CN117018175A - 一种呼吸道合胞病毒腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用，具体的，从诸多腺病毒载体中筛选出针对RSV的黏膜给药制剂适用的腺病毒载体。通过吸入方式接种，模拟病毒侵染过程，激发产生免疫反应。可以避免肌肉注射所带来的注射部位疼痛等局部不良反应。通过吸入至肺的方式，可使雾化后的疫苗经过呼吸道最终抵达肺部，在产生体液免疫和细胞免疫的同时，激发呼吸道黏膜免疫，其中激发肺部黏膜免疫是预防RSV感染和传播最有效方法。在激发肺部黏膜免疫的同时，也展现出更好的体液免疫水平。本发明对吸入剂量进行了筛选，使用的剂量较肌注剂型更小，提高了安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种黏膜给药制剂及其制备方法和应用。具体地，涉及一种用于预防和/或治疗RSV感染的黏膜给药制剂。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是一种高度传染性的病毒，在全球范围内长期流行，可导致所有年龄组的人群肺部和呼吸道感染，尤其是婴幼儿、老年人和处于免疫抑制状态的人群。
在1950年发现呼吸道合胞病毒(RSV)之后，该病毒很快即成为公认的与人类下呼吸道感染及上呼吸道感染相关的病原体；分为两大亚型：A型和B型。全世界每年约有3400万5岁以下儿童遭受RSV的感染，其中约有340万儿童住院，16～20万儿童死亡。老年人的感染风险更高，每年大约3％-7％的60岁以上老年人会受到RSV感染。老年人因为免疫力下降和基础疾病，出现严重疾病的风险更高。RSV每年给全球造成了巨大的经济损失，并严重威胁人类健康。全世界每年有超过300万人因感染RSV而住院，并导致近6万人死亡。
自从1957年第一次在人体中发现RSV病毒后，RSV疫苗的研发就开始了。全球第一个进入临床研究的产品是辉瑞的RSV福尔马林灭活疫苗。在前后开展的多项临床研究中，该RSV疫苗不但没有对接种者产生保护，反而出现了疾病增强作用(ERD，即不但不能预防接种者感染RSV病毒，而且还会导致接种者感染RSV后病情加重)。甚至在一项研究中，试验组的20个婴儿中16个病情严重需要住院治疗,住院率高达80％，其中还有两个婴儿死亡。就此FDA紧急叫停了所有RSV疫苗的临床研究，RSV疫苗研发进入了长久的沉默期。在此后的60年中，科学家们一直没有放弃对RSV疫苗的研究，也逐渐发现福尔马林灭活RSV疫苗产生ERD的原因可能是因为疫苗激活了Th2-CD4+T细胞，从而导致相关细胞因子介导的肺炎发生。随着ERD机理的阐明和疫苗制备技术的进步，各界又重新燃起了对RSV疫苗的研发热情，然而过程并不顺利。
例如Novavax公司研制的RSV F蛋白重组纳米颗粒疫苗(ResVax)在III期临床试验中，结果却未达到主次要临床终点，宣告失败。GSK的另一RSV候选疫苗GSK3003891A在完成I期临床研究取得初步结果后，II期研究开展不久便于2017年宣布终止。
和传统的肌肉注射制剂相比，黏膜免疫制剂在疫苗中的应用目前公开的数据并不多，尤其是针对RSV的黏膜制剂目前尚无研究数据。黏膜免疫制剂虽然有如上所述的诸多优势，但因为其递送方式的特殊性，导致抗原在黏膜中停留时间短，限制了抗原的递送效率，使得黏膜免疫制剂应用始终受限；此外不同免疫原特异性明显，不同的载体/递送方式使得药物在肺部的沉积出现明显区别，而沉积在不同部位药物可能出现吸收速率的差异，直接影响着疫苗效果。
为了填补改技术空白，同时克服现有技术中出现的诸多问题，进一步提高肺炎疫苗的免疫效力，本发明人针对RSV开发出一种黏膜给药制剂。
发明内容
本发明提供一种抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的组合物。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
如本文中所用的术语“重组”暗指其已经人工修饰，例如其已改变其中主动克隆的末端和/或其包含异源基因，亦即其并非天然存在的野生型腺病毒。
如本文中所用的术语“重组腺病毒”是基于如本文中所用的腺病毒，至少在序列上源于野生型。此可通过使用野生型基因组或其部分作为起始物质进行分子克隆来实现。亦可使用野生型腺病毒基因组的已知序列以通过DNA合成重新产生基因组(的部分)，DNA合成可由DNA合成和/或分子克隆领域中的商业性服务公司(例如GeneArt、Invitrogen、GenScripts、Eurofins)使用常规程序来进行。
普通技术人员应了解，许多不同聚核苷酸及核酸可由于遗传密码的简并性而编码相同多肽。亦应了解，普通技术人员可使用常规技术进行不会影响由此处所述的聚核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，从而反映欲表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。因此，除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质及RNA的核苷酸序列可包括内含子。
如本文中所用的术语“片段”是指具有氨基端和/或羧基端和/或内部缺失，应了解，出于诱导免疫反应及一般出于接种疫苗的目的，蛋白质无须为全长的，亦无须具有所有其野生型功能，且该蛋白质的片段同等适用。
如本文中所用的术语“组合物”是指以腺病毒作为载体，将目的基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达该目的基因的重组腺病毒制成的疫苗或其他组合物；或指其为医药组合物，且因此通常包括医药学上可接受的稀释剂、运载剂或赋形剂。其可能包含或可能不包含其他活性成分。在某些实施例中，其可为另外包含诱导免疫反应(例如抗RSV的其他蛋白质和/或抗其他感染物)的其他组分的组合疫苗。
本文中所用的术语“猿猴类腺病毒”是指非人猿猴腺病毒，诸如Rhesus Macaque、cynomolgus macaque、gorilla、vervet monkey、baboon、bonnbo、chimpanzee等。
在本发明中，组合物包含有效量的有效量的编码RSV抗原的片段。提供一种为受试者预防因RSV感染及复制而导致住院治疗的严重下呼吸道疾病且减少因RSV感染及复制而引起的并发症(诸如肺炎及细支气管炎)的频率的方法。因此，本发明亦提供一种为受试者预防或减少由RSV引起的严重下呼吸道疾病、预防或减少(例如缩短)由RSV引起的住院治疗、和/或降低由RSV引起的肺炎或细支气管炎的频率和/或严重程度的方法。
本发明针对呼吸道合胞病毒，对诸多类型的腺病毒载体进行筛选，提供一种抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的组合物，包含重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体中插入编码RSV抗原的基因，所述组合物为黏膜给药制剂；优选地，所述组合物为疫苗。
具体的，所述腺病毒载体包括人腺病毒和/或猿猴类腺病毒载体；优选地，所述人腺病毒为Ad5型、Ad26型、Ad35型、Ad48型，所述猿猴类腺病毒为sAd36型、sAd37型；更优选地，所述重组腺病毒优选为Ad5型，Ad26型或sAd36型。
融合蛋白(fusion protein,F)和粘附蛋白(attachment protein,G)是病毒入侵人体的关键，二者都可以成为病毒研发的理想靶点。F蛋白有两个构象：活性构象(与宿主细胞融合前的pre-F)；非活性构象(与宿主细胞融合后的post-F)。pre-F有六个主要的抗原位点(I,II,III,IV,和V)，post-F有四个(I,II,III,和IV)。前者抗原性更强，本发明选择F蛋白pre-F构象。
具体的，本发明其编码以融合前构象形式(融合前RSV F蛋白)被稳定化的RSV F蛋白。
具体的，其中所述编码RSV抗原的基因可为基于单数或复数个融合前构象形式的RSV F(pre-F)蛋白和/或黏附蛋白(G)和/或小疏水蛋白(SH)蛋白。
具体的RSV融合蛋白F、黏附蛋白(G)或小疏水蛋白(SH)蛋白质的核酸可通过本领域技术人员公知技术检索得到。
如本领域中所惯用，本文中的序列自5'至3'方向提供。
具体的，在某些实施例中，编码RSV F(pre-F)蛋白质的核酸包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码RSV F(pre-F)蛋白质的核酸包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码RSV F(pre-F)蛋白质的核酸包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码RSV pre-F/G蛋白的核酸包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码RSV F(pre-F)蛋白质的核酸包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码RSV F(pre-F)蛋白质的核酸包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码RSV F(pre-F)、G蛋白质的核酸是针对在人类细胞中的表达进行密码子优化。
具体的，所述黏膜给药制剂为雾化吸入制剂、滴鼻或喷鼻给药制剂、干粉吸入制剂，优选地，所述雾化吸入制剂为雾化口吸入制剂或雾化鼻吸入制剂。
优选的，所述剂型为雾化吸入剂，所述疫苗经雾化给药装置雾化后形成粒径10μm以下的颗粒；优选地，0.5～10μm,更优选地，5～10μm。
具体的，所述编码RSV抗原的基因，可源于天然存在的RSV或重组RSV的任何病毒株，优选地源于人类RSV病毒株，诸如A2、Long或B病毒株。
具体的，所述组合物包含药学上可接受的辅料，所述辅料包括但不限于下述中的一种或多种：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂、防腐剂、灭活剂或人源白蛋白。
具体的，所述黏膜给药制剂重组腺病毒的剂量为1×107～×1010IFU/剂，优选地为1×107～6×109IFU/剂，更优选地，为1×107～1.3×109IFU/剂。
具体的，所述制剂的单位剂量为0.05-5ml，优选地为，0.1-1ml。
本发明提供一种组合物的制备方法，使所述重组腺病毒在宿主细胞培养物中增殖，分离并纯化该重组腺病毒，并将该重组腺病毒调配成医药学上可接受的黏膜给药制剂。
具体的，所述重组腺病毒缺乏腺病毒基因组E1区和/或E3区的至少一部分。
具体的，所述重组腺病毒缺乏腺病毒基因组E4区和/或E2区的至少一部分。
本发明提供一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的套件，包括所述黏膜给药制剂和递送装置。
具体的，所述递送装置为雾化吸入装置，优选地，为气溶胶发生器。
具体的，所述疫苗经雾化给药装置雾化后形成粒径10μm以下的颗粒；优选地，0.5～10μm,更优选地，5～10μm。
本发明提供一种组合物在制备对哺乳动物中引发免疫反应的疫苗中的用途，为初次免疫或加强免疫。
具体的，向所述受试者施用足够量的组合物，所述哺乳动物在使用所述组合物前已产生针对同种免疫原的初级免疫反应。
具体的，其中所述的组合物为单剂或双剂或三剂。
具体的，所述的组合物还可以与相同或不同血清型重组腺病毒的免疫组合物联合，和/或,
与RSV抗原核酸表达的蛋白质组合物联用，和/或,
与佐剂联用，和/或,
与另外一种额外治疗剂联合施用，
优选地，所述额外的治疗剂可以选自但不限于针对RSV感染治疗剂，例如RSV下呼吸道感染住院期间的标准治疗剂、支气管扩张剂、抗生素，包括(但不限于)肾上腺素、抗胆碱能药、退热药和/或非甾体抗炎药。
本发明的有益效果包括：
1、本发明的一个方面，从诸多腺病毒载体中筛选出针对RSV的黏膜给药制剂适用的腺病毒载体。通过吸入方式接种，模拟病毒侵染过程，激发产生免疫反应。本发明所述的黏膜给药制剂具有顺应性，可以避免肌肉注射所带来的注射部位疼痛等局部不良反应。
2、本发明通过吸入至肺的方式，可使雾化后的疫苗经过呼吸道最终抵达肺部，在产生体液免疫和细胞免疫的同时，激发呼吸道黏膜免疫。激发肺部黏膜免疫，可能是预防感染和传播最有效方法。在激发肺部黏膜免疫的同时，也展现出更好的体液免疫水平。对机体进行免疫后，针对原始毒株可产生中和抗体和特异IgG，可通过胎盘血液屏障，有利于抗体从母体通过胎盘传递至胎儿，对防止新生儿出生短期内的感染期很大作用。
3、本发明对吸入剂量进行了筛选，使用的剂量较肌注剂型更小，提高了安全性。可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫三重效果。
4、本发明所述的黏膜给药制剂可用于初次免疫或加强免疫。
附图说明
图1.重组sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F病毒侵染细胞图；
图2.重组sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G病毒侵染细胞图；
图3.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F/sAd37-rsv-F/Ad35-rsv-F/Ad48-rsv-F的黏膜给药制剂和注射制剂免疫小鼠28d后血清pre-F的IgG结合抗体滴度；
图4.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F/sAd37-rsv-F/Ad35-rsv-F/Ad48-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂免疫小鼠28d后血清RSV A2真病毒的中和抗体滴度
图5.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，SPL CD8+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平；
图6.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，SPL CD4+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平；
图7.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，BALF CD8+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平；
图8.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，BALF CD4+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平；
图9.不同剂量sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F黏膜给药制剂免疫小鼠28天后血清IgG结合抗体滴度；
图10.不同剂量sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F黏膜给药制剂免疫小鼠28天后血清RSV A2真病毒的中和抗体滴度；
图11.不同免疫原黏膜给药制剂免疫28天和42天IgG结合抗体滴度；
图12.不同免疫原黏膜给药制剂免疫28天和42天RSV A2真病毒的中和抗体滴度。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的重组腺病毒载体Ad5，Ad26或sAd36缺乏病毒复制所需的腺病毒基因组E1区的至少一个必需基因功能。在某些实施例中，本发明的腺病毒载体缺乏非必需E3区的至少一部分。在某些实施例中，载体缺乏E1区的至少一个必需基因功能及非必需E3区的至少一部分。腺病毒载体可为“多重缺乏”的，意谓腺病毒载体的腺病毒基因组的两个或两个以上区中各自缺乏一或多个必需基因功能。在前述E1缺乏或E1、E3缺乏腺病毒载体可另外缺乏E4区的至少一个必需基因和/或E2区的至少一个必需基因。
在某些实施例中，腺病毒例如由于其在基因组的E1区中含有缺失而为复制缺陷型。如普通技术人员所知，在腺病毒基因组缺失必需区的情况下，由此等区编码的功能必须反式(in trans)提供，优选地由生产细胞提供，亦即当腺病毒缺失部分或整个E1、E2和/或E4区时，此等区必须存在于生产细胞中，例如整合于其基因组中或呈所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。腺病毒亦可在并非复制所必需的E3区中具有缺失，且因此无须补充此种缺失。
可使用的生产细胞(有时在本领域中及本文中亦称为‘包装细胞’或‘补充细胞’或‘宿主细胞’)可为可使所需腺病毒增殖的任何生产细胞。举例而言，重组腺病毒载体的增殖是在补充腺病毒中的缺陷的生产细胞中进行。这些生产细胞优选地在其基因组中具有至少腺病毒E1序列，且由此能够补充E1区缺失的重组腺病毒。可使用任何补充E1的生产细胞，诸如HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞及其类似细胞。
对于在E1区中具有缺失的Ad5，Ad26或sAd36，优选地保留腺病毒中E1B 55K开放阅读框的3'末端，可进一步增加腺病毒的稳定性。
本发明的重组腺病毒，包括编码RSV抗原的核酸，可将其例如克隆于腺病毒载体缺失的E1或E3区中。
本发明中编码RSV抗原的核酸选自：RSV融合蛋白F(pre-F)、黏附蛋白(G)或小疏水蛋白(SH)蛋白质中的一种或多种。RSV的融合蛋白F和/或黏附蛋白(G)和/或小疏水蛋白(SH)蛋白质可源于天然存在的RSV或重组RSV的任何病毒株，优选地源于人类RSV病毒株，诸如A2、Long或B病毒株。
在其他实施例中，编码RSV抗原的核酸可为基于复数个RSV F(pre-F)蛋白和/或黏附蛋白(G)和/或小疏水蛋白(SH)蛋白质氨基酸序列。
在某些实施例中，重组腺病毒包含编码RSV F(pre-F)蛋白质的核酸，为进一步证明本发明所述黏膜给药制剂在RSV抗原中的通用性，在某些实施例中，重组腺病毒包含编码RSV F(pre-F)/G蛋白质的核酸。
本发明所述黏膜给药制剂的制造方法，使所述重组腺病毒Ad5，Ad26或sAd36在宿主细胞培养物中增殖，分离并纯化该重组腺病毒，并将该重组腺病毒调配于医药学上可接受的黏膜给药制剂中。
可根据熟知方法制备重组腺病毒且在宿主细胞中增殖，这些方法需要经腺病毒感染的宿主细胞的细胞培养。细胞培养可为任何类型的细胞培养，包括黏附细胞培养，例如细胞附着于培养容器或微载体表面；以及悬浮培养。大多数大规模悬浮培养以分批制程或补料分批制程操作，因为这些制程最易于操作及扩大规模。
培养生产细胞以增加细胞及病毒数目和/或病毒效价。完成细胞培养以使其能够代谢和/或生长和/或分裂和/或产生本发明的相关病毒。此可通过如普通技术人员所熟知的方法来实现，且包括(但不限于)例如在适当培养基中为细胞提供营养物。适合培养基为普通技术人员所熟知，且一般可自商业来源大量获得或根据标准方案定制。可使用分批系统、补料分批系统、连续系统及其类似系统在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。
在某些实施例中，进一步纯化所收集的腺病毒。可分若干步骤进行腺病毒纯化，包含净化、超滤、透滤或层析分离，可通过过滤步骤进行净化，自细胞溶解产物移除细胞碎片及其他杂质。使用超滤来浓缩病毒溶液。使用超滤器进行透滤或缓冲液交换为移除及交换盐、糖及其类似物的方式。普通技术人员已知如何发现各纯化步骤的最佳条件。
所述黏膜给药制剂包括药学上可接受的辅料，包括但不限于下述中的一种或多种：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂、佐剂、防腐剂、灭活剂或人源白蛋白；优选地，为人血白蛋白；所述缓冲剂包括但不限于HEPES、HIS、TRIS、PB、琥珀酸、柠檬酸中的一种或多种；所述保护剂包括但不限于明胶、乙醇、二乙氨四乙酸(EDTA)、二乙氨四乙酸二钠(EDTA-2Na)和氯化镁中的一种或者多种；所述稳定剂包括但不限于蔗糖、甘露醇、岩藻糖和麦芽糖中的一种或多种；所述表面活性剂包括但不限于吐温、司盘、甘油中的一种或者多种；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠或省去；优选地，所述辅料组分包括甘露醇，蔗糖，氯化钠，氯化镁，HEPES，聚山梨酯80，甘油，优选地，甘露醇10-200mg/ml、氯化钠0.5-30mg/ml、HEPES 0.05-10mg/ml、聚山梨酯800.01-10mg/ml、甘油0.1-5mg/ml、氯化镁0.1-5mg/ml、蔗糖1-80mg/ml；优选地，为甘露醇10-80mg/ml、氯化钠1-15mg/ml、HEPES 0.1-5mg/ml、聚山梨酯800.1-5mg/ml、甘油0.5-5mg/ml、氯化镁0.2-5mg/ml、蔗糖5-40mg/m。
在某些实施例中，提供一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的套件，包括本发明所述黏膜给药制剂和递送装置。
所述递送装置可以为吸入装置，例如雾化器或气溶胶发生器。
在某些实施例中，提供一种黏膜给药制剂在在哺乳动物中引发免疫反应的用途，包括向所述受试者施用足够量的黏膜给药制剂，引发初级免疫反应。
在某些实施例中，提供一种黏膜给药制剂在在哺乳动物中引发加强免疫反应的用途，包括向所述受试者施用足够量的黏膜给药制剂，所述哺乳动物在使用本发明所述黏膜给药制剂前已产生针对同种免疫原的初级免疫反应。
本文中所用的受试者优选地为哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、棉鼠，或非人类灵长类动物，或人类。受试者优选地为人类受试者。受试者可为任何年龄，例如约1个月大至100岁，例如约2个月大至约80岁，例如约1个月大至约3岁、约3岁至约50岁、约50岁至约75岁等。
在某些实施例中，提供一种用于治疗和/预防呼吸道合胞病毒感染的方法，所述方法包括给患者或接种者施用所述黏膜给药制剂，所述黏膜给药制剂施用量1×107IFU，优选为1×107-6×109IFU，优选为1×107-1.3×109IFU。
在某些实施例中，提供用于治疗和/预防呼吸道合胞病毒感染的方法，其中所述黏膜给药制剂至少施用一次。
在某些实施例中，提供用于治疗和/预防呼吸道合胞病毒感染的方法，所述的黏膜给药制剂，可以与包含相同或不同血清型重组腺病毒的免疫组合物联合施用。也可以与RSV抗原核酸表达的蛋白质组合物联合施用。
在某些实施例中，提供用于治疗和/预防呼吸道合胞病毒感染的方法，所述的黏膜给药制剂可以与另外一种额外治疗剂联合施用，所述额外治疗剂与本发明所述黏膜给药制剂可能或不可能产生协同作用，两者给药方式可以相同或不同，可以在基本相同或不同的时间给药。
额外的治疗剂可以选自但不限于针对RSV感染治疗剂，例如RSV下呼吸道感染住院期间的标准治疗、支气管扩张剂、抗生素，包括(但不限于)肾上腺素、抗胆碱能药、退热药和/或非甾体抗炎药。
支气管扩张剂主要有两类:拟交感神经药和抗胆碱能药，包括短效和长效β2模拟物。短效模拟物包括但不限于：沙丁胺醇、特布他林、非诺特罗、吡布特罗和妥洛特罗。长效β2-模拟物包括但不限于福莫特罗和沙美特罗。它们也可以用作碱或可接受的药用盐。抗胆碱能药包括(但不限于)异丙托溴铵、氧托溴铵和噻托溴铵。
用于本发明方法的其他支气管扩张剂包括但不限于：Accu Hale、沙丁胺醇、比托特罗、麻黄碱、肾上腺素、异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、间丙肾上腺素、吡布特罗、乙酰肾上腺素、利托君、特布他林、左旋、甲基苯丙胺、茶碱、咖啡因、可可碱、THC和MDPV。
本发明的发明人惊讶地发现包含编码RSV抗原的核苷酸序列的重组sAd36、Ad26、Ad5腺病毒黏膜给药制剂在小鼠模型中展示为极有效的抗RSV组合物。为进一步验证本发明所述类型腺病毒载体在黏膜免疫中的优势，构建包含编码RSV抗原的核苷酸序列的重组腺病毒sAd37，Ad48，Ad35，并以同样的方法制备为黏膜给药制剂，上述对比例载体分别选自人腺病毒以及猿猴类腺病毒，以更全面的对比本发明所述载体的优势。
为进一步验证本发明所述黏膜给药制剂的优势，将包含编码RSV抗原的核苷酸序列的重组sAd36、Ad26、Ad5腺病毒以雾化口吸入、雾化鼻吸入、滴鼻、干粉口吸入的不同给药方式进行给药，以全面对比黏膜给药制剂的优势，同时针对进一步筛选出最具优势的黏膜给药制剂给药方式。
为进一步验证本发明所述黏膜给药制剂的优势，将包含编码RSV抗原的核苷酸序列的重组sAd36、Ad26、Ad5腺病毒以雾化口吸入的方式进行给药，调整给药剂量不同，以进一步筛选出最具优势剂量范围。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例涉及的融合前构象形式的RSV F(pre-F)蛋白的模型氨基酸序列如SEQID NO.1所示；编码RSV pre-F/G蛋白的模型氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例1：产生表达sAd36-ΔE1,3，Ad26-ΔE1,3，Ad5-ΔE1,3,sAd37-ΔE1,3，Ad35-ΔE1,3，Ad48-ΔE1,3腺病毒载体
以猿猴类腺病毒sAd36型(GENBANK号：FJ025917.1)腺病毒载体为基础，删除E1和E3基因；
以猿猴类腺病毒sAd37型(GENBANK号：FJ025921)腺病毒载体为基础，删除E1和E3基因；
以人腺病毒26型(GENBANK号：EF153474.1)腺病毒载体为基础，删除E1和E3基因；
以人腺病毒5型(GENBANK号：AC_000008.1)腺病毒载体为基础，删除E1和E3基因；
以人腺病毒35型(GENBANK号：AC_000019.1)腺病毒载体为基础，删除E1和E3基因
以人腺病毒48型(GENBANK号：EF153473.1)腺病毒载体为基础，删除E1和E3基因
实施例2：重组sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F病毒适应细胞测试
反向遗传方式构建sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，使用MssI酶切去除不属于病毒基因组的ori、抗性基因等元件，同时将质粒线性化，采用商业化纯化回收试剂盒将线性化的质粒纯化，去除其中的酶和其他反应成分，取1-2ug纯化后的线性质粒采用lipo2000试剂盒转染生长在6孔板中的HEK293SF-3F6细胞，第二天转至T25瓶培养，以去除对细胞有害的lipo2000试剂，同时使细胞具有更大的生长空间。7天后可观察到出毒产生的空斑，空斑处细胞脱落形成空洞。采用同样的方式构建sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F。
Ad5-rsv-F的构建，优化后的RSV的F蛋白基因，进行PCR实验并回收产物酶切，回收酶切片段。同时，将质粒pDC316载体使用同样的核酸内切酶进行酶切，回收重组后的pDC316载体；将该载体和pBHGloxΔE1,3Cre共同转染到HEK293SF-3F6细胞中进行病毒拯救。10-20天后可观察到出毒产生的空斑，空斑处细胞脱落形成空洞。
实验结果见图1，由实验结果可知，证明本发明重组sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F病毒细胞适应性良好，可满足后续大规模生产。
sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F腺病毒产生、感染及继代：
观察到出毒产生的空斑，空斑处细胞脱落形成空洞，之后在培养3-5天可收获病毒，方法为用细胞培养也将细胞吹下，转移至15ml离心管中，使用振荡器充分振荡混匀，1ml/支分装，即获得P-2代次sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F，之后可通过接种HEK293悬浮细胞对病毒进行扩增，P-2代次病毒接种30ml HEK293悬浮细胞获得P-1代次病毒，P-1代次病毒接种500ml HEK293S悬浮细胞获得P0代次病毒，收获的500ml病毒经过纯化制备即可用于动物免疫实验。
实施例3：重组sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G病毒适应细胞测试
反向遗传方式构建sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，其中使用MssI酶切去除不属于病毒基因组的ori、抗性基因等元件，同时将质粒线性化，采用商业化纯化回收试剂盒将线性化的质粒纯化，去除其中的酶和其他反应成分，取1-2ug纯化后的线性质粒采用lipo2000试剂盒转染生长在6孔板中的HEK293SF-3F6细胞，第二天转至T25瓶培养，以去除对细胞有害的lipo2000试剂，同时使细胞具有更大的生长空间。7天后可观察到出毒产生的空斑，空斑处细胞脱落形成空洞。
Ad5-rsv-F/G的构建，优化后的RSV的F/G蛋白进行PCR实验并回收产物，酶切，回收酶切片段。同时，将质粒pDC316载体使用同样的核酸内切酶进行酶切，回收重组后的pDC316载体；将该载体和pBHGloxΔE1,3Cre共同转染到HEK293SF-3F6细胞中进行病毒拯救。10-20天后可观察到出毒产生的空斑，空斑处细胞脱落形成空洞。
实验结果见图2，由实验结果可知，证明本发明的重组sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G腺病毒细胞适应性良好，可满足后续大规模生产。
重组sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G腺病毒产生、感染及继代同实施例2。
实施例4：sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F黏膜给药制剂和注射制剂的制备
取上述sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F，sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G病毒原液，加入甘露醇、蔗糖、氯化钠、氯化镁、聚山梨醇80、甘油、HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)制备为注射制剂。
取上述sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F，sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G病毒原液，加入HEPES缓冲液、蔗糖、等渗盐水、聚山梨醇80，制备为黏膜给药制剂雾化口吸入制剂。进一步将上述获得的黏膜给药制剂通过低温喷雾干燥，制备为干粉吸入颗粒，即干粉口吸入制剂。
取上述sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F，sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G病毒原液，加入PBS缓冲液、甘露醇、聚山梨醇80、甘油，制备为黏膜给药制剂雾化口吸入制剂。
取上述sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F，sAd36-rsv-F/G，Ad26-rsv-F/G，Ad5-rsv-F/G病毒原液，加入氯化钠、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸钠、组氨酸、尿素、右旋糖酐40、人血白蛋白制备滴鼻给药制剂。
实施例5：黏膜给药制剂和注射制剂体液免疫反应评价实验
动物实验：BALB/c小鼠按照《实验动物检疫标准操作规程》(SOP-QCM-050)进行检疫，检疫合格后挑选78只，随机分组。本实验共设13组。分别取实施例4制备的注射制剂和黏膜给药制剂按照下表给药方式和免疫剂量进行实验。
免疫方法：组1-6雾化口吸入。免疫过程：施用异氟烷麻醉；至少20分钟后，将小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，使用雾化吸入装置，经口插入气管施用上述制备的黏膜给药制剂；并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。组7-12后腿肌肉注射。
检测方法pre-F的IgG结合抗体滴度检测方法结果评价:以生理氯化钠溶液对照组小鼠血清的吸光度值求出Cutoff值，计算疫苗组小鼠血清抗体效价，高于cutoff值的最大稀释倍数，即为抗体效价。Cutoff值＝阴性对照组小鼠血清吸光度值的平均值*2.1。
RSV A2真病毒的中和抗体检测。
体液免疫实验结果28天采血检测pre-F的IgG结合抗体滴度和RSV A2真病毒的中和抗体滴度。
表1.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F/sAd37-rsv-F/Ad35-rsv-F/Ad48-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂免疫小鼠28d后，血清pre-F的IgG结合抗体滴度
*相同剂量sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F，sAd37-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F黏膜给药制剂和注射制剂，免疫28天后采血IgG结合抗体滴度.其中i.m表示肌肉注射制剂；i.n.表示雾化口吸入黏膜给药制剂。
组1-6数据显示，在制备为注射制剂中，Ad26-rsv-F，Ad35-rsv-F，Ad48-rsv-F引发的IgG结合抗体滴度较高，组7-12数据显示，在黏膜给药制剂通过雾化吸入给药中的实验中，sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F引发的IgG结合抗体滴度较高。
表2.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F/sAd37-rsv-F/Ad35-rsv-F/Ad48-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂免疫小鼠28d后，血清RSV A2真病毒的中和抗体滴度
*其中组1和7，2和8，3和9，4和10，5和11，6和12采用相同血清型重组腺病毒。组1-6雾化口吸入施用黏膜给药制剂，组7-12后腿肌肉施用注射制剂。
根据实验结果，sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F重组腺病毒制备为黏膜给药制剂比制备注射制剂可更好的诱发机体中和抗体；证明黏膜给药制剂可更好的诱发机体的体液免疫反应。
对于不同的细菌或病毒抗原以及不同的给药方式，病毒类载体疫苗应筛选匹配不同血清型的载体，具体的，针对RSV而言，根据不同血清型重组腺病毒载体数据，对比相应注射制剂，sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F黏膜给药制剂的中和抗体滴度提升度表现更高优势，说明针对RSV，sAd36，Ad26，Ad5血清型腺病毒在制备为黏膜给药制剂相比其他血清型更具优势。
实施例6.黏膜给药制剂和注射制剂细胞免疫和黏膜免疫评价实验
动物实验：BALB/c小鼠按照《实验动物检疫标准操作规程》(SOP-QCM-050)进行检疫，检疫合格后挑选96只，随机分组。本实验共设16组。
取实施例4制备的黏膜给药制剂和黏膜给药制剂干粉颗粒，分别按照下述给药方式和剂量进行免疫实验。
/>
其中组1、6、11雾化口吸入。免疫过程：施用异氟烷麻醉；至少20分钟后，将小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，使用雾化吸入装置经口插入气管施用上述制备的黏膜给药制剂；并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。
组2、7、12雾化鼻吸入。免疫过程：施用异氟烷麻醉；至少20分钟后，将小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，插鼻连接雾化装置施用实施例4制备的的黏膜给药制剂；然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。
组3、8、13滴鼻给药。免疫过程：施用异氟烷麻醉；5-10分钟后，小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，滴鼻实施例4制备的黏膜给药制剂；并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。
组4、9、14干粉口吸入。免疫过程：施用异氟烷麻醉；至少20分钟后，小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，使用雾化吸入装置经口插入气管施用实施例4制备的黏膜给药制剂干粉；并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。
组5、10、15小鼠后腿肌肉注射实施例4制备的注射制剂。
检测方法：ICS法检测。
细胞免疫实验结果：
28天杀鼠，取脾细胞进行ICS检测CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平，以评价黏膜给药制剂和注射制剂引发的细胞免疫反应；并进一步评价黏膜给药制剂不同给药方式引发的细胞免疫反应。
表3.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，SPL CD8+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平
表4.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，SPL CD4+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平
组1-5数据分析，sAd36-rsv-F重组腺病毒，组1-4施用sAd36-rsv-F黏膜给药制剂，组5施用sAd36-rsv-F注射制剂，施用剂量黏膜给药制剂为5×107IFU，注射制剂为1×108IFU，黏膜给药制剂施用剂量减半。其中组5的脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平较低，组1-4的脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平显著优于组5；组1-4的数据对比显示，黏膜给药制剂的不同给药方式诱发的CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平表现不一，具体的雾化口吸入＞雾化鼻吸入＞滴鼻＞干粉口吸入，黏膜给药制剂的优选给药方式为雾化口吸入或雾化鼻吸入。
组6-10数据分析，Ad5-rsv-F重组腺病毒，组6-9施用Ad5-rsv-F黏膜给药制剂，组10施用Ad5-rsv-F注射制剂，施用剂量黏膜给药制剂为5×107IFU，注射制剂为1×108IFU，黏膜给药制剂施用剂量减半。其中组10的脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平较低，组6-9的脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平显著优于组10，组6-9的数据对比显示，黏膜给药制剂的不同给药方式诱发的CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平表现不一，具体的雾化口吸入＞雾化鼻吸入＞滴鼻＞干粉口吸入，说明黏膜给药制剂的优选给药方式为雾化口吸入或雾化鼻吸入。
组11-15数据分析，Ad26-rsv-F重组腺病毒，组11-14施用Ad26-rsv-F黏膜给药制剂，组15施用Ad26-rsv-F注射制剂，施用剂量黏膜给药制剂为5×107IFU，注射制剂为1×108IFU，黏膜给药制剂施用剂量减半。其中组15的脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平较低，组11-14的脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平显著优于组15，组11-14的数据对比显示，黏膜给药制剂的不同给药方式诱发的CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平表现不一，具体的雾化口吸入＞雾化鼻吸入＞滴鼻＞干粉口吸入，黏膜给药制剂的优选给药方式为为雾化口吸入或雾化鼻吸入。
基于上述组5、10、15实验数据推测，现有技术中多项针对RSV疫苗临床效果不好，可能在于难以诱导机体有效地细胞免疫反应，导致疫苗效果不佳。而对比组1-4、组6-9、组11-14实验数据显示，相比注射制剂，即使在施用剂量减半的情况下黏膜给药制剂诱发机体的细胞免疫反应呈现显著提升，说明本发明所述黏膜给药制剂在诱发机体细胞免疫反应中呈现突出优势，可更好的诱发机体的细胞免疫反应，提高机体免疫能力。
黏膜免疫实验结果：28天小鼠灌肺取BALF，离心，细胞做ICS检测CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平，评价黏膜给药制剂和注射制剂引发的黏膜免疫反应，以及黏膜给药制剂不同给药方式引发的黏膜免疫反应。
表5.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，BALF CD8+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平
表6.sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F制备为黏膜给药制剂和注射制剂不同给药方式免疫小鼠28d后，BALF CD4+T细胞TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平
组1-5数据分析，sAd36-rsv-F重组腺病毒，组1-4施用sAd36-rsv-F黏膜给药制剂，组5施用sAd36-rsv-F注射制剂，施用剂量黏膜给药制剂为5×107IFU，注射制剂为1×108IFU，黏膜给药制剂施用剂量减半。其中组5的的BALF CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平几乎趋近于零，组1-4的BALF CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平显著优于组5；组1-4的数据对比显示，黏膜给药制剂的不同给药方式诱发的CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平表现不一，具体的雾化口吸入＞雾化鼻吸入＞滴鼻＞干粉口吸入，黏膜给药制剂的优选给药方式为雾化口吸入或雾化鼻吸入。
组6-10数据分析，Ad5-rsv-F重组腺病毒，组6-9施用Ad5-rsv-F黏膜给药制剂，组10施用Ad5-rsv-F注射制剂，施用剂量黏膜给药制剂为5×107IFU，注射制剂为1×108IFU，黏膜给药制剂施用剂量减半。其中组10的BALF CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平几乎趋近于零，组6-9的BALF CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平显著优于组10，组6-9的数据对比显示，黏膜给药制剂的不同给药方式诱发的CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平表现不一，具体的雾化口吸入＞雾化鼻吸入＞滴鼻＞干粉口吸入，说明黏膜给药制剂的优选给药方式为雾化口吸入或雾化鼻吸入。
组11-15数据分析，Ad26-rsv-F重组腺病毒，组11-14施用Ad26-rsv-F黏膜给药制剂，组15施用Ad26-rsv-F注射制剂，施用剂量黏膜给药制剂为5×107IFU，注射制剂为1×108IFU，黏膜给药制剂施用剂量减半。其中组15的BALF CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平几乎趋近于零，组11-14的BALF CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平显著优于组15，组11-14的数据对比显示，黏膜给药制剂的不同给药方式诱发的CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平表现不一，具体的雾化口吸入＞雾化鼻吸入＞滴鼻＞干粉口吸入，黏膜给药制剂的优选给药方式为为雾化口吸入或雾化鼻吸入。
基于上述组5、10、15实验数据显示，注射制剂难以诱导机体黏膜免疫反应；而对比组1-4、组6-9、组11-14实验数据显示，相比注射制剂，即使在施用剂量减半的情况下黏膜给药制剂亦可显著诱发机体的黏膜免疫反应；同时对比上述脾CD4+和CD8+T细胞的TNF-α,IFN-γ，IL-2应答水平，推测黏膜免疫反应协同诱发了机体的细胞免疫反应；说明本发明所述黏膜给药制剂在诱发机体黏膜免疫反应中呈现突出优势，并可协同提高机体的细胞免疫反应，提高机体免疫能力。
实施例7.黏膜给药制剂雾化吸入剂量评价对比实验
动物实验：BALB/c小鼠按照《实验动物检疫标准操作规程》(SOP-QCM-050)进行检疫，检疫合格后挑选90只，随机分组。本实验共设15组。
取实施例4制备的sAd36-rsv-F、Ad5-rsv-F、Ad26-rsv-F黏膜给药制剂通过雾化口吸入方式给药，评价黏膜给药制剂的剂量对比。
雾化口吸入：
免疫过程：施用异氟烷麻醉；至少20分钟后，将小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，使用雾化吸入装置经口插入气管施用上述制备的黏膜给药制剂；并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。
实验结果：
28天采血检测pre-F的IgG结合抗体滴度，检测方法同实施例5。表7.不同剂量sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F黏膜给药制剂免疫小鼠28天后血清IgG结合抗体滴度
/>
实验结果显示，
sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F初期随着给药剂量的增加，机体产生的结合抗体和中和抗体滴度逐步提高，然给药剂量达到一定程度后趋于持平。优选的给药剂量范围为mid-1到high-1之间，即1×106 -1×108IFU，
28天采血检测RSV A2真病毒的中和抗体滴度。
表8.不同剂量sAd36-rsv-F/Ad26-rsv-F/Ad5-rsv-F黏膜给药制剂免疫小鼠28天后血清RSV A2真病毒的中和抗体滴度
/>
sAd36-rsv-F，Ad26-rsv-F，Ad5-rsv-F初期随着给药剂量的增加，机体产生的结合抗体和中和抗体滴度逐步提高，然给药剂量达到一定程度后趋于持平。优选的给药剂量范围为mid-1到high-1之间，即1×106 -1×108IFU，根据《药理实验方法学》等经典教科书指导，按照人和动物间表面积折算的等效剂量比值进行换算，在人体中，最佳剂量为1×107-1.3×109IFU。
实施例8.不同免疫原黏膜给药制剂免疫反应评价实验
动物实验：BALB/c小鼠按照《实验动物检疫标准操作规程》(SOP-QCM-050)进行检疫，检疫合格后挑选30只，随机分组。本实验共设6组。
取实施例4制备的黏膜给药制剂，分别按照下述给药方式和剂量进行免疫实验。
雾化口吸入。免疫过程：施用异氟烷麻醉；至少20分钟后，将小鼠固定在一个与桌面成约45°角的操作平板上，使用雾化吸入装置经口插入气管施用上述制备的黏膜给药制剂；并继续保持小鼠头处于较高位置的姿势10-20s，然后将小鼠放入笼内，用红外灯给小鼠保暖直至小鼠清醒。
实验结果
28天和42天分别采血检测pre-F的IgG结合抗体滴度，检测方法同实施例5
表9.不同免疫原黏膜给药制剂免疫28天和42天IgG结合抗体滴度
28天和42天分别采血检测RSV A2真病毒的中和抗体滴度，检测方法同实施例5。
表10.不同免疫原黏膜给药制剂免疫28天和42天RSV A2真病毒的中和抗体滴度
数据显示，免疫原为F或F/G均能引发机体的体液免疫反应，并产生高效价的中和抗体，组1、3、5对比组2、4、6数据显示，免疫原为F/G时，机体的pre-F的IgG结合抗体滴度和中和抗体滴度均略高于免疫原F。不论何种免疫原，均不影响黏膜给药制剂的优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
Claims (17)
1.一种抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的组合物，其特征在于，包含重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体中插入编码RSV抗原的基因，所述组合物为黏膜给药制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述腺病毒载体包括人腺病毒和/或猿猴类腺病毒载体；优选地，所述人腺病毒选自Ad5型、Ad26型、Ad35型或Ad48型，所述猿猴类腺病毒载体选自sAd36型或sAd37型；更优选地，所述重组腺病毒优选为Ad5型，Ad26型或sAd36型。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其中所述编码RSV抗原的基因为编码基于单数或复数个融合前构象形式的RSV F(pre-F)蛋白、黏附蛋白(G)或小疏水蛋白(SH)蛋白中一种或多种的基因。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述黏膜给药制剂为雾化吸入制剂、滴鼻或喷鼻制剂或干粉吸入制剂，优选地，所述雾化吸入制剂为雾化口吸入制剂或雾化鼻吸入制剂。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述编码RSV抗原的基因源于天然存在的RSV或重组RSV的病毒株，优选地，源于人类RSV病毒株，更优选地，为A2、Long或B病毒株。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含药学上可接受的辅料，优选地，所述辅料选自：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂、防腐剂、灭活剂或人源白蛋白中的一种或多种；更优选地，所述的人源白蛋白为人血白蛋白；和/或，所述缓冲剂选自HEPES、HIS、TRIS、PB、琥珀酸、柠檬酸中的一种或多种；和/或，所述保护剂选自明胶、乙醇、二乙氨四乙酸(EDTA)、二乙氨四乙酸二钠(EDTA-2Na)和氯化镁中的一种或者多种；和/或，所述稳定剂选自蔗糖、甘露醇、岩藻糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或，所述表面活性剂选自吐温、司盘、甘油中的一种或者多种；和/或，所述渗透压调节剂选自氯化钠；更优选地，所述辅料组分包括甘露醇，蔗糖，氯化钠，氯化镁，HEPES，聚山梨酯80和甘油；更优选地，所述辅料组分包括甘露醇5-300mg/ml、氯化钠0.1-30mg/ml、HEPES 0.05-10mg/ml、聚山梨酯80 0.01-10mg/ml、甘油0.1-5mg/ml、氯化镁0.1-5mg/ml和蔗糖1-80mg/ml；更优选地，所述辅料组分包括甘露醇10-50mg/ml、氯化钠1-10mg/ml、HEPES 0.1-5mg/ml、聚山梨酯80 0.1-5mg/ml、甘油0.5-5mg/ml、氯化镁0.1-5mg/ml和蔗糖5-30mg/ml。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述黏膜给药制剂中重组腺病毒的剂量为1×107～1×1010IFU/剂，优选地，为1×107～6×109IFU/剂，更优选地，为1×107～1.3×109IFU/剂。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述制剂的单位剂量为0.05-5ml，优选地为，0.1-1ml。
9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，使所述重组腺病毒在宿主细胞培养物中增殖，分离并纯化所述重组腺病毒载体，并将所述重组腺病毒载体调配成黏膜给药制剂。
10.根据权利要求9所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒载体缺乏腺病毒基因组E1区和/或E3区的至少一部分。
11.根据权利要求10所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒缺乏腺病毒基因组E4区和/或E2区的至少一部分。
12.一种根据权利要求1-8中任一项所述的组合物在制备对哺乳动物中引发免疫反应的疫苗中的用途，优选地，所述的免疫为初次免疫或加强免疫。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，其中所述的组合物为单剂或双剂或三剂。
14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的组合物还与相同或不同血清型重组腺病毒的免疫组合物联合，和/或,
与RSV抗原核酸表达的蛋白质组合物联用，和/或,
与佐剂联用，和/或,
与另外一种额外治疗剂联合施用，
优选地，所述额外的治疗剂选自针对RSV感染治疗剂，更优选地，所述额外的治疗剂选自针对RSV下呼吸道感染住院期间的标准治疗剂；更优选地，所述额外的治疗剂选自支气管扩张剂、抗生素、肾上腺素、抗胆碱能药、退热药或非甾体抗炎药中的一种或多种。
15.一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的套件，其特征在于，包括权利要求1-8中任一项所述黏膜给药制剂和递送装置。
16.根据权利要求15所述的用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的套件，其特征在于，所述递送装置为雾化吸入装置，优选地，为气溶胶发生器。
17.根据权利要求16所述的用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的套件，其特征在于，所述疫苗经雾化给药装置雾化后形成粒径10μm以下的颗粒；优选地，0.5～10μm,更优选地，5～10μm。
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