CN117031044A - 一种预测卒中相关性肺炎的生物标志物和试剂盒及诊断设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种预测卒中相关性肺炎的生物标志物和试剂盒及诊断设备。本发明提出检测PD‑L1蛋白的物质在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用，检测PD‑L1蛋白的物质为用于测定外周血脑源性外泌体中PD‑L1蛋白含量的试剂。本发明首次提出卒中相关性肺炎的预测方法，具有指导临床用药方案、提高护理水平、改善脑出血患者临床转归和预后的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种预测卒中相关性肺炎的生物标志物和试剂盒及诊断设备。
背景技术
2003年，德国科隆大学附属医院Hilker等提出了卒中相关性肺炎（Strokeassociated pneumonia，SAP）的概念。卒中相关性肺炎是指原无肺部感染的脑卒中患者所罹患的感染性肺实质（含肺泡壁即广义上的肺间质）炎症。其发病群体为卒中患者，和卒中后机体的功能障碍有极为密切的关系：如卒中后脑损伤所致免疫功能降低；意识和/或吞咽障碍所致误吸等。
目前卒中相关性肺炎的预测主要依靠临床特点，如高龄、慢性阻塞性肺疾病、卒中严重度、吞咽障碍等来粗略判断卒中相关性肺炎的发病可能性，目前尚无可靠的卒中相关性肺炎预测标记物。
外泌体是几乎所有细胞都可分泌的双层球形膜泡结构小体，携带来源细胞的蛋白质、氨基酸、脂质、代谢物和遗传物质；包含来源细胞的生理及病理信息。外泌体参与多种生理过程，在疾病的发生发展中发挥作用。外泌体可在血液，尿液，脑脊液等多种体液中被检测到。
脑源性外泌体是一种由神经细胞分泌的外泌体，利用免疫沉淀技术能够通过外周血直接获得。在卒中后，神经元损伤会增加外泌体的分泌/释放，通过检测卒中后脑源性外泌体内的标记物内特定蛋白等标记物的水平可以为我们提供疾病的发生发展及转归的信息。程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1,PD-L1）分子与免疫细胞表面的程序性死亡-1（programmed death-1，PD-1）受体结合可诱导免疫细胞凋亡和功能障碍，是卒中后外周免疫抑制的主要机制之一。测量卒中后脑源性外泌体PD-L1水平并建立其与卒中相关性肺炎发病风险的预测模型有着重要的临床应用前景和意义。
目前尚未有明确的卒中相关性肺炎的预测方法，鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生物标志物和试剂盒及诊断设备。
本发明提供了检测PD-L1蛋白的物质在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用。
检测PD-L1蛋白的物质为用于测定外周血脑源性外泌体中PD-L1蛋白含量的试剂。
用于检测PD-L1蛋白含量的试剂包括通过酶联免疫吸附法、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术或生物素-亲和素技术检测PD-L1蛋白含量的试剂。
可选的，用于检测PD-L1蛋白含量的试剂包括结合PD-L1蛋白的抗体；
可选的，用于检测PD-L1蛋白含量的试剂还包括与结合PD-L1蛋白的抗体相结合的二抗。
可选的，在通过酶联免疫吸附试验的试剂检测PD-L1蛋白含量的试剂制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用中，根据外周血脑源性外泌体中的PD-L1蛋白在外周血脑源性外泌体总蛋白中的浓度结果进行预测。
可选的，预测的方法包括：如果PD-L1蛋白的浓度大于6.655 pg/20 µg脑源性外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险高，如果PD-L1蛋白的浓度小于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险低，灵敏度为0.692，特异度为0.769。
本发明提供了一种试剂盒在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用，试剂盒包括含有上述用于检测PD-L1蛋白含量的试剂。
本发明提供了一种卒中相关性肺炎的预测设备，包括：
外周血脑源性外泌体分离模块：用于从外周血样本中分离得到外周血脑源性外泌体；
PD-L1蛋白定量检测模块：通过酶联免疫吸附试验对外周血脑源性外泌体总蛋白和外周血脑源性外泌体中的PD-L1蛋白进行定量检测；
判定模块：用于根据外周血外泌体总蛋白中PD-L1蛋白含量进行预测，大于阈值的判定为卒中相关性肺炎高风险样本；
预测的方法包括：如果PD-L1蛋白的浓度大于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险高，如果PD-L1蛋白的浓度小于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险低，灵敏度为0.692，特异度为0.769。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明针对脑出血患者外周血脑源性外泌体PD-L1的鉴定和定量工作，建立了系统的方法流程；明确了脑源性外泌体PD-L1水平与脑出血患者发生卒中相关性肺炎的关系。
本发明提供了一站式从脑出血患者抽血到外泌体提取、外泌体鉴定、外泌体PD-L1蛋白定量检测及临床卒中相关性肺炎发病预测的全流程方法学及临床应用。
本发明首创了一个从脑出血患者外周血到外泌体提取、外泌体鉴定、PD-L1蛋白定量、预测临床卒中相关性肺炎发生风险的完整的流程和方法学平台。脑出血患者卒中相关性肺炎发病率超过10%，是最严重的感染性并发症，合并卒中相关性肺炎的患者其死亡率升高3倍。因此，针对卒中相关性肺炎发病的有效预测可以指导临床用药方案、提高护理水平、有助于改善脑出血患者临床转归和预后。
附图说明
图1为实施例1中外周血脑源性外泌体的提取、鉴定、检测的流程图；
图2为外周血脑源性外泌体透射电子显微镜成像，白色标尺为100 nm；
图3为外周血脑源性外泌体纳米追踪结果；
图4为性别年龄匹配的健康对照（Con）和脑出血患者（ICH）的外泌体蛋白标记物Western blot检测结果（每孔蛋白上样量10 µg）；
图5为脑出血患者（n=24）外泌体蛋白PD-L1与NCAM-L1水平相关性检验（Spearman相关性检验，R2=0.905，P＜0.0001）；
图6为脑出血患者（n=39）外泌体PD-L1水平预测卒中相关性肺炎发病风险的ROC曲线分析。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例通过无标记定量蛋白质组学技术，对外周血脑源性外泌体蛋白质组学进行了研究，筛选获得一系列显著差异表达的蛋白质，本发明实施例通过进一步分析，确定PD-L1蛋白具有最优的诊断效能，提出了一种外周血脑源性外泌体蛋白PD-L1的新应用，从而可以针对脑出血患者卒中相关性肺炎发病进行有效预测，指导临床用药方案、提高护理水平、有助于改善脑出血患者临床转归和预后。具体的，本发明实施例提出了检测PD-L1蛋白的物质在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用。
在上述应用中，检测PD-L1蛋白的物质为用于测定外周血脑源性外泌体中PD-L1蛋白含量的试剂。
在本发明实施例的应用中，用于检测PD-L1蛋白含量的试剂包括通过酶联免疫吸附法、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术或生物素-亲和素技术检测PD-L1蛋白含量的试剂。具体的，用于检测PD-L1蛋白含量的试剂包括结合PD-L1蛋白的抗体；用于检测PD-L1蛋白含量的试剂还包括与结合PD-L1蛋白的抗体相结合的二抗。
在本发明实施例的应用中，在通过酶联免疫吸附试验的试剂检测PD-L1蛋白含量的试剂制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用中，根据外周血脑源性外泌体中的PD-L1蛋白在外周血脑源性外泌体总蛋白中的浓度结果进行预测。
在本发明实施例的应用中，预测的方法包括：如果PD-L1蛋白的浓度大于6.655pg/20 µg脑源性外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险高；如果PD-L1蛋白的浓度小于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险低；灵敏度为0.692，特异度为0.769。
本发明实施例还涉及一种试剂盒在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用，试剂盒包括含有上述用于检测PD-L1蛋白含量的试剂。
本发明实施例还涉及一种卒中相关性肺炎的预测设备，包括：
外周血脑源性外泌体分离模块：用于从外周血样本中分离得到外周血脑源性外泌体；
PD-L1蛋白定量检测模块：通过酶联免疫吸附试验对外周血脑源性外泌体总蛋白和外周血脑源性外泌体中的PD-L1蛋白进行定量检测；
判定模块：用于根据外周血外泌体总蛋白中PD-L1蛋白含量进行预测，大于阈值的判定为卒中相关性肺炎高风险样本；预测的方法包括：如果PD-L1蛋白的浓度大于6.655pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险高，如果PD-L1蛋白的浓度小于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险低；灵敏度为0.692，特异度为0.769。
实施例1
一、外周血脑源性外泌体的提取和鉴定：
使用EDTA抗凝管采集脑出血患者外周静脉血，4℃条件下3000转/分×10分钟低速离心，取上清经40 µm滤网过滤后留存于EP管中；
基于QIAGEN exoEasy Maxi kit试剂盒提取外泌体（按照试剂盒说明书操作），采用纳米粒子追踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA），透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）等技术鉴定外泌体，流程图如图1所示，实验结果如图2、图3所示。
图2为外泌体透射电子显微镜成像，白色标尺为100 nm。图3为纳米颗粒追踪结果，峰值直径为76 nm。
基于Western blot技术使用外泌体标记物CD63、TSG101鉴定外泌体，使用神经元标记物L1-CAM鉴定外泌体来源。
Western blot具体实验过程：
1、收集蛋白样品：使用超声裂解仪对提取的外泌体进行裂解，随后测定每个蛋白样品的蛋白浓度；
2、蛋白样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液使其终浓度为1X，100℃金属浴加热10分钟，以充分变性蛋白；
3、上样和电泳：
3.1根据测得蛋白浓度计算出10ug的蛋白样品，待蛋白冷却至室温，将蛋白样品及蛋白marker加至SDS-PAGE胶加样孔内，并记录加样位置；
3.2采用恒压电泳，80V电压电泳直至溴酚蓝到达胶的底端；
4、转膜：使用包含配套反应单元的半干转转膜仪进行转膜，转膜前准备转膜试剂盒（pyxis，spj-t20s），内含top buffer、down buffer、balance buffer和滤纸。
4.1、裁取合适尺寸的NC膜，双面浸润balance buffer至少1分钟以充分激活NC膜，随后取出两张滤纸，分别完全浸润top buffer及down buffer备用；
4.2、待电泳结束，裁切蛋白质凝胶的大小确保目的蛋白包含其中。随后取出反应单元，在反应单元下盒电极上依次放入下层滤纸、NC膜、电泳后的蛋白质凝胶、上层滤纸，并合上反应单元上盖，根据胶的厚度调整反应单元旋钮的旋转角度；
4.3、将反应单元插入主机中，按照指示转膜10 min，待转膜结束后取出膜进行下一步实验，注意蛋白在与胶贴合度一面，此面作标记小心避免受到摩擦；
5、封闭：转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液TBST中，漂洗1 ~ 2 min，以洗去膜上的转膜液，随后将蛋白膜放入5%脱脂牛奶中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60 min；
6、一抗孵育：参考一抗的说明书，按照适当比例用含0.1%叠氮钠TBST溶液稀释一抗，4℃摇床过夜；
7、漂洗：隔日将蛋白膜置于TBST溶液中快速漂洗3次，每次10 min；
8、二抗孵育：参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，常温摇床慢摇，孵育60 min；
9、漂洗：将蛋白膜置于TBST溶液中快速漂洗3次，每次10 min；
10、蛋白检测：使用ECL发光液孵育蛋白膜，蛋白成像仪曝光并收集图像数据；
11、数据分析：使用Image J软件进行数据分析。
实验结果如图4和图5所示。
图4为性别年龄匹配的健康对照（Con）和脑出血患者（ICH）的外泌体蛋白标记物Western blot检测结果（每孔蛋白上样量10 µg），其中，PD-L1为目标蛋白；NCAM-L1为神经元来源标记蛋白；CD63和TSG101为外泌体标记蛋白；β-actin为内参蛋白。图5为脑出血患者（n=24）外泌体蛋白PD-L1与NCAM-L1水平相关性检验（Spearman相关性检验，R2=0.905，P＜0.0001）。
以上实验结果说明发生脑出血的患者外周血中神经元来源的外泌体PD-L1水平明显升高。
二、外泌体总蛋白的测定、样本内PD-L1含量的测定
使用超声裂解外泌体后使用Bradford法测外泌体总蛋白浓度，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术进行对20 µg外泌体总蛋白样本内PD-L1含量进行定量检测。
具体操作流程：
1）收集蛋白样品：将外泌体样本液置于超声波细胞裂解仪中裂解5秒×3次。
2）蛋白浓度测量：使用考马斯亮蓝工作液配制一组浓度分别为0.10 mg/mL、0.08mg/mL、0.06 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0 mg/mL的牛血清蛋白(BSA)溶液，该溶液体系为1 mL。紫外分光光度计于595 nm测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条尺度曲线。1 mL体系稀释蛋白样本，测定样本蛋白质的吸光度，根据尺度曲线计算得到相应样本蛋白质的浓度。
3）使用Human PD-L1 (clone 28-8) ELISA Kit（ab277712，Abcam Cambridge，UK）进行PD-L1含量检测，上样量为20 µg外泌体总蛋白稀释至50 µL总体积。
计算得到PD-L1蛋白在外周血脑源性外泌体总蛋白中的浓度用于预测。
实验例1
脑源性外泌体PD-L1蛋白定量水平与卒中相关性肺炎发病的确立过程：
1）数据和信息收集：
在一个前瞻性脑出血队列里检测了39名脑出血患者入院时外泌体PD-L1水平，收集其年龄，性别，卒中严重度（NIHSS评分和GCS评分），既往高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症、脑出血及脑梗死病史，血肿体积及7天内是否发生SAP等信息。
2）ROC（receiver operating characteristic）：
利用SPSS25.0软件绘制外泌体PD-L1水平与SAP发病的受试者操作曲线（ROC），得到ROC曲线如图6所示。获得曲线下面积（AUC）为0.725。计算出截断值（cut-off value）为133.1 pg/mL（6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白）。
由图6可知，39名脑出血患者，卒中相关性肺炎患者26人（66.67%）。
3）风险预测：
以133.1pg/mL为界将患者分为外泌体PD-L1≥133.1 pg/mL和外泌体PD-L1＜133.1 pg/mL两组，使用SPSS25.0软件进行logistics回归分析，获得结果为在矫正年龄、性别、NIHSS、GCS等混杂因素后，外泌体PD-L1≥133.1 pg/mL的患者其SAP风险为外泌体PD-L1＜133.1 pg/mL患者的6.638倍（p<0.05；OR: 6.638；95%CI: 1.012 ~ 43.546）
实验例2
利用该标志物在临床上应用的情况，验证PD-L1蛋白作为生物标志物的效率。
1）数据和信息收集：为了验证外泌体PD-L1对于SAP预测的效能，我们基于2个三级转诊中心建立了一个脑出血验证队列，共纳入97例脑出血患者，使用前文建立的方法检测其入院时外泌体PD-L1水平并收集其年龄，性别，卒中严重度（NIHSS评分和GCS评分），既往高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症、脑出血及脑梗死病史，血肿体积及7天内是否发生SAP等信息。
2）风险预测：以133.1 pg/mL为界将患者分为外泌体PD-L1≥133.1 pg/mL和外泌体PD-L1＜133.1 pg/mL两组，使用SPSS25.0软件进行logistics回归分析，获得结果为在矫正年龄、性别、NIHSS、GCS、血肿体积、血肿位置等混杂因素后，外泌体PD-L1≥133.1 pg/mL的患者其SAP风险为外泌体PD-L1＜133.1 pg/mL患者的4.370倍（p<0.05；OR: 4.370；95%CI: 1.028 ~ 18.580）。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.检测PD-L1蛋白的物质在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测PD-L1蛋白的物质为用于测定外周血脑源性外泌体中PD-L1蛋白含量的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于检测PD-L1蛋白含量的试剂包括通过酶联免疫吸附法、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术或生物素-亲和素技术检测PD-L1蛋白含量的试剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于检测PD-L1蛋白含量的试剂包括结合PD-L1蛋白的抗体；
和/或，所述用于检测PD-L1蛋白含量的试剂还包括与所述结合PD-L1蛋白的抗体相结合的二抗。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在通过酶联免疫吸附试验的试剂检测PD-L1蛋白含量的试剂制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用中，根据所述外周血脑源性外泌体中的PD-L1蛋白在所述外周血脑源性外泌体总蛋白中的浓度结果进行预测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述预测的方法包括：如果PD-L1蛋白的浓度大于6.655 pg/20 µg脑源性外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险高，如果PD-L1蛋白的浓度小于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险低，灵敏度为0.692，特异度为0.769。
7.一种试剂盒在制备用于预测卒中相关性肺炎的产品中的应用，所述试剂盒包括含有权利要求2~6任一项中所述的用于检测PD-L1蛋白含量的试剂。
8.一种卒中相关性肺炎的预测设备，包括：
外周血脑源性外泌体分离模块：用于从外周血样本中分离得到外周血脑源性外泌体；
PD-L1蛋白定量检测模块：通过酶联免疫吸附试验对所述外周血脑源性外泌体总蛋白和所述外周血脑源性外泌体中的PD-L1蛋白进行定量检测；
判定模块：用于根据所述外周血外泌体总蛋白中所述PD-L1蛋白含量进行预测，大于阈值的判定为卒中相关性肺炎高风险样本；
所述预测的方法包括：如果PD-L1蛋白的浓度大于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险高，如果PD-L1蛋白的浓度小于6.655 pg/20 µg外泌体总蛋白，则预测为卒中相关性肺炎的风险低，灵敏度为0.692，特异度为0.769。
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