CN117015606A - 用于神经变性疾病治疗的多核苷酸、载体、细胞、药物组合物和筛选方法 - Google Patents

用于神经变性疾病治疗的多核苷酸、载体、细胞、药物组合物和筛选方法 Download PDF

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贝濑峻
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Abstract

本公开的目的在于提供增加成体脑中新生神经元数的新的方法，此外提供该方法中应用的多核苷酸、载体、药物组合物。本公开是：多核苷酸，其特征在于包含(A)Plagl2基因的核酸序列、(B)针对Dyrk1a基因的miR‑shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列、和(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列；包含该多核苷酸的载体；包含它们的药物组合物。

Description

用于神经变性疾病治疗的多核苷酸、载体、细胞、药物组合物 和筛选方法
技术领域
本发明涉及用于神经变性疾病治疗的多核苷酸、载体、细胞、药物组合物和筛选方法。
背景技术
越来越清楚的是，即使在包括人的哺乳动物成体脑中，神经干细胞和神经前体细胞也绝对数少地存在，根据脑的区域进行神经新生。但是，成体脑的神经干细胞的大部分为静止状态，增殖能力、神经元产生能力低。由于该增殖能力、神经元产生能力随着年龄的增长进一步变低，老化脑中新产生的神经元(新生神经元)几乎不存在。认为新生神经元的显著减少是称为痴呆症的脑功能降低、阿尔茨海默病、帕金森病等的神经变性疾病的原因。
在这样的状况下，进行了通过生长因子等的刺激使在成体脑中极少存在的神经干细胞、神经前体细胞扩增、分化、促进功能恢复的尝试(参考非专利文献1)。但是，该效果不能说是充分的。此外，也盛行应用来自胎儿脑、ES细胞和iPS细胞的神经干细胞、神经前体细胞的细胞移植治疗模型的研究，但对于脑中的细胞移植治疗，是否可以重建正常的神经回路网也不明，副作用的风险也大。进一步，迄今进行了增加成体脑中新生神经元数的许多尝试，但其效果尚有限(参考非专利文献1～5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nagahara AH et al.(2009)Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzhe imer′sdisease,Nat.Med.,vol.15(3),pp.331-337.
非专利文献2：Henriette van Praag et al.,Exercise enhances learning andhippocampal neurogenesis in aged mice,J Neurosci.,2005Sep 21；25(38):8680-5
非专利文献3：Benedetta Artegiani et al.,Overexpression of cdk4andcyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adultmouse brain.J Exp Med.2011May 9；208(5):937-48
非专利文献4：Benraiss,A.et al.(2013)Mobilization of endogenousprogenitor cells regenerates functionally-integrated medium spiny striopallidal projection neurons and delays disease progression in a transgenic mod elof Huntington′s disease.Cell Stem Cell 12,787-799
非专利文献5：Berdugo-Vega,G.et al.(2020).Increasing neurogenesisrefines hippocampal activity rejuvenating navigational learning strategies and contextual memory throughout life.Nat.Commun.11,135
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供增加成体脑中新生神经元数的新的方法、此外提供该方法中应用的多核苷酸、载体、转化细胞、药物组合物、和增加成体脑中新生神经元数的物质的筛选方法。
用于解决问题的手段
在这样的状况下，本发明人等进行了深入的研究，结果发现，通过用慢病毒将特定的基因组导入老龄小鼠脑，内在的神经干细胞被有效地活化增殖，产生多数神经元。老龄期的神经干细胞恢复到青年期或比其更年轻时期的状态，产生多数神经元，记忆、学习能力被改善。此外，即使在导入阿尔茨海默病模型小鼠的脑的情形中，内在的神经干细胞也被有效地活化、产生多数神经元，记忆/学习能力被改善。即，本发明的主旨如下所述。
[1]多核苷酸，其特征在于包含：
(A)Plagl2基因的核酸序列，
(B)针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列，和
(C)与所述核酸序列可操作连接的启动子序列。
[2][1]中记载的多核苷酸，其中，上述Plagl2基因和Dyrk1a基因是哺乳动物基因。
[3][1]或[2]中记载的多核苷酸，其中，上述启动子是选自由Hes5启动子、GFAP启动子、Sox2启动子和Lfng启动子组成的组的启动子。
[4]载体，其包含[1]至[3]的任一项中记载的多核苷酸。
[5][4]中记载的载体，其中，上述载体是慢病毒载体、腺伴随病毒载体、腺病毒载体或质粒载体。
[6]药物组合物，其含有[4]或[5]中记载的载体。
[7]药物组合物，其含有：
(a)包含Plagl2基因的核酸序列和与上述Plagl2基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的载体、以及
(b)包含针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列和与上述miR-shRNA的核酸序列可操作连接的启动子序列的载体，或针对Dyrk1a基因的siRNA或miRNA。
[8]细胞，其通过[4]或[5]中记载的载体转化而成。
[9]药物组合物，其含有[8]中记载的细胞。
[10][6]、[7]或[9]中记载的药物组合物，其用于神经变性疾病或内耳疾病的治疗。
[11][10]中记载的药物组合物，其通过脑室内注射、髄腔内的推注或注入、神经节内注射、神经内注射、皮下注射、或鼓室内注射施用于对象。
[12]神经变性疾病或内耳疾病的治疗用物质的筛选方法，其包括：
(1)使被测物质作用于神经干细胞或内耳支持细胞，测定Plagl2基因和Dyrk1a基因的表达的步骤、以及
(2-1)根据上述步骤(1)的结果选择具有Plagl2基因表达增强能力和Dyr k1a基因表达抑制能力的被测物质的步骤、或
(2-2)根据上述步骤(1)的结果，选择具有Plagl2基因表达增强能力的被测物质和具有Dyrk1a基因的表达抑制能力的被测物质的步骤。
发明效果
根据本发明，通过将特定的基因组导入成体脑、老龄脑，能够使内在的神经干细胞有效地活化增殖，产生多数神经元。可以将老龄脑中神经干细胞恢复到青年期或比其更年轻时期的状态，能够产生多数神经元，改善记忆、学习能力。此外，也可以期待对阿尔茨海默病等的神经变性疾病的治疗效果，能够有效地活化内在的神经干细胞产生多数神经元，改善记忆/学习能力。进一步，本发明的特定的基因组不仅在脑的神经干细胞、在内耳也可以使支持细胞分化为毛细胞，提示在内耳疾病的治疗中也有效。
附图简述
[图1]图1是显示有助于NSC(神经干细胞)的活化的基因的筛选步骤的图。
[图2]图2是显示通过胚胎高表达基因的过度表达的NSC活化基因的体外筛选的结果的图。
[图3]图3是显示通过胚胎高表达基因的过度表达的NSC活化基因的体内筛选的结果的图。
[图4-1]图4-1是显示通过成体高表达基因的敲低的NSC活化基因的体外筛选的结果的图。
[图4-2]图4-2是显示通过成体高表达基因的敲低的NSC活化基因的体外筛选的结果的图。
[图5]图5是显示NSC活化基因的体内筛选的结果的图。
[图6]图6是显示NSC活化基因的体内筛选的结果的图。
[图7]图7是显示通过iPaD的小鼠老龄脑中神经新生的长期的活化的图。另外，将Plagl2过度表达和Dyrk1a敲低的联用命名为“iPaD(诱导Plagl2和抗-Dyrk1a)”。
[图8]图8是显示通过iPaD的小鼠老龄脑中神经新生的长期的活化的图。
[图9-1]图9-1是显示伴随年龄增长的神经新生能力的降低的图(野生型海马)。
[图9-2]图9-2是显示伴随年龄增长的神经新生能力的降低、和通过iPa D的高龄化NSC的恢复年轻化的图。
[图10-1]图10-1是显示巴恩斯迷宫试验的时间表的图。
[图10-2]图10-2是显示通过iPaD的年龄增长小鼠的认知功能改善效果的图(巴恩斯迷宫试验)。
[图10-3]图10-3是显示通过iPaD的年龄增长小鼠的认知功能改善效果的图(巴恩斯迷宫试验)。
[图11]图11是显示阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)和正常小鼠(野生型同胞幼小鼠)的海马齿状回中MCM2阳性细胞数的随月龄的变化的图。
[图12]图12是显示阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)和正常小鼠(野生型同胞幼小鼠)的海马齿状回中DCX阳性细胞数的随月龄的变化的图。
[图13]图13是显示阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)的海马齿状回中β淀粉样蛋白斑块数的随年龄增长的增加的图。
[图14]图14是显示阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)和正常小鼠(野生型同胞幼小鼠)的认知功能的比较结果的图(巴恩斯圆形迷宫试验)。
[图15]图15是显示阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)和正常小鼠(野生型同胞幼小鼠)的认知功能的比较结果的图(情景条件恐惧试验)。
[图16]是显示通过iPaD的阿尔茨海默病的改善效果的图(MCM2阳性细胞数)。
[图17]是显示通过iPaD的阿尔茨海默病的改善效果的图(DCX阳性细胞数)。
[图18]是显示通过iPaD的阿尔茨海默病的改善效果的图(β淀粉样蛋白斑块数)。
[图19]图19是显示通过iPaD的阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)的认知功能的改善效果的图(巴恩斯圆形迷宫试验)。
[图20]图20是显示通过iPaD的阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)的认知功能的改善效果的图(情景条件恐惧试验)。
[图21]图21是显示通过iPaD的内耳的支持细胞的活化和毛细胞的再生的图。
用于实施发明的方式
以下，对本发明进行详细说明。另外，在本说明书中，分子生物学方法可以通过本领域技术人员公知的一般实验文件中记载的方法或基于其的方法进行，除非另有说明。此外，本说明书中使用的术语以该技术领域通常应用的的含义解释，除非另有说明。
根据本公开，在成为靶标的神经干细胞等细胞中，通过使在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因强制表达，并且抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达，可以使这些细胞有效活化增殖。即，在本申请中，提供包含特定的基因组的多核苷酸、载体、转化细胞、包含它们的药物组合物、使用它们的神经变性疾病等的治疗方法等，其可以将成体脑、老龄脑、疾病脑等中内在的神经干细胞等有效活化增殖，产生多数神经元。
＜多核苷酸＞
本公开的多核苷酸的第1实施方式是，向成为靶标的神经干细胞等的细胞导入的、包含下列的多核苷酸：(A)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、(B)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRN A(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列。
本公开的多核苷酸的第2实施方式是，向成为靶标的神经干细胞等的细胞导入的、下列的组合：(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，与(b1)包含抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(micr oRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和与上述抑制基因表达的核酸序列(例如miR-shRNA的核酸序列)可操作连接的启动子序列的多核苷酸。
本公开的多核苷酸的第3实施方式是，向成为靶标的神经干细胞等的细胞导入的、下列的组合：(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，与(b2)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的siRNA或miRNA的多核苷酸)。
本说明书中的“多核苷酸”可与“核酸”、“基因”或“核酸分子”交换使用，意味着核苷酸的聚合物。在本说明书中，术语“核苷酸序列”可与“核酸序列”或“碱基序列”交换使用，示为脱氧核糖核苷酸(省略为A、G、C和T)的序列。例如，在称为“包含序列编号1的核苷酸序列的多核苷酸或其片段”的情形中，意味着包含由序列编号1的各脱氧核苷酸A、G、C和/或T显示的序列的多核苷酸或其片段部分。
作为成为导入本公开的多核苷酸的靶标的细胞，列举神经干细胞、内耳支持细胞、造血干细胞、间充质干细胞、骨格肌干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)、视网膜米勒胶质细胞、组织前体细胞等，从通过它们中导入本公开的多核苷酸促进活化、增殖的观点看来，优选神经干细胞、内耳支持细胞。
(关于第1实施方式)
向成为靶标的神经干细胞等的细胞导入的本公开的多核苷酸的第1实施方式是包含下列的多核苷酸：(A)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、(B)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列。
[(A)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列]
(A)作为核酸序列，只要是在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列则没有特别限定，其中优选通过在成体神经干细胞中过度表达促进成体神经干细胞的增殖、活化的基因的核酸序列，作为具体实例，列举Gsx2、Dmrt3、Cdk4、Plagl2、Sox21、Ascl1、Tgif2、Plagl1、Hmga2等的核酸序列。在它们之中，从成体神经干细的增殖、活化能力更优异的观点看来，更优选Plagl2基因的核酸序列。Plagl2基因(多形性腺瘤基因样-2)是编码具有C2H2锌指区的转录因子PLAGL2的基因。也称为ZNF900。已知PLAGL2作为转录的正调节剂起作用并定位于核。如实施例中详细说明，在本公开中，将来自E14小鼠胚胎的神经节隆起和背侧皮质的G1/G0 NSC的转录组(DDBJ BioProject Accession:PRJDB9010)与来自2～3个月龄小鼠的LV-SVZ(SAMD00192826)和DG-SGZ(SAMD00192827)的大部分为静止状态的NSC比较，发现了见到表达差异的核因子之一。
在本公开中，Plagl2基因等的在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的来源是人、猴、猪、马、牛、兔、绵羊、山羊、猫、狗、豚鼠等哺乳动物，其中优选人、猴、小鼠来源，更优选人来源。
本公开中的Plagl2基因等的在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列包含上述基因的mRNA序列内的编码区(CDS)。作为上述基因的核酸序列，可以采用已知作为上述的哺乳动物来源的各基因的mRNA序列的编码区(CDS)的序列，例如，可以使用在GenBank的碱基序列数据库等中注册的碱基序列。作为本公开中的Plagl2基因的核酸序列，与在GenBank的碱基序列数据库等中注册的碱基序列同一(序列编号1)、或具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的同源性，并且编码的肽具有作为PLAGL2的转录因子活性。作为本公开中的Plagl2基因的最优选核酸序列，列举序列编号1的序列。
[(B)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列]
(B)作为核酸序列，只要是抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列则没有特别限定，作为这样的在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因，优选能够通过敲低有效活化静止状态的神经干细胞的基因，例如，列举Cdkn1a、Prkcz、Dyrk1a、Zbtb7a、Dusp22、Cidea、Rasd1、Nr4a1、Nfe2l2、Stat6、Tsc22d3等，其中更优选Cdkn1a、Prkcz、Dyrk1a、Zbtb7a，更优选Dyrk1a。该Dyrk1a基因编码磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的酶，是认为可能参与以21号染色体的三体性为原因引起的唐氏综合征的发病的基因。如实施例中详细说明，在本公开中，在作为靶标的神经干细胞中，发现了作为通过敲低有效活化静止状态的NSC的上述11种基因之一。
本公开中的Dyrk1a基因等在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的来源是人、猴、猪、马、牛、兔、绵羊、山羊、猫、狗、豚鼠等哺乳动物，其中优选人、猴、小鼠来源，更优选人来源。
本公开中的Dyrk1a基因等在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的核酸序列包含上述基因的mRNA序列内的编码区(CDS)。作为上述基因的核酸序列，可以采用已知作为上述的哺乳动物来源的各基因的mRNA序列的编码区(CDS)的序列，例如，可以使用在GenBank的碱基序列数据库等中注册的碱基序列。作为本公开中的Dyrk1a基因的核酸序列，与在GenBank的碱基序列数据库等中注册的碱基序列同一(序列编号2)、或具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的同源性，并且编码的肽具有作为Dyrk1a的酶活性。作为本公开中的Dyrk1a基因的最优选核酸序列，列举序列编号2的序列。
在本公开中，抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列只要是具有能够通过以往公知的方法抑制上述基因的表达的核酸序列的那种则没有特别限定，例如，列举针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)。针对上述基因的miR-shRNA是可以抑制上述基因的表达的shRNA(用于通过RNA干扰的基因沉默的发夹型的RNA序列)。只要具有可以抑制上述基因的表达的核酸序列则没有特别限定，可以配合上述基因的序列适当设计。作为这样的shRNA的核酸序列，例如，列举为针对Dyrk1a的miR-shRNA的核酸序列的序列编号3的核酸序列作为优选的那种，也可以采用与序列编号3的核酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的同源性、并且可以抑制上述Dyrk1a基因的表达的核酸序列作为本公开的针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列。
[(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列]
在本公开中，在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)与(C)启动子序列可操作连接。作为本实施方式中的(C)启动子序列，可以采用在神经干细胞、内耳支持细胞等神经系统细胞内起作用的启动子序列。作为这样的启动子序列，列举例如在神经干细胞中起作用的Hes5启动子(序列编号4)、GFAP启动子、在内耳支持细胞中起作用的Sox2启动子、Lfng启动子等。
此处的“可操作连接”是指记载的成分能够以其预期方式起作用的关系中的并置。在一个实施方式中，该术语指核酸表达控制序列(例如，启动子和/或增强子)与目的多核苷酸序列间的功能性连接，可以是直接连接、间接连接(另一多核苷酸序列介于其间的情形)。在本公开中，启动子序列导致连接的目的多核苷酸的转录。
作为本实施方式的包含(A)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、(B)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，优选包含(A)Plagl2基因的核酸序列、(B)抑制Dyrk1a基因表达的核酸序列(例如，针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，例如，作为更优选的那种，列举：序列编号5的多核苷酸；和序列编号5的多核苷酸中具有1个以上(例如，1～50个、1～40个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个等)的核苷酸的缺失、置换、插入和/或添加的多核苷酸，其导入载体转化靶标细胞时可以强制表达Plagl2基因、敲低Dyrk1a基因。可以同时包含这些缺失、置换、插入和添加中2种以上的组合。上述核苷酸的缺失、置换、插入和/或添加的数目通常越小越好。此外，本申请发明中优选的多核苷酸例如包含能够在严格杂交条件下与序列编号5的其互补序列杂交的多核苷酸。
此处的“严格条件”可以是低严格条件、中严格条件和高严格条件的任一。“低严格条件”例如是5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。此外，“中严格条件”例如是5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”例如是5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件中，越升高温度，越可以期待有效得到具有高同源性的DNA。但是，作为影响杂交的严格性的要素，考虑温度、探针浓度、探针的长度、离子强度、时间、盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，通过适当选择这些要素，可实现同样的严格性。
本实施方式的多核苷酸可以进一步包含辅助mRNA的转录、向蛋白质翻译等的增强子序列、Kozak序列、适当的多腺苷化信号序列等公知序列。
向靶标细胞导入本实施方式的多核苷酸的方法没有特别限定，例如，可以列举应用病毒、质粒、人工染色体等载体、或脂质转染、脂质体、显微注射等方法。将本实施方式的多核苷酸导入为靶标的神经干细胞等转化时，可以强制表达Plagl2基因等在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因，敲低Dyrk1a基因等在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因。如此转化的靶标细胞(神经干细胞等)可以以充分发挥活化增殖、产生多数神经元等细胞功能的方式分化。本实施方式的多核苷酸可对成体脑、老龄脑、疾病脑等中内在的神经干细胞、内耳中存在的支持细胞等适当应用。
(关于第2实施方式)
向成为靶标的神经干细胞等细胞导入的本公开的多核苷酸的第2实施方式是下列的组合：(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，和(b1)包含抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和与上述抑制基因的表达的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸。本实施方式的多核苷酸的组合用于将在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因、和抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对Dy rk1a基因的miR-shRNA)分别导入单独载体等，将成为靶标的神经干细胞等的细胞单独转化。
关于本实施方式中的(a)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列，可以原样适用上述第1实施方式中的(A)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列的说明。此外，关于与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列，也可以适用第1实施方式中的(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列的说明，作为具体实例，例如，列举神经干细胞中起作用的Hes5启动子(序列编号4)、GFAP启动子、内耳支持细胞中起作用的Sox2启动子、Lfng启动子等。
作为本实施方式中的(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，优选(a)包含Plagl2基因的核酸序列、和与上述Plagl2基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，作为更优选实例，可以列举包含序列编号6的核酸序列的那种。该多核苷酸可以进一步包含辅助mRNA的转录、向蛋白质翻译等的增强子序列、Kozak序列、适当的多腺苷化信号序列等公知序列。
关于本实施方式中的(b1)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)，可以原样适用上述第1实施方式中的(B)抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列的说明。此外，作为与上述核酸序列可操作连接的启动子序列，可以适用第1实施方式中的(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列的说明，作为具体实例，例如，列举在神经干细胞中起作用的Hes5启动子(序列编号4)、GFAP启动子、在内耳支持细胞中起作用的Sox2启动子、Lfng启动子等。
作为本实施方式中的(b1)包含抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的表达的核酸序列(例如，针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和与上述核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，优选(b1)包含针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列、和与上述miR-shRNA的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，作为更优选实例，可以列举包含序列编号7的核酸序列的那种。该多核苷酸可以进一步包含辅助mRNA的转录、向蛋白质翻译等的增强子序列、Kozak序列、适当的多腺苷化信号序列等公知序列。
向靶标细胞导入本实施方式的多核苷酸的方法没有特别限定，例如，可以列举应用病毒、质粒、人工染色体等载体、或脂质转染、脂质体、显微注射等方法。本实施方式的2种多核苷酸可以分别独立导入靶标细胞。例如，将各自整合进单独载体、导入为靶标的神经干细胞等转化时，可以强制表达在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因，敲低在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因。如此转化的靶标细胞(神经干细胞等)可以充分发挥活化增殖、产生多数神经元等细胞功能。本实施方式的多核苷酸可对成体脑、老龄脑、疾病脑等中内在的神经干细胞、内耳中存在的支持细胞等适当应用。
(关于第3实施方式)
向成为靶标的神经干细胞等细胞导入的本公开的多核苷酸的第3实施方式是下列的组合：(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，和(b2)针对在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的siRNA或miRNA的多核苷酸。在本实施方式中，将(a)多核苷酸导入载体，将(b2)多核苷酸(siRNA或miRNA)与转染用试剂等共同用于靶标细胞的转化。
关于本实施方式中的(a)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列，可以原样适用上述第1实施方式中的(A)在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列的说明。此外，关于与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列，可以适用第1实施方式中的(C)与上述核酸序列可操作连接的启动子序列的说明，作为具体实例，例如，列举在神经干细胞中起作用的Hes5启动子(序列编号4)、GFAP启动子、在内耳支持细胞中起作用的Sox2启动子、Lfng启动子等。
作为本实施方式中的(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，优选(a)包含Plagl2基因的核酸序列、和与上述Plagl2基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的多核苷酸，作为更优选实例，可以列举包含序列编号6的核酸序列的那种。
作为本实施方式中的(b2)多核苷酸，只要是在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因的siRNA或miRNA、可以抑制(敲低)上述基因的表达的序列则没有特别限定。上述基因的siRNA或miRNA可根据上述基因的序列设计。例如，Dyrk1a基因的siRNA或miRNA可根据Dyrk1a基因的序列设计，具体地，列举序列编号8的多核苷酸。
将本实施方式的多核苷酸导入靶标细胞的方法没有特别限定，例如，可以列举应用病毒、质粒、人工染色体等载体、或脂质转染、脂质体、显微注射等方法。例如，可以用导入了本实施方式的(a)多核苷酸的载体转化靶标细胞(神经干细胞等)强制表达Plagl2基因等，进一步将作为(b2)多核苷酸的Dyrk1a基因等的siRNA或miRNA转染至靶标细胞抑制Dyrk1a基因等的表达。转染的方法可以使用本领域技术人员以往公知的方法。如此转化的靶标细胞(神经干细胞等)可以充分发挥活化增殖、产生多数神经元等细胞的功能。本实施方式的多核苷酸可对成体脑、老龄脑、疾病脑等中内在的神经干细胞、内耳中存在的支持细胞等适当应用。
＜载体＞
本公开也包含含有上述本公开的多核苷酸的载体。关于本公开的载体包含的本公开的多核苷酸，可以原样适用上述多核苷酸项的说明。
在本公开中，作为用于靶标细胞的在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的强制表达、和/或在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达的抑制(敲低)的载体，只要是能够向靶标细胞(神经干细胞、内耳支持细胞等)有效递送基因的载体则没有特别限定。作为这样的载体，例如，列举慢病毒载体、腺伴随病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体(例如，单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳多空病毒载体(例如，SV40)等病毒载体；质粒载体；噬菌粒载体；粘粒载体；λ噬菌体、M13噬菌体等噬菌体等。其中，优选慢病毒载体、腺伴随病毒载体、腺病毒载体、质粒载体，更优选慢病毒载体、腺伴随病毒载体，进一步优选慢病毒载体。
作为具体的表达载体的实例，列举哺乳动物细胞中的慢病毒介导的基因导入和表达用的pLenti4/V5-DEST(商标)、pLenti6/V5-DEST(商标)和pL enti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)；哺乳动物细胞中的表达用的pClneo载体(Promega)等。
载体可以包含启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子、多腺苷化位点等控制序列，使得目的基因可表达。此外，按需要可以包含抗药性基因(例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等)、胸苷激酶基因、白喉毒素基因等选择标记物序列、mCherry(红色荧光蛋白)、绿色荧光蛋白(GFP)、β葡萄糖醛酸酶(GUS)、FLAG等报告基因序列等。
＜药物组合物＞
本公开还包含含有上述本公开的载体的药物组合物。此外，还包含含有下列的药物组合物：(a)包含在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的核酸序列、和与上述基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的载体、以及(b)包含抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达的核酸序列(例如，针对上述基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列)、和与上述抑制基因表达的核酸序列可操作连接的启动子序列的载体、或针对上述基因的siRNA或miRNA。进一步，还包含含有本公开的转化的细胞的药物组合物。上述本公开的药物组合物也可含有选自由药学上容许的辅助剂、赋形剂、载体和稀释剂组成的组的至少1种。另外，关于本公开的载体、转化细胞，可以适用各自项的说明。这些本公开的药物组合物用于神经变性疾病或内耳疾病的治疗。
本公开此外还包含用于神经变性疾病或内耳疾病治疗的药物组合物，其作为有效成分含有：具有在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达增强能力和在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达抑制能力的化合物、或其前药或其药学上容许的盐。进一步，也包含用于神经变性疾病或内耳疾病治疗的药物组合物，其作为有效成分含有：具有在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达增强能力的化合物、或其前药或其药学上容许的盐，和具有在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达抑制能力的化合物、或其前药或其药学上容许的盐。
上述在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达和在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达优选是神经干细胞或内耳支持细胞中各基因的表达。此外，上述化合物、或其前药或其药学上容许的盐可以是低分子化合物、中分子化合物、高分子化合物的任一。
本公开的药物组合物通过脑室内注射、髄腔内的推注或注入、神经节内注射、神经内注射、皮下注射、或鼓室内注射施用于对象。
本公开的药物组合物的施用量没有特别限定，可按照疾病的种类、患者的年龄和症状、施用途径、治疗的目的、联用药物的有无等各种条件选择适当的施用量。
＜治疗方法＞
本公开也包含神经变性疾病的治疗方法，其特征在于，在神经干细胞中强制表达在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)、抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达。此外，也包含内耳疾病的治疗方法，其特征在于，在内耳支持细胞中强制表达在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)、抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达。作为在神经干细胞、内耳支持细胞等靶标细胞中强制表达在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)、抑制在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达的方法，列举应用本公开的多核苷酸、载体、转化细胞、药物组合物的方法，关于各自的具体的说明可以适用上述多核苷酸、载体、药物组合物的项的说明。
＜转化细胞＞
本公开也包含导入了上述本公开的多核苷酸的靶标细胞。例如，通过上述本公开的载体转化的细胞、通过经本公开的载体的转化和经转染本公开的多核苷酸等转化得到的细胞也包含在本公开中。本公开的转化细胞可在体外配制、施用于需要治疗的受试者。此时，本公开的转化细胞可与药学上容许的辅助剂、赋形剂、载体、稀释剂共同作为药物组合物施用。
进一步，本公开也包含：用具有在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达增强能力和在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达抑制能力的化合物、或其前药或其药学上容许的盐处理转化的细胞，以及用具有在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达增强能力的化合物、或其前药或其药学上容许的盐、和具有在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达抑制能力的化合物、或其前药或其药学上容许的盐处理转化的细胞。作为这样的细胞，优选神经干细胞或内耳支持细胞是上述转化的细胞，此外，上述化合物、或其前药或其药学上容许的盐可以是低分子化合物、中分子化合物、高分子化合物的任一。
＜神经变性疾病或内耳疾病的治疗用物质的筛选方法＞
本公开也包含神经变性疾病或内耳疾病的治疗用物质的筛选方法，其包括：
(1)使被测物质作用于神经干细胞或内耳支持细胞，测定在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)和在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达的步骤，以及
(2-1)根据上述步骤(1)的结果，选择具有在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达增强能力和在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达抑制能力的被测物质的步骤、或
(2-2)根据上述步骤(1)的结果，选择具有在胚胎中高表达、在成体神经干细胞中低表达的基因(Plagl2基因等)的表达增强能力的被测物质、和具有在胚胎中低表达、在成体神经干细胞中高表达的基因(Dyrk1a基因等)的表达抑制能力的被测物质的步骤。
通过本公开的筛选方法选择的物质可使神经干细胞有效活化增殖，产生多数神经元。因此，可以将老龄脑中神经干细胞恢复到青年期或比其更年轻时期的状态，可以期待产生多数神经元、改善记忆和学习能力。此外，也可以期待对阿尔茨海默病等神经变性疾病的治疗效果，可以有效活化内在的神经干细胞产生多数神经元、改善记忆/学习能力。进一步，通过本公开的筛选方法选择的物质不仅可以在脑的神经干细胞也在内耳将支持细胞分化为毛细胞，在内耳疾病的治疗中也期待有效。
实施例
用以下的实施例具体地说明本公开，但本公开不被这些实施例限定性解释。
1.神经干细胞(Neural Stem Cell:NSC)活化基因的筛选
本公开人推断，为了使老化的NSC活化增殖，需要改变多个基因的表达。因此，由于成体NSC的大部分为静止状态，所以将E14小鼠胚胎的神经节隆起和背侧皮质来源的G1/G0NSC的转录组(DDBJ BioProject Acces sion:PRJDB9010)与2～3月龄小鼠的LV-SVZ(SAMD00192826)和DG-SGZ(SAMD00192827)来源的大部分为静止状态的NSC比较，鉴定见到表达差异的核因子和它们的已知调节剂。
首先，鉴定在胚胎中高水平表达、在成体NSC中表达低的基因(“胚胎-高(embryonic-high)”)。随后，在通过bFGF和BMP维持在静止状态(EdU-)的NSC中，使它们的基因在体外过度表达(图1)。2日后，测定掺入EdU的增殖细胞的比例，鉴定能够增殖、活化NSC的基因。在本试验中，使在胚胎中高水平表达的基因的前80个的各自在静止状态的NSC中在体外过度表达，监测NSC的增殖、活化。结果示于图2。在试验的基因中，Gsx2、Dmrt3、Cdk4、Plagl2、Sox21、Ascl1、Tgif2、Plagl1、和Hmga2有效活化静止状态的NSC。
关于Gsx2、Dmrt3、Cdk4、Plagl2、Sox21、Ascl1、Tgif2、Plagl1、和Hmga2进一步进行体内的试验。将这些9个基因在NSC和星形胶质细胞中特异性操作的Hes5启动子(序列编号9)的控制下单独克隆至慢病毒。将各慢病毒注入6月龄小鼠的海马齿状回，1周后研究脑切片(图3)。已知Cdk4和细胞周期蛋白D1的组合(D1K4)活化成体脑的NSC，因此将它们作为阳性对照。在试验的基因中，Plagl2(将序列编号10、Hes5启动子和Plagl2连接而成的序列是序列编号11)与对照小鼠比较最有效地增加6月龄小鼠的海马齿状回中MCM2+有丝分裂细胞(活化NSC、为中间前体细胞的可能性高的细胞)的数目。
随后，为了鉴定能够通过抑制表达增殖、活化NSC的基因，将在胚胎中表达低、在成体NSC中表达高的基因作为对象基因。通过向静止状态的NSC导入作为目标的对象基因的siRNA，实施成体NSC中以高水平表达的基因(“成体-高(adult-high)”)和其调节剂的基因的敲低。体外的敲低筛选的结果示于图4-1、图4-2。从试验的124个基因中，选择通过敲低有效活化静止状态的NSC的11个基因。
应用慢病毒，在Hes5启动子(序列编号9)的控制下与Plagl2共同将上述选择的11个基因的shRNA在体内表达诱导。将各自的慢病毒注射至6月、18月或20月龄的小鼠的海马齿状回，2或4周后研究脑切片。其结果，Cdkn1a、Prkcz、Dyrk1a的shRNA在18月龄小鼠中增加MCM2+活性型NSC/IPC数(图5上)。另外，图5的“对照(control)”显示将仅mCherry连接至Hes5启动子的那种的结果，“随机打乱的序列(Scramble)”显示将mCherry、Plagl2和随机序列连接至Hes5启动子的那种的结果。MCM2+活性型NSC/IPC数的增减通过与“随机打乱的序列”的比较来判断。此外，Dyrk1a(序列编号12)的shRNA(序列编号13)使6月龄和19月龄(18月+4周)的小鼠中DCX+树突+的细胞数与其它比较有效增加(图5中、图5下、图6)。另外，在图5中和图5下中，关于表达诱导MCM2+活性型NSC/IPC数有增加倾向的Prkcz、Dyrk1a、Zbtb7a的shRNA的6月龄和19月龄(18月+4周)的小鼠的DCX+树突+的细胞数进行显示。上述IPC是中间前体细胞(Intermediate progenitor cell)。
根据这些数据显示，Plagl2过度表达和Dyrk1a敲低的联用在6月龄、19月龄小鼠中都最有效活化海马齿状回的神经新生，将这2个基因表达的联用命名为iPaD(诱导Plagl2和抗Dyrk1a活性)。为这2个基因表达的组合的iPa D(序列编号14)使包含Sox2+GFAP+BrdU+活化NSC、和DCX+树突+BrdU+未成熟神经元的MCM2+和/或BrdU掺入细胞的个数增加。其结果提示，在成体脑、老龄脑等中，通过内在的神经干细胞的Plagl2过度表达和Dyrk1a敲低，可使该神经干细胞有效活化增殖，产生多数神经元，改善记忆/学习能力。
2.iPaD对神经发生的长期效果
为了研究iPaD慢病毒对老龄脑的神经新生带来的长期效果，向18月龄小鼠的海马齿状回导入iPaD慢病毒。在该月龄的小鼠中，活化NSC(MCM2+；DCX-)、IPC(MCM2+；DCX+/-)、未成熟神经元(MCM2-；DCX+；树突+)在该区域只少量存在，对照的慢病毒对该数目不造成影响(图7对照/8wpi)。另一方面，iPaD慢病毒有效活化NSC，感染1月后(19月龄)诱导IPC和未熟神经元的形成(图7iPaD/4wpi)。由于感染后第8周和第12周(分别为20月龄和21月龄)也见到同样的效果(图7iPaD/8wpi，iPaD/12wpi)，提示在高龄脑中，通过经iPaD慢病毒的内在性神经干细胞的Plagl2过度表达和Dyrk1a敲低，神经新生持续活化。另外，即使Plagl2单独也活化神经新生，但不如iPaD慢病毒有效(图8)。通过将Dyrk1a敲低与Plagl2过度表达组合，在神经干细胞的活化和神经元形成中得到显著效果。这些结果提示，通过iPaD慢病毒活化的NSC连续增殖，即使在3月后也不消耗。在野生型海马中，MCM2+或DCX+细胞数随年龄增长显著减少，在18月龄几乎消失(图9-1)。但是，由于iPaD慢病毒使老龄脑(19月龄)的海马齿状回中这些细胞数增加到9月龄或更年轻的野生型小鼠同程度的水平(图9-2)，提示老龄脑中的神经新生可通过iPaD慢病毒有效再活化。
为了确认iPaD慢病毒对阿尔茨海默病是否产生治疗效果，向阿尔茨海默模型小鼠的海马齿状回导入iPaD慢病毒，进行与上述同样的分析。其结果，iPaD慢病毒有效诱导阿尔茨海默模型小鼠的NSC，诱导IPC和未熟神经元的形成。此外，β淀粉样蛋白的沉积被抑制，在条件恐惧试验中观察到记忆改善。关于细节，记载于以下的“4.通过iPaD的阿尔茨海默病的治疗效果”的项。
此外，为了研究iPaD慢病毒是否能够活化非NSC，注入到不存在神经干细胞的脑区域。由于Hes5启动子在星形胶质细胞中也显示活性，但均不表达MCM2、DCX，提示通过iPaD慢病毒诱导的活化是NSC特异性的。
3.通过iPaD的认知功能的提高(巴恩斯迷宫试验)
为了研究活化的神经新生是否使高龄小鼠的认知功能提高，用巴恩斯迷宫试验(Barnes maze test)分析空间学习和记忆。应用该试验，先前显示空间学习和记忆依赖于海马齿状回的神经新生(Imayoshi,I.,et al.Roles of continuous neurogenesis inthe structural and functional integrity of th e adult forebrain.Nat Neurosci11,1153-1161(2008))，高龄小鼠与年轻小鼠相比在训练期为了到达目标孔需要长的距离和潜伏期，显示更差的性能(Shoji,H.&Miyakawa,T.Age-related behavioral changesfrom young to old age in male mice of a C57BL/6J strain maintained under agene tic stability program.Neuropsychopharmacol.Rep.39,100-118(2019))。
将19月龄的小鼠分为2组，1月前注射对照慢病毒和iPaD慢病毒(图10-1)。对这些小鼠如下实施巴恩斯迷宫试验。即，在各行为分析中，每1组应用10～12只雄小鼠。应用ANY迷宫软件(Stoellting公司制)检测多个体点进行小鼠的自动追踪。病毒注入的1日前，为了使手术的损伤恢复，将P7C3-A20(MedKoo)10mg/kg1日1次腹腔内注射施用直至牺牲。P7C3-A20溶解于5％右旋糖、3％DMSO、10％Cremophor EL(Nakarai)溶液。空间记忆应用巴恩斯圆形迷宫(直径92cm、12孔、Brain science idea公司制)测定。将行为测试空间用黑色窗帘围起，将代表性的4个提示(Cue)距离迷宫端部30cm以上配置。在1个逃生孔进行5分钟的驯化。驯化阶段的1日后，为了各小鼠记忆在小鼠间随机化但各个小鼠每只固定的1个逃生孔的位置，1日2次进行训练。在训练的最初，将小鼠放入迷宫中央的白色圆柱中30秒，开始记录时使圆柱脱落。各记录在小鼠进入逃生孔、或围绕逃生孔的周围10秒后、最大5分后自动停止。在5分钟的训练中小鼠没有找到逃生孔的情形中，实验者轻轻诱导小鼠，诱导至逃生孔。自进入逃生孔60秒，小鼠在逃生孔中不混乱地放置。训练结束后，以1日间隔实施3分钟第1次的探针测试。在训练中，用设置在迷宫正上方的摄像机，记录总距离、围绕正确孔和误解孔周围的次数、至进入目标孔的等待時间。在探针测试中，记录正确孔和误解孔周围的总距离、访问次数、滞留時间。光的强度在训练第1日为100勒克斯，1日强化30勒克斯左右。迷宫用70％乙醇溶液彻底洗涤，每次试验时干燥。
其结果知晓，注入iPaD慢病毒的小鼠与注入对照慢病毒的小鼠相比以更短距离到达目的孔，误差少，等待时间短(图10-2)。在最初的探针测试(训练后1日后)中，iPaD小鼠比对照小鼠更长滞留在目标孔(图10-3)。这些数据显示，通过注入iPaD慢病毒，巴恩斯迷宫试验中高龄小鼠的认知功能提高。
4.阿尔茨海默病模型小鼠和正常小鼠的比较
(1)海马齿状回中MCM2阳性细胞数和DCX阳性细胞数、以及β淀粉样蛋白沉积的比较
作为阿尔茨海默病模型小鼠，使用5×FAD小鼠。5×FAD小鼠是将突变型人淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)(瑞典突变:K670N,M671L；佛罗里达突变:I716V；伦敦突变:V717I)基因、突变型人早老素1(PS1)(M146L；L286V)基因在小鼠Thy1启动子控制下导入(Tg6799系)的小鼠。在该小鼠中，β淀粉样蛋白沉积在脑区域，神经元新生也降低，记忆和学习能力变差。5×FAD小鼠(B6/SJL遗传背景)购自Jackson Laboratory，与C57BL/6J野生型小鼠交配2代以上应用。使用野生型同胞幼小鼠作为对照动物。全部小鼠按照“京都大学有关动物实验实施的规定”处理。实验方案得到了京都大学病毒/再生医科学研究所动物实验委员会的认可。
关于4月龄、6月龄以及8月龄的阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)和正常小鼠(野生型同胞幼小鼠)，制备海马齿状回的切片，通过免疫染色计数MCM2阳性细胞数、DCX阳性细胞数，确认随月龄的变化。结果示于图11(MCM2阳性细胞)、图12(DCX阳性细胞)。另外，关于标记细胞的定量的评价，按照“标记细胞的定量的评价”的项中记载的方法。此外，关于4月龄、6月龄和8月龄的阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)也制备海马齿状回的切片，确认随β淀粉样蛋白沉积的月龄的变化。结果示于图13。另外，关于β淀粉样蛋白沉积的定量的评价，按照“β淀粉样蛋白沉积的定量的评价”的项中记载的方法。
(标记细胞的定量的评价)
各实验中将3只以上小鼠的海马齿状回用于分析。关于各动物，制备距iPaD慢病毒注入点前方的海马齿状回的50μm厚的连续切片，每第7张进行评价。将除损伤切片的所有切片用于免疫染色。免疫染色后，通过共聚焦显微镜(LSM780)，应用10倍或20倍的物镜取得z-stack图像。应用Imaris软件(Bitplane)或ImageJ计数染色细胞，定量为海马齿状回的每1mm3的细胞数。
(β淀粉样蛋白沉积的定量的评价)
各小鼠的每第7张的脑切片用小鼠抗β-淀粉样蛋白一抗(Clone 6E10；1:500；BioLegend 9320)标记，用荧光标记的二抗检测。免疫染色后，通过共聚焦显微镜(LSM780)，用10倍物镜取得z-stack图像。在充分的阈值处理和噪声除去后，应用ImageJ定量化Aβ斑块的数目。结果表示为海马齿状回每1mm3的斑块数。
如图11所示，为活性型NSC的标记物的MCM2是阳性的细胞数在4月龄的正常小鼠中为约1000细胞/mm3，但月龄进展时减少，在6月龄为约700细胞/mm3，在8月龄为约680细胞/mm3。另一方面，在阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)中，即使4月龄MCM2阳性细胞数也少至约350细胞/mm3，即使月龄进展也保持为少，没有大变化。
如图12所示，为未分化神经标记物的DCX是阳性的细胞数在4月龄的正常小鼠中为约2700细胞/mm3，但月龄进展时减少，在6月龄为约1500细胞/mm3，在8月龄为约800细胞/mm3。另一方面，在阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)中，即使4月龄DCX阳性细胞数也少至约1200细胞/mm3，月龄进展时进一步减少，在6月龄为约800细胞/mm3，在8月龄为约150细胞/mm3。
如图13所示，在阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)中，月龄进展时β淀粉样蛋白沉积(β淀粉样蛋白斑块)显著增加，在4月龄为约1000斑块/mm3，但在6月龄为约2400细胞/mm3，在8月龄为约3700细胞/mm3。
(2)行为试验
对阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)和正常小鼠(野生型同胞幼小鼠)按以下记载的方法进行行为试验(巴恩斯圆形迷宫试验、情景条件恐惧试验)。结果示于图14(巴恩斯圆形迷宫试验)、图15(情景条件恐惧试验)。
各行为分析中每1组使用8～12只雄小鼠。应用ANY-maze软件(Stoeltin g公司制)进行小鼠的自动追踪，以检测多个身体点。另外，在进行病毒注入的试验的情形中，将P7C3-A20(MedKoo公司制)10mg/kg自病毒注入1日前腹腔内施用1周，1日1次，谋求手术损伤的恢复。P7C3-A20溶解于5％右旋糖、3％DMSO、10％Cremophor EL(Nakarai)溶液。
通过与上述“3.通过iPaD的认知功能的提高(巴恩斯迷宫试验)”的项同样的巴恩斯迷宫试验，确认空间记忆。
关于情景记忆，部分修正先前报告中记载的方案，通过情景条件恐惧试验来评价(Walgrave,H.et al.,Cell Stem Cell 28,1805-1821.e1808,doi:10.1016/j.stem.2021.05.001(2021))。将连接到电击发生器的24根不锈钢制棒安装在腔室(17×10×10cm)的地板，在具有60dB的背景白噪声的声衰减隔间内进行试验。第1日，将各小鼠放入腔室(情景A、地板：不锈钢棒、壁：无色透明)，使其探索3分钟。其后，给予80mA的2秒的足电击(foot shock)。小鼠在腔室内进一步停留1分钟。各动物每个用70％乙醇消毒、干燥腔室。24、48小时后，将小鼠再次放入情景A，重复与第1日相同的程序。应用TimeFZ2(O′HARA&CO.,LTD,Japan)，测定最初3分钟的恐怖反応。
另外，在本实施例中，用平均值±标准误差(SEM)表示数据。统计分析应用R软件进行。统计学差异应用一元方差分析或二元方差分析研究，进一步，作为后检验，应用Tukey-Kramer法、或Bonferroni法。P值＜0.05被视为显著。
如图14和15所示，知晓阿尔茨海默病模型小鼠(5×FAD小鼠)与正常小鼠比较空间记忆能力、情景记忆能力都差。
5.通过iPaD的阿尔茨海默病的治疗效果
为了研究iPaD慢病毒是否具有阿尔茨海默病的治疗效果，向5月龄的5×FAD小鼠的海马齿状回导入对照慢病毒或iPaD慢病毒。4周后(6月龄)、12周后(8月龄)制备距慢病毒注入点前方的海马齿状回的50μm厚的连续切片，每第7张确认MCM2阳性细胞数、DCX阳性细胞数、β淀粉样蛋白沉积并评价。此外，自iPaD慢病毒导入后经4周，也进行行为试验(巴恩斯圆形迷宫试验和情景条件恐惧试验)。结果示于图16(MCM2阳性细胞)、图17(DCX阳性细胞)、图18(β淀粉样蛋白沉积)、图19(巴恩斯圆形迷宫试验)、图20(情景条件恐惧试验)。另外，关于标记细胞的定量的评价，按照上述“标记细胞的定量的评价”的项中记载的方法进行，关于β淀粉样蛋白沉积的定量的评价，按照上述“β淀粉样蛋白沉积的定量的评价”的项中记载的方法进行，关于巴恩斯圆形迷宫试验，按照上述“3.通过iPaD的认知功能的提高(巴恩斯迷宫试验)”的项中记载的方法进行，关于情景条件恐惧试验，按照上述“4.阿尔茨海默病模型小鼠和正常小鼠的比较”的项的“(2)行为试验”中记载的方法进行。
如图16所示，在导入iPaD慢病毒的小鼠中，为活性型NSC的标记物的MCM2是阳性的细胞数在施用后第4周显著增加。在施用后第12周比第4周减少，但比对照显著多。
如图17所示，在导入iPaD慢病毒的小鼠中，为未分化神经标记物的DCX是阳性的细胞数在施用后第4周显著增加。在施用后第12周比第4周减少，但比对照显著多。
如图18所示，关于β淀粉样蛋白沉积，在导入iPaD慢病毒后第4周，未见与导入对照慢病毒的对照的差异，但在导入后第12周，可以确认显著的抑制效果。即，在对照中，β淀粉样蛋白的斑块数与第4周比较增加至2倍以上，与之相比，在导入iPaD慢病毒的小鼠中，抑制为1.2倍左右的增加。
如图19和图20所示，在导入iPaD慢病毒的小鼠中，空间记忆和情景记忆分别恢复到图14和图15所示的正常小鼠的水平。
如以上知晓，通过iPaD慢病毒的导入阿尔茨海默病的症状显著改善，得到优异的治疗效果。
6.通过iPaD的从内耳支持细胞向毛细胞的分化诱导
在出生后1月龄的年轻小鼠的内耳的支持细胞(Hensen细胞)中，使iPa D表达2周。在许多情形中，形成由数个BrdU+细胞组成的群(认为1个支持细胞分裂为数个细胞)，但该图所示的群由11个BrdU+细胞组成(图21)。认为1个支持细胞分裂为11个细胞。其中3个细胞为mCherry+(2、3、7号)。由于Hes5启动子在内耳中仅在支持细胞中微弱起作用、而在其它细胞中不起作用，提示mCherry阴性的8个细胞从支持细胞变化为其它细胞种类的可能性。其中1个细胞(11号)为肌球蛋白6阳性，认为分化为毛细胞。由于此时期的支持细胞已经失去细胞增殖能力，提示通过iPaD有效恢复增殖能力、至少一部分可分化为毛细胞的可能性。
产业上的可利用性
根据本公开，通过将特定的基因组导入成体脑、老龄脑，可使内在的神经干细胞有效活化增殖，产生多数神经元。可以将老龄脑中神经干细胞恢复到青年期或比其更年轻时期的状态，能够产生多数神经元，改善记忆、学习能力。此外，也可以期待对阿尔茨海默病等的神经变性疾病的治疗效果，能够有效地活化内在的神经干细胞产生多数神经元、改善记忆/学习能力。进一步，本发明的特定的基因组不仅在脑的神经干细胞、在内耳也可以使支持细胞分化为毛细胞，提示在内耳疾病的治疗中也有效。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学
<120> 用于神经变性疾病治疗的多核苷酸、载体、细胞、药物组合物和筛选方法
<130> 7181_FP4751PCT-W
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atgaccacat ttttcaccag cgtccccccc tggattcaag atgcaaagca ggaggaggaa 60
gtgggctgga aactagttcc caggcctcgg ggccgggagg cggagagtca agtgaagtgc 120
caatgtgaaa tttcgggaac acctttctca aatggggaga agctgaggcc tcacagcctc 180
ccgcaaccag agcagagacc atatagctgc cctcagctgc actgtggcaa ggcttttgct 240
tccaaataca agctgtatag gcacatggcc acccactcag cccagaaacc ccaccagtgt 300
atgtactgtg ataagatgtt tcaccgcaag gaccatctgc ggaaccatct gcagacccat 360
gatcctaaca aagaggccct ccactgctct gagtgcggta agaattacaa tacgaagctg 420
ggctaccggc gccacctggc catgcatgct gccagcagcg gtgacctcag ctgcaaggtg 480
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cgggtagcag gcggtgccaa ggagaagaag cacccctgtg accactgcga ccggcggttc 600
tatactcgta aggatgtacg gcggcaccta gtggtgcaca caggccgtaa ggacttcctg 660
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agccactcgc aggagctgct caagatcaag acagagcccg tggacatgtt aggcctactc 780
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cacatcccta ccatgcccag cacgggcgtg ccacactccc tggtgcacaa cacgctgccc 960
atgggtatga gctaccctct ggaatcctca cctatctctt ccccagctca gctccctcca 1020
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<211> 5518
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
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ggatgccagg tgcctttaga atgaccgtat catttaccct agaggttcat gacgttcctg 2040
tctaaggaaa tgtgcgtcag caatttcctg ctcctcttgg ttggtcaggc actgaagctc 2100
ctacacaggt cactgttgaa actcatcctg ttcaagaaac aacctttcat gtagcccctc 2160
aacagaatgc attgcatcat caccatggta acagttccca tcaccatcac caccaccacc 2220
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attctccaac gaatagctcc tctacccaag attctatgga ggttggccac agtcaccact 2340
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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ccaggc 1506
<210> 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 1921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 启动子shRNA
<400> 7
aaggctcctc attggaccct gccagctggc cagggaaccc cactcctgga ttcaaactct 60
gcctaaccag ccctgatgcc agccccagct ctgggggcta aggcccttcc gctaggaccc 120
ggcagggtcc caacctgtct ctaggagcca gcccaggccc cgaatcctct cctagtctct 180
gctgcagagc atttgaggaa ctgtgaccgc aggctagggg gtgggggtct cccaagggac 240
cctcccctaa ggacccaggg tgggattcat tgcctcaaag tggctgcggg cactcagctc 300
agttggccag gtaccggggt tattagctca tcccatggac cggtggttgg gggcgggggg 360
ctagggctgg catggcctct gatcctcaag tctgccacct ggcacccact ccctacccac 420
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gcacttgttc attctacagt ttttccctta tctgctccta cggcctctgc cagccagcag 1020
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gctgcggaga agtcactcct ctcaactgac agaactggca ataaagcgcc taaattctaa 960
atacatgagt ccctctctca tcctgtacct gcgaatggca tggcggcagc atctgtttga 1020
gagaatgtgg cccactttaa cccactgtgc ctgtgggcaa caggtcccag ctggggaggg 1080
tgcccactcc tctggaagtc gctgtctgtt cattgtaaaa ctctcatttc tctgcgcctg 1140
tggcctctgc cagccagcgg tggggagcct ctggggagtg ggagggaaga agggagagaa 1200
ggggggggga gagcactcct tcctgccctc cccacctccc cgcggcctgg gaaaaggcag 1260
catattgagg cgcggggctc tcagcatcag gccccgggat gctaatgagg gcgagcgcgt 1320
tcccacagcc cggacattgt gccgcgcggc ccacctgctc ctcggggagc gaccattgtg 1380
cccgcgccaa ttcacaggca atttagcgtg cgctaatggg ccggcgcctt tgtgcggccg 1440
gcgccgccat tggccgccga gtgtgggaac ggccgcggcg cccggacccc aggcgccggg 1500
ccgctgcccg cgcctatata gggctggcgt gctggggtcc aggtcgcgcc agtccgggac 1560
gcctggctct gtccgctccg ctccgctccg ctcgctaatc gcctccagag ctccaggcct 1620
taagaggcag gcaggcttaa ttaagccacc atgaccacat ttttcaccag cgtccctccc 1680
tggattcaag atgcaaagca ggaggaggaa gtgggctgga aactagttcc caggcctcgg 1740
ggccgggagg cagagagtca agtgaagtgc caatgtgaaa tctcggggac accattttca 1800
aatggggaga agctaaggcc tcacagcctt ccccatccgg agcagagacc atatagctgt 1860
cctcagctgc actgcggcaa ggcttttgcc tccaagtaca agctgtatag gcacatggcc 1920
acccactcgg cccagaaacc ccaccagtgc atgtactgtg acaagatgtt tcaccgaaag 1980
gaccatctgc ggaaccactt gcagacccat gaccccaaca aagaggccct ccactgctct 2040
gagtgtggta agaattataa tacaaagctg ggataccgtc gtcacctggc catgcatgct 2100
gccagcagtg gtgatctcag ctgcaaggtg tgcctgcaga cctttgagag tacccaggcc 2160
ctattggagc acctgaaggc tcactcacgc cgggtagcag gaggtgctaa ggagaagaag 2220
cacccctgtg accattgtga caggcggttc tatactcgga aggatgtccg acggcaccta 2280
gtggtgcaca caggtcgtaa ggacttcctg tgtcagtact gtgcccagag atttggccgc 2340
aaggatcacc tgacacgcca tgtcaagaag agccactcac aggaactgct caagatcaag 2400
acagagccag tggatatgtt aggcttgctc agctgtagct ctacagtcag tgtaaaggaa 2460
gagctgagcc ctgtgctttg catggcctct cgggacgtga tgggggctaa ggcctttcct 2520
ggcatgttgc ccatgggtat gtatggtgcc cacatcccta ccatgcccag tgcgggcatg 2580
ccacactccc tggtgcacaa cacactgccc atgggtatga gttaccctct ggaatcttct 2640
cctatctcct cctcagctca gctccctcca aaataccagc ttggatctac ctcatacttg 2700
cccgacaaac tgcccaaagt ggaggtggat agttttctgg cagagcttcc tggaagcctg 2760
tctctctcct cggctgaacc tcagcccgcc tcacctcagc cggcggcagc tgcagccctc 2820
ctggatgaag cactgctcgc caagagtccc gccaacctct ccgaggccct ctgcgctgct 2880
aatgtggact tttcccactt actgggcttt cttccgctca acctaccccc atgtaaccca 2940
ccaggggcca caggaggctt ggttatgggc tactcccaag ctgaggcaca gcctttgctc 3000
accactttgc aggctcagcc tcaagattcc gctggagctg ggggacccct gaactttggg 3060
cctctgcact ccttacctcc tgtcttcacc tctggcctga gtaccaccac cctgcctcgt 3120
ttccaccaag cattccaggg aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 3180
gacgtggagg agaaccctgg acctgtgagc aagggcgagg aggataacat ggccatcatc 3240
aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag 3300
atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg 3360
accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc 3420
tccaaggcct acgtgaagca ccccgctgac atccccgact acttgaagct gtccttcccc 3480
gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 3540
caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac 3600
ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag 3660
cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag 3720
gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag 3780
ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag ttggacatca cctcccacaa cgaggactac 3840
accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag 3900
ctgtacaagg atatccctcc aaagaagaag agaaaggtgt aaggcgcgcc tagggataac 3960
agggtaattg tttgaatgag gcttcagtac tttacagaat cgttgcctgc acatcttgga 4020
aacacttgct gggattactt cgacttctta acccaacaga aggctcgaga aggtatattg 4080
ctgttgacag tgagcgcgct gtgtatattg taacgttata gtgaagccac agatgtataa 4140
cgttacaata tacacagcat gcctactgcc tcggacttca aggggctaga attcgagcaa 4200
ttatcttgtt tactaaaact gaataccttg ctatctcttt gatacatttt tacaaagctg 4260
aattaaaatg gtataaatta aatcactcta gtaataaagg atcctttatc ttcattggat 4320
ccgtgtgttg gttttttgtg tgcggcccgt ctagacc 4357

Claims (12)

1.多核苷酸，其特征在于包含：
(A)Plagl2基因的核酸序列，
(B)针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列，和
(C)与所述核酸序列可操作连接的启动子序列。
2.权利要求1中所述的多核苷酸，其中，所述Plagl2基因和Dyrk1a基因是哺乳动物基因。
3.权利要求1或2中所述的多核苷酸，其中，所述启动子是选自由Hes5启动子、GFAP启动子、Sox2启动子和Lfng启动子组成的组的启动子。
4.载体，其包含权利要求1至3的任一项中所述的多核苷酸。
5.权利要求4中所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体、腺伴随病毒载体、腺病毒载体或质粒载体。
6.药物组合物，其含有权利要求4或5中所述的载体。
7.药物组合物，其含有：
(a)包含Plagl2基因的核酸序列和与所述Plagl2基因的核酸序列可操作连接的启动子序列的载体，以及
(b)包含针对Dyrk1a基因的miR-shRNA(microRNA适应短发夹RNA)的核酸序列和与所述miR-shRNA的核酸序列可操作连接的启动子序列的载体，或针对Dyrk1a基因的siRNA或miRNA。
8.细胞，其通过权利要求4或5中所述的载体转化而成。
9.药物组合物，其含有权利要求8中所述的细胞。
10.权利要求6、7或9中所述的药物组合物，其用于神经变性疾病或内耳疾病的治疗。
11.权利要求10中所述的药物组合物，其通过脑室内注射、髄腔内的推注或注入、神经节内注射、神经内注射、皮下注射、或鼓室内注射施用于对象。
12.神经变性疾病或内耳疾病的治疗用物质的筛选方法，其包括：
(1)使被测物质作用于神经干细胞或内耳支持细胞，测定Plagl2基因和Dyrk1a基因的表达的步骤，以及
(2-1)根据所述步骤(1)的结果选择具有Plagl2基因表达增强能力和Dyr k1a基因表达抑制能力的被测物质的步骤，或
(2-2)根据所述步骤(1)的结果选择具有Plagl2基因表达增强能力的被测物质和具有Dyrk1a基因的表达抑制能力的被测物质的步骤。
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