这种选择的渗透性可以通过选择截止尺寸来获得，例如膜、过滤器或其他类似结构的孔尺寸或网目尺寸，使得细胞和/或纳米结构化纤维素不能行进通过该结构。第一表面也可以由纳米结构化纤维素本身的表面形成，或者该表面可以是另一表面30，例如第二或第三分离表面。如果纳米结构化纤维素作为单独实体提供，则实体的尺寸(最小直径)通常远高于细胞的尺寸(最小直径)，因此细胞直径可以是用于选择多孔结构或层的孔或网目尺寸的限制因素，或其他合适限制因素。在这种情况下，孔尺寸可以小于细胞的最小平均直径。然而，细胞可以在纳米结构化纤维素内培养，因此其不会被释放到细胞培养基中，因此在这种情况下，可以使用非常大的孔尺寸或网目尺寸，特别是如果纳米结构化纤维素实体是大的，例如呈大球状体形式，例如颗粒或珠，或细长形式。较大的截止尺寸(如孔尺寸或网目尺寸)能够使液体和物质更好地流动，这有助于细胞培养、生产和分离细胞衍生产品。孔尺寸可以在0.1-3μm的范围内，例如0.4-3μm。

在一个实例中，第一表面包括平均孔尺寸为0.1-3μm、如0.4-3μm的膜、过滤器或网状物。孔尺寸可以是平均孔尺寸或平均孔径，其可以通过使用合适的成像软件用显微镜来确定。这使得大多数细胞衍生产物，如胞外囊泡和较小物质和分子，能够行进通过膜，从而与细胞和纳米结构化纤维素分离，并最终回收。取决于纳米结构化纤维素的形式，孔尺寸可以更大。例如，如果使用相对较大的纳米结构化纤维素实体，其最小直径可高达毫米，则可以使用孔尺寸高达例如100μm，或甚至高达300μm或500μm的膜、网状物或其他结构，即使具有球状体或球状实体亦是如此。对于细长实体，例如纤维或纤丝，可以使用更大的孔尺寸。使用第一隔室和第二隔室之间的分隔结构的较大网目、孔或孔径尺寸允许培养基更好地流动通过该结构，这有利于物质的迁移以及细胞衍生产物的分离和回收。可以用各种装置获得培养基的混合和/或流动，例如通过使用合适的混合器24、泵40和/或其他致动器，或者通过改变隔室的体积，例如通过使用具有可调节体积的容器，例如配备有可移动部件的容器，如可变形部件，如波纹管等，或者活塞状部件，如柱塞，其中所述容器的体积通过操作可移动部件而改变，例如利用连接至所述可移动部件的致动器来操作。

可以为第一表面选择合适的孔尺寸或截止尺寸。采用合适的尺寸，可以根据不同细胞衍生产物的尺寸对其进行分离。可以提供对包含细胞衍生产物的细胞培养基可渗透且对细胞和纳米结构化纤维素不可渗透的第二或另外的表面。这样的表面可能具有不同的截止尺寸或孔尺寸，因此其对细胞衍生产物具有不同的渗透性。通过提供第一表面、第二表面和任选地合适数量的另外的表面，各表面具有不同的孔或截止尺寸，可以根据其尺寸将细胞衍生产物分离成不同的级分。这将有助于分离所需的细胞衍生产物。第一表面和另一表面可以包括类似或不同的结构，例如一个或多个膜、一个或多个过滤器，其可以包括一个或多个超滤器、一个或多个网状物及它们的组合。可以设置这些表面，从而能够根据细胞衍生产物尺寸对其进行分离，例如通过首先提供具有最高渗透性(具有最高截止尺寸或孔尺寸)的表面，然后提供另外的表面以呈现较低的渗透性。

例如，胞外囊泡的平均尺寸(即最小直径)可能主要在50-300nm的范围内，因此可以为第一和任选的另外的分离表面选择一个或多个孔或截止尺寸，例如500nm、400nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm和50nm。第一分离表面和另外的分离表面可以限定第二隔室和另外的隔室，可以从其中收获不同的级分。

在一个实施方式中，第一表面是中空纤维形式的。在这种情况下，反应器可以是中空纤维反应器。细胞和NFC可以在纤维的表面上，并且细胞衍生产物能够通过纤维的壁并进入在纤维中流动的液体，并因此与细胞和纳米结构化纤维素分离，并且可以回收。

隔室还可以包括另一表面30，其可以被称为气体交换表面，并且设计为允许气体交换。气体交换表面可以连接到气体源和/或气体入口和/或出口或设置成与气体源和/或气体入口和/或出口接触。气体交换表面可以与第一表面相同或相似，例如其可以包括膜或类似结构。然而，气体交换表面可以特别适于气体交换，因此例如孔或类似可渗透结构可以适于气体。因此，与第一表面相比，孔尺寸可以更小。因此，生物反应器在气体交换表面可以包括对气体可渗透并且对细胞和纳米结构化纤维素不可渗透、还优选对液体(例如水性液体或溶液)不可渗透的表面或膜。

生物反应器或第一隔室可以包括用于在隔室中混合纳米结构化纤维素和细胞的装置。用于混合的装置可以包括混合器、搅拌器，或者混合可以通过提供合适的液体流动进入和/或流动通过第一隔室和/或反应器来实现。混合器或搅拌器可以包括一个或多个合适突出部分用于对混合物进行混合，例如舵等，并且优选地，以不会破坏细胞和纳米结构化纤维素和/或细胞衍生产物的方式设置混合。可以例如通过控制混合器的速度和/或反应器或隔室中的流量来控制混合。

在一个实施方式中，生物反应器包括用于经入口和/或出口、优选通过(第一)隔室来提供细胞培养基流的装置。细胞被保留在隔室中的纳米结构化纤维素中，并且(连续的)流动设置成通过细胞、纳米结构化纤维素和/或隔室。以此方式，可以获得灌注型生物反应器、连续生物反应器或流动生物反应器，这些术语可以在本文中互换使用，适用于本文所讨论的目的，特别是用于连续和稳定生产细胞衍生产物。用于提供细胞培养基流动的装置可以包括泵、混合器、搅拌器、推进器或类似致动器，其可以是可控的，例如可操作地连接到控制单元。可以控制流速或速度，并且可以保持在所期望水平或范围内。用于提供细胞培养基流动的装置还可以包括用于调节容器或隔室体积的装置。用于提供流动的装置和用于混合的装置可以是相同的装置，或者它们可以是不同的装置。

生物反应器可以包括一个或多个传感器，用于监测来自生物反应器的一个或更多个参数，例如来自第一隔室和/或来自第二隔室或另一隔室的一个或更多个参数。参数可以是温度、pH、流速、电导率、氧含量、二氧化碳含量中的一个或多个。一个或多个传感器可以可操作地连接到控制单元。因此，控制单元可以设置成监测来自体系(例如生物反应器)的参数。控制单元可以设置成实施一个或多个控制动作，该控制动作可以基于一个或更多个监测的参数和/或预定(如编程)的动作。

生物反应器可以包括一个或多个致动器和/或连接到用于控制生物反应器的装置的致动器，例如泵、混合器、加热器、曝气器、用于添加液体和/或试剂的装置、阀、搅拌器等。致动器和装置可以可操作地连接到控制单元。控制单元可以构造成操作致动器和装置，优选控制生物反应器中的条件，特别是作为对一个或多个测量值或条件的反馈，和/或作为对一个或多个预定动作的响应。例如，控制单元可以编程为根据预定程序由生物反应器进行细胞培养和/或其他动作，该预定程序可以包括将例如反应器中的温度保持在指定范围，实施培养或其他动作一定的指定时间，将培养基的流速保持在指定的范围，将pH、氧气水平和/或二氧化碳水平保持在特定范围内等动作。

细胞

将在生物反应器中并用本方法孵育和培养的细胞可以是任何适用细胞，其可以产生感兴趣的细胞衍生产物或作为感兴趣的细胞衍生产物的来源。

通常，细胞可以在纳米结构化纤维素中培养或孵育，并且其可以在纳米结构化纤维素上或纳米结构化纤维素中维持和增殖，而无需源自细胞外的基于动物或人的试剂或培养基。细胞可以均匀分散在纳米结构化纤维素水凝胶或纳米结构化纤维素实体上或纳米结构化纤维素水凝胶或纳米结构化纤维素实体中。出于本文公开的生产目的而在纳米结构化纤维素中孵育的细胞形成了细胞体系。

最初，细胞可以在第一培养基中单独的培养物中预培养，回收并转移到新培养基中，该新培养基可以与第一培养基相似或不同。获得细胞悬浮液。这可以与第一隔室的纳米结构化纤维素组合和/或混合以获得或形成细胞体系或细胞组合物，这是所选择形式的细胞和纳米结构化纤维素的混合物。当细胞在细胞体系中培养时，形成细胞培养物，优选3D体系或培养物(是指纳米结构化纤维素中的体系或培养物)，其中，允许细胞在所有三个维度上生长和/或相互作用。纳米结构化纤维素水凝胶基质模拟天然胞外基质结构并提供营养物、气体等的高效运输。当开始细胞孵育或培养时，可能需要一个或多个增殖步骤以获得对生产目的最佳的细胞培养物或细胞体系。这可以包括细胞的接种和繁殖，直到获得合适的细胞密度。在此之后，可以开始实际生产。

在一实施方式中，细胞是原代细胞，例如干细胞。细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞和/或非人动物细胞。在一实施方式中，细胞是人原代细胞。在一实施方式中，干细胞是人干细胞。

术语“细胞培养”或“培养细胞”可以指细胞或组织的维持、运输、分离、培养、增殖、移动和/或分化中的一种或多种。“细胞体系”可以包括细胞培养物，但细胞体系的主要目的是维持细胞和生产细胞衍生产物。可能不希望允许细胞分化，并且可以控制和/或限制细胞的增殖。也可能不希望在生产期间运输、分离和/或移动细胞。细胞可以任何合适的方式维持，例如，作为单个细胞、单层、细胞簇和/或球状体，或作为组织。在一实施方式中，细胞以聚集体(例如球状体)存在。本文公开的纳米结构化纤维素材料及其在生物反应器中的设置有助于维持细胞体系，例如将细胞维持在所需的设置中并表现出所需表型。

细胞，尤其是真核细胞，可以是干细胞或分化细胞，例如源自或衍生自人体或动物体的细胞。细胞的具体实例包括干细胞、未分化细胞、前体细胞以及完全分化的细胞及其组合。在一些实例中，细胞包括选自下组的细胞类型：角膜基质细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、上皮细胞及其组合。在一些实例中，细胞选自下组：干细胞、祖细胞、前体细胞、结缔组织细胞、上皮细胞、肌肉细胞、神经元细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、基质细胞、间充质细胞、免疫体系细胞、造血细胞、树突状细胞、毛囊细胞及其组合。细胞可以是癌细胞或癌症干细胞。细胞可以是遗传修饰的细胞，例如转基因细胞、顺基因细胞或敲除细胞，或病原细胞。此类细胞可用于例如药物研究或治疗应用，例如用于提供治疗物质。尤其，干细胞可用于治疗应用，在这种情况下，在使用本文公开的材料、装置和方法的过程中保护细胞和获得的细胞衍生产物尤为重要。

真核细胞可以是动物细胞，例如哺乳动物细胞。动物和哺乳动物细胞的实例包括人细胞和非人动物细胞，例如小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猴细胞、猪细胞、牛细胞、鸡细胞等。

在一个实施方式中，细胞是干细胞，例如全能干细胞，其可以是非人干细胞、多潜能干细胞、多能干细胞、寡能干细胞或单能干细胞。干细胞是这样的细胞，其能够通过细胞分裂进行自我更新并且可以分化成多谱系细胞。这些细胞可分为胚胎干细胞(ESC)、诱导多潜能干细胞(iPSC)和成体干细胞(也称为组织特异性干细胞或体细胞干细胞)。干细胞可以是人干细胞，可以是非胚胎来源的，例如成体干细胞。它们是分化后可见于全身的未分化细胞。它们负责例如器官再生并且能够以多潜能或多能状态分裂并分化成分化的细胞谱系。干细胞可以是不破坏胚胎产生的人胚胎干细胞系，例如Cell Stem Cell.2008年2月7日；2(2):113-7中所述。干细胞可以从自体同源成体干细胞来源获得，例如骨髓、脂肪组织或血液。

干细胞的实例包括间充质干细胞(MSC)、多能成体祖细胞诱导多潜能干细胞(iPS)和造血干细胞。

就人干细胞而言，细胞可以是非胚胎细胞或胚胎细胞，例如hESCs(人胚胎干细胞)，它们是在不破坏胚胎的情况下获得的。对于人胚胎干细胞，细胞可以来自保藏的细胞系或者由未受精的卵(即“无性生殖”卵)或由孤雌生殖性激活卵制备，因此不会破坏人胚胎。

在一个实施方式中，细胞是间充质干细胞(MSC)。间充质干细胞(MSC)是成体干细胞，可以分离自人和动物来源，例如哺乳动物。间充质干细胞是多能基质细胞，其可以分化成多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。间充质本身是源自中胚层并分化为造血和结缔组织的胚胎结缔组织。然而，间充质干细胞不分化成造血细胞。间充质干细胞和骨髓基质细胞这两个术语多年来一直可以互换使用，但是这两个术语的描述性都不够。基质细胞是结缔组织细胞，其形成组织功能细胞所在的支持结构。虽然这是对MSC功能之一的准确描述，但是该术语未能表明相对最近发现的MSC在组织修复中的作用。该术语包括源自其他非骨髓组织的多能细胞，例如胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质或脱落乳牙的牙髓。间充质干细胞没有能力重建整个器官。

国际细胞治疗学会(The International Society for Cellular Therapy)提出了定义MSC的基本标准。这些细胞(a)应当表现出塑料贴附性，(b)具有特定的细胞表面标志物组，即分化簇(CD)73、D90、CD105，并且没有CD14、CD34、CD45和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达，和(c)具有在体外分化成脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力。这些特征对所有MSC都有效，尽管从不同组织来源分离的MSC存在少许差异。MSC不仅存在于胎儿组织中，而且存在于许多成人组织中，只有少数例外。已经报道了取自骨髓的高效MSC群。已从脂肪组织、羊水、羊膜、牙组织、子宫内膜、肢芽、经血、外周血、胎盘和胎膜、唾液腺、皮肤和包皮、羊膜下脐带内膜、滑膜液和华顿胶中分离到表现出MSC特征的细胞。

人间充质干细胞(hMSC)表现出非常高的塑性，并且几乎存在于所有器官中，且在骨髓中密度最高。hMSC可作为间充质细胞的可再生来源，具有在适当刺激下体外和移植后体内分化成多种细胞谱系的多潜能能力，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼和心肌细胞、内皮细胞和神经元。

在一个实例中，细胞是多能人成体祖细胞(MAPC)，其衍生自可以收获自骨髓、肌肉和脑的原始细胞群。MAPC是比间充质干细胞更原始的细胞群，虽然它们模仿胚胎干细胞特性，但它们仍然保留了成体干细胞在细胞治疗中的潜力。在体外，MAPC显示出对脂肪生成、成骨、神经原性、肝原性、造血、肌原性、软骨形成、上皮和内皮谱系的巨大分化潜力。MAPC的一个关键特征是它们在体外显示出巨大的增殖潜力而不会失去其表型。MAPC可用于治疗多种疾病，例如缺血性中风、移植物抗宿主病、急性心肌梗塞、器官移植、骨修复和骨髓增生异常。MAPC还增强骨形成，促进新血管形成，并具有免疫调节作用。

诱导多潜能干细胞(iPS)是一类可以直接从成体细胞生成的多潜能干细胞。它们实际上可以无限繁殖并可以产生体内所有其他细胞类型，包括神经元、心脏、胰腺和肝细胞。诱导多潜能干细胞可以直接源自成人组织，并且它们可以患者匹配的方式制备，可以获得特定的细胞衍生产物，使用这些产物没有免疫排斥风险。人诱导多潜能干细胞特别受关注，它们可以由例如人成纤维细胞、角质形成细胞、外周血细胞、肾上皮细胞或其他合适的细胞类型生成。

造血干细胞(HSC)也称为血干细胞，是可以发育成所有血细胞类型的细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。造血干细胞存在于外周血和骨髓中。HSC产生血细胞的骨髓样和淋巴样谱系。骨髓样和淋巴样谱系都参与树突状细胞形成。骨髓样细胞包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞和巨核细胞至血小板。淋巴样细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。

在一个实施方式中，细胞是从脂肪组织例如小鼠胚胎衍生的脂肪祖细胞(APC)获得的干细胞。

干细胞可以是不聚集的单个或分离的干细胞，或者它们可以是聚集的，例如干细胞球状体，例如干细胞衍生的球状体。

细胞球状体指通过胞外基质连接在一起的多细胞细胞聚集体，在这种情况下，多细胞细胞聚集体通过纳米结构化纤维素基质连接在一起。由于动态的细胞间和细胞基质间相互作用，球状体比作为分离的细胞存在的单个细胞更复杂，这使得它们成为在体外模拟体内组织微环境的重要工具。细胞球状体可以这样形成：在基质材料中培养或孵育细胞以形成包含多细胞聚集体或球状体的三维细胞培养体系。当使用纳米原纤维纤维素作为基质材料时，经过三天的培养或孵育就可以得到细胞球状体。通常，细胞球状体的直径可以各不相同，范围从几十微米到超过毫米。然而，在本文中，通过控制和调整培养和基质形成材料和条件，可以获得具有受控直径的细胞球状体，适合于细胞衍生产物生产目的。细胞可以在第一培养基中的单独培养物中进行预培养，随后其在纳米结构化纤维素(如纳米原纤维纤维素)中形成为聚集体，例如，在第一隔室中；并且/或者，细胞聚集体保持在第一隔室中的纳米结构化纤维素中。

在细胞衍生产物生产过程中，由原纤维纤维素网络稳定的多细胞聚集体促进了细胞的活性、增殖和分化。纳米结构化纤维素基质创造了用于该细胞聚集体的最佳条件。在本文公开的方法中所形成的细胞聚集体可以是细胞球状体形式的，或者细胞聚集体可形成细胞球状体。

本申请公开了一种用于制备细胞组合物的方法，其可以用于生产细胞衍生产物，所述方法包括：

-在允许细胞形成细胞聚集体的条件下培养真核细胞，

-在纳米结构化纤维素水凝胶中提供细胞聚集体和/或将细胞聚集体与纳米结构化纤维素水凝胶结合以获得细胞体系，例如细胞组合物或混合物，其包含在纳米结构化纤维素水凝胶中的真核细胞。细胞体系可以形成在并且/或者可以位于第一隔室中。

该方法可以包括在允许细胞聚结的条件下培养细胞。该条件包括允许聚结和/或形成聚集体的合适时间。所述条件可以包括合适的培养基，例如液体培养基和/或凝胶培养基。培养可以在培养皿或培养板中进行，或者在多孔微孔板中进行。细胞可以在纳米结构化纤维素水凝胶中进行培养，例如纳米原纤维纤维素水凝胶，其优选包含液体培养基。使用纳米结构化纤维素水凝胶可以促进获得所需尺寸的细胞球状体。水凝胶的浓度不应太高，因为太高浓度的纳米结构化纤维素凝胶基质材料(如NFC)可能会阻止球状体的形成，特别是对于干细胞，如多能干细胞。水凝胶的合适浓度可能取决于所使用的纳米结构化纤维素的类型和/或所需的细胞衍生产物，并且可能为0.1-8％(w/w)，例如0.2-6％(w/w)。优选水凝胶的浓度不超过3％(w/w)，或者对于纳米原纤维纤维素不超过2.5％(w/w)。在实例中，细胞在约1％(w/w)的NFC水凝胶、约1.5％(w/w)NFC水凝胶或约2％(w/w)NFC水凝胶中进行培养。某些细胞类型更喜欢低水凝胶浓度作为最佳培养条件，如0.1-0.8％(w/w)。例如，MSC可以包埋在0.2-0.5％(w/w)的水凝胶中进行培养。如果使用纳米晶体纤维素，则浓度可以更高，高达5％、高达6％、高达7％或甚至高达8％。

该方法可包括在纳米原纤维纤维素水凝胶中培养真核细胞，其浓度为0.1-3％(w/w)，0.2-2.2％(w/w)，0.1-2％，0.2-2％(w/w)，如0.1-0.8％(w/w)，或0.8-3％(w/w)，1.3-2.2％(w/w)，0.8-2％，1-2％(w/w)，如0.8-1.5％(w/w)，或约1％(w/w)，约1.5％(w/w)或约2％(w/w)。细胞可以以1x10⁵个细胞/ml-1x10⁷个细胞/ml的密度进行接种或提供给细胞培养物，例如以1x10⁶-5x10⁶个细胞/ml的密度进行。相同的浓度也可以用于单个或分离的细胞，其可以是干细胞也可以不是干细胞，并且当使用纳米晶体纤维素时也是如此。

细胞聚集体可以是细胞球状体，其平均直径可以为80-700μm，例如80-300μm。直径可以是数均直径。似乎用浓度约为2％(w/w)的NFC产生(如在NFC中培养的和/或与NFC组合的)的细胞球状体的平均直径较小，如为80-250μm，比在较低浓度的NFC中产生的细胞球状体更小。也可以保持直径。这可以提高细胞在体外和体内的存活率，并能够提供高效且可行的细胞制备/制剂和细胞衍生产物。还可以调节所形成或正形成的细胞球状体的直径，例如通过添加EDTA溶液或类似的络合试剂来减小细胞的直径。

该方法还可以包括提供纳米结构化纤维素水凝胶，例如纳米原纤维纤维素水凝胶，其可以用于培养和/或生产细胞衍生产物。细胞聚集体可以水凝胶提供和/或与水凝胶结合。水凝胶可以混合，优选通过用移液管尖端或类似工具轻轻混合，以获得细胞和水凝胶的均匀分布，并避免破坏细胞或细胞球状体并避免气泡形成。

所形成的细胞聚集体是多细胞聚集体，在本文中称为细胞球状体。培养可以进行至少3天，例如3-14天或3-7天。特别是该方法适用于干细胞。在聚集体形成后，可以收获细胞并用合适的培养基或缓冲液进行洗涤，和/或悬浮在合适的培养基或缓冲液中，例如前文公开的pH为6-8的缓冲液或培养基。此后，可以将细胞聚集体转移到NFC水凝胶中。NFC水凝胶将在细胞聚集体之间形成间隙基质，该基质增强结构，固定细胞，但使试剂能够流动通过基质，从而实现例如细胞信号传导、营养物质流动和其他重要功能。实施方式的基质是指围绕细胞并形成多孔三维晶格的基质，其功能类似于在细胞外基质组织中发现的间质基质。基质可以均匀地分布在组合物中和/或在细胞之间。在细胞已经存在于基质中一段合适时间，例如至少6小时、至少12小时或至少24小时之后，可以形成和/或进一步发展基质，即NFC可以与细胞反应以形成基质。细胞可以在纳米结构化纤维素水凝胶中储存和/或孵育几天或者甚至几周。

发现无论是未化学改性的或化学改性的(特别是阴离子改性的)纳米原纤维纤维素都能促进细胞球状体形成并使其稳定。细胞球状体可用于细胞衍生产物的生产。特别是与干细胞球状体一起使用的NFC水凝胶减少了细胞的进一步聚集，并使细胞在生物反应器中培养和生产期间免受剪切力的影响。如果细胞以单独的形式，即非聚集的形式存在，也会出现相同的效果。

由于水凝胶的光学性质，细胞和细胞球状体可以在纳米结构化纤维素水凝胶中以视觉方式进行研究，例如以显微镜进行研究。当细胞在水凝胶基质中时，还可以进行其他测试，因为基质允许分子物质流动。通过酶促使水凝胶降解，例如通过使用一种或多种纤维素酶进行降解，可以从水凝胶中释放细胞或细胞球状体。

细胞衍生产物

细胞衍生产物可以是任何适用的细胞衍生产物，例如本文所讨论那些中的一种或多种。细胞衍生产物可以是细胞来源的任何产物，例如由细胞排泄和/或分泌和/或以其他方式由细胞释放的产物。细胞不是细胞衍生产物。细胞衍生产物优选为生物活性物质，可统称为“生物制品”，因此本文所用的细胞衍生产物和生物制品是可互换的术语。希望保持这些物质的生物活性。

细胞衍生产物可以是或包括囊泡，例如胞外囊泡。在一个实施方式中，细胞衍生产物是或包含外泌体，其中，细胞优选是哺乳动物细胞。细胞衍生产物也可以是或包括(大)分子，例如蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、抗体、激素、其他适用分子，例如重组分子，和/或病毒或其部分。细胞衍生产物可以是或包含分泌蛋白质组(secretome)，根据定义，分泌蛋白质组是由生物体表达并分泌到胞外空间中的一组蛋白质。

本文公开的细胞衍生产物的数均直径可以为1000nm或更小、800nm或更小、或500nm或更小，例如数均直径在5-1000nm范围内，例如20-1000nm或20-500nm或更小，并且可能具有相对较窄的尺寸分布。本文的细胞衍生产物可以包含胞外囊泡和较小的物质和/或分子，例如一种或多种本文提及的那些。

在一个实例中，细胞衍生产物包括或者是病毒、病毒组成部分、病毒样颗粒、病毒产物和/或病毒载体。例如，它们可以用于疫苗制造或基因治疗。在这种情况下，细胞是病毒的宿主细胞。

细胞衍生产物可以是或包括生物活性物质，例如，分子和/或胞外囊泡。

在一个实例中，细胞衍生产物包含或为蛋白质，例如治疗性蛋白质，例如抗炎细胞因子和其他分子、胰岛素、激素等。

在一个实例中，细胞衍生产物为或包含抗体。在这种情况下，该方法可以是用于产生、分离和/或回收抗体的方法。可能期望使用纳米结构化纤维素实体来产生抗体，特别是通过培养实体顶部的细胞，从而有更多的表面可供细胞生长。这也可以应用于生产本文公开的其他细胞衍生产物。

血细胞可排除在细胞产物之外，例如红细胞、白细胞和/或血小板可不被视为细胞衍生产物。最小的血细胞血小板(血小板)的最大直径已经达到2-3μm，红细胞和白细胞甚至更大。然而，即使比前面所讨论的细胞衍生产物大得多，在某些情况下，也可以使用本发明的材料和方法来提取血细胞。

细胞衍生产物的尺寸可能会对纳米结构化纤维素或其他材料中的迁移速度和效率产生影响。例如，囊泡、病毒和类似实体比例如某些大分子更大，并且作为含有脂质单层或双层的实体，它们可能是脆弱的或者是基质材料可能对这类细胞衍生产物的迁移和维持具有实质性影响的动态结构。因此，可能期望在纳米结构化纤维素实体表面和/或包埋于该实体中培养细胞以获取这些细胞衍生产物，和/或使用允许细胞衍生产物迁移的该类型的纳米结构化纤维素。

纳米原纤维纤维素

纳米结构化纤维素可以包括或者是纳米原纤维纤维素。纳米原纤维纤维素对于某些用途可能是优选的，例如当需要高纵横比和/或保存的原纤维时。这些对例如材料的结构和流变特性以及与细胞相互作用的能力以及产生和促进所需细胞产物的释放具有影响。

优选NFC水凝胶的浓度不超过3％(w/w)，或者不超过2.5％(w/w)。在实例中，细胞在约1％(w/w)的NFC水凝胶、约1.5％(w/w)NFC水凝胶或约2％(w/w)NFC水凝胶中进行孵育。该方法可包括使细胞在纳米原纤维纤维素水凝胶中进行孵育，所述纳米原纤维纤维素水凝胶的浓度为0.5-3％(w/w)，1-3％(w/w)，0.5-2.5％(w/w)，1-2.2％(w/w)、0.6-2％，1-2％(w/w)，如0.6-1.5％(w/w)，或约1％(w/w)，约1.5％(w/w)，或约2％(w/w)。细胞可以以1x10⁵个细胞/ml-1x10⁷个细胞/ml的密度进行接种或提供给细胞体系，例如以1x10⁶-5x10⁶个细胞/ml的密度进行。发现浓度不应更低，因为水凝胶的粘度在低于0.2％(w/w)、0.5％(w/w)或低于0.8％(w/w)的浓度下可能过低。另一方面，浓度不应太高，例如超过5％(w/w)、或超过3％(w/w)或超过2.5％(w/w)，因为水凝胶基质中和/或从水凝胶基质中流出的物质的流动可能减少或甚至可能被阻断。已经在超过2％(w/w)或超过2.5％(w/w)的浓度下，水凝胶的孔径往往太低，例如低于100nm，并且水凝胶可能太硬，可能导致捕获细胞衍生产物、特别是较大的细胞产物，例如囊泡等。因此，过高的浓度和过于硬或致密的水凝胶可能干扰细胞衍生产物的迁移和/或细胞培养基的流动。

所述浓度适用于水凝胶形式的NFC，其可以作为基本均匀和/或连续的水凝胶存在，或者适用于形成为单独实体的NFC，如本文所讨论的。然而，在单独的实体中，可以使用更高浓度，例如高达3％(w/w)、5％(w/w)或甚至高达8％(w/w)。这种更高的浓度可以促进细胞在实体表面上或直接在表面下孵育，这反过来又可以促进物质向实体迁移和从实体迁移到周围培养基。例如，可以促进大细胞衍生产物迁移，从而可以提高细胞衍生产物的生产和回收。

纳米原纤维纤维素应具有足够的原纤化程度，从而获得所需的性能和效果。在一个实施方式中，纳米原纤维纤维素的原纤维和/或原纤维束的数均直径可以为1-200nm。纳米原纤维纤维素可以通过流变特性进一步表征，例如粘度和/或屈服应力。

在一个实施方式中，通过旋转流变仪在22±1℃、0.5重量％稠度、水性培养基中进行测定，纳米原纤维纤维素分散在水中时提供的零剪切粘度为100-50000Pa·s，如300-8000Pa·s，屈服应力为1-50Pa，例如2-15Pa。该材料原纤维化到这样的程度，并且具有这样的性质：特别有利于细胞培养、孵育和细胞衍生产物生产。具体地，300-8000Pa·s的零剪切粘度和2-15Pa的屈服应力特别适合本文生物反应器应用。例如，细胞衍生产物能够从细胞扩散到水凝胶中，并从水凝胶扩散到培养基中，因此其可以高效分离和回收。在一个特别有利的实施方式中，纳米原纤维纤维素包含数均直径为2-100nm，如2-50nm、2-20nm或10-50nm的纤维素原纤维和/或原纤维束，并且当分散在水中时，纳米原纤维纤维素提供的屈服应力为1-50Pa，例如2-15Pa，其通过旋转流变仪在22±1℃、0.5重量％稠度、水性培养基中进行测定。

纳米原纤维纤维素可以是生物反应器中和/或第一隔室中和/或水凝胶中和/或实体中的唯一基质材料，例如唯一的聚合物材料和/或唯一的纤维素材料。然而，除了NFC之外，还可以包括其他聚合材料，例如纳米晶体纤维素、透明质烷、透明质酸及其衍生物、肽基材料、蛋白质、其他多糖例如藻酸盐或聚乙二醇。可以获得形成半互穿网络(半IPN)的组合物，其中纳米原纤维纤维素提供结构稳定性。其他聚合材料在总组合物中的含量以干重计可以在20-80％(w/w)的范围内，例如40-60％(w/w)或10-30％(w/w)或10-20％(w/w)。

形成水凝胶的起始原料可以是纳米原纤维纤维素，也称为纳米纤维素，指衍生自纤维素原料的分离的纤维素原纤维和/或原纤维束。纳米原纤维纤维素是基于自然界中丰富的天然聚合物。纳米原纤维纤维素具有在水中形成粘性水凝胶的能力。纳米原纤维纤维素的生产技术可以基于使纤维原料崩解，例如研磨浆纤维的水性分散体以获得纳米原纤化的纤维素。在研磨或均质化过程后，得到的纳米原纤维纤维素材料是稀薄的粘弹性水凝胶。

由于崩解条件，所获得的材料通常以相对低的浓度均匀地分布在水中的形式存在。起始材料可以是浓度为0.2-10％(w/w)，例如0.2-5％(w/w)的水性凝胶。纳米原纤维纤维素可以直接由纤维原料(例如纤维素纤维)的崩解获得。市售的纳米原纤维纤维素水凝胶的实例包括UPM的变体。

由于其纳米级结构，纳米原纤维纤维素具有独特的性质，该性质能够实现常规非纳米原纤维纤维素或例如合成纤维或原纤维无法提供的功能。可以制备表现出与常规产品或使用常规纤维素材料或其他聚合材料的产品不同性质的材料和产品。然而，由于纳米级结构，纳米原纤维纤维素也是具有挑战性的材料。例如，纳米原纤维纤维素的脱水或处理可能是困难的。

纳米原纤维纤维素可以由植物来源的纤维素原料制备，或者也可以源自某些细菌发酵过程。纳米原纤维纤维素优选由植物材料制备。纳米原纤维纤维素优选通过纤维素纤维的机械崩解从植物中获得。该原料可以基于含纤维素的任何植物材料。在一个例子中，原纤维是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤维可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤维的一种丰富来源是木质纤维。纳米原纤维纤维素可以通过对来自木材的纤维原料进行均质化制得，所述纤维原料可以是化学浆。纤维素纤维崩解以产生平均直径仅为数纳米的原纤维，在大多数情况下该平均直径为200nm或更低，得到在水中的原纤维分散体。来源于次级细胞壁的原纤维基本为晶体，其结晶度至少为55％。这类原纤维可能具有与源自原生细胞壁的原纤维不同的特性。例如，源自次生细胞壁的原纤维的脱水可能更难。通常，在来自初级细胞壁的纤维素来源中，例如在甜菜、马铃薯块茎和香蕉轴(banana rachis)来源中，微原纤维比来自木材的原纤维更容易从纤维基质中释放出来，并且崩解所需的能量更少。然而，这些材料仍然有些不均匀，并且主要由大的原纤维束组成。

非木质材料可能来自农业残留物、草或其他植物物质，例如来自棉花、玉米、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻米、亚麻、大麻、马尼拉麻、剑麻、黄麻、苎麻、洋麻、甘蔗渣、竹子或芦苇的秸秆、叶、树皮、种子、外壳、花、蔬菜或果实。纤维素原料还可以源自产生纤维素的微生物。微生物可以是醋杆菌属(Acetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)或产碱杆菌属(Alcaligenes)，优选醋杆菌属，更优选木醋杆菌(Acetobacter xylinumor)或巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)。

已发现从植物纤维素，特别是木质纤维素获得的纳米原纤维纤维素对于本文所述的生命科学、医学或科学产品是优选的。木质纤维素可大量获得，并且针对木质纤维素开发的制备方法能够进一步生产适用于这类产品的纳米原纤维材料。通过使植物纤维，特别是木质纤维原纤化而获得的纳米原纤维纤维素在结构上与从微生物获得的纳米原纤维纤维素不同，并且具有不同的性质。例如，与细菌纤维素相比，纳米原纤化木质纤维素是均质且多孔和松散的材料，这在涉及活细胞的应用中是有利的。细菌纤维素通常原样使用而不像对植物纤维素那样进行原纤化，因此材料在这方面也有所不同。细菌纤维素是致密材料，容易形成小球状体，因此材料的结构是不连续的，并且在与活细胞有关的应用中不希望使用这种材料，特别是当需要材料的均质性时。

源自植物材料的纳米原纤维纤维素需要将纤维素纤维崩解成原纤维和/或原纤维束，这能够控制原纤化过程以及获得的原纤化纤维素材料的性能。可以在崩解过程之前对纤维素进行改性并控制原纤化类型和效率，例如通过选择合适的设备、合适的工艺条件和时间以及其他相关参数，以获得具有所需特性如原纤化程度、纵横比和改性类型的纳米原纤维纤维素。这对于通常以原纤维形式存在的细菌纳米纤维素是不可能的。植物纤维素对于本文方法也是优选的，其中，制备细胞衍生产物，并且希望具有受控生产且没有任何干扰或污染物质。当使用植物纤维素时，不会有存在任何细菌来源的物质的风险。

木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实例中，纳米原纤维纤维素从木浆获得。纳米原纤维纤维素可以从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。纳米原纤维纤维素可以从软木浆获得。在一个实例中，所述木浆是化学浆。本文公开的产品可能期望采用化学浆。化学浆是纯材料，可用于多种应用。例如，化学浆缺少机械浆中存在的沥青和树脂酸，并且它无菌程度更高或更容易灭菌。此外，化学浆更灵活并提供了有利的特性，例如在医疗和科学材料中。例如，可以制备非常均匀的纳米原纤维纤维素材料，而无需过度加工或需要特定设备或费力的加工步骤。

纳米原纤维纤维素，包括纤维素原纤维和/或原纤维束的特征在于高纵横比(长度/直径)。纳米原纤维纤维素的平均长度(原纤维和/或原纤维束之类的颗粒的中值长度)可超过1μm，在大多数情况下为50μm或更小。如果初级原纤维没有完全彼此分离，则缠结原纤维(例如，原纤维束)的平均总长度可以例如在1-100μm，1-50μm或1-20μm的范围内。这尤其适用于天然级别的原纤维，这些原纤维不会例如在化学、酶促或机械作用下被缩短或消化。但是，如果纳米原纤维材料高度原纤化，则初级原纤维可能完全或几乎完全分离，平均原纤维长度会更短，例如在1-10μm或1-5μm的范围内。强衍生的纳米原纤维纤维素的平均原纤维长度可以更短，例如在0.3-50μm，例如0.3-20μm，例如0.5-10μm或1-10μm的范围内。特别是较短的原纤维，例如酶促消化或化学消化的原纤维，或经过机械处理的材料所具有的平均原纤维长度可以小于1μm，例如0.1-1μm，0.2-0.8μm或0.4-0.6μm。可以例如使用CRYO-TEM、SEM或AFM图像在显微镜下估测原纤维的长度和/或直径。可以使用合适的成像软件。如果需要高纵横比，则不希望缩短原纤维长度，因此可能不希望使用以化学或酶方式消化的纤维素，或者这类原纤维已被缩短的高度机械原纤化材料。低纵横比通常可以检测为NFC分散体的粘度降低。

就NFC而言，也就其他颗粒、实体、细胞、聚集体以及其他本文所讨论的那些而言，本文公开的平均长度和/或直径可以是数均长度和/或直径。如本文所讨论的，这些尺寸可以在显微镜下确定。如果适用，术语“原纤维/原纤(fibril)”还包括原纤维束/原纤束。机械崩解的纤维素材料可包含至少少量的纤维素，这些纤维素没有完全分离成元素原纤维而仍为原纤维束的形式。

对于高度原纤化的材料，纳米原纤维纤维素的平均直径(宽度)小于1μm，或小于或等于500nm，例如在1-500nm的范围内，但优选小于或等于200nm，甚至小于或等于100nm或者小于或等于50nm，例如，在1-200nm，2-200nm，2-100nm或2-50nm，甚至2-20的范围内。本文公开的直径指原纤维和/或原纤维束的直径。最小的原纤维在初级原纤维的级别上，平均直径一般在4-12nm的范围内。原纤维的尺度和尺寸分布取决于精制方法和效率。就高度精制的天然纳米原纤维纤维素而言，平均原纤维和/或原纤维束直径可以在2-200nm或2-100nm的范围内，例如在10-50nm的范围内。纳米原纤维纤维素的特征在于具有大的比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤维纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，从植物(特别是木材)获得的纳米原纤维纤维素也可含有少量的其它植物成分，特别是木成分，如半纤维素或木质素。含量取决于植物来源。

通常，根据TAPPIW13021，纤维素纳米材料可以分为几类，TAPPI W13021提供了纤维素纳米材料的标准术语。并非所有这些材料都是纳米原纤维纤维素。两个主要类别是“纳米物体”和“纳米结构化材料”。纳米结构化材料包括直径为10-12μm且长径比(L/D)<2的“纤维素微晶”(有时称为CMC)，以及直径为10-100nm且长度为0.5-50μm的“纤维素微原纤维”。纳米物体包括“纤维素纳米纤维”，其可以分为直径为3-10nm且L/D>5的“纤维素纳米晶体”(CNC)和直径为5-30nm且L/D>50的“纤维素纳米原纤维”(CNF或NFC)。

可以基于三大主要特性对不同级别的纳米原纤维纤维素进行分类：(i)尺寸分布，长度和/或直径；(ii)化学组成；和(iii)流变性质。为了充分描述某级别，可以平行使用两个或更多个性质。不同级别的实例包括天然(未化学和/或酶改性的)NFC、氧化NFC(高粘度)、氧化NFC(低粘度)、羧甲基化NFC和阳离子化NFC。在这些主要级别中，还存在一些子级别，例如：原纤化极好与中度原纤化，高取代度与低取代度，低粘度与高粘度等。原纤化技术和化学预改性对原纤维尺寸分布有影响。通常，非离子级别具有更宽的平均原纤维和/或原纤维束直径(例如在10-100nm或10-50nm的范围内)，而化学改性级别则要细很多(例如在2-20nm的范围内)。改性级别的分布也更窄。某些改性，特别是TEMPO氧化，可产生较短的原纤维。

在化学衍生化过程中，可以获得期望的纤维素取代度。这可以通过控制化学衍生过程来进行，例如通过选择合适的原材料、反应条件、设备、反应时间、试剂和/或类似性质。例如，通常进行TEMPO或N-氧基介导的氧化，至电荷值达300至1500微摩尔/克，优选600至1200微摩尔/克，最优选700至1100微摩尔/克。氧化的NFC还可以含有醛官能团，通常为0至250微摩尔/克。对于纤维素浆，通过羧甲基化衍生通常在原纤化之前进行到0.05-0.3、优选0.08-0.25、最优选0.10-0.2的ds水平。如果通过阳离子化进行衍生化，则DS水平通常为0.05至0.4，优选0.15至0.3。

取决于原料来源，例如硬木浆与软木浆相比，最终纳米原纤维纤维素产品中存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆制备非离子级别，会产生高二甲苯含量(25重量％)。从硬木浆或软木浆制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素也与纤维素域一起进行改性。最有可能的是，改性是不均匀的，即，一些部分可能相比其他部分改性程度更高。因此，通常无法进行详细的化学分析，因为改性产物是不同多糖结构的复杂混合物。

在水性环境中，纤维素纳米原纤维的分散体形成粘弹性水凝胶网络。所述凝胶由分散和水合的缠结原纤维在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下就已经形成。NFC水凝胶的粘弹性可用例如动态振动流变学测量来表征。一般来说，流变学测量是在标准条件下进行的，例如水分散体的特定浓度NFC下。为了测量，可以通过用纯水(例如去离子水和/或蒸馏水)调节浓度来制备NFC样品。

纳米原纤维纤维素水凝胶表现出特有的流变性质。例如，纳米原纤维纤维素水凝胶是剪切稀化或假塑性材料，它们可能被认为是触变行为的一种特殊情况，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度或作用力。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化特性：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性行为，这意味着在材料开始容易地流动之前需要一定的剪切应力(力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制流变仪测定的稳态流动曲线确定。将粘度相对于施加的剪切应力作图时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力是描述材料悬浮能力的最重要流变参数。这两个参数能够非常清楚地区分不同的级别，从而能对级别进行分类。

原纤维和/或原纤维束的尺寸以及纳米原纤维纤维素的其他性质取决于例如原材料、崩解方法和崩解运行次数。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子分散器、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。在存在足够的水以防止纤维间形成键的条件下进行崩解处理。

在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械构件的分散器进行崩解，所述分散器例如是具有至少两个转子的转子-转子分散器。在分散器中，当桨叶以由半径(到转轴的距离)确定的圆周速度和转速以相反方向旋转时，分散体中的纤维材料被转子的桨叶或拱肋从相反方向反复撞击。由于纤维材料在径向上向外转移，其撞在一个接着一个以高圆周速度从相反方向过来的桨叶(即拱肋)的宽表面上；换而言之，其受到来自相反方向的多次连续冲击。同样，在桨叶的宽表面(即拱肋)的边缘处(其边缘与下一个转子桨叶的相对边缘形成桨叶间隙)，出现剪切力，其有助于纤维的崩解并使原纤维脱离。撞击频率取决于转子的转速、转子的数量、各转子中桨叶的数量和分散体通过装置的流速。

在转子-转子分散器中，纤维材料通过反向旋转的转子被引入，并且按照以下方式沿着相对于转子转轴的径向方向向外移动并籍此而同时发生原纤化：所述材料反复受到由不同的反向旋转转子引起的剪切和撞击力。转子-转子分散器的一个实例是Atrex设备。

崩解的合适设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。该设备的一个示例包括外壳，且在所述外壳内具有装配有碰撞表面的第一转子；与第一转子同心并装配有碰撞表面的第二转子，该第二转子被设置为以与第一转子相反的方向旋转；或与第一转子同心并装配有碰撞表面的定子。该设备包括位于外壳中并向转子或转子和定子的中央开放的进料孔，和外壳壁上并向最外部转子或定子的外周开放的出料孔。

在一个实例中，崩解通过使用均质机进行。在均质机中，纤维材料在压力的作用下进行均质化。纤维材料分散体向纳米原纤维纤维素的均质化是由分散体的强制通流引起的，这使得材料崩解为原纤维。纤维材料分散体在给定的压力下通过窄通流间隙，其中，分散体线性速度的增加使分散体受到剪切力和撞击力，导致从纤维材料中移去原纤维。纤维片段在原纤化步骤中崩解为原纤维。

在本文中，术语"原纤化"一般指通过向颗粒作功(work)来机械崩解纤维材料，其中纤维素原纤维从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、碾碎或剪切、或它们的组合，或者能够降低颗粒尺寸的其他相应的作用。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。

经历原纤化的纤维材料分散体是纤维材料和水的混合物，在本文中也被称为“浆(pulp)”。纤维材料分散体一般可指与水混合的全纤维、从中分离的部分(片段)、原纤维束或原纤维，并且，水性纤维材料分散体一般是这些物质的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如取决于同一批次纤维材料在处理过程中进行处理的次数或经历的“轮数”。

表征纳米原纤维纤维素的一种方式是使用含有所述纳米原纤维纤维素的水性溶液或分散体的粘度。粘度可以是例如布氏(Brookfield)粘度或零剪切粘度。如本文所述，比粘度可用于区分纳米原纤维纤维素与非纳米原纤维纤维素。

纳米原纤维纤维素还可以通过平均直径(或宽度)、或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如零剪切粘度。在一个实例中，适用于本文所述产品的纳米原纤维纤维素的数均原纤维直径范围为1-200nm或1-100nm。在一个实例中，所述纳米原纤维纤维素的数均原纤维直径为1-50nm，例如2-20nm或5-30nm。在一个实例中，所述纳米原纤维纤维素的数均原纤维直径为2-15nm，例如TEMPO氧化的纳米原纤维纤维素。

可用多种技术，例如使用显微镜检来确定原纤维的直径。原纤维厚度和宽度分布可以通过显微镜图像的图像分析来测量，例如来自场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)(诸如低温透射电子显微镜(CRYO-TEM))或原子力显微镜(AFM)的图像。一般而言，AFM和TEM，尤其是CRYO-TEM，最适合具有窄原纤直径分布的纳米原纤维纤维素级别。从Cryo-TEM图像中还可以看到束结构。

原纤化程度可以通过纤维分析来评估，其中评估了较大的、仅部分原纤化的实体的数量。例如，在衍生化纳米原纤维纤维素的情况下，每mg干样品中那些颗粒的数量可以在0-10000的范围内，例如在0-5000的范围内，例如在0-1000的范围内。然而，在非衍生化NFC中，每mg非原纤化颗粒的数量通常在0-20000的稍高的范围内，例如在0-10000的范围内，例如在0-5000的范围内。纤维分析可以使用Fiberlab方法进行。

可以通过凝胶的粘弹性测量来评估纳米原纤维纤维素水凝胶的刚度。通常，0.5％(按重量计)纳米原纤维纤维素水凝胶在25±1℃或22±1℃下pH值为7的纯水中的储能模量为1-50Pa，优选2-20Pa。通常衍生的NFC形成更硬的水凝胶，但这些级别的广泛原纤化也可能导致较低的储能模量。

根据一个实例，纳米原纤维纤维素分散体的流变粘度可以在22℃下用装有窄间隙叶片几何结构(直径28mm，长度42mm)的应力受控的旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司(TAInstruments,UK))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在最多2分钟之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当超过1000s^-1的剪切速率时，停止测量。该方法可用于确定零剪切粘度。

在另一个实例中，水凝胶样品的流变测量使用装配有20mm板几何形状的应力控制旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司，UK)进行。在将样品装载到流变仪之后，1mm间隔，不稀释，在开始测量前静置5分钟。测量应力扫描粘度(sweep viscosity)，剪切应力在0,001-100Pa的范围内逐渐增加，频率为10rad/s，应变2％，温度为25℃。可以确定储能模量、损耗模量和屈服应力/断裂强度。

在一个实例中，通过旋转流变仪在0.5重量％(w/w)稠度、22±1℃下、在水性培养基中进行测定，纳米原纤维纤维素(例如在方法中作为起始材料提供的纳米原纤维纤维素)在分散在水中时提供了零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的“平台”)和屈服应力(剪切稀化开始时的剪切应力)，所述零剪切粘度为1000-100000Pa·s，例如5000-50000Pa·s，所述屈服应力为1-50Pa，例如2-15Pa。该纳米原纤维纤维素的平均原纤维直径还可以为200nm或更小，例如1-200nm。

浊度是通常肉眼不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的混浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样柱时的衰减(即，强度的降低)。可以替代使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或JTU)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。

可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。有多种市售用于定量测量浊度的浊度计(turbidometer)。在本公开中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(NTU)。用标准校准样品对测量设备(浊度计)进行校准和控制，然后测量经稀释NFC样品的浊度。

在一种浊度测量方法中，将纳米原纤维纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤维纤维素的胶凝点的浓度，测量稀释样品的浊度。所述测定纳米原纤维纤维素样品浊度的浓度为0.1％。采用具有50mL测量容器的HACH P2100浊度计来进行浊度测量。确定纳米原纤维纤维素样品的干物质，将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，注入自来水至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。对每个容器进行3次测量。从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果单位为NTU单位。

表征纳米原纤维纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度表示原纤维的尺寸小，例如小直径，因为小原纤维对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这种情况发生直到达到某个点为止。当进一步继续原纤化时，原纤维最终开始破裂和缩短，并因此不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都开始下降。

在一个实例中，阴离子纳米原纤维纤维素的浊度低于90NTU，例如3-90NTU，诸如5-60NTU，例如8-40NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。在一个实例中，天然纳米原纤维的浊度甚至可以高于200NTU，例如10-220NTU，诸如20-200NTU，例如50-200NTU，这些数值是通过比浊法在20℃±1℃，0.1％(w/w)稠度条件下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤维纤维素，这些范围可以与纳米原纤维纤维素的粘度范围组合，例如零剪切粘度、储能模量和/或屈服应力。

纳米原纤维纤维素可以是未改性的纳米原纤维纤维素或包含未改性的纳米原纤维纤维素。未改性的纳米原纤维纤维素的排液明显比例如阴离子级别更快。未改性的纳米原纤维纤维素通常在20℃±1℃、0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的布氏粘度为2000-10000mPa·s。

崩解的纤维类纤维素原料可以是改性纤维原料。改性纤维原料是指纤维受处理影响从而使纤维素纳米原纤维更易于从纤维上脱离的原料。通常对液体中悬浮物(即浆)形式存在的纤维状纤维素原料进行改性。

对纤维的改性处理可以是化学、酶促或物理改性处理。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，优选使纤维素分子的长度不受影响但将官能团添加至聚合物的β-D-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性以某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，原则上化学改性不完全，这样纤维素将保持为原纤维的固体形式并且不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合物理性地吸附在纤维素表面上。

尤其，改性后纤维中的纤维素可以带离子电荷。纤维素的离子电荷削弱了纤维的内部键，随后将促进其崩解为纳米原纤维纤维素。可以通过对纤维素进行化学或物理改性来获得离子电荷。与起始原料相比，改性后的纤维可以具有更高的阴离子或阳离子电荷。用于形成阴离子电荷的最常用化学改性方法是氧化(其中羟基被氧化为醛基和羧基)，磺化和羧甲基化。可能需要化学改性引入基团，例如羧基，所述基团可以参与纳米原纤维纤维素和生物活性分子之间共价键的形成。进而，可以通过使阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。

纳米原纤维纤维素可包括化学改性的纳米原纤维纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤维纤维素或阳离子改性的纳米原纤维纤维素。在一个实例中，纳米原纤维纤维素是阴离子改性的纳米原纤维纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤维纤维素是氧化的纳米原纤维纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤维纤维素是磺化的纳米原纤维纤维素。在一个实例中，阴离子改性的纳米原纤维纤维素是羧甲基化的纳米原纤维纤维素。通过纤维素的阴离子改性获得的材料可以称为阴离子纤维素，指与未改性的材料相比，通过改性增加了阴离子基团(例如羧基)的量或比例的材料。作为羧基的替代或者补充，还可以将其他阴离子基团引入纤维素，例如磷酸根基团或硫酸根基团。这些基团的含量范围可以与本文就羧酸所述的范围相同。

可以期望纳米原纤维纤维素具有合适的羧酸含量，例如在0.6-1.4毫摩尔COOH/克的范围内，例如在0.7-1.2毫摩尔COOH/克的范围内，或在0.7-1.0毫摩尔COOH/克的范围内，或在0.8-1.2毫摩尔COOH/克的范围内，该羧酸含量通过电导滴定法测定。

可以将纤维素氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基可以通过杂环硝酰基化合物，例如通过N-氧基介导的催化氧化(例如2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基自由基，通常称为“TEMPO”)进行催化氧化。纤维素β-D-吡喃葡萄糖单元的伯羟基(C6-羟基)被选择性地氧化为羧酸基团。还从伯羟基形成一些醛基。关于这一发现即低氧化程度不能实现足够有效的原纤化而较高的氧化程度在机械破坏处理之后引起纤维素的降解，可将纤维素氧化到一定的水平，即通过电导滴定测定的氧化纤维素中的羧酸含量为0.5-2.0mmol COOH/g浆，或0.6-1.4mmol COOH/g浆，或0.8-1.2mmol COOH/g浆，优选1.0-1.2mmol COOH/g浆。当由此得到的氧化的纤维素的纤维在水中崩解时，它们提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，所述个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。当氧化的浆作为起始培养基时，可以得到在0.8％(w/w)稠度下测得的布氏粘度至少为10000mPa·s、例如在10000-30000mPa·s范围内的纳米原纤维纤维素。

在本公开中无论何时提及催化剂“TEMPO”，很明显所有涉及“TEMPO”的测量和操作都等同地或者类似地适用于TEMPO的任意衍生物或者任意能够选择性催化纤维素中C6碳的羟基基团的氧化的杂环硝酰基自由基。

纳米原纤维纤维素分散体中可包含用于增强制造工艺或者改进或调节NFC或NFC形成的产品性质的助剂。类似的试剂也可以包括在纳米晶体纤维素中。这些助剂可以溶于分散体的液相中，它们可以形成乳液或者它们可以是固体。在制造纳米原纤维纤维素分散体的过程中助剂可以已经添加到原料中，或者添加到形成的纳米原纤维纤维素分散体或凝胶中。助剂也可以添加到NFC产品(即实体)中，例如通过浸渍、喷洒，浸没，浸泡等方法添加到NFC产品中。助剂通常不与纳米原纤维纤维素共价结合，因此它们可以从纳米纤维素基质中释放出来。当使用NFC作为基质时，可以控释和/或缓释这些试剂。助剂的实例包括治疗(药剂)剂和影响纳米原纤维纤维素特性或影响细胞和/或细胞产物性质的其他试剂，例如缓冲剂、表面活性剂、增塑剂、乳化剂、生物活性剂等。在一个实例中，分散体包含一种或多种盐，可添加用以增强最终产品的性能。盐的实例包括氯化物盐，例如氯化钠、氯化钙和氯化钾。盐的含量可以为分散体中干物质的0.01-1.0％(w/w)。也可将NFC产品浸入或浸泡在氯化钠溶液中，例如浸入或浸泡在约0.9％的氯化钠水溶液中。NFC产品中所需的盐含量可以为湿产品体积的0.5-1％，例如约0.9％。可以提供盐、缓冲剂和类似试剂以获得生理条件。

可以包括多价阳离子以获得纳米原纤维纤维素的非共价交联。一个实例提供了纳米原纤维纤维素产品，其包含纳米原纤维纤维素(特别是包括阴离子改性的纳米原纤维纤维素)以及多价阳离子，例如多价金属阳离子，例如选自钙、钡、镁、锌、铝、金、铂和钛的阳离子，其中，所述纳米原纤维纤维素通过所述多价阳离子进行交联。特别是，钡和钙可用于生物医学应用，尤其是，钡可用于标记。根据水凝胶的干含量计算，多价阳离子的量可以在0.1-3％(w/w)的范围内，例如0.1-2％(w/w)。

一个实例提供了一种制备这种水凝胶的方法，该方法包括提供浆料，使浆料崩解直到获得纳米原纤维纤维素，使纳米原纤维纤维素形成水凝胶。

可以将纳米原纤维纤维素原纤化至所需原纤化程度并调节成所需水含量，或以其他方式改性，以使其形成具有本文所述所需特性的水凝胶。在一个实例中，水凝胶中的纳米原纤维纤维素是阴离子改性的纳米原纤维纤维素。

当前应用中使用的水凝胶优选为均质的。因此，制备水凝胶的方法可以包括使包含纳米原纤维纤维素的水凝胶均质化，优选用均质化装置如本文所述的那些进行均质化。利用这种优选的非原纤化均质化步骤，可以从凝胶中除去不连续区域。获得具有对应用而言更好性质的均匀凝胶。这种非原纤化处理对所获得的材料的性质，例如流变性质和/或其他性质有影响。可以进一步对水凝胶进行灭菌，例如使用加热和/或辐射，和/或通过添加灭菌剂，例如抗微生物剂来进行灭菌。如前所述获得的水凝胶可用于形成实体。

本申请公开了纳米原纤维纤维素用于制备本文公开的水凝胶或实体的用途。纳米原纤维纤维素可以是本文公开的任何合适的纳米原纤维纤维素。

纳米晶体纤维素

纳米晶体纤维素是不同于纳米原纤维纤维素的材料，并且具有不同的性质和行为。纳米晶体纤维素是由纤维素通过酸水解产生的，酸水解去除了无定形区域，获得了纤维素的结晶区域。因此，纳米晶体纤维素实际上由晶体纤维素组成，并且其不含纤维素的无定形区域。原纤维长度显著缩短。另一方面，纳米原纤维纤维素包括作为直区段的晶体部分和在原纤维维中提供扭结的无定形部分。纳米原纤维纤维素不是由纤维素通过酸水解产生的。本文所用的纳米原纤维纤维素也并不意味着包括纤维素纳米晶须或其他棒状颗粒，或在常规纤维素制浆工艺中形成的细料，例如在纤维素纤维表面上的少量。

纳米晶体纤维素或纤维素纳米晶体也可适用于本生物反应器和方法。与纳米原纤维纤维素相比，纳米晶体纤维素可以更高的浓度使用，例如浓度为2-8％(w/w)，例如2-6％(w/w)。纳米原纤维纤维素和纳米晶体纤维素可以具有不同的性质并且可以在本用途中提供不同的功能。因此，可能需要将这些材料中的一种用于某些特定应用。可以在制造过程中对两种材料的性质进行控制和调整，从而能够制备所需材料用于特定目的。

在一个实施方式中，纳米结构化纤维素包括或是纳米晶体纤维素。纳米晶体纤维素的数均原纤维直径可以为2-40nm，如2-20nm，数均原纤维长度可以为100nm或更长，高达几微米，如100-400nm。通常10％或更少的材料的颗粒尺寸小于5μm。纳米晶体纤维素可以是由纤维素通过酸水解产生的，酸水解去除了无定形区域，获得了纤维素的结晶区域。因此，纳米晶体纤维素实际上由晶体纤维素组成，并且其不含纤维素的无定形区域。另一方面，纳米原纤维纤维素包括作为直区段的晶体部分和在原纤维中提供扭结的无定形部分。尽管这两种纳米结构化纤维素材料都具有共同的特征和性能，但由于结构差异，这两种材料也可能表现出一些不同的性能。

本文公开的涉及纳米原纤维纤维素的实施方式和实例也可应用于纳米晶体纤维素。例如，水凝胶或实体也可以由纳米晶体纤维素形成。

纳米结构化纤维素实体

本文中所讨论的“实体”，例如“NFC实体”、“单独(的)实体”、“单独(的)NFC实体”或类似表达是指由本文所讨论的纳米结构化纤维素形成的任何合适形式。该实体可以存在或称为主体或水凝胶主体。实体可以悬浮液提供。水凝胶可以是多种形式，例如连续的、部分或完全不连续的，例如球状或细长形式，例如包括不连续形式的多个珠或类似实体，这些实体可以是分离的或(部分)互连的。然而，实体的结构是均质的。实体也可以是由纳米原纤维或纳米晶体纤维素形成的纤维或纤丝，因此这些形式也呈现出纳米原纤维或者纳米晶体纤维素水凝胶的性质，并且不应与其他材料的纤维素纤维或纤维或纤丝混淆。这些实体可以称为三维实体，旨在区分纳米结构化纤维素薄层。

实体的平均(最小)直径可能为100μm或更大，例如平均最小直径为100-5000μm。当实体具有细长形状时，例如纤丝的纤维，可能存在最高平均直径，平均最小直径(例如宽度)可以为200-5000μm，例如500-3000μm。这种细长实体的长度可能为1mm或更长，甚至数厘米，例如1-10000mm。具有球状体或球状形式的实体，如珠、粒料等，可能具有较低的平均直径，如100-500μm，例如150-350μm。

提供这种实体形式的纳米结构化纤维素有助于控制细胞培养的条件。例如，分离的纳米结构化纤维素实体悬浮液的粘度远低于均质纳米结构化纤维素的悬浮液，尤其是纳米原纤维纤维素，其在大多数情况下以粘性水凝胶的形式存在。这使得混合这种粘性悬浮液具有难度，尤其是当浓度增加时。另一方面，分离的实体可以各自具有相对高的纳米结构化纤维素浓度、原纤化程度和/或纵横比，但仍然可以毫无问题地处理它们。对诸如营养物、气体、代谢物和/或细胞衍生产物等物质的迁移等性质而言同样如此，相较于具有大体积的均质纳米结构化纤维素水凝胶，这些物质更容易从分离的实体中释放。分离的实体还使得能够在实体的表面上和/或表面下培养细胞，即包埋的，这在某些情况下可能是期望的。例如，此类情况下，物质交换，包括细胞衍生产物的释放，可以更快和/或更有效。还可以更好地维持产生和释放胞外囊泡等细胞衍生结构的结构，尤其是具有脂质单层或双层的结构。还应注意的是，在应力状态下孵育、培养和/或提供的细胞可能期望使用这种实体。在这种情况下可以保持较高的应力阈值。当细胞在实体上和/或实体中、尤其是在实体内孵育或培养时，细胞可以耐受更高的流速和更强的混合或搅动。这能够提供更高效的灌注反应器和条件、更高效的混合和更高效的细胞衍生产物生产。

一个实施例提供了用于培养细胞的纳米结构化纤维素实体，其包含水性介质和水凝胶主体，所述水凝胶主体包含悬浮在所述水性介质中的所述纳米结构化纤维素产品。纳米结构化纤维素实体可以应用于和/或可以在生物反应器的第一隔室中。水性培养基可以是细胞培养基。在一个实例中，纳米结构纤维素实体是相互连接的。在一个实例中，纳米结构纤维素实体不是相互连接的。纳米结构纤维素实体可以1-90％(w/w)、更特别是40-99％(w/w)或90-99％(w/w)的水含量提供。通常，在这样的水凝胶体或珠中的水含量仍然很高。它们以水凝胶团块或溶胀的微珠的形式存在，而不是固体纤维素颗粒形式存在。即使是喷雾干燥的颗粒也需要在生物反应器中显著膨胀，才能恰当地与细胞相容。

纳米结构化纤维素实体可通过包括以下步骤的方法获得：在第一水性介质中提供纳米结构化纤维素产物以提供水凝胶，并将所述水凝胶与第二水性介质混合以获得在第二水性介质中的水凝胶主体悬浮液。第一和第二水性介质可以是相同或不同的，其中，其可以是相同的介质类型，但其也可以是不同的，例如第一介质是例如细胞储存介质，第二介质是细胞培养基。纳米结构化纤维素实体也可以通过将浓缩的水凝胶或干纳米结构化纤维素造粒以获得颗粒，在水性介质中对颗粒进行水合，并混合水合的颗粒，任选地加入水性介质，以获得水凝胶主体的悬浮液，由浓缩的纳米结构化纤维素水凝胶或由干的纳米结构化纤维素制成。纳米结构化纤维素实体悬浮液的不连续结构可以通过例如简单的显微镜分析或粘度和/或屈服应力测定以及与具有相应纳米结构化纤维素浓度的连续均质水凝胶进行比较来验证。在相同条件下，纳米结构化纤维素实体悬浮液的屈服应力低于相应的连续的均质水凝胶的屈服应度，例如为相同条件下相应的连续的均质水凝胶屈服应力的1-95％。粘度也是如此，这使得纳米结构化纤维素实体悬浮液的处理更容易。

不连续的凝胶结构也可以由浓缩的(例如10-30％w/w)甚至由干燥的纳米结构化纤维素产品制成。当使用干的或浓缩的材料时，首先将样品造粒至合适的尺寸，例如0.1-2mm的平均直径，在水中或细胞培养基中水合，然后使用适当方法活化为连续或不连续形式。平均直径为2-20微米的喷雾干燥颗粒也可用作起始材料。这些类型的不连续凝胶中的受控孔隙率取决于颗粒尺寸和总浓度，即溶胀的凝胶域或凝胶主体之间的距离。

在一个实施例中，水凝胶主体的总体积与纳米结构化纤维素实体悬浮液的总体积的比值为10-99％(v/v)，例如50-95％(v/v)。

一个实例提供了不连续的纳米结构化纤维素实体悬浮液和用于生产该悬浮液的方法，其中，所述方法包括：

-提供如下形式的纳米结构化纤维素产品：

i)均质水凝胶；

ii)均质水凝胶与水性介质的组合；和/或

iii)在水性介质中水合的脱水的凝胶主体或干的颗粒状纳米结构化纤维素产品；和

-在有利于水凝胶均质结构机械破坏的条件下进行混合，以获得纳米结构化纤维素实体的悬浮液，例如作为三维不连续实体的水凝胶主体。

包含三维不连续实体的凝胶主体的体积分数可以为三维不连续主体总体积的50-99％，因此，局部纳米结构化纤维素浓度可以高于或低于总实体浓度。凝胶主体的分数可以容易地进行定性确定，例如通过显微镜下的检查或通过沉淀分析来确定。

术语“三维不连续实体”是指具有三维不连续结构的体系。所述实体包括水性介质和水凝胶主体，所述水凝胶主体包括悬浮在水性介质中的纤维素纳米原纤维和/或其衍生物。术语“三维(3D)”用于区别“二维”，后者是指基于层的体系，例如层细胞培养，所述层具有低厚度。可以在本文讨论的反应器中建立三维体系。

“不连续的”是指实体的异质结构或实体内物理连续性的中断，例如在水性介质中通过水凝胶主体中断或水凝胶主体中和/或水凝胶主体之间通过水性介质中断。通常，不连续材料可包括多个分离物，包括部分分离的主体、域、粒料、颗粒等，其可具有大致球形、椭圆形、细长形等或不均匀形状。多个主体、域、粒料、颗粒等也可能在不连续材料中部分相互连接。不连续是指实质上不均匀的材料。例如，水凝胶的块料或膜并不是不连续的，但是悬浮在液体介质中的多个珠、球状体或类似分离的主体形成了不连续的实体，即使其中一些主体彼此连接。在一个实施方式中，纳米结构化纤维素是分离的主体形式，其可以是水凝胶主体，例如珠。

“水凝胶主体”和“水凝胶域”是指水凝胶的等分、分区、域、组分、部分或剂量，优选具有连续的内部结构。水凝胶主体可以具有明确定义的、不定的、对称的或不对称的形状。本文中使用的“实体”可以指这样的水凝胶主体或域。

当用于三维不连续实体或水凝胶主体时，“悬浮(的)”或“悬浮液”是指水性介质和水凝胶的非均质混合物，其中，水凝胶可以作为分离和/或互连的水凝胶实体存在。

当用于水凝胶实体时，“相互连接/互连的”和“相互连接/互连”是指水凝胶实体相互接触的体系。接触可以是水凝胶实体之间的直接连接，或者水凝胶实体可以是松散连接的。当水凝胶的均质结构被破坏时，例如通过混合破坏，所得的不连续结构可以由不同尺寸和形式的水凝胶实体表征。所得的体系可能包含相互连接的水凝胶实体之间的水性腔室，或者松散连接的水凝胶实体可能“漂浮”在相互接触的水性介质中。水凝胶实体可以通过例如存在于体系中的细胞或其他组分间接连接。

“脱水(的)”或“去水(的)”形式是指从相关材料中去除部分但不一定全部水的材料形式。因此，术语脱水包括例如浓缩的浆、粒料、薄片和粉末。脱水材料的含水量可以为0-90％(w/w)，例如0-80％(w/w)、0-50％(w/w)，1-50％(w/w)、1-40％(w/w)、1-30％(w/w)、1-20％(w/w)、10-50％(w/w)、10-40％(w/w)、10-30％(w/w)或1-10％(w/w)。

培养方法

本文所述的提取、进行培养或培养是指其中细胞衍生产物如生物制品由在纳米结构化纤维素水凝胶材料中孵育和/或培养的细胞产生的过程，并且其中细胞衍生产物随后从纳米结构化纤维素水凝胶中释放用于作为生物活性产物收集，即以活性形式收集。

生物反应器，包括其中所包含的材料，可以用于从培养和/或孵育的细胞中分离细胞衍生产物的方法。该方法也可以是用于培养和/或孵育细胞的方法，和/或用于生产细胞衍生产物的方法。

本申请还公开了生物反应器用于从所培养的细胞中分离细胞衍生产物的用途。本申请还公开了生物反应器用于培养细胞的用途。本申请还公开了生物反应器用于生产细胞衍生产物的用途。

本申请公开了纳米结构化纤维素的用途，特别是作为平均孔尺寸为100-1000nm或中值孔尺寸为0.1-10μm²(如0.3-2.0μm²)的水凝胶，用于通过本文公开的任何方法从孵育的细胞中提取细胞衍生产物。本申请公开了中值孔尺寸为0.1-10μm²(如0.3-2.0μm²)的纳米结构化纤维素的用途，用于采用本文所公开的任何方法从孵育的细胞中提取细胞衍生产物。在一个实施方式中，纳米结构化纤维素是纳米原纤维纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤维纤维素是天然纳米原纤维纤维素，例如，未化学改性的纳米原纤维纤维素，还优选未以酶促方式和/或物理方式改性的纳米原纤维纤维素。中值孔尺寸优选以使用浓度存在于纳米结构化纤维素水凝胶中和/或可从纳米结构化纤维素水凝胶中检测到，所述浓度可以为0.1-8％(w/w)，例如0.2-6％(w/w)或在子范围内，如本文所述。

本公开提供一种用于从所培养细胞中提取细胞衍生产物的纳米结构化纤维素产品，所述产品包括中值孔径为0.1-10μm²(例如，0.3-2.0μm²)的纳米结构化纤维素水凝胶。该产品可以包括天然和/或改性的纳米结构化纤维素。天然纳米结构化纤维素是未化学改性的纳米结构化纤维素，但其还可以是未以酶促和/或物理方式改性的纳米结构化纤维素。可能需要未化学改性的纳米原纤维纤维素用于涉及细胞产物回收的应用，因为化学改性的纳米原纤维纤维素可以含有这样的额外化学基团，其将改变纳米原纤维纤维素的性质并防止或减缓细胞衍生产物的释放和迁移。例如，添加的化学基团可以结合细胞衍生产物，并且/或者与未化学改性的纳米原纤维纤维素相比，原纤维直径将低至使得水凝胶的流变性质和/或孔隙率不太适合本用途。未以化学和酶促方式改性的纳米原纤维纤维素也保持了原始原纤维长度，这对材料的性质有影响。

改性的纳米结构化纤维素可以是化学改性和/或酶促改性的纳米结构化纤维素，如阴离子改性的纳米原纤维纤维素或阳离子改性的纳米原纤维纤维素，可以是物理和/或化学改性，如本文所述。改性等级可用于其中需要对纳米结构化纤维素的性质和/或特性进行改变以用于特定用途的方法，例如用于特定细胞和/或用于特定细胞产品。

产品可以作为包装产品提供，例如包装在小瓶、管、容器、注射器、瓶(bottle)、烧瓶或任何其他适用容器中，通常是密封容器。该材料可以一定浓度提供，所述浓度是使用期间的浓度，或者是适合添加到生物反应器中的浓度，例如本文公开的任何浓度。因此，产品可以是即用型产品。在一个实施方式中，纳米结构化纤维素是纳米原纤维纤维素。

中值孔尺寸在本文中表示为孔隙面积，可以在显微镜下确定，例如由显微镜图像如SEM图像显示。中值孔尺寸描述了水凝胶中可用孔的尺寸，优于平均孔尺寸，因为水凝胶还包含大腔室，这将提高平均孔尺寸值。孔尺寸可以由(内部)孔宽度得出，孔宽度可以是圆柱形孔的直径或狭缝的相对壁之间的距离，这是多孔材料内各种尺寸的空隙空间的代表值。孔径可以是模型中孔的直径，其中，孔通常假设为形状是圆柱形的，并且可以根据通过指定程序获得的数据来确定或计算。其可以是中值孔径，是对应于第50百分位的孔体积的直径，即，发现孔体积的一半为较大孔且一半为较小孔的直径。

纳米结构化纤维素可以是本文公开的任何形式，例如在(均质的)水凝胶中或作为(分离的)实体。细胞和细胞衍生产物可以是本文所公开的任何一种。

所述方法可包括：

-提供生物反应器，

-提供细胞培养基，其优选无血清、无动物来源、无饲养细胞和/或无异种细胞培养基，

-提供细胞，

-在包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室中培养和/或孵育细胞，以形成细胞衍生产物，

-任选地，混合纳米结构化纤维素和细胞；

-允许细胞衍生产物从细胞扩散出去，例如从包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室扩散到细胞培养基中，

-从生物反应器中收获包含细胞衍生产物的细胞培养基，优选通过用于提取包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口进行收获，从而将细胞衍生产物与培养的细胞分离。

最简单地，生物反应器可以包括容器，其中，用于将细胞培养基输入容器的入口和用于从容器输出包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口是相同的，例如容器的开口，例如烧瓶的口14、16。所述容器可以包括包含构造成接收细胞的纳米结构化纤维素的隔室，所述纳米结构化纤维素包括第一分离表面，所述第一分离表面允许包含细胞衍生产物的细胞培养基行进通过第一分离表面，优选从所述出口分离所述纳米结构化纤维素。在这种情况下，第一分离表面可以由纳米结构化纤维素的表面形成。

一个实例提供了一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的方法，所述方法包括：

-提供生物反应器，例如，烧瓶、瓶或类似容器，

-提供细胞培养基，优选无血清、无动物来源、无饲养细胞和/或无异种细胞培养基，

-提供细胞，

-在包含纳米结构化纤维素的隔室中，在生物反应器中，孵育细胞以形成细胞衍生产物，并且任选地混合纳米结构化纤维素和细胞，

-让细胞衍生产物从细胞扩散到细胞培养基中，

-从生物反应器中收获包含细胞衍生产物的细胞培养基，优选通过用于提取包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口进行收获，从而将细胞衍生产物与孵育的细胞分离。

细胞培养基可以是可用于本文公开的生物反应器中的任何适用的细胞培养基。通常，细胞培养基是水性介质，例如水性溶液或分散体，或者提供这样的水性介质以形成细胞培养基，其还可以包含纳米结构化纤维素，例如凝胶形式。细胞培养基可包含适用的能量源和调节细胞周期的化合物。培养基可以包含氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖的补体，并且可以含有血清作为生长因子、激素和附着因子的来源。除了营养物质外，培养基还有助于保持pH值和渗透压。

优选地，细胞培养基不包含或仅包含痕量的其它类型的细胞衍生材料。“痕量”可指小于0.5％(w/w)、小于0.1％(w/w)，小于0.05％(w/w)或小于0.01％(w/w)的量，或使用检测或鉴定特定生物化合物的常用方法(如免疫学方法)无法检测到的量。细胞培养基优选无血清、无动物来源、无人类来源、无血液来源、无饲养细胞和/或无异种细胞培养基，“无饲养细胞”是指细胞培养基和/或条件，其中，不存在饲养细胞，例如，其中，细胞在不含饲养细胞层的情况下进行培养。这种培养基优选仅含有所需细胞培养(例如干细胞培养)需要的必需细胞培养化合物。在细胞培养期间，也可以在最后一步，即在允许细胞衍生产物从细胞扩散之前，将培养基改变为这样的培养基。

孵育也可以指培养和/或维持细胞，其通常进行一段足以从细胞中获得细胞衍生产物的时间。一般来说，本文所用的“培养”指的是孵育。细胞可以在允许细胞产生细胞衍生产物的条件下，或在促进所选或所需的细胞衍生产物产生的条件下进行孵育。条件可能包括例如合适的时间、合适类型的细胞培养基、合适类型和/或浓度的纳米结构化纤维素和/或合适的温度。还可以添加一种或多种促进所需细胞衍生产物产生的物质，例如将该物质添加到细胞培养基中。

由生物反应器型的培养体系中孵育或培养的细胞中生产细胞衍生产物(例如EV)可以以不同的方式进行，可以利用混合，例如搅拌。生物反应器可分为多个隔室，例如通过使用结构进行划分，例如膜，如半渗透膜，该膜对于包含细胞衍生产物的细胞培养基可渗透且对细胞和纳米结构化纤维素不可渗透。细胞可以在第一隔室中，该第一隔室可以称为静态隔室和/或其中细胞基本固定，并且培养基流动设置在膜的另一侧上和/或穿过膜的另一侧，优选在第二隔室处和/或到达第二隔室，或在另一隔室处和/或到达另一隔室。可以从第二隔室和/或从另一隔室收获细胞衍生产物。这种生物反应器可以以各种尺寸实施，例如通过使用装有膜插件的细胞培养孔，例如产品，如Transwell细胞培养插件，通过使用细胞培养瓶或瓶，或者通过使用大容器来实施。

该方法可以包括：提供纳米结构化纤维素，例如以本文所讨论的任何合适形式；提供细胞，例如本文讨论的任何适合的细胞；以及将纳米结构化纤维素与细胞组合。纳米结构化纤维素和细胞可以在将组合或混合物施用至反应器中之前进行组合，或者可以首先将纳米结构化纤维素施用至反应器中，然后将细胞施用至反应器。对于纳米结构化纤维素和/或细胞，这可以分批或连续进行。纳米结构化纤维素和细胞可以作为悬浮液提供。

该方法可以包括将细胞包埋或允许细胞包埋在纳米结构化纤维素实体中。这可以包括允许细胞进入实体。这可以通过以允许细胞进入的形式和/或组成(例如以合适浓度)提供实体来控制，所述实体包括具有原纤化程度和/或化学组成或允许其进入的其他性质的纳米结构化纤维素。例如，可以使用较低浓度的纳米结构化纤维素和/或较低的原纤化程度和/或较低的纵横比来获得对细胞更具渗透性的实体或水凝胶。以类似的方式，可以使用更高的浓度、原纤化程度和/或纵横比来防止或限制细胞进入实体或水凝胶，因此，细胞可以在实体或水凝胶的顶部/表面上和/或实体表面的正下方进行培养。在这种情况下，该方法可以包括将细胞附着或允许细胞附着至纳米结构化纤维素实体的表面和/或将细胞封装或包埋在纳米结构化纤维素内。

纳米结构化纤维素可以具有合适的孔隙率程度，这有助于将细胞包埋到材料中，也有助于物质的交换，例如液体流动和/或细胞衍生产物(特别是囊泡形式)的迁移。孔隙率特别允许将细胞封装在纳米结构化纤维素内。平均孔尺寸可以是数均孔尺寸。孔隙率也可以表示为孔面积，其可以是中值孔尺寸。在一个实施方式中，纳米结构化纤维素的中值孔尺寸为0.1-10μm²，例如0.3-2.0μm²。这可以通过提供具有合适的原纤维尺寸和纵横比、原纤化程度、改性程度和/或水凝胶浓度的纳米结构化纤维素来获得。已经发现，在所述范围内的纳米结构化纤维素水凝胶的孔隙率下，细胞被有效固定在纳米结构化纤维素基质中，但细胞衍生产物很容易从细胞和水凝胶中释放，并且可以毫无问题地进行分离和回收。囊泡型细胞衍生产物的结构和细胞衍生产物类型通常不会改变。此外，细胞保持其所需的表型，并且在孵育(如混合和/或流动)期间可以耐受机械应力。

纳米结构化纤维素实体可以是本文讨论的任何实体，例如珠或类似物，例如微珠。大多数纳米结构化纤维素实体的体积中值颗粒尺寸可以为10-1000μm。微珠或其他类似的球状或球状体实体的体积中值颗粒尺寸可以为50-500μm。这样的珠和类似物可以通过使用微流体体系、电喷涂或印刷或分配来形成。

通过使用本文讨论的纳米结构化纤维素和生物反应器，该方法可以按连续或半连续方法实施，因此可以在相对较长的时间内，例如数周或者甚至数月，维持细胞衍生产物的生产。可以提高生产率并保持在高水平，而细胞衍生产物的生产率或质量没有显著变化。细胞可以保持在所需状态，例如表现出所需表型，并且可以保持细胞衍生产物的类型，从而在整个生产期内可以获得相同种类的细胞衍生产物。

在一个实施方式中，该方法是连续的方法，其可以包括半连续方法，其中，分批收获细胞衍生产物并且以规则间隔添加新培养基。然而，特别是在完全连续的方法中，在收获细胞衍生产物之前，需要使细胞或细胞载体或基质沉淀，或将其与培养基分离，或停止流动、混合或搅拌。不需要改变体系或培养的温度或其他条件。因此，细胞在该过程期间不会受到威胁或干扰，因为其可以连续接收氧气和营养，并且不会被包装或以其他方式经受到额外机械力或环境中的其他突然变化。细胞衍生产物的生产在连续生产期间并不会停止或减缓，因此保持了工艺效率以及所生产产物的恒定质量。

在一个实施方式中，该方法包括以与从生物反应器收获包含细胞衍生产物的细胞培养基的速率相等的速率，将新细胞培养基添加到生物反应器中。

图1显示了包括容器12的生物反应器10设置的示例，容器12划分为第一隔室18和第二隔室22，并且第一表面20包括孔尺寸为0.4-3μm的可渗透膜。第一隔室18包含纳米结构化纤维素和细胞的分散体26，并且装有混合器24。纳米结构化纤维素和细胞的分散体26可以经由第一入口14输送到第一隔室中，细胞培养基可以经由第二入口15输送到第一隔室中。富含细胞衍生产物的培养基通过表面20处的膜分离到第二隔室22中，并且可以通过出口16从容器中输送出来。

在一个实例中，细胞在纳米结构化纤维素中混合，以获得混合物，该混合物可能处于所需浓度。混合物，即整个培养体系，例如用混合器或搅拌器(例如包括舵的混合器或搅拌器)进行混合或搅拌，以促进和/或保持均匀混合。也可以在不使用或不提供混合器或搅拌器的情况下获得混合。

在一个实例中，该方法以分批方法进行，例如在例如12-72小时的短时间内分批生产细胞。在该情况下，搅拌可能不是必须的。在一个实例中，使用连接至摇摆基座的生物反应器，例如WAVE生物反应器。该体系并不进行搅拌并且不包含搅拌器，但是通过以摇摆方式移动生物反应器来获得混合，该生物反应器可以包括包含细胞培养物和纳米结构化纤维素的器皿或容器，例如袋。摇摆运动在细胞培养基中诱导波浪，以提供混合和氧气转移。

细胞可以与纳米结构化纤维素水凝胶或分散体混合，因此在该选择中，纳米结构化纤维素并未作为单独的实体存在。将细胞和纳米结构化纤维素混合并在细胞培养基中形成混合物，更具体地，形成均匀混合物或基本均匀的混合物。该混合物可以是水凝胶形式。细胞可以在纳米结构化纤维素内进行培养，而无需规范细胞/纳米结构化纤维素的相互作用或形态。

在一个实施方式中，细胞包埋在纳米结构化纤维素实体中并且/或者附着至纳米结构化纤维素实体表面。使用该实体并以选定的方式将细胞与实体结合有利于且有助于控制细胞培养，细胞孵育，细胞衍生产物形成和/或释放，营养物质、液体和/或气体交换等性质。可以在第一隔室和第二隔室之间使用具有更高孔尺寸的结构或其他装置，以促进介质的流动，因为实体不能通过孔。通过使用实体，可以促进细胞和纳米结构化纤维素混合物的混合，因为实体的悬浮液具有相对低的粘度。

图2显示了包括容器12的生物反应器10设置的示例，容器12划分为第一隔室18和第二隔室22，并且第一表面20包括孔尺寸为0.4-3μm的可渗透膜。第一隔室18包含纳米结构化纤维素实体和细胞的悬浮液28，并且装有混合器24。纳米结构化纤维素实体和细胞的悬浮液28可以经由第一入口14输送到第一隔室中，并且细胞培养基可以经由第二入口15输送到第一隔室中。富含细胞衍生产物的培养基通过表面20处的膜分离到第二隔室22中，并且可以通过出口16从容器中输送出来。

在一个实例中，胞外囊泡(EV)的生产过程如下。将纳米结构化纤维素与培养基和细胞混合至最终浓度，以获得细胞和纳米结构化纤维素的混合物。将细胞和纳米结构化纤维素的混合物添加到生物反应器中。细胞和纳米结构化纤维素的混合物通过在培养期间添加新培养基来保持或者将其移除(例如虹吸)并用新鲜细胞和/或纳米结构化纤维素替换。让细胞产生EV并分泌至培养基。当去除富含EV的培养基时，可以向体系添加新的培养基。可以等于添加新培养基的速率收获富含EV的培养基，其中，渗透膜将从富含EV的培养基中分离细胞和纳米结构化纤维素。

图3显示了生物反应器设置的一个实例，包括培养基入口1，用于使喂养细胞的新培养基进入容器；和出口4，用于交换用过的培养基，以及用于从培养物中分离EV或其他细胞衍生产物。该容器包括可渗透膜2，该可渗透膜仅允许培养基扩散进出细胞以喂养细胞，例如用于允许培养基消散到培养室中。一些EV能够通过此处的膜出来，但这些EV可以通过出口端口4收集。与NFC 3混合的细胞在隔室/培养室中，但也可以使用纳米晶体纤维素替代。NFC可以是例如0.5％(w/w)的连续水凝胶或微珠。如应用需要，可以存在入口和/或出口5，以允许交换包埋在NFC中的细胞。分离可渗透的膜或网状物6允许从细胞中过滤细胞产物。网状物膜的孔尺寸可以为0.4-3.0μm。生物反应器包括用于过滤以分离EV的细胞产物的出口7。如果应用需要，可以使用柱塞8来压缩细胞和NFC。出口4和7包括截止尺寸为0.22μm的过滤器。因此，该实例包含两个出口，其中，下部出口4可主要用于交换培养基，上部入口可主要用于分离和回收细胞衍生产物。

在一个实施方式中，纳米结构化纤维素是单独实体的形式，例如水凝胶珠、多孔珠、纤维、纤丝和/或膜。这能够控制反应器中的纳米结构化纤维素，并且还可以促进气体和/或液体与细胞的交换。此外，可以进一步控制培养，因为细胞可以在实体顶部或表面上培养，或者可以允许渗透并包埋于实体。在反应器中混合培养物可能更容易和/或更高效。

在另一实例中，将细胞接种在纳米结构化纤维素实体的顶部上并培养为粘附细胞，和/或将细胞包埋在纳米结构化纤维素实体内。这些实体可以是珠或类似的基本球状形式，也可以是细长的实体，如纤维或纤丝。混合物，即整个培养体系，例如用混合器或搅拌器(例如包括舵的混合器或搅拌器)进行混合或搅拌，以促进和/或保持均匀混合。也可以在不使用或不提供混合器或搅拌器的情况下获得混合，如前文所讨论。

在一个实例中，在实体(如珠)顶部上产生细胞的过程如下。纳米结构化纤维素以实体提供或制备成实体，例如微珠，与培养基和细胞混合至最终浓度，以获得细胞和纳米结构化纤维素实体的混合物。将细胞和纳米结构化纤维素实体的混合物添加到生物反应器中。让细胞产生EV并分泌至培养基。细胞和纳米结构化纤维素实体的混合物通过在培养期间添加新培养基来保持或者将其移除(例如虹吸)并用新鲜细胞和/或纳米结构化纤维素实体替换。当去除富含EV的培养基时，可以向体系添加新的培养基。可以等于添加新培养基的速率收获富含EV的培养基。可使用渗透膜或半渗透膜从富含EV的培养基中分离细胞和NFC实体。

在一个实例中，产生包埋于纳米结构化纤维素中的细胞的过程如下。纳米结构化纤维素与培养基和细胞混合，然后形成为实体如微珠，或者形成为其他形式，例如使用挤出方法进行。将细胞和纳米结构化纤维素实体的混合物添加到生物反应器中。让细胞产生EV并分泌至培养基。细胞和纳米结构化纤维素实体的混合物通过在培养期间添加新培养基来保持或者将其移除(例如虹吸)并用新鲜细胞和/或纳米结构化纤维素实体替换。当去除富含EV的培养基时，可以向体系添加新的培养基。可以等于添加新培养基的速率收获富含EV的培养基。可使用渗透膜或半渗透膜从富含EV的培养基中分离细胞和纳米结构化纤维素实体。

或者，生物反应器可以是纳米结构化纤维素/培养基与珠或凝胶(基于摇轴的顶部)的槽，从而产生混合。

在一个实例中，生物反应器用包括可调节体积的容器(例如波纹管瓶)来实现，其中，容器包括能够以机械方式操纵以改变部件(波纹管)体积的部件。容器可以由弹性材料制成或包括由弹性材料制成的部件，所述弹性材料为例如塑料、弹性体等。将细胞培养基中的细胞和纳米结构化纤维素(例如纳米结构化纤维素实体)放置在容器中，并且改变容器的体积，从而在容器中产生培养基流动并混合容器的内容物。外部致动器可以提供并设置成以操纵容器的可调节体积部分，例如自动地和/或由控制单元进行控制。致动器可以连接到容器或隔室中的可移动部件，例如活塞、柱塞等，或者连接到容器或隔室的可变形部分如波纹管等。这种设置的实例提供了在波纹管瓶中通过使用NFC水凝胶纤维生产自动胞外囊泡，所述NFC水凝胶纤维通过结合分离的纳米结构化纤维素原纤维而形成，所述波纹管瓶包括控制器和用于操作波纹管瓶的机械装置，其由弹性材料制成。当波纹管进行拉伸或释放以获得最大体积的容器时，波纹管填充有细胞培养基，但波纹管上方的尼龙网状物防止细胞和纳米结构化纤维素纤维进入波纹管部分。当波纹管加压时，液体从波纹管进入上部隔间，并且混合其中的内容物。当需要时，容易从包含细胞的纳米结构化纤维素纤维分离富含EV的培养基。

因此，用于混合的装置可以包括混合器，该混合器可以是机械混合器，其可以完全或部分地在隔室中；或者用于混合的装置可以包括用于提供介质流动的装置，或者/例如用于改变、更改或以其他方式调节容器体积或隔室体积的装置，例如重复增加和减少体积，即以脉冲方式，如前文所述。当使用不包括混合装置(例如混合器)与细胞和/或纳米结构化纤维素接触的这种混合装置时，在该过程期间可以保护细胞和/或细胞衍生产物免受机械应力。

在一个实例中，生物反应器在烧瓶中实施，如图6所示的细胞培养瓶。培养瓶可划分为具有一个或多个膜20、30的隔室，例如具有用于营养物和细胞衍生产物交换的合适截止尺寸的半渗透膜20，该半渗透膜在孵育期间位于细胞隔室18(第一隔室)上方，并分隔细胞培养隔室(第一隔间)与第二隔室22，所述第二隔室用作细胞衍生产物隔室。还可以有用于气体交换的另一表面30、膜或类似结构，其可以在第一隔室18的与第一表面不同的一侧处，例如在孵育期间在细胞隔室下方，例如，如图6的硅酮膜30。在这种类型的生物反应器中，也可以使用纳米结构化纤维素水凝胶和单独的纳米结构化纤维素实体。可以通过提供气体隔室(第三隔室)34来促进气体交换，气体隔室34通过所述第二膜30由细胞隔室18分隔开，并且可以用作氧气供养室(oxygen support chamber)，并且例如可以包括具有气体管道的供养材料(support material)。图6还显示了气体交换管32，其设置在培养瓶外侧和气体隔室34之间。如果需要，管32或类似的管也可以用作用于培养基的入口，例如当这种入口管设置在第一隔室上方或设置到第一隔室中时。培养基可以替代地或附加地从培养瓶的瓶口输入，因此培养瓶的瓶口可以用作入口14和/或出口16。培养瓶可以是摇瓶，并且该方法可以包括摇晃该摇瓶。然而，通过其他装置和方法，例如如本文所述的那些，例如通过提供流动通过入口和出口的液体，可以设置使细胞培养基流动和/或混合到培养瓶。

包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室可以是容器的单独单元。该单独单元可以是或包括另一容器，即第二容器，其可以在第一容器内部，或者可以在第一容器外部。例如，该第二容器可以是固定床反应器，如图7所示。图7A显示了固定床类型的设置，其包括用于接收和/或培养细胞的固定床材料18。固定床材料18包括纳米结构化纤维素，例如，如本文所公开的单独实体的形式。液体(如细胞培养基)的流动设置为从入口14通过固定床到出口16，因此可以提供培养基的进料和细胞衍生产物的收获，如图7A所示。固定床可设置在容器12中或第二容器36中(图7B)。容器可以包含用于液体的入口(进料)和出口(收获)，所述入口(进料)和出口(收获)直接通向和/或连接到另一容器12。第二容器36可以包括第一表面20，用于将包含来自细胞的细胞衍生产物的细胞培养基提供到出口，该第一表面可以包括膜或其他适用结构或表面。第二容器36还可以包括一个或多个其他膜、网状物或其他结构，用于保持固定床并允许液体、气体和细胞衍生产物通过。

单独容器36中的固定床18可以连接到容器12，例如生物反应器的容器和/或可以用作调节器皿的其他容器，如图7B所示。固定床通过用于输送液体或允许液体流动的管、软管或类似结构连接到容器。细胞培养基可以用泵40在体系中循环，使其流动通过固定床18并从固定床的出口流动到容器12，所述容器12设有混合器24，并且培养基在其中进行混合。可以在容器12中交换气体，从而可以释放38废气并且可以输入39新的气体。还可以将新的培养基进料至容器中，并且可以从容器12中收获细胞衍生产物。细胞培养基可以进一步循环回到固定床的入口。

或者，固定床18可以在容器12内部，如图7C所示，图7C显示了其中入口14设置到固定珠18中的设置，固定珠18通过表面20可渗透到容器12中的周围培养基。出口16设置在培养基中，该培养基可以用混合器24混合。

在一个实施方式中，生物反应器是灌注型生物反应器。在该情况下，所述方法可以包括灌注细胞培养。灌注生物反应器能够连续生产细胞衍生产物。灌注是上游加工，其将细胞保留在生物反应器内，同时不断清除细胞代谢的细胞废弃产物和缺乏营养的培养基。以与去除用过的培养基相同的速率，向细胞提供新鲜培养基。一种实现灌注的方式是使用中空纤维过滤，但也可以使用本文公开的其他设置，例如固定床类型的设置。灌注方法可以包括提供细胞培养基流动通过包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室。相应地，灌注型生物反应器可以包括用于提供细胞培养基流动通过包含纳米结构化纤维素和细胞的隔室的装置。

纳米结构化纤维素特别适用于灌注型细胞培养方法，例如用于能够灌注的生物反应器，例如膜基生物反应器或其他适用的能够灌注的技术。通过不断用新鲜培养基饲养细胞并去除用过的培养基，同时保持细胞在培养时产生大量浓缩的外泌体，灌注支持延长时间的细胞培养。纳米结构化纤维素水凝胶可用于填充固定床或中空纤维灌注型生物反应器，用于大规模细胞培养生产，特别是外泌体生产，因为灌注支持连续培养和减少血清/因子需求。

通过以酶促方式来降解纳米结构化纤维素，例如通过提供一种或多种纤维素酶并允许纳米结构化纤维素降解以释放细胞，可以从纳米结构化纤维素释放细胞。细胞和/或降解的纳米结构化纤维素可以进行分离并且任选地收获和/或回收。这可以用于扩增细胞培养物，或者用于收集细胞用于下游加工，例如用于分析和/或分离RNA、DNA和/或蛋白质。

本申请提供了用本文所公开的方法获得的胞外囊泡。与现有技术的方法(例如2D方法和/或使用不同基质材料和/或设置的方法)相比，通过使用本文材料和方法获得的胞外囊泡具有更窄的尺寸(直径)分布，并且通常还具有更密集的分布和/或更高的生物活性。例如，如图9A和B以及图13A和B所示，囊泡的数均直径可以是200nm或更小，更特别地是150nm或更小或130nm或更小，例如90-200nm、90-150nm、90-130nm、100-200nm，100-150nm或100-130nm。胞外囊泡的直径通常与测量技术无关，并且可以例如通过显微镜和/或使用其他技术和装置来确定。胞外囊泡的直径/大小和/或颗粒分布可以通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)来确定，从而获得液体悬浮液中的颗粒尺寸分布，所述纳米颗粒跟踪分析(NTA)是一种结合激光散射显微镜和布朗运动特性的表征技术。例如，NanoSight仪器(英国马尔文)可用于EV领域的NTA，该仪器装有一个或多个激光器和连接到数码相机的光学显微镜。根据制造商，NanoSight能够对溶液中10-2000nm的颗粒进行表征。颗粒通过其在激光照射下散射的光来可视化，并监测其布朗运动。NTA软件通过跟踪单个颗粒的均方位移，并且从而使用Stokes-Einstein方程计算其理论流体动力学直径，来实现单个颗粒的尺寸确定。在了解所分析样品体积的基础上，NTA还允许估算颗粒浓度。(Beate Vestad、Alicia Llorente、AxlNeurauter、Santosh Phuyal、Bente Kierulf、Peter Kierulf、Tore Skotland、KirstenSandvig、Kari Bente F.Haug&(2017)通过纳米颗粒跟踪分析对胞外囊泡的尺寸和浓度进行分析：变异研究(Size and concentration analyses ofextracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis:a variation study)，《胞外囊泡期刊》(Journal of Extracellular Vesicles)，6:1，DOI:10.1080/20013078.2017.134087)。

例如，可以使用装有488nm激光器、高灵敏度sCMOS相机和注射泵的NanoSightNS500仪器(Malvern Instruments，Amesbury，UK)进行分析。样品可在0.02μm过滤的PBS中稀释20±50倍，以获得108-109个颗粒/毫升的浓度。可以用NTA软件(版本3.1Build3.1.54)进行分析，每个样本(一式三份)使用60秒的视频捕获，并且注射器泵速度为20。可以将相机级别设置为14，并且将检测阈值设置为3。

实施例

实施例1

对本文公开的不同生物反应器设置进行测试。用显微镜测定源自桦树(GrowDex)的化学天然纳米原纤维纤维素的0.5％(w/w)水凝胶的原纤维直径。图4显示了用于不同应用、特别是提取胞外囊泡的最有用材料的结果。

图4A显示了所用的GrowDex来源的纳米原纤维纤维素中的原纤维直径分布。图4B显示了水凝胶的SEM图像，其中可以看到孔尺寸和形状。图4C和4D显示了水凝胶的孔尺寸分布。

类似地，研究了桦树(GrowDexT)来源的带负电荷的纳米原纤维纤维素的0.5％(w/w)水凝胶，相应的结果如图5A-5D所示。

用以下方法进行扫描电子显微镜(SEM)。在冲洗之前，用2％甲醛和2％戊二醛将0.5重量％的水凝胶(无细胞或有细胞)固定在0.05M的二甲氧基酸缓冲液中至少24小时。水凝胶用去离子水(DIW)洗涤两次以去除固定剂，然后通过用尖头剃须刀片切割插件的底部网状物，小心地从其生长插件中去除。将样品放置在10mm盖玻片上(网状物侧朝下)，轻轻去除多余的水，然后样品在液氮冷却乙烷中进行急冻。随后，将样品在EMITECHK775X液氮冷却冷冻干燥机(Quorum Technologies)中冷冻干燥过夜。使用银-DAG(TAAB)将Melinex盖玻片安装在铝SEM桩上；使用网状物/样品底部边缘周围的少量银-DAG将样品固定在盖玻片上并确保导电性。然后，使用EMITECH K575X溅射涂布机(QuorumTechnologies)用35nm金和15nm铱涂覆样品。样品在2keV的加速电压和50pA的探针电流下，在FEI Verios 460扫描电子显微镜中进行观察。图像以二次电子模式，使用EverhartThornley检测器(ETD)，或浸没模式的Through Lens检测器(TLD)来采集。原纤维直径和孔尺寸由图像测定。

实施例2

在本实施例中，结合图6所示类型的CELLine Adhes 1000(CLAD1000)烧瓶，获得了3D实验细胞培养模型，从而在模拟皮肤细胞微环境的条件下研究由源自脂肪的干细胞外泌体的外泌体释放和通过人类真皮成纤维细胞摄取。一般来说，可以从细胞培养物上清液中开发出一种安全、简单、经济高效的外泌体生产体系。

所用的CELLine烧瓶包括由膜(营养物质膜)形成的第一表面20和用于气体交换的另一表面30(气体膜)，在用于细胞的表面之间形成隔室18(培养室)。在气体膜下方和烧瓶底部之间形成氧气供应室，该氧气供应室包含一个或多个氧气供应孔洞。在烧瓶中设置有气体交换管32(培养室端口)。气体膜可以用琼脂糖凝胶层涂覆。

所用的方法和方案

水凝胶制备

本研究使用两种细胞系，包括小鼠胚胎来源的脂肪祖细胞(APC)和人类真皮成纤维细胞(HDF)。根据初步测试，发现与实施例1中使用的材料相对应的0.2％(w/w)和0.5％(w/w)未化学改性的木材纳米原纤维纤维素(NFC)水凝胶(UPM Biomedicals，芬兰)分别代表APC和HDF的最佳浓度。

细胞培养

2D培养：Adult-HDF(人类真皮成纤维细胞)购自ScienCell，小鼠3T3-L1脂肪祖细胞(APC)购自ZenBio股份有限公司。HDF和3T3L1细胞均在杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium，DMEM)(隆撒公司(Lonza)，瑞士)中培养，该培养基补充有1％l-谷氨酰胺(隆撒公司(Lonza))、0.5％青霉素/链霉素(Gibco生命技术有限公司(Gibco LifeTechnologies)，英国)和10％FBS(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，美国)。

3D培养：将HDF和APC细胞悬浮液(对于0.2％(w/w)和0.5％(w/w)NFC，分别为2.5×10⁴和1×10⁵个细胞/毫升)缓慢添加到稀释的NFC水凝胶中，并使用移液管尖端进行小心混合，以使细胞均匀分散。将获得的水凝胶(100μl)转移到超低附着96孔板(西格玛奥德里奇公司，美国)的孔中，在37℃下孵育30分钟后，将标准培养基添加到水凝胶的顶部。每2-3天更换一次培养基。

CELLine AD(粘附)1000烧瓶培养(生物反应器)：APC(3T3L1)使用CELLine AD(粘附)1000烧瓶(Integra Biosciences AG)培养并扩增。简言之，以2.5×10⁶个细胞的初始密度将3T3L1细胞接种在补充有1％l-谷氨酰胺(隆撒公司)、0.5％青霉素/链霉素(Gibco生命技术有限公司，英国)和0.5％外泌体贫化的胎牛血清(FBS)(赛默飞世尔科技公司，美国)的15ml杜氏改良伊氏培养基(DMEM)(隆撒公司，瑞士)中，置于细胞隔室中。外部腔室填充有1000ml DMEM，所述DMEM补充有1％l-谷氨酰胺、0.5％青霉素/链霉素和10％FBS(赛默飞世尔科技公司，美国)。对于单独的生物反应器对照测量，在5、7、10和14天后从细胞隔室收集细胞调节培养基，并且随后用于外泌体纯化。每五天更换一次来自培养基隔室的经补充培养基。所有细胞培养方案均在37℃下、湿润的5％CO₂环境中进行。

NFC-CELLine AD(粘附)1000烧瓶培养(NFC生物反应器)：对该步骤进行与生物反应器培养相同的方案，但在将细胞接种到细胞隔室内之前，用4ml 0.5％琼脂糖(西格玛奥里奇公司(Sigma-Aldrich))覆盖表面1小时。然后，将15ml含有2.5×10⁶个3T3L1细胞的0.2％稀释的NFC加入细胞隔室中。

细胞活力评估

使用3D细胞活性评估(普洛麦格公司(Promega))测量细胞活性。简言之，将一定体积的/>3D试剂添加到96孔板中的等体积细胞培养基中。将内容物混合并在室温下孵育25分钟。用分光光度计(Hidex Plate Reader，芬兰)测量样品发光的总ATP含量。

外泌体分离

为了由2D培养分离外泌体，在70％融合度时，细胞用PBS洗涤一次，并替换补充有0.5％外泌体贫化的胎牛血清的生长培养基。所有细胞培养方案均在37℃下、湿润的5％CO₂环境中进行。24小时后收集培养物上清液用于外泌体分离。

对于使用NFC的3D培养，细胞在5天后用PBS洗涤一次，并用补充有0.5％外泌体贫化的胎牛血清的生长培养基进行替换。在24小时后，收集培养物上清液。

对于生物反应器和NFC生物反应器培养，在5、7、10和14天后从细胞隔室收集全培养物上清液(15-20ml)，并替换新鲜上清液。

收集的经调节培养基(来自2D培养、NFC中的3D培养、生物反应器培养和NFC生物反应器培养)随后以300g离心10分钟，从而去除细胞碎片。然后将上清液转移到新的15ml锥形管中，并以2000g离心20分钟以分离凋亡体。随后，将上清液转移到无菌超净管(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)中，并在Beckman Coulter Optima^TML-80XP超级离心机中进行离心，通过在10000g下离心40分钟来分离微囊泡。此后，再次收集上清液并以100000g离心90分钟，以使外泌体成粒。将所得外泌体颗粒重悬于1×PBS中，并储存在-80℃下以备将来使用。所有方案均在4℃下进行。

外泌体表征

在实验中使用外泌体之前，通过透射电子显微镜(TEM)评估所分离外泌体的形态，通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)仪器评估颗粒分布和尺寸，并通过蛋白质印迹评估外泌体标记。TEM和NTA分析由赫尔辛基大学通过EV核心进行。

蛋白质印迹分析：外泌体和细胞裂解物样品在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(cocktail)(Cell Signaling，马萨诸塞州丹弗斯)的RIPA缓冲液(5mM EDTA，150mM NaCl，1％NP40，1％脱氧胆酸钠，1％SDS20％溶液，50mM Tris-HCl，pH 7.4)中裂解，加热至95℃5分钟，随后在冰上进行冷却。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞科学公司(ThermoScientific Pierce),美国伊利诺伊州罗克福德)来测量样品的总蛋白质浓度，并使用分光光度计(Hidex Plate Reader，芬兰)在562nm下进行分析。样品(每孔30μg蛋白质)在1D十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)12％凝胶上进行分离。将蛋白质转移到PVDF膜(BioRad Laboratories，加利福尼亚州赫拉克勒斯)上，封闭在PBS-T(0.5％吐温-20)中的5％脱脂奶粉中，并用外泌体特征标记物抗体CD9、CD81和HSP70(1:500，均来自系统生物学公司(System Biosciences)，加利福尼亚州帕洛阿尔托，https://www.systembio.com)探测过夜。膜在TBS-T中洗涤三次，5分钟，以冲洗掉残留的一抗，并使用其相应二抗以1:20000的稀释度进行探测。通过ECL Prime蛋白质印迹检测试剂(Advansta，美国)和BioradChemidoc MP成像系统对信号进行可视化。

外泌体标记和摄取

通过BCA测定法对所分离外泌体的总蛋白质浓度进行测量。用PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒(西格玛奥德里奇公司)对纯化的外泌体进行荧光标记，并用Amicon 10kDaMWCO(西格玛奥德里奇公司)去除多余的染料。然后，外泌体以约1μg蛋白质/μl的浓度重新悬浮在PBS中。测量来自各样品(Hidex Plate Reader，芬兰)的等量的标记外泌体的荧光强度(Ex 530，Em 590)，然后对各条件下活细胞总数的差值进行校正。

对于外泌体摄取评估，在与水凝胶混合之前，用1,1'-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(Dil)染料(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，美国)对细胞进行荧光标记，孵育5天，然后用PHK67标记的外泌体(100μg/ml)孵育48小时。对于旋转盘显微镜，使用μ-Slide 8孔未涂覆腔室(伊比迪公司(Ibidi)，德国)和外泌体分离超低附着6孔板(西格玛奥里奇公司，美国)(摄取评估图像如图12所示)。

结果

结果表明，从7天起，与2D和NFC培养相比，使用生物反应器可以显著提高细胞增殖率，而在10天之后，使用与NFC结合的生物反应器培养可以甚至更多地提高该增殖率(30％)。有趣的是，观察到与其他培养方法相比，使用与NFC结合的生物反应器可以显著促进第10天的外泌体生产。这证明细胞可以在NFC水凝胶中储存和/或孵育相对较长的时间，并且仍然获得提高的外泌体生产。

观察到如下情况，如所引用的附图证明。

1NFC与APC和HDF生物相容。

图8显示(A)四天后APC和HDF球状体形成的代表性图像。APC和HDF用DiI染色并分别在0.2％和0.4％NFC内培养。使用荧光显微镜来观察球状体ll的形成。尺：100μm。(B)培养四天后HDF球状体形成的实时成像视频截图。将3×10⁵个细胞/100μl培养基与1ml的NFC(对于APC和HDF，分别为0.2％和0.4％)在6孔超低附着板的孔中混合。悬浮液在37℃中孵育30分钟，然后在水凝胶顶部缓慢添加1ml培养基。

2.3D细胞培养会刺激体内类外泌体的分泌

图9显示了通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)从APC 2D(A)和3D(B)培养物中分离的外泌体的尺寸分布测量(显示了模式值)。将3×10⁵个细胞/孔作为初始细胞密度接种在6孔板中。在2D的70％融合度后和3D的5天后，分离外泌体。(C)外泌体的浓度(个颗粒/ml)。显示了来自2D和3D培养物的APC外泌体的平均值±SE(n＝3)。**P<0.01

图10显示了来自2D和3D APC培养物的PHK67标记的外泌体的(A)荧光显微镜图像和(B)定量分析。基于PKH67标记的外泌体的绿色荧光强度进行定量。将100μl来自2D和3D培养物的各分离的外泌体用PKH67染料染色，然后插入96孔板的孔中。获取样品的荧光图像，并使用ImageJ软件测量荧光强度。对所有图像使用最大投影强度。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。比例尺＝10μm。***P<0.001。

图11显示了通过TEM(A)和(B)蛋白质印迹分析对来自2D和3D APC培养物的分离的外泌体的表征。通过蛋白质印迹法来检测外泌体标记物(包括CD81、CD9和Hsp70)，(C)使用BCA试剂盒测定来自2D和3D APC培养物的分离的外泌体浓度(n＝3)。***P<0.001。

图12显示(A)在处理24小时后、随后进行共聚焦显微镜观察的分别通过2D和3DHDF的2D和3D-APC-Exos(100微克/毫升)摄取的代表性图像。比例尺＝100μm。(B)用3D-APC-Exo(100μg/ml)处理24小时期间，通过3D HDF球状体的外泌体摄取的代表性图像，然后进行共聚焦显微镜观察。比例尺＝200μm。(C)通过3D HDF获取的3D-APC-Exo的定量。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。6小时后的外泌体摄取被认为是数据标准化的对照。***P<0.01。D)处理24小时后内化的PHK67标记的外泌体的定量分析。基于PKH67标记的外泌体的绿色荧光强度进行定量。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。2D HDF+2D APC-Exo被认为是数据标准化的对照处理。**P<0.01，***P<0.01。

图13显示了通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)从生物反应器(A)和NFC-生物反应器培养物(B)中分离的外泌体的尺寸分布测量。将25×10⁶个细胞作为初始细胞密度接种在生物反应器中。10天后分离外泌体。(C)外泌体的浓度(个颗粒/ml)。显示了来自生物反应器和NFC-生物反应器培养物的APC外泌体的平均值±SE(n＝3)。***P<0.001

图14显示了来自生物反应器和NFC-生物反应器培养物的PHK67标记的外泌体的(A)荧光显微镜图像和(B)定量分析。基于PKH67标记的外泌体的绿色荧光强度进行定量。将100μl的各分离的外泌体用PKH67染料染色，然后插入96孔板的孔中。获取样品的荧光图像，并使用ImageJ软件测量荧光强度。对所有图像使用最大投影强度。将数据归一化为表面积，并表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。比例尺＝10μm。***P<0.001。

图15显示了通过TEM(A)和(B)蛋白质印迹分析对来自生物反应器和NFC-生物反应器培养物的分离的外泌体的表征。通过蛋白质印迹法来检测外泌体标记物(包括CD81、CD9和Hsp70)。(C)分别在处理24小时后通过HDF的来自生物反应器(左栏)和NFC-生物反应器(右栏)(100μg/ml)摄取的分离的外泌体的代表性图像，然后进行共聚焦显微镜观察。比例尺＝100μm。

5.生物反应器-NFC与生物反应器的细胞增殖：

图16显示了通过四种细胞培养方法对APC增殖的量化，所述方法包括2D(板中的正常细胞培养)、3D(使用NFC的细胞培养)、生物反应器培养和与NFC结合的生物反应器培养。对于各时间点，将数据标准化为2D培养的结果。将数据表示为平均值±平均值标准误差(n＝5)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

6.通过生物反应器-NFC与生物反应器的外泌体生产

图17显示了使用BCA试剂盒通过四种细胞培养方法由APC产生的外泌体生产的量化，所述方法包括2D(板中的正常细胞培养)、3D(使用NFC的细胞培养)、生物反应器培养和与NFC结合的生物反应器培养。对于各时间点，将数据标准化为2D培养的结果。将数据表示为平均值±平均值标准误差(n＝10)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

在目前的研究中，旨在于开发一种3D实验细胞培养模型，从而在模拟皮肤细胞微环境的条件下研究由源自脂肪的干细胞外泌体的外泌体释放和通过人类真皮成纤维细胞摄取。结果表明，目前的细胞培养方法和生物反应器可以提高来自脂肪祖干细胞(adiposeprogenitor stem cells)的外泌体的产生和功能。这些数据表明，与其他培养方法相比，使用与NFC结合的生物反应器培养可以显著提高外泌体生产。

综上所述，发现NFC与干细胞如APC和HDF是生物相容的。与传统的2D细胞培养相比，NFC 3D培养提高了3D培养中的外泌体产生。特别是，3D细胞培养会刺激体内类外泌体的分泌。

与正常2D细胞培养相比，NFC 3D培养还增强了外泌体功能，包括外泌体摄取。与2D-APC外泌物相比，HDF内化了更多的3D-APC外泌体。

与细胞培养瓶结合的NFC增强了体内类外泌体的分泌。与2D外泌体相比，Dd中的外泌体形态更加相同，因为测量的尺寸分布更窄。该结果支持了更具功能或“体内样”外泌体的结论，因为可以假设更均质产物会导致更好的靶向治疗。在刺激体内类外泌体分泌中使用NFC为更高效递送外泌体治疗剂量用于临床应用提供了新的范例。

Claims (31)

1.一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的生物反应器(10)，所述生物反应器包括：

-容器(12)；

-用于将细胞培养基输入容器的入口(14)，

-用于从容器中输出包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口(16)，

-所述容器(12)包括或连接至隔室(18)，所述隔室包括构造成接收细胞的纳米结构化纤维素，所述隔室包括第一分离表面(20)，其将纳米结构化纤维素与出口隔开，并且允许包含细胞衍生产物的细胞培养基行进通过所述第一分离表面(20)，并且所述隔室任选地包含其他分离表面(30)，用于气体交换。

2.如权利要求1所述的生物反应器，其中，第一分离表面(20)包括可渗透含细胞衍生产物的细胞培养基且不可渗透细胞和纳米结构化纤维素的结构或以该结构的形式存在，所述结构为例如膜或网状物，例如平均孔尺寸为0.4-3μm的膜。

3.如权利要求1或2所述的生物反应器，所述生物反应器包括用于在隔室(18)中混合纳米结构化纤维素和细胞的装置(24)，例如其中，用于混合的装置包括混合器；用于提供培养基流的装置；和/或用于调整容器或隔室体积的装置。

4.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，包括用于通过入口(14)和/或出口(16)提供细胞培养基流的装置，优选通过包括纳米结构化纤维素的隔室(18)，例如，从而获得灌注型生物反应器。

5.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，包括纳米结构化纤维素的隔室(18)包括在一个或多个表面上的细胞培养凝胶的涂层，例如，包含琼脂糖、胶原或透明质酸或其衍生物的凝胶，例如，浓度为0.3-1.0％(w/w)的凝胶。

6.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，包括纳米结构化纤维素的隔室(18)是相对于容器(12)的单独单元(36)，例如，固定床反应器。

7.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，第一表面是中空纤维形式。

8.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，容器包括烧瓶或瓶。

9.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，第一分离表面通过纳米结构化纤维素表面形成。

10.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，纳米结构化纤维素是分离实体形式的，例如水凝胶珠和/或多孔珠。

11.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，纳米结构化纤维素包括纳米原纤维纤维素，所述纳米原纤维纤维素包括数均直径为200nm或更小的纤维素原纤维和/或原纤维束；和/或其中，当纳米原纤维纤维素分散在水中时，其提供了在22±1℃的水性介质中、在0.5重量％的稠度下通过旋转流变仪测定的1-50Pa、如2-15Pa的屈服应力和100-50000Pa·s、如300-8000Pa·s的零剪切粘度。

12.如权利要求11所述的生物反应器，其中，纳米原纤维纤维素是化学改性的纳米原纤维纤维素，例如，阴离子改性的纳米原纤维纤维素或阳离子改性的纳米原纤维纤维素。

13.如权利要求11所述的生物反应器，其中，纳米原纤维纤维素是未化学改性的纳米原纤维纤维素，优选还是未酶促改性的纳米原纤维纤维素。

14.如权利要求11至13中任一项所述的生物反应器，其中，纳米原纤维纤维素包括数均直径为2至50nm、如2至20nm的纤维素原纤维和/或原纤维束；其中当纳米原纤维纤维素分散于水中时，其提供了在22±1℃的水性介质中、在0.5重量％的稠度下、通过旋转流变仪测得的1-50Pa、如2-15Pa的屈服应力，优选地，其中，纳米原纤维纤维素是未化学改性的纳米原纤维纤维素。

15.如权利要求1至10中任一项所述的生物反应器，其中，纳米结构化纤维素包括数均原纤维直径为2至40nm、如2至20nm且数均原纤维长度为100nm或更大、如100至400nm的纳米晶体纤维素。

16.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，纳米结构化纤维素的中值孔尺寸为0.1-10μm²，例如，0.3-2.0μm²。

17.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中，细胞衍生产物的数均直径为1000nm或更低。

18.一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的方法，所述方法包括：

-提供如前述权利要求中任一项所述的生物反应器(10)；

-提供细胞培养基，优选无血清、无动物来源、无饲养细胞和/或无异种细胞培养基，

-提供细胞，

-在包含纳米结构化纤维素的隔室中孵育细胞以形成细胞衍生产物，并且任选地混合纳米结构化纤维素和细胞，

-让细胞衍生产物从细胞扩散到细胞培养基中，

-从生物反应器中收获包含细胞衍生产物的细胞培养基，优选通过用于提取包含细胞衍生产物的细胞培养基的出口进行收获，从而将细胞衍生产物与孵育的细胞分离。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述方法是连续的方法，优选地，所述方法包括：以与从生物反应器收获包含细胞衍生产物的细胞培养基的速率相等的速率，将新细胞培养基添加到生物反应器中。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中，细胞衍生产物包括胞外囊泡，例如，外泌体，优选地，其中细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞，例如，细胞是原代细胞，例如干细胞，例如间充质干细胞，和/或其中细胞以聚集体，例如球状体的形式存在。

21.如权利要求18-20所述的方法，其中，细胞衍生产物的数均直径为1000nm或更低。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中，细胞是从脂肪组织例如小鼠胚胎衍生的脂肪祖细胞(APC)获得的干细胞。

23.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中，第一分离表面通过纳米结构化纤维素表面形成。

24.如权利要求18至23中任一项所述的方法，其中，纳米结构化纤维素是纳米原纤维纤维素，所述纳米原纤维纤维素包括数均直径为2至50nm、如2至20nm的纤维素原纤维和/或原纤维束；其中当纳米原纤维纤维素分散于水中时，其提供了在22±1℃的水性介质中、在0.5重量％的稠度下、通过旋转流变仪测得的1-50Pa、如2-15Pa的屈服应力，优选地，其中，纳米原纤维纤维素是未化学改性的纳米原纤维纤维素。

25.如权利要求18至24中任一项所述的方法，其中，纳米结构化纤维素包括中值孔尺寸为0.1-10μm²、如0.3-2.0μm²的纳米结构化纤维素水凝胶。

26.一种用于从所培养的细胞中提取细胞衍生产物的纳米结构化纤维素产品，所述产品包括中值孔尺寸为0.1-10μm²、如0.3-2.0μm²的纳米结构化纤维素水凝胶。

27.如权利要求26所述的纳米结构化纤维素产品，其中，纳米结构化纤维素是纳米原纤维纤维素，所述纳米原纤维纤维素包括数均直径为2至50nm、如2至20nm的纤维素原纤维和/或原纤维束；其中当纳米原纤维纤维素分散于水中时，其提供了在22±1℃的水性介质中、在0.5重量％的稠度下、通过旋转流变仪测得的1-50Pa、如2-15Pa的屈服应力。

28.如权利要求26或27所述的纳米结构化纤维素产品，其中，纳米原纤维纤维素是化学改性的纳米原纤维纤维素，例如，阴离子改性的纳米原纤维纤维素或阳离子改性的纳米原纤维纤维素。

29.如权利要求26或27所述的纳米结构化纤维素产品，其中，纳米原纤维纤维素是未化学改性的纳米原纤维纤维素，优选还是未酶促改性的纳米原纤维纤维素。

30.如权利要求26至29中任一项所述的纳米结构化纤维素产品的用途，用于从所孵育的细胞中提取细胞衍生产物，优选用如权利要求18至25中任一项所述的方法进行提取。

31.用如权利要求18-25中任一项所述的方法获得的胞外囊泡，例如，其中囊泡的数均直径是200nm或更小，更特别地是150nm或更小，或130nm或更小，例如90-200nm、90-150nm、90-130nm、100-200nm，100-150nm或100-130nm。