CN117004579A

CN117004579A - 重组溶瘤牛痘病毒及其应用

Info

Publication number: CN117004579A
Application number: CN202310781871.0A
Authority: CN
Inventors: 居颂光; 葛彦
Original assignee: Suzhou Enliwei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Enliwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2023-11-07

Abstract

本发明提供了重组溶瘤牛痘病毒，此病毒可操作地插入能够表达4‑1BBL的同义突变后的外源基因，并提供了其在制备预防或治疗肿瘤、癌症的药物中的应用。有益效果为：基于同义突变的重组牛痘病毒VV‑mH4‑1BBL，保留了溶瘤病毒原有的溶瘤作用和启动及增强抗肿瘤免疫应答作用，且通过删除TK基因提升了安全性；4‑1BBL在肿瘤细胞表面高表达，可使得4‑1BBL以激发肿瘤微环境中4‑1BB+免疫细胞(包括T细胞)的4‑1BB信号的方式增强抗肿瘤免疫，还将4‑1BBL局限在肿瘤组织中集中发挥作用，规避了潜在的全身性毒副作用；引入同义突变位点使得此病毒在治疗过程中可检测到治疗性(外源性)4‑1BBL基因的表达。

Description

重组溶瘤牛痘病毒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及重组溶瘤牛痘病毒及其应用。

背景技术

激发免疫细胞的4-1BB信号可引发强烈和持久的抗肿瘤免疫，目前已有4-1BB激发型单抗进入临床研究，例如urelumab单抗和utomilumab单抗等。全身性使用这类抗体时，由于起效剂量和安全剂量之间差别小，往往在有效激发抗肿瘤免疫效应时出现全身性毒副作用，或者无明显毒副作用时但抗肿瘤效应也不显著。这些矛盾性问题极大限制了其临床应用。

可溶性4-1BBL可激发4-1BB信号，未见于临床应用研究，如果直接全身性使用，可在全身强烈增强免疫应答，带来严重毒副作用。

溶瘤病毒可选择性感染肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞免疫原性死亡、启动机体抗肿瘤免疫并引发局部炎症充当免疫佐剂。但单纯使用溶瘤病毒治疗肿瘤往往因为机体的抗病毒效应将病毒迅速清除，因而需要在溶瘤病毒发挥作用后，增强其引发的抗肿瘤免疫方能诱导强烈而持久的抗肿瘤效应。因而，需要引入免疫增强因子来改善溶瘤病毒的抗肿瘤作用。

已有研究报道了采用小鼠4-1BBL基因构建了鼠4-1BBL重组溶瘤病毒，通过小鼠模型证明了其作用的可靠性。然而，新近的研究发现，野生型4-1BBL基因普遍表达于肠癌等肿瘤细胞，且其编码产物(即4-1BBL分子)定位于细胞内而并不定位在细胞表面，因此，如果用野生型4-1BBL基因构建4-1BBL重组溶瘤病毒进行治疗过程中，将无法检测和追踪治疗性4-1BBL的表达和定位。

溶瘤病毒可以选择性感染并导致肿瘤细胞免疫原性死亡，进而引发机体抗肿瘤免疫应答，使其成为肿瘤免疫治疗的可行手段进入肿瘤免疫药物研发领域。然而溶瘤病毒作为病毒本身容易被机体清除，溶瘤病毒引发的抗肿瘤免疫又面临被免疫检查点等负性机制阻断的共性问题。因此，构建重组溶瘤病毒，保留原有溶瘤病毒的优势、规避其弱点，进而重组入免疫增强因子，克服负性免疫机制，引发机体安全、有效、全身和持久的抗肿瘤免疫是这一领域的总体设计思想。

共刺激分子配体4-1BBL通过作用于T细胞、NK细胞、DC等表面的4-1BB分子，即通过4-1BB/4-1BBL途径强烈促进机体抗肿瘤免疫。因而，以4-1BB/4-1BBL途径为刺激靶点研发的生物制剂可能成为新型抗肿瘤药物。激发型4-1BB单克隆抗体和4-1BBL重组溶瘤病毒是这一领域研发的重要生物制剂，然而其中的不足之处制约了他们的未来应用，需要进行改进。

激发型4-1BB单克隆抗体可以激活4-1BB/4-1BBL途径产生的强烈的抗肿瘤效应，然而其有效抗肿瘤作用和产生毒副作用之间所用的单克隆抗体剂量差别较小，即安全剂量范围小。因此，选择了天然配体4-1BBL作为4-1BB分子的免疫激活剂可提供天然的刺激方式激活4-1BB信号。另外如果直接采用可溶性4-1BBL治疗肿瘤，可能由于细胞因子的全身效应带来毒副作用。

然而，已有研究表面，4-1BBL分子普遍存在于肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞内部，但不表达于细胞膜，这样肿瘤细胞可以避免刺激免疫细胞表面的4-1BB分子，这是一种肿瘤免疫逃逸机制。如采用天然配体4-1BBL构建重组溶瘤病毒可以将4-1BBL表达于肿瘤细胞表面，激发抗肿瘤免疫。然而，未来的治疗过程中，无法区分肿瘤组织的4-1BBL基因来源于肿瘤组织自身还是治疗性的4-1BBL重组溶瘤病毒，对于疗效的监控和评判都有极大困难。

发明内容

针对上述存在的技术局限性，本发明提出了重组溶瘤牛痘病毒及其应用，建立新型的4-1BB信号激发方式，保留4-1BBL激发4-1BB信号的免疫作用，改善其使用安全性，并提供一种可检测和监测治疗过程和疗效的新型生物制剂，克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的发明点是提供了重组溶瘤牛痘病毒，所述重组溶瘤牛痘病毒可操作地插入能够表达4-1BBL的同义突变后的外源基因。

可选地，上述的重组溶瘤牛痘病毒，所述外源基因插入至牛痘病毒TK基因中。

可选地，上述的重组溶瘤牛痘病毒，所述外源基因的DNA序列如SEQ ID No.1-SEQID No.3所示。

申请人列出了此三种同义突变后的基因序列，但其并不能限制本发明技术的范围，实际上，只要最终编码得到的多肽/氨基酸/蛋白序列相同(功效相同或近似)，任意一个或几个位点的同义突变均是可行的。

SEQ ID No.1(540T突变为C)的序列为：

atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggcCttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaataa。

SEQ ID No.2(468G突变为A)的序列为：

atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgaAggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaataa。

SEQ ID No.3(597C突变为T)的序列为：

atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttTcagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaataa。

可选地，上述的重组溶瘤牛痘病毒，所述外源基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.4的序列为：

MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE。

可选地，上述的重组溶瘤牛痘病毒，所述外源基因通过IRES序列连接。

IRES为核糖体进入位点，其只是可使用的连接序列之一。

可选地，上述的重组溶瘤牛痘病毒，所述IRES序列如SEQ ID No.5所示。

SEQ ID No.5的序列为：

TTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCACGTCCCCGTGGTTCGGGGGGCCTAGACGTTTTTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGCACCGAGGCCCCAGATCAGATCCCATACAATGGGGTACCTTCTGGGCATCCTTCAGCCCCTTGTTGAATACGCTTGAGGTGAGCCATTTGACTCTTTCCACAACTATCCAACTCACAACGTGGCACTGGGGTTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATCTTATACACGTGGCTTTTGGCCGCAGAGGCACCTGTCGCCAGGTGGGGGGTTCCGCTGCCTGCAAAGGGTCGCTACAGACGTTGTTTGTCTTCAAGAAGCTTCCAGAGGAACTGCTTCCTTCACGACATTCAACAGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAGGGGAAAGACCCCTAGGAATGCTCGTCAAGAAGACAGGGCCAGGTTTCCGGGCCCTCACATTGCCAAAAGACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGGCCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGG。

本发明的第二个发明点是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的重组溶瘤牛痘病毒、药学上可接受的载体和药物辅料。

可选地，上述的药物组合物，所述药物组合物的给药方式为直接注射和/或结合内镜注射；内镜优选为腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜和神经内镜。

本发明的第三个发明点是提供了上述的重组溶瘤牛痘病毒、上述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

可选地，上述的应用，所述肿瘤和/或癌症为实体瘤，优选为冷肿瘤和/或热肿瘤，其组织学类型包括但不限于胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤。

本发明的关键技术点及优势在于：

1、同义突变的人4-1BBL基因序列，该序列可用于重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL治疗肿瘤患者后检测和监测其治疗性(外源性)4-1BBL的表达和分布；

2、基于同义突变的人4-1BBL基因序列的重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL，该重组病毒保留了溶瘤病毒原有的溶瘤作用、启动抗肿瘤免疫应、作为佐剂增强免疫应答的作用特点和优势，也通过删除TK基因使其在原本安全性好的基础上更安全；通过重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL将4-1BBL实现在肿瘤微环境中的肿瘤细胞表面高表达，实现了4-1BBL激发肿瘤微环境中4-1BB+免疫细胞(包括T细胞)的4-1BB信号增强抗肿瘤免疫，还将4-1BBL局限在肿瘤组织集中发挥作用，规避了全身性使用激发型4-1BB单抗或可溶性4-1BBL治疗肿瘤带来的潜在的全身性毒副作用。

与其他溶瘤病毒相比，牛痘病毒有其特殊性：

1、曾经在全人类大规模接种用于预防天花，已经证实了其安全性；

2、TK基因在正常细胞中的弱表达/不表达和诸多肿瘤细胞中的强表达决定了敲除TK基因后的VV在正常细胞几乎不表达，说明了以VV为亲本病毒改建后的产品具有极高的安全性。

本发明通过构建人4-1BBL同义突变基因(同义突变是DNA片段中某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸)，并在此基础上构建人4-1BBL同义突变基因重组溶瘤痘病毒VV-mH4-1BBL，既保留了溶瘤病毒原有的溶瘤作用、启动抗肿瘤免疫应、作为佐剂增强免疫应答的作用特点和优势，也通过删除TK基因使其在原本安全性好的基础上更安全；通过重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL将4-1BBL实现在肿瘤微环境中的肿瘤细胞表面高表达，实现了4-1BBL激发肿瘤微环境中4-1BB+免疫细胞(包括T细胞)的4-1BB信号增强抗肿瘤免疫，还将4-1BBL局限在肿瘤组织集中发挥作用，规避了全身性使用激发型4-1BB单抗或可溶性4-1BBL治疗肿瘤带来的潜在的全身性毒副作用。

mH4-1BBL在制备肿瘤药物方面的应用，具有以下几个方面的态势和效果：

1、mH4-1BBL改善肿瘤微环境抗肿瘤免疫态势的应用：

肿瘤细胞与抗肿瘤免疫的相互作用，共同决定着肿瘤的发生和进展。肿瘤微环境中免疫细胞(尤其是树突状细胞DC和T细胞)的数量和功能状态是影响肿瘤免疫治疗效果和患者转归的关键要素之一。

mH4-1BBL主要通过溶瘤病毒的特性溶解局部肿瘤组织，启动免疫应答，在肿瘤局部建立肿瘤免疫的炎性环境；通过表达的mH4-1BBL编码蛋白并使其表达于肿瘤细胞表面，增强和维持肿瘤组织“炎性环境”DC和T细胞等免疫细胞的抗肿瘤功能状态。因而，VV-mH4-1BBL对于不同免疫状态下的肿瘤组织均具有作用：基于肿瘤微环境的免疫分型角度，VV-mH4-1BBL可用于“免疫炎性型”肿瘤组织(即“热肿瘤”，已有T细胞等免疫细胞浸润)，使得“热肿瘤”更“热”，即进一步增强肿瘤微环境的免疫细胞数量和活力；VV-mH4-1BBL可用于“免疫沙漠型”肿瘤组织(即“冷肿瘤”，肿瘤组织内部和周围均缺乏T细胞等免疫细胞)，使得“冷肿瘤”转换为“热肿瘤”，即促进T细胞等免疫细胞向肿瘤组织浸润，同时增强其抗肿瘤活力，也为联合PD-1单抗等免疫治疗创造条件；VV-mH4-1BBL可用于“免疫豁免型”肿瘤组织(T细胞等免疫细胞存在于肿瘤组织外围，但不能浸润至肿瘤组织内部)，不仅促进免疫细胞突破各种障碍进入肿瘤组织，还促进免疫细胞抗肿瘤功能。

2、VV-mH4-1BBL通过直接注射和结合内镜注射治疗体表和深部肿瘤：

基于应用(给药)方式，VV-mH4-1BBL可通过直接瘤内注射，用于黑色素瘤等一系列存在于体表部位的实体瘤；VV-mH4-1BBL也可通过腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜、神经内镜等，在清晰观察肿瘤瘤体的基础上，精确进行深部实体瘤的瘤内注射，直接溶解肿瘤细胞的同时激发抗肿瘤免疫应答。

3、VV-mH4-1BBL用于治疗结直肠癌、胰腺癌和黑色素瘤等实体肿瘤的药物中：

基于肿瘤类型角度，由于VV-mH4-1BBL以直接溶瘤并启动和增强T细胞等免疫细胞效能为作用原理，因而VV-mH4-1BBL可通过上述给药方式治疗各个临床分期的胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤等。

实际上，VV-mH4-1BBL可用于治疗所有类型的实体肿瘤，申请人也进行了相关的大量实验加以证明，但考虑到篇幅限制，在本申请中只列出了具有代表性的结直肠癌、胰腺癌以及黑色素瘤的相关验证实验，此实验数据并不能限制VV-mH4-1BBL可于所有类型实体肿瘤上发挥作用的范围性。

本发明构建了同义突变基因mH4-1BBL，进而构建重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL。为了将具有激发强烈抗肿瘤免疫功能的4-1BBL分子高水平表达于肿瘤细胞表面，并可对治疗性的4-1BBL的表达进行检测和监测，通过分子设计并合成同义突变引物通过PCR将540T碱基为540C碱基，获得4-1BBL的同义突变基因mH4-1BBL；进而将mH4-1BBL重组入牛痘病毒基因组，构建成包含mH4-1BBL基因序列的新型重组牛痘病毒，命名为VV-mH4-1BBL。VV-mH4-1BBL既保留了溶瘤特性，又在快速复制的同时表达大量的mH4-1BBL基因的编码蛋白，并表达于肿瘤细胞表面。重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL作为病毒本身可发挥直接溶瘤、进而启动抗肿瘤免疫的作用，其携带的mH4-1BBL基因所编码的蛋白4-1BBL局限在肿瘤组织集中发挥增强抗肿瘤免疫的治疗作用。

如采用激发型抗人4-1BB单克隆抗体或者可溶性4-1BBL作用4-1BB信号激动剂进行肿瘤免疫治疗的话，可能带来全身性毒副作用的潜在风险。VV-mH4-1BBL所携带的mH4-1BBL基因所编码的蛋白4-1BBL分子被局限于肿瘤微环境中发挥作用，这样既可避免潜在的4-1BBL全身副作用，又可实现肿瘤组织局部4-1BBL高水平表达，发挥更强的局部抗肿瘤效能。这是重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL的优势。另外，在构建重组病毒的同时，删除了牛痘病毒胸苷激酶(TK)基因，使之更具安全性并进一步增强感染肿瘤细胞的选择性。

本发明很好地实现了构建同义突变基因和重组溶瘤病毒，保留原有溶瘤病毒的优势和规避其弱点的技术效果。本发明中，将野生型人4-1BBL编码序列的540T碱基突变为540C碱基，构建同义突变基因mH4-1BBL。而后将mH4-1BBL通过同源重组导入牛痘病毒VV，建立重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL。重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL应用于肿瘤免疫治疗的药物中，在感染肿瘤细胞并获得溶解肿瘤细胞效应和促进肿瘤局部炎性环境的同时，表达表达于细胞表面的4-1BBL编码融合蛋白，使得4-1BBL分子物质集中且局限表达于肿瘤微环境，在促进抗肿瘤免疫应答的同时避免潜在的全身性毒副作用等不良反应，突破了抗肿瘤免疫细胞不易进入肿瘤组织以及抗肿瘤免疫易于被患者体内的负性免疫抑制的肿瘤免疫治疗瓶颈。

本发明将4-1BBL重组入溶瘤病毒，这样可以使得4-1BBL在肿瘤微环境局部发挥作用，避免全身效应。因此，通过本发明较好地避免了人工制备抗体造成的超强激活4-1BB信号可能严重失控的潜在危险，也避免的直接采用可溶性4-1BBL可能导致的全身毒副作用。

本发明构建的同义突变的4-1BBL重组痘病毒，在不改变4-1BBL蛋白序列的同时，可通过分子简单的基因测序等分子生物学手段监测外源性4-1BBL的表达，监控和评判疗效。

附图说明

图1显示为导入重组载体PV-1的基因片段以及PV-1载体的结构示意图。

图2显示为人4-1BBL定点突变过程中F1-2片段制备示意图。

图3显示为人4-1BBL定点突变过程中F1-1片段制备示意图。

图4显示为连接定点突变片段构建同义突变全长人4-1BBL(mH4-1BBL)基因示意图。

图5显示为将同义突变引入人4-1BBL基因内部的PCR产物凝胶电泳图，其中，图5A为片段F1-1至片段F3-2的PCR产物凝胶电泳结果，图5B为同义突变后的mH4-1BBL、mH4-1BBL-2、mH4-1BBL-3的PCR产物凝胶电泳结果。

图6显示为流式细胞术检测VV-ΔTK、VV-mH4-1BBL、VV-mH4-1BBL-2和VV-mH4-1BBL-3感染肠癌细胞HCT-116后细胞表面4-1BBL分子的表达。

图7显示为通过RT-PCR和基因测序检测人肠癌细胞株表达的人4-1BBL基因序列。

图8显示为通过NCBI网站的BLAST程序比对人肠癌细胞株所表达的人4-1BBL基因序列。

图9显示为通过RT-PCR和基因测序检测VV-mH4-1BBL感染人肠癌细胞株后表达的人4-1BBL基因序列。

图10显示为通过RT-PCR和基因测序检测VV-mH4-1BBL-2感染人肠癌细胞株后表达的人4-1BBL基因序列。

图11显示为通过RT-PCR和基因测序检测VV-mH4-1BBL-3感染人肠癌细胞株后表达的人4-1BBL基因序列。

图12显示为导入重组载体PV-1的基因片段以及PV-1载体的结构示意图。

图13显示为采用基因测序鉴定PV-4-1BBL重组载体所携带的小鼠4-1BBL基因序列。

图14显示为PV-4-1BBL重组载体所携带的小鼠4-1BBL基因序列的比对结果。

图15显示为重组溶瘤痘病毒VV-ΔTK-4-1BBL感染MC-38细胞后，采用RT-PCR检测到4-1BBL基因高表达。

图16显示为重组溶瘤痘病毒VV-ΔTK-4-1BBL感染MC-38细胞后，采用免疫荧光标记和流式细胞术检测到细胞表面4-1BBL分子的表达。

图17显示为病毒滴度法检测VV-ΔTK-4-1BBL在不同肿瘤细胞内的增殖能力；其中，A：小鼠胰腺癌细胞株LTPA；B：小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10；C：小鼠胰腺癌细胞株Panc02/Luc；D：小鼠肠癌细胞株MC-38。

图18显示为MTT法检测在体外VV-ΔTK-4-1BBL对不同肿瘤细胞的杀伤能力；其中，A：小鼠胰腺癌细胞株LTPA；B：小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10；C：小鼠胰腺癌细胞株Panc02/Luc；D：小鼠肠癌细胞株MC-38。

图19显示为采用基因测序检测小鼠肠癌细胞表达的小鼠4-1BBL基因序列。

图20显示为RT-PCR所获小鼠4-1BBL基因序列的比对结果。

图21显示为基因测序检测VV-△TK-4-1BBL治疗组中小鼠肠癌细胞表达的4-1BBL基因序列。

图22显示为RT-PCR所获小鼠4-1BBL基因序列的比对结果。

图23显示为MC-38荷瘤小鼠经VV-ΔTK-4-1BBL治疗后脾脏的大体观察以及脾脏重量、脾脏内细胞数量比较；其中，图23A为脾脏重量比较结果，图23B为脾脏内细胞数量比较结果。

图24显示为VV-ΔTK-4-1BBL治疗后脾脏中CD3+T、CD8+T、CD4+T细胞的百分比；其中，图24A为脾脏中CD3+T细胞的百分比变化，图24B为脾脏中CD8+T细胞的百分比变化，图24C为脾脏中CD4+T细胞的百分比变化。

图25显示为VV-ΔTK-4-1BBL治疗对脾脏组织中CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达的影响，其中，图25A为VV-ΔTK-4-1BBL治疗后的免疫荧光染色和流式细胞术分析结果，图25B为VV-ΔTK-4-1BBL治疗后以流式细胞术测定的脾脏中CD8+T细胞PD-1的表达情况对比结果，图25C为VV-ΔTK-4-1BBL治疗后以流式细胞术测定的脾脏中CD4+T细胞PD-1的表达情况对比结果。

图26显示为VV-ΔTK-4-1BBL治疗后肿瘤组织中CD3+T、CD8+T、CD4+T细胞的百分比，其中，图26A为CD3+T细胞百分比，图26B为CD8+T细胞百分比，图26C为CD4+T细胞百分比。

图27显示为VV-ΔTK-4-1BBL治疗后，肿瘤组织中免疫分子的变化，其中，图27A为免疫分子穿孔素Perforin的变化，图27B为免疫分子颗粒酶B的变化，图27C为免疫分子IFN-γ的变化，图27D为免疫分子IL-1β的变化，图27E为免疫分子TNF-α的变化，图27F为免疫分子TGF-β的变化。

图28显示为重组牛痘病毒治疗小鼠肠癌腹腔肿瘤模型的疗效比较。

图29显示为重组溶瘤痘病毒VV-ΔTK-4-1BBL联合PD-1/PD-L1阻断治疗MC-38腹腔型小鼠肿瘤模型的生存时间观察。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。

为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

同义突变基因4-1BBL(mH4-1BBL)重组牛痘病毒，代号VV-mH4-1BBL，是在牛痘病毒母本基因组(基因序列以GenBank:AY243312.1为基准)的第81001bp位置之后插入同义突变基因mH4-1BBL和相关调控元件的基因序列后得到的重组牛痘病毒，其中，向牛痘病毒母本基因组中插入的基因序列见SEQ ID No.22。

其中，同义突变基因mH4-1BBL是在野生型人4-1BBL基因序列(基因序列以NCBIReference Sequence:NM_003811.4编码序列为基准)基础上选择其编码序列(Codingsequence)的第540位碱基，通过设计引物通过PCR进行同义突变后获得。

VV-mH4-1BBL重组病毒的基因信息为：

1、构建VV-mH4-1BBL重组溶瘤病毒所采用的牛痘病毒母本的基因序列以GenBank:AY243312.1为基准，以下陈述中提及的牛痘病毒母本的基因序列以此为基础。

2、通过重组载体(PV-mH4-1BBL)将同义突变基因mH4-1BBL及相关调控元件与牛痘病毒母本进行同源基因重组。这一过程中，在牛痘病毒母本基因组的第81001bp位置之后，即位于胸苷激酶(TK)基因中间，插入mH4-1BBL基因及相关调控元件序列，既破坏了完整的TK基因(敲除TK基因)，又实现了mH4-1BBL的表达。由于相关调控元件中有重组病毒筛选使用的黄荧光蛋白(YFP)基因(基因两侧有loxp序列)，因而将上述重组病毒感染Cre基因转染的293T细胞，删除YFP，由此获得本发明中的mH4-1BBL重组牛痘病毒：VV-mH4-1BBL。与母本牛痘病毒(VV)的基因组相比，VV-mH4-1BBL基因组中的TK基因内部插入了基因片段(SEQ IDNo.22)，其基因序列如下(带下划线部分序列为mH4-1BBL基因；3’至5’方向；其他序列为启动子等调控元件)：

SEQ ID No.22：

5’-agatcgataaaaattaattaattacccgggtaccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaa cataaaatgaatgcaattgttgttgttaacTTATTCCGACCTCGGT GAAGGGAGTCCGGCTGGGATTTCGGGGGTCACCCGGAAGAGTCCCAAGACTGTGGCGCCCTGGGTAAGCTGCCAGG CATGGCGTGCCCTGGCCTCAGTGTGAAGATGGACGCCCAGGCGCTGGCCGGCACTCAGGTGCAGCAAGCGGCCCTG GAAACCGAAGGCCGAGTTCCGAGCCTCGGAGGAGGCGGGTGGCAGGTCCACGGTCAAAGCCAGGGCGGCGGCCCCA GCAGCAGAGCGCAGTGGCTGCAGGTGCAGCGCAAGTGAAACGGAGCCTGAGCCCTCGCCGGCCACCACGCGCCGCA GCTCTAGTTGAAAGAAGACATAGTAGACTCCAGCCTTGGCCACCACCAGCTCCTTCGTGTCCTCTTTGTAGCTCAG GCCCCCCGTCAGGGACACGCCTGCCAGGCCTGGGTCACTGTACCAGCTCAGGGGCCCATCGATCAGCAGAACATTT TGGGCCACCAGCTGCGCAAACATGCCCTGCCGCAGGTCCAAGAGGCCGGCGGGATCGTCGGGCGAAAGCTCGGGAC CCTCGCGGAGTCTCGGGCTGGCCGCGGAGCCGGGCGAGGCGCGAGCCCCGGACACGGCCCAGGGGCAGGCGAGGAA GACGGCGCAGGCGGCAGCGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCGACCAGGGCCCAAGGCAGTACGCGGCAGGCG CGAGCGCGGGGCGCGGGAGGCCACGGGGCTTCGGGGTCCAGTGAAGCGTCAGAGGCGTATTCCATCCTGCAGGGCCGGCCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCACGTCCCCGTGGTTCGGGGGGCCTAGACGTTTTTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGCACCGAGGCCCCAGATCAGATCCCATACAATGGGGTACCTTCTGGGCATCCTTCAGCCCCTTGTTGAATACGCTTGAGGTGAGCCATTTGACTCTTTCCACAACTATCCAACTCACAACGTGGCACTGGGGTTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATCTTATACACGTGGCTTTTGGCCGCAGAGGCACCTGTCGCCAGGTGGGGGGTTCCGCTGCCTGCAAAGGGTCGCTACAGACGTTGTTTGTCTTCAAGAAGCTTCCAGAGGAACTGCTTCCTTCACGACATTCAACAGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAGGGGAAAGACCCCTAGGAATGCTCGTCAAGAAGACAGGGCCAGGTTTCCGGGCCCTCACATTGCCAAAAGACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGGCCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGGCGCGCCTTAAGTCGACttcgagcttatttatattccaaaaaaaaaaaataaaatttcaatttttaagctttcactaattccaaacccacccgctttttatagtaagtttttcacccataaataataaatacaataattaatttctcgtaaaagtagaaaatatattctaatttattgcacggtaaggaagtagatcataactcgagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgcggccgcttcctcgctcactgacgctagcgccctatagtgagtcgtattacagatcc-3’。

本发明所述VV-mH4-1BBL由以下方法建立：

1)同义突变基因mH4-1BBL的构建：以野生型人4-1BBL基因(基因序列以NCBIReference Sequence:NM_003811.4的编码序列为基准)为模板，以其编码序列的第540位碱基为中心设计并合成同义突变引物通过PCR将540T碱基为540C碱基，仅改变其编码的多肽产物，同义突变后的4-1BBL基因，命名为mH4-1BBL基因；

2)基因mH4-1BBL两翼导入限制性酶切位点：通过PCR在mH4-1BBL基因的两翼导入SdaI和HpaI限制性酶切位点，分离基因片段；

3)牛痘病毒VV同源重组载体粘性末端的制备：使用SdaI和HpaI切割VV同源重组载体PV-1(含黄荧光YFP序列)，分离质粒片段；

4)基因mH4-1BBL与VV同源重组载体PV-1粘性末端的连接：连接步骤2)和步骤3)中的回收产物；

5)转化感受态细胞并筛选阳性克隆：步骤4)的连接产物与感受态大肠杆菌共孵育，扩大培养后，抽提重组质粒，并经基因测序确认基因mH4-1BBL正确克隆入同源重组载体PV-1，命名为PV-mH4-1BBL；

6)基因mH4-1BBL重组入VV基因组：VV在被感染复制的同时，PV-mH4-1BBL与之进行同源重组；mH4-1BBL基因片段以及黄荧光YFP序列同时被同源重组入VV基因组，形成重组病毒；与此同时，由于mH4-1BBL插入VV基因组的位置在TK基因内部，TK基因被破坏(即TK基因被删除)；进而筛选单克隆重组VV，获得高纯度重组VV；

7)将所获得高纯度重组VV感染表达cre酶的293T细胞，切除重组VV基因组中的YFP基因，而后筛选单克隆重组VV，获得目的重组VV的种子并纯化。通过基因测序分析，确认正确的mH4-1BBL基因重组入VV，获得同义突变基因mH4-1BBL重组溶瘤牛痘病毒，命名为VV-mH4-1BBL。

本发明提供同义突变4-1BBL重组牛痘病毒，即VV-mH4-1BBL，在制备抗肿瘤药物方面的应用。所述重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL可单独使用在抗肿瘤药物的制备中，或与其他抗肿瘤药物或手段联合应用。

其中，重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL可用于制备治疗“免疫炎性型”肿瘤组织、“免疫沙漠型”肿瘤组织、“免疫豁免型”肿瘤组织的药物或产品。

其中，重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL可用于制备通过直接注射和结合内镜注射治疗体表肿瘤和深部肿瘤的药物和产品；

体表肿瘤包括但不限于黑色素瘤等存在于体表部位的实体瘤。

结合内镜注射治疗包括但不限于通过腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜、神经内镜等在清晰观察肿瘤瘤体的基础上，精确进行深部实体瘤的瘤内注射治疗。

其中，重组牛痘病毒VV-mH4-1BBL可用于制备治疗各个临床分期的肿瘤治疗药物和产品，所述肿瘤包括但不限于胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤。

同义突变基因mH4-1BBL的应用，通过对于肠癌细胞等系列肿瘤的基因测序表明，肿瘤细胞自身表达野生型4-1BBL，但其表达产物4-1BBL分子定位于细胞内，不表达于细胞表面。在采用同义突变基因mH4-1BBL实施治疗干预肿瘤细胞的过程中，可通过基因水平检测和检测其表达水平，用于治疗过程和疗效监测。

实施例1

构建重组溶瘤牛痘病毒：通过PCR定点突变，将野生型人4-1BBL基因(基因序列以NCBI Reference Sequence:NM_003811.4的编码序列为基准)位点突变为同义密码子(同义突变是指：基因密码子的核苷酸序列改变，但其编码的氨基酸并不发生改变)，同义突变后的人4-1BBL命名为mh4-1BBL，将mh4-1BBL重组入牛痘病毒基因组，同时敲除TK(胸苷激酶)基因，构建新型重组牛痘病毒，命名为VV-mh4-1BBL。VV-mh4-1BBL保留了母本VV的溶瘤特性，并在感染肿瘤细胞后能表达mh4-1BBL分子并定位于细胞膜表面。mh4-1BBL分子在氨基酸序列上与野生型4-1BBL分子无差异，但在mRNA水平可区分VV-mh4-1BBL治疗后肿瘤组织表达的4-1BBL是内源性还是外源性的。通过溶瘤病毒表达的mh4-1BBL分子可避免可溶性4-1BBL使用时的全身作用导致的潜在风险，也使得mh4-1BBL分子在肿瘤组织(肿瘤微环境)集中发挥增强抗肿瘤免疫的治疗作用。

重组溶瘤牛痘病毒，其可操作地插入能够表达4-1BBL的同义突变后的外源基因。

外源基因插入至牛痘病毒TK基因中。

外源基因的DNA序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.1(540T突变为C)的序列为：

SEQ ID No.2(468G突变为A)的序列为：

SEQ ID No.3(597C突变为T)的序列为：

外源基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.4的序列为：

外源基因通过IRES序列连接。

IRES为核糖体进入位点，其只是可使用的连接序列之一。

IRES序列如SEQ ID No.5所示。

SEQ ID No.5的序列为：

本发明还提供了一种药物组合物，包括上述的重组溶瘤牛痘病毒、药学上可接受的载体和药物辅料。

药物组合物的给药方式为直接注射和/或结合内镜注射；内镜优选为腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜和神经内镜。

本发明还提供了上述的重组溶瘤牛痘病毒、上述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

肿瘤和/或癌症为实体瘤，优选为冷肿瘤和/或热肿瘤，其组织学类型包括但不限于胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤。

实施例2

同义突变人4-1BBL重组痘病毒感染肠癌细胞后同义突变位点的检测：

蛋白分子发挥生物学功能有赖于其正确的氨基酸序列。DNA的碱基序列通过三联密码子编码氨基酸。在此过程中存在着“简并密码子”的生物学现象，即一个氨基酸可由一个以上的三联体密码编码的现象。由此，将对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子。这些同义密码子通常是第1和第2个碱基相同，只有第3个碱基不同。

鉴于上述生物学机制，可对编码特定蛋白质的基因DNA序列的密码子进行同义突变(改变密码子的第3位碱基，并保持该密码子编码氨基酸不变)。这样既不影响基因表达产物的氨基酸序列和功能，又可用分子生物学手段检测所导入细胞的同义突变碱基。

本实施例通过构建表达同义突变的人4-1BBL基因重组溶瘤病毒，其目的在于，在发挥溶瘤病毒自身抗肿瘤作用的同时，于肿瘤组织局部表达4-1BBL分子，促进抗肿瘤免疫，并通过检测同义突变位点实现对治疗性(外源性)4-1BBL的检测。

一、携带同义突变人4-1BBL基因的重组载体构建：

为了验证可以通过分子生物学手段检测同义突变人4-1BBL重组痘病毒感染肿瘤细胞后所表达的突变人4-1BBL基因，本实施例构建了同义突变人4-1BBL基因，并克隆入同源重组载体PV-1(图1)，通过同源重组将同义突变人4-1BBL基因导入牛痘病毒，同时删除tk(胸苷激酶)基因，获得同义突变人4-1BBL重组痘病毒。

导入重组载体PV-1的基因片段以及PV-1载体的结构示意如图1所示。图1的载体中，TK 5’和TK 3’序列与牛痘病毒基因组部分序列同源，位于目的基因序列两翼。重组载体构建导入野生型牛痘病毒感染的宿主细胞，TK 5’和TK 3’序列可与野生型牛痘病毒基因进行同源重组，将载体中TK 5’和TK 3’之间的基因序列导入牛痘病毒基因组，构建重组病毒。

图1中的名词分别为：

1)MCS：多克隆位点，可插入目的基因；

2)YFP：黄荧光蛋白基因；

3)IRES：核糖体进入位点；

4)PV-1：同源重组载体；

5)PV-mH4-1BBL：mH4-1BBL基因导入PV-1载体多克隆位点后的重组载体；

6)PV-mH4-1BBL-2：mH4-1BBL-2基因导入PV-1载体多克隆位点后的重组载体；

7)PV-mH4-1BBL-3：mH4-1BBL-3基因导入PV-1载体多克隆位点后的重组载体。

上述的mH4-1BBL、mH4-1BBL-2和mH4-1BBL-3基因，是以野生型人4-1BBL基因(NCBIReference Sequence:NM_003811.4)的CDS为基准，分别将540位碱基T突变为碱基C、将468位碱基G突变为碱基A、将597位碱基C突变为碱基T的情况下，所编码的多肽产物序列，即同义突变后的4-1BBL基因。

二、同义突变人4-1BBL基因的制备：

1、将人4-1BBL基因CDS中第540位T碱基同义突变为540位C碱基的设计及制备过程：

为了在野生型人4-1BBL基因(H4-1BBL)编码序列(Coding sequence，CDS)基础上构建同义突变的人4-1BBL基因，以野生型人4-1BBL基因(NCBI Reference Sequence：NM_003811.4)的CDS为基准，针对其CDS的第540位T碱基设计突变引物并通过PCR突变为C碱基。而在人4-1BBL基因的CDS中，540位T碱基所属密码子为“GCT”(编码丙氨酸)，突变为“GCC”后仍编码丙氨酸。设计引物如下：

Pf(SEQ ID No.6)：

5’-TATAGTCGACATGGAATACGCCTCTGACGCTTC-3’(含Sal I限制性酶切位点)；

同时以编码序列的第540位碱基为中心设计并合成同义突变引物：

Pr11(SEQ ID No.7)：

5’-CGGGTGGCAGGTCCACGGTCAAGGCCAGGGCGGCGGCCCCAGCAGC-3’。

以野生型人4-1BBL基因(H4-1BBL)为模板，Pf和Pr11为引物，通过PCR获得片段F1-2(技术路线如图2所示；PCR产物片段见图5)。

为了在野生型人4-1BBL基因(H4-1BBL)基础上构建同义突变的人4-1BBL基因，以野生型人4-1BBL基因(NCBI Reference Sequence：NM_003811.4)的编码序列(Codingsequence，CDS)为基准，选择其CDS的第540位T碱基，设计引物通过PCR突变为C碱基。设计引物如下：

Pr(SEQ ID No.8)：

5’-TATAGGCGCGCCTTATTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3’(含Sgs I限制性酶切位点)；

Pf12(SEQ ID No.9)：

5’-GCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCCTTGACCGTGGACCTGCCACCCG-3’。

以野生型人4-1BBL基因(H4-1BBL)为模板，Pf12和Pr为引物，通过PCR获得片段F1-1(技术路线见图3；PCR产物片段见图5)。

为了将含有突变碱基的F1-1和F1-2片段连接为含有突变的全长人4-1BBL基因，以F1-1和F1-2片段为模板，Pf和Pr为引物，通过PCR获得含有540位突变为C碱基的全长人4-1BBL基因片段。所获片段与野生型人4-1BBL基因编码序列(CDS)相比，在CDS的540位碱基发生改变。由于在其所属密码子的第3位，并未改变其编码的多肽产物序列，因此称之为同义突变的4-1BBL基因，命名为mH4-1BBL(技术路线见图4；PCR产物片段见图5)。

引物信息如下：

Pf(SEQ ID No.10)：

5’-TATAGTCGACATGGAATACGCCTCTGACGCTTC-3’(含Sal I限制性酶切位点)；

Pr(SEQ ID No.11)：

5’-TATAGGCGCGCCTTATTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3’(含Sgs I限制性酶切位点)。

2、针对人4-1BBL基因的CDS中468位G碱基和597位C碱基的同义突变设计及制备过程：

为了证明本实施例中4-1BBL基因同义突变的作用在的普适性，采用类似于图2、图3和图4所示过程，分别选择野生型人4-1BBL基因(基因序列以NCBI Reference Sequence：NM_003811.4)编码序列的468位G碱基和597位C碱基分别进行同义突变。具体如下：

1)以编码序列的第468位碱基为中心设计同义突变引物：

Pr21(SEQ ID No.12)：

5’-CAAGTGAAACGGAGCCTGAGCCTTCGCCGGCCACCACGCGC-3’；

Pf22(SEQ ID No.13)：

5’-GCGCGTGGTGGCCGGCGAAGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTG-3’。

以野生型人4-1BBL基因为模板，以Pf和Pr21为引物对、以Pf22和Pr为引物对，通过高保真PCR将468位同义突变碱基(468位G碱基突变为468位A碱基，所属密码子仍编码谷氨酸)导入人4-1BBL基因片段，并回收PCR产物片段F2-1和F2-2(如图13)。以片段F2-1和F2-2为模板，以F和R为基因将片段F2-1和F2-2连接成完整的468位碱基同义突变的人4-1BBL基因。上述468位碱基突变并未改变其编码的多肽产物序列，同义突变后的4-1BBL基因，命名为mH4-1BBL-2基因(PCR产物片段见图5)。

2)以编码序列的第597位碱基为中心设计同义突变引物：

Pr31(SEQ ID No.14)：

5’-GGTGCAGCAAGCGGCCCTGAAAACCGAAGGCCGAGTTCCG-3’；

Pf32(SEQ ID No.15)：

5’-CGGAACTCGGCCTTCGGTTTTCAGGGCCGCTTGCTGCACC-3’。

以野生型人4-1BBL基因为模板，以Pf和Pr31为引物对、以Pf32和Pr为引物对，通过高保真PCR将597位同义突变碱基(597位C碱基突变为597位T碱基，所属密码子仍编码苯丙氨酸)导入人4-1BBL基因片段，并回收PCR产物片段F3-1和F3-2(图13)。以片段F3-1和F3-2为模板，以F和R为基因将片段F3-1和F3-2连接成完整的597位碱基同义突变的人4-1BBL基因。上述597位碱基突变并未改变其编码的多肽产物序列，同义突变后的4-1BBL基因，命名为mH4-1BBL-3基因(PCR产物片段见图5)。

3、同义突变人4-1BBL同源重组载体的制备：

采用Sal I和Sgs I限制性酶分别双酶切载体PV-1、mH4-1BBL基因、mH4-1BBL-2基因和mH4-1BBL-3基因，1％凝胶电泳后切胶并回收目的片段。采用T4连接酶将酶切后的载体PV-1骨架分别与回收后的mH4-1BBL基因、mH4-1BBL-2基因和mH4-1BBL-3基因连接(4℃连接过夜)，将连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养16小时后选取抗性菌落，抽提重组质粒，并经基因测序确认mH4-1BBL基因、mH4-1BBL-2基因和mH4-1BBL-3基因正确克隆入同源重组载体PV-1，将上述重组质粒分别命名为PV-mH4-1BBL、PV-mH4-1BBL-2和PV-mH4-1BBL-3。

三、同义突变人4-1BBL重组溶瘤病毒的制备：

将PV-mH4-1BBL、PV-mH4-1BBL-2和PV-mH4-1BBL-3分别与牛痘病毒(VacciniaVirus，VV)感染CV-1细胞，获得重组溶瘤病毒。

取对数生长期的CV1细胞，调整细胞密度至1×10⁵个/mL，按1mL/孔接种至24孔板。24h后，采用牛痘病毒(Vaccinia Virus，VV)感染CV1细胞。感染2h后，将PV-mH4-1BBL、PV-mH4-1BBL-2和PV-mH4-1BBL-3分别与转染试剂(Polyplus，法国)混合后室温孵育15min，取混合液200μL转染CV1细胞。2h后加入含10％ FCS的DMEM培养基，继续培养48h。采用荧光显微镜检测黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein，YFP)荧光强度，判断质粒与病毒同源重组情况。待细胞完全破碎后，收取病毒细胞悬液。

取对数生长期的CV1细胞，调整细胞密度为1.5×10⁵个/mL，按2mL/孔接种至6孔板。24h后，加入病毒细胞悬液感染CV1细胞。培养24h，消化CV1细胞，使用流式细胞仪分选表达YFP的CV1细胞，制备成单细胞悬液。通过有限稀释法，将YFP+CV1细胞接种于预铺CV1细胞的96孔板中。48h后挑选具有单个YFP+病毒溶斑培养孔，收取细胞及上清，反复冻融后获得病毒悬液备用。

将上述所获得的病毒悬液感染表达cre酶的293T细胞，切除重组VV基因组中的YFP基因，而后筛选单克隆重组VV，获得目的重组VV的种子并纯化。通过基因测序分析，确认同义突变人4-1BBL基因mH4-1BBL、mH4-1BBL-2和mH4-1BBL-3基因重组入VV。将上述插入同义突变人4-1BBL基因mH4-1BBL、mH4-1BBL-2和mH4-1BBL-3的重组溶瘤痘病毒命名为VV-mH4-1BBL、VV-mH4-1BBL-2和VV-mH4-1BBL-3。

采用直径为15cm培养皿培养Hela细胞，当Hela细胞丰度为80％左右时，加入上述病毒细胞悬液，感染Hela细胞，扩增感染直至获得足够的病毒细胞悬液。

纯化重组痘病毒：收集病毒细胞悬液，离心弃上清。冻融3次裂解细胞，采用杜恩斯匀浆器研磨细胞，释放病毒颗粒。1200r/min离心收取含病毒上清，并加至36％的蔗糖溶液上方，130000×g离心1h，所获沉淀用10mM Tris-HCl重悬后冻存备用。

为了确认上述构建的同义突变人4-1BBL重组痘病毒感染肿瘤细胞后能否实现在肿瘤细胞表面表达4-1BBL分子，将上述病毒感染人肠癌细胞株后，采用免疫荧光标记和流式细胞术分析检测细胞表面4-1BBL分子的表达，具体如下：

取对数生长期的人肠癌细胞株HCT-116，分别调整细胞密度至3×10⁵个/mL，接种1mL至24孔板。待细胞完全贴壁后，分为VV-ΔTK、VV-mH4-1BBL、VV-mH4-1BBL-2和VV-mH4-1BBL-3感染组，按照感染复数(Multiplication of infection，MOI)为1分别进行感染。24h后收集感染后的细胞，采用APC标记的抗人4-1BBL单克隆抗体进行染色标记，采用流式细胞术分析细胞膜4-1BBL分子的表达。结果显示，可检测到仅删除了tk基因的牛痘病毒VV-ΔTK感染后的HCT-116细胞表面不表达4-1BBL分子，VV-mH4-1BBL、VV-mH4-1BBL-2和VV-mH4-1BBL-3感染后的HCT-116细胞表面高水平表达4-1BBL分子(图6)。

图6中，VV-ΔTK：删除了tk基因的牛痘病毒；VV-mH4-1BBL：删除了tk基因并插入了mH4-1BBL基因片段的重组牛痘病毒；VV-mH4-1BBL-2：删除了tk基因并插入了mH4-1BBL-2基因片段的重组牛痘病毒；VV-mH4-1BBL-3：删除了tk基因并插入了mH4-1BBL-3基因片段的重组牛痘病毒；Anti-4-1BBL-APC：APC标记的抗人4-1BBL单克隆抗体。

四、同义突变人4-1BBL重组溶瘤痘病毒感染肿瘤细胞后通过分子生物学手段检测同义突变位点：

为了验证同义突变人4-1BBL重组溶瘤痘病毒感染肿瘤细胞后导入的外源4-1BBL能否被检测到，将重组溶瘤病毒VV-mH4-1BBL、VV-mH4-1BBL-2和VV-mH4-1BBL-3分别感染人肠癌细胞株HCT-116，并设立未感染组作为对照。而后通过进行RT-PCR检测分析，具体如下：

按上述方法将VV-mH4-1BBL、VV-mH4-1BBL-2和VV-mH4-1BBL-3按MOI＝1感染人肠癌细胞株HCT-116，同时设立未感染组。24h后收取细胞置入200μL Trizol溶液裂解并抽提总RNA，采用Takara公司的RT-PCR试剂盒将RNA逆转录为cDNA。同时抽提未感染的HCT116细胞的总RNA并逆转录获得cDNA。

在涵盖突变位点的人4-1BBL基因(基因序列以NCBI Reference Sequence：NM_003811.4)CDS区域设计引物，引物序列如下：

Pif(SEQ ID No.16)：5’-TGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGC-3’；

PiR(SEQ ID No.17)：5’-TTATTCCGACCTCGGTGAAGGGAGTCC-3’。

以所获cDNA为模板，Pif和PiR为引物，通过PCR扩增涵盖同义突变位点的人4-1BBL基因片段，将PCR产物与pUMc-T载体连接后转化感受态DH5α大肠杆菌、涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板，待抗性菌落形成后随机选取单个菌落进行单向测序。测序引物序列为5’-GTTGTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID No.18)。结果如下：

未感染组选取5个菌落抽提质粒后进行基因测序，结果如图7所示，通过NCBI网站BLAST程序比对表明，引物Pif和Pir所涵盖片段与人4-1BBL基因(NCBI ReferenceSequence：NM_003811.4)CDS区域比对100％匹配(图8)。这一结果验证了肠癌细胞所表达的人4-1BBL基因无突变。

1)选取VV-mH4-1BBL感染组的10个菌落进行单向测序。结果表明，共有10个菌落测序成功，且均检测到如图9中箭头所标识的同义突变，而其他位点无突变。这一结果表明，VV-mH4-1BBL感染肿瘤细胞后可大量复制，而其所携带的同义突变(540位T碱基突变为540位C碱基)可被清晰检测到。因此，人4-1BBL同义突变在不改变其编码氨基酸序列的前提下，可为检测和鉴别外源性人4-1BBL基因的导入提供手段。

2)选取VV-mH4-1BBL-2感染组的10个菌落进行单向测序。结果表明，共有10个菌落测序成功，且均检测到如图10中箭头所标识的同义突变，而其他位点无突变。这一结果表明，VV-mH4-1BBL感染肿瘤细胞后可大量复制，而其所携带的同义突变468位同义突变碱基(468位G碱基突变为468位A碱基)可被清晰检测到。因此，人4-1BBL同义突变在不改变其编码氨基酸序列的前提下，可为检测和鉴别外源性人4-1BBL基因的导入提供手段。

3)选取VV-mH4-1BBL-2感染组的10个菌落进行单向测序。结果表明，共有10个菌落测序成功，且均检测到如图11中箭头所标识的同义突变，而其他位点无突变。这一结果表明，VV-mH4-1BBL感染肿瘤细胞后可大量复制，而其所携带的同义突变597位同义突变碱基(597位C碱基突变为597位T碱基)可被清晰检测到。因此，人4-1BBL同义突变在不改变其编码氨基酸序列的前提下，可为检测和鉴别外源性人4-1BBL基因的导入提供手段。

实施例3

同义突变4-1BBL重组痘病毒的抗肿瘤作用及同义突变位点的检测：

为了进一步验证同义突变4-1BBL重组痘病毒的抗肿瘤效应并验证其治疗过程中对于同义突变位4-1BBL的检测，本实施例构建了基于小鼠4-1BBL的同义突变体，并构建了同义突变的小鼠4-1BBL溶瘤牛痘病毒。同时建立了腹腔型小鼠肠癌模型进行实验性治疗并检测治疗过程中小鼠4-1BBL的同义突变位点。具体实施过程如下：

一、构建同义突变小鼠4-1BBL基因重组载体以及同义突变小鼠4-1BBL重组溶瘤牛痘病毒：

为了验证可以通过分子生物学手段检测同义突变人4-1BBL重组痘病毒感染肿瘤细胞后所表达的突变人4-1BBL基因，采用实施例2中类似方法构建了同义突变小鼠4-1BBL基因，并克隆入同源重组载体PV-1(图12)，命名为PV-4-1BBL。基因测序鉴定结果如图13，所获序列通过NCBI网站BLAST程序比对表明，与小鼠4-1BBL基因(NCBI Reference SequenceID：NM_009404.3)的CDS相比，PV-4-1BBL中4-1BBL基因CDS的309位C碱基突变为T碱基(图14中箭头所示)，即其所属密码子ACC突变为ACT，但两者的编码产物仍为苏氨酸。因此，成功建立了基于同义突变小鼠4-1BBL基因(本实施例中称为4-1BBL)的同源重组载体。

采用实施例2中类似方法，利用PV-4-1BBL将同义突变4-1BBL基因重组入溶瘤痘病毒，同时敲除其tk基因，建立重组溶瘤病毒命名为VV-ΔTK-4-1BBL，并通过体内外实验验证VV-ΔTK-4-1BBL的抗肿瘤功能和进行4-1BBL的同义突变位点检测。

图12中的PV-4-1BBL：同义突变小鼠4-1BBL基因导入PV-1载体多克隆位点后的重组载体。

二、采用RT-PCR在mRNA水平检测VV-ΔTK-4-1BBL感染肠癌细胞后4-1BBL的表达：

为了检测VV-ΔTK-4-1BBL感染肿瘤细胞后4-1BBL基因的表达，选择肠癌细胞株MC-38细胞为模型，将VV-ΔTK-4-1BBL以MOI＝1的感染复数感染MC-38细胞，并设置VV-ΔTK感染组作为对照。感染24h后收集肿瘤细胞，抽提总RNA并逆转录成cDNA，并经PCR扩增4-1BBL基因。

实验结果表明(图15)，VV-△TK-4L感染组目的基因条带高亮，VV-ΔTK感染组和为感染组仅有本底水平目的基因条带。这一结果确证了VV-△TK-4-1BBL感染肿瘤细胞后借助病毒的快速复制表达高水平4-1BBL基因，另外也证明了肿瘤细胞存在本底水平的4-1BBL基因表达(申请人之前的研究发现了，未加干预情况下该基因的编码蛋白表达于肿瘤细胞膜内)。

重组溶瘤痘病毒VV-ΔTK-4-1BBL感染MC-38细胞后，采用RT-PCR检测到4-1BBL基因高表达的结果如图15所示，其中，泳道M：DL 2000DNA Marker；泳道1：未感染组；泳道2：VV-ΔTK感染组；泳道3：未感染组；泳道4：VV-ΔTK-4-1BBL感染组。

三、流式细胞术检测VV-ΔTK-4-1BBL感染后4-1BBL在肠癌细胞表面的表达：

为了确认可否利用重组溶瘤病毒在肿瘤细胞内的快速复制实现4-1BBL分子的高表达并定位于肿瘤细胞表面，按不同病毒感染复数(MOI)0、0.1、1、5感染对数生长期的肠癌细胞株MC-38，24h后消化细胞，制备单细胞悬液，采用荧光素标记抗4-1BBL单克隆抗体染色，流式细胞术分析细胞膜4-1BBL的表达。

实验结果(图16)表明随着病毒感染复数(MOI)的增加，重组病毒携带的黄荧光蛋白(YFP)表达增高；VV-△TK-4L感染组表达细胞膜型4-1BBL，且随MOI的增加而增加；VV-△TK感染组不表达细胞膜型4-1BBL。这一结果确证了VV-△TK-4-1BBL感染肿瘤细胞后可实现4-1BBL分子在肿瘤细胞表面的表达。

四、病毒滴度法检测VV-ΔTK-4-1BBL在不同肿瘤细胞内的增殖能力：

为确认基因重组对牛痘病毒在肿瘤细胞内复制增殖能力的影响，将各重组病毒分别感染LTPA细胞、B16-F10细胞、Panc02/Luc细胞和MC-38细胞，分别于感染后24h、48h和72h收取细胞，反复冻融并稀释后感染绿猴肾细胞CV-1，通过溶斑法测定病毒产量。

实验结果(图17)表明，4-1BBL基因重组入牛痘病毒后，并不改变病毒本身在肿瘤细胞内的复制特性。

五、检测和比较VV-ΔTK-4-1BBL对于肿瘤细胞内的杀伤能力：

为确认本实施例中基因重组对病毒溶瘤效应是否产生影响，本实验将各重组病毒按不同MOI(0、0.1、0.5和5)感染LTPA细胞、B16-F10细胞、Panc02/Luc细胞和MC-38细胞，48h后MTT法检测活细胞比例。

实验结果(图18)表明，4-1BBL基因重组入牛痘病毒后，并不改变病毒本身的溶瘤效能。

六、同义突变4-1BBL重组溶瘤痘病毒治疗肿瘤过程中4-1BBL同义突变位点的检测：

为了验证同义突变4-1BBL重组溶瘤痘病毒能否在治疗肿瘤过程中被检测到，在建立小鼠肠癌模型基础上，采用VV-ΔTK-4-1BBL进行实验性治疗，而后取肿瘤组织进行检测。具体过程如下。

选择8-12周龄C57BL/6小鼠，按5×10⁵/小鼠腹腔接种MC-38肠癌细胞。9d后将小鼠随机分为2组，一组按2×10⁸PFU/小鼠腹腔注射VV-ΔTK-4L，另一组腹腔注射等量PBS。48h后取出处死小鼠，取出肿瘤组织，取10mg肿瘤组织溶于Trizol后提取总RNA，逆转录为cDNA后采用PCR。

以小鼠4-1BBL基因(NCBI Reference Sequence ID：NM_009404.3)的CDS区域设计引物，引物序列如下：

Pmf(SEQ ID No.19)：

5‘-TATAAAGCTTATGGACCAGCACACACTTGATG-3’；

Pmr(SEQ ID No.20)：

5‘-TATATCTAGATCATTCCCATGGGTTGTCGG-3’。

以所获cDNA为模板，Pmf和PmR为引物，采用通过PCR扩增涵盖小鼠4-1BBL基因CDS的全长片段，将PCR产物与pUMc-T载体连接后转化感受态DH5α大肠杆菌、涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板，待抗性菌落形成后随机选取单个菌落进行单向测序。测序引物序列为5’-GTTGTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID No.21)。

实验结果表明，PBS治疗组中，随机选取3个克隆测序，所获4-1BBL片段均为野生型4-1BBL，即与小鼠4-1BBL基因(NCBI Reference Sequence ID：NM_009404.3)的CDS区域100％匹配(图19和图20)，图19中，箭头所示小鼠4-1BBL基因CDS的309位C碱基并无突变；VV-△TK-4-1BBL组中，随机选取10个克隆测序，其中1个克隆中的4-1BBL序列小鼠4-1BBL基因(NCBI Reference Sequence ID：NM_009404.3)的CDS区域100％匹配，而另外9个克隆中均检测到CDS的309位C碱基突变为T碱基，而其余位点无突变(图21和图22)，图21中，箭头所示小鼠4-1BBL基因CDS的309位C碱基突变为T碱基，图22中，箭头所示小鼠4-1BBL基因CDS的309位C碱基突变为T碱基。野生型的4-1BBL基因来自于荷瘤小鼠，而高比例的同义突变4-1BBL基因表达源自溶瘤病毒VV-△TK-4-1BBL。

这一结果证明了肿瘤细胞存在本底水平的4-1BBL基因表达，也确证了VV-△TK-4-1BBL进行体内治疗过程中，通过感染肿瘤细胞后借助病毒的快速复制表达高水平同义突变4-1BBL基因，并可通过分子生物学的手段检测到。

七、检测同义突变4-1BBL重组溶瘤痘病毒对于外周免疫器官的作用及机制：

1、为了综合考察VV-ΔTK-4-1BBL的体内抗肿瘤效应和作用机制，验证其中VV-ΔTK-4-1BBL对于外周免疫组织器官的效应，选择8-12周龄C57BL/6小鼠，按5×10⁵/小鼠腹腔接种MC-38肠癌细胞。9d后将小鼠随机分组，按2×10⁸PFU/小鼠腹腔注射VV-ΔTK-4L、VV-ΔTK和等体积PBS。5d后处死小鼠，取小鼠脾脏称重并制备单细胞悬液后计数。

实验结果(图23)表明，VV-ΔTK-4-1BBL治疗MC-38荷瘤小鼠后，可引发脾脏重量(图23A)和脾脏细胞数量(图23B)的增加，即可以促进外周免疫细胞增殖和外周免疫组织器官的增生。

实验结果(图24)表明，VV-ΔTK-4-1BBL治疗MC-38荷瘤小鼠后，可促进脾脏细胞中CD3+T细胞(图24A)、CD4+T细胞(图24B)和CD8+T细胞(图24C)比例的增加。这确认了VV-ΔTK-4-1BBL可通过溶瘤病毒及其表达的4-1BBL分子共同作用，促进外周免疫组织器官中T细胞及其亚群和NK细胞等的增殖。

2、为了综合考察VV-ΔTK-4-1BBL的体内抗肿瘤效应和作用机制，验证其中VV-ΔTK-4-1BBL对于抗肿瘤免疫的关键细胞CD4+T、CD8+T细胞表达PD-1等免疫检查点分子的影响，选择8-12周龄C57BL/6小鼠，按5×10⁵/小鼠腹腔接种MC-38肠癌细胞。9d后将小鼠随机分组，按2×10⁸PFU/小鼠腹腔注射VV-ΔTK-4L、VV-ΔTK和等体积PBS。5d后处死小鼠，取小鼠脾脏制备单细胞悬液后，通过免疫荧光染色和流式细胞术进行分析。

实验结果(图25)表明，VV-ΔTK-4-1BBL治疗肿瘤后产生抗肿瘤免疫应答，可在CD4+T、CD8+T等免疫细胞表面反馈性地上调PD-1分子表达。这一结果表明VV-ΔTK-4-1BBL联合PD-1/PD-L1途径阻断剂治疗提升抗肿瘤疗效的构想存在必要的前提基础。

八、检测同义突变4-1BBL重组溶瘤痘病毒对于肿瘤微环境的作用及机制：

1、为了验证VV-ΔTK-4-1BBL对于肿瘤微环境中抗肿瘤免疫态势的影响，选择8-12周龄C57BL/6小鼠，按5×10⁵/小鼠腹腔接种MC-38肠癌细胞。9d后将小鼠随机分组，按2×10⁸PFU/小鼠腹腔注射VV-ΔTK-4L、VV-ΔTK和等体积PBS。5d后处死小鼠，取肿瘤组织制备单细胞悬液，采用免疫荧光染色和流式细胞术分析。

实验结果(图26)表明，VV-ΔTK-4-1BBL治疗MC-38荷瘤小鼠后，肿瘤组织内CD3+T、CD8+T、CD4+T细胞的比例明显增高。这表明VV-ΔTK-4-1BBL可通过溶瘤病毒及其表达的4-1BBL分子共同作用，促进肿瘤组织中T细胞及其亚群数量增加，改变抗肿瘤免疫态势。

2、为了验证VV-ΔTK-4-1BBL对于肿瘤微环境中抗肿瘤免疫态势的影响，选择8-12周龄C57BL/6小鼠，按5×10⁵/小鼠腹腔接种MC-38肠癌细胞。9d后将小鼠随机分组，按2×10⁸PFU/小鼠腹腔注射VV-ΔTK-4L、VV-ΔTK和等体积PBS。5d后处死小鼠，每个肿瘤组织50mg溶于Trizol后提取总RNA，逆转录为cDNA后采用Realtime PCR(实时定量PCR)分析。

实验结果(图27)表明，VV-ΔTK-4-1BBL治疗组肿瘤组织中穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)、IFN-γ、IL-1β、TNF-α等抗肿瘤免疫分子明显增高，TGF-β等负性免疫分子则比空白溶瘤病毒对照(VV-ΔTK)组明显降低。这些结果表明进一步证明了，VV-ΔTK-4-1BBL可通过溶瘤病毒及其表达的4-1BBL分子共同作用，改变肿瘤组织中的免疫态势，促进抗肿瘤免疫效应。

九、验证同义突变4-1BBL重组溶瘤痘病毒的体内抗肿瘤作用：

本实施例中4-1BBL基因重组入牛痘病毒基因组，构建了新型重组牛痘病毒。为比较其体内抗肿瘤能力，本实验将小鼠肠癌细胞MC-38注射入C57/BL6品系小鼠腹腔建立肠癌腹腔肿瘤模型，9d后随机分组，分别于腹腔注射各重组病毒，而后观察小鼠生存时间。结果表明：和磷酸盐缓冲液治疗组(PBS)比较，VV-ΔTK(敲除TK基因的VV)和VV-ΔTK-4-1BBL(敲除TK基因并重组入4-1BBL基因的VV)治疗组荷瘤小鼠生存时间均较PBS治疗组延长，而VV-ΔTK-4-1BBL治疗组荷瘤小鼠生存时间较VV-ΔTK治疗组延长。

实验结果(图28)表明，VV-ΔTK-4-1BBL用于治疗肿瘤可产生明显的抗肿瘤效应，延长治疗对象的生存时间。

十、验证同义突变4-1BBL重组溶瘤痘病毒联合PD-1单抗的体内抗肿瘤作用：

为了验证VV-ΔTK-4-1BBL联合免疫检查点阻断剂的联合疗效，本实验将小鼠肠癌细胞MC-38注射入C57/BL6品系小鼠腹腔建立肠癌腹腔肿瘤模型，9d后随机分组，分别按PBS治疗组、VV-ΔTK-4-1BBL、PD-1阻断性单抗治疗组以及VV-ΔTK-4-1BBL联合PD-1阻断性单抗治疗组，共分为4组分别进行腹腔注射治疗，而后观察小鼠生存时间。

实验结果(图29)表明，VV-ΔTK-4-1BBL和PD-1阻断性单抗治疗组荷瘤小鼠生存时间均较PBS治疗组延长，而VV-ΔTK-4-1BBL和PD-1阻断性单抗治疗组荷瘤小鼠疗效相当。VV-ΔTK-4-1BBL联合PD-1阻断性单抗治疗组治疗效果明显优于VV-ΔTK-4-1BBL治疗组或PD-1阻断性单抗治疗组。

这一结果证明了VV-ΔTK-4-1BBL可为提高PD-1单抗等免疫检查点阻断剂治疗肿瘤的疗效提供有力手段。VV-ΔTK-4-1BBL与免疫检查点阻断联合使用可产生更为明显的抗肿瘤效应，并提高治疗对象的生存率和生存时间。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述重组溶瘤牛痘病毒可操作地插入能够表达4-1BBL的同义突变后的外源基因。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述外源基因插入至牛痘病毒TK基因中。

3.根据权利要求1所述的重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述外源基因的DNA序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求1所述的重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述外源基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求1所述的重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述外源基因通过IRES序列连接。

6.根据权利要求5所述的重组溶瘤牛痘病毒，其特征在于，所述IRES序列如SEQ IDNo.5所示。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-6中任意一项所述的重组溶瘤牛痘病毒、药学上可接受的载体和药物辅料。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为直接注射和/或结合内镜注射；内镜优选为腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜和神经内镜。

9.权利要求1-6中任意一项所述的重组溶瘤牛痘病毒、权利要求7-8中任意一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤和/或癌症为实体瘤，优选为冷肿瘤和/或热肿瘤，其组织学类型包括但不限于胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤。