CN117003884A - 一种多靶向融合蛋白Rainbody及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种融合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链从N端至C端依次包含：第一结合模块的第一部分，第一连接区域，第二结合模块的第二部分；所述第二多肽链从N端至C端依次包含：第二结合模块的第一部分，第二连接区域，第一结合模块的第二部分；并且其中所述第一结合模块的第一部分与所述第一结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；所述第二结合模块的第一部分与第二结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；并且其中所述第一连接区域与所述第二连接区域能够二聚化。本申请还提供了制备所述融合蛋白的方法及其用途。

Description

一种多靶向融合蛋白Rainbody及其制备方法和用途
技术领域
本申请通常涉及融合蛋白领域。更具体地，本申请涉及一种多靶向的蛋白及其制备方法和用途。
发明背景
20世纪80年代中期，研究人员设计出有两个结合模块的抗体，一个与肿瘤细胞抗原结合，另一个与T细胞表面的CD3蛋白相匹配。 1985年，Pilar Perez等人(Specifictargeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target cellantibody,Pilar Perez,Robert W. Hoffman,Stephen Shaw,Jeffrey A.Bluestone&DavidM.Segal Nature volume 316,pages354–356(1985)Cite this article)报道了这种双特异性抗体可以破坏培养皿中的癌细胞并能缩小小鼠体内的肿瘤。2000年， Peter Kufer和Gert Riethmüller推出一种简化的双特异性抗体，其两个模块通过一种柔性肽而不是传统的抗体骨架连接。简化的设计使得抗体的制造更容易，但由于抗体骨架的缺失，肾脏会在2小时内将其从血液中清除。这种类型的分子也被称为双特异性T细胞衔接器 (bispecificT cell engager，)。
BITE分子虽然展示了强大的抗肿瘤能力，但其产量仍然较低，而且这种双特异性抗体有时也会引发严重的副作用，包括肝损伤和过度免疫反应，其中白细胞会分泌大量有毒的细胞因子信号。这样的细胞因子“风暴”会导致发烧，严重时还会导致器官损伤。
为了解决多特异性抗体的制造问题，近年来涌现了大量不同的分子模式，用于多特异性抗体的分子设计与制造。但如何设计使两个或者更多个结合模块以实现多靶向以及协同作用，仍然面临诸多挑战。
发明概述
本文中提供一种新的多靶向融合蛋白Rainbody及其制备方法。所述融合蛋白包括第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多链的N端包含结合模块A的第一部分，C端则包含结合模块B的第二部分；所述第二多肽链的N端包含结合模块B的第一部分，C端则包含结合模块A的第二部分。第一多肽链结合模块A的第一部分与第二多肽链结合模块A的第二部分彼此结合，形成完整的或具有功能性的结合位点；同样地，第二链结合模块B的第一部分与第一链结合模块B的第二部分亦彼此结合，形成完整的或具有功能性的结合位点。由此融合蛋白的第一多肽链与第二多肽链互相匹配结合，形成一种双向环化的球状结构。
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中
所述第一多肽链从N端至C端依次包含：第一结合模块的第一部分，第一连接区域，第二结合模块的第二部分；
所述第二多肽链从N端至C端依次包含：第二结合模块的第一部分，第二连接区域，第一结合模块的第二部分；并且其中
所述第一结合模块的第一部分与所述第一结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；
所述第二结合模块的第一部分与第二结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；并且其中
所述第一连接区域与所述第二连接区域能够二聚化。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分与所述第一连接区域直接融合或通过第一接头融合。
在一些实施方案中，所述第一连接区域与所述第二结合模块的第二部分直接融合或通过第二接头融合。
在一些实施方案中，所述第二结合模块的第一部分与所述第二连接区域直接融合或通过第三接头融合。
在一些实施方案中，所述第二连接区域与所述第一结合模块的第二部分直接融合或通过第四接头融合。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第一抗体的轻链可变区，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第二结合模块的第一部分为第二抗体的重链可变区，并且所述第二结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的轻链可变区-第五接头-第二抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区-第六接头-第一抗体的重链可变区，并且其中所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的轻链可变区-第七接头- 第四抗体的重链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的轻链可变区-第八接头-第三抗体的重链可变区。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的轻链可变区-第五接头-第二抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区-第六接头-第一抗体的重链可变区，并且所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然，并且所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的轻链可变区-第七接头-第四抗体的重链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的轻链可变区-第八接头-第三抗体的重链可变区。
在一些实施方案中，所述第一连接区域和所述第二连接区域各自独立地选自抗体的Fc结构域、配体和受体。
在一些实施方案中，其中所述第一接头、第二接头、第三接头、第四接头、第五接头、第六接头、第七接头和/或第八接头为肽接头。
在一些实施方案中，所述第一接头至第八接头相同或不相同。
在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。
在第五方面，本申请提供了制备第一方面所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)培养第四方面所述的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。
在第六方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的药物中的用途。
在第八方面，本申请提供了治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞。
在第九方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的用途。
附图说明
图1A至图1E显示了本申请中构建的融合蛋白Rainbody的结构示意图，其中图1A显示了本申请构建的融合蛋白Rainbody的平台结构示意图；图1B显示了抗PD-L1×抗HER2融合蛋白(RAb01)的结构示意图；
图1C显示了抗B7H3×抗CD137×抗CD3融合蛋白(RAb02)的结构示意图；图1D显示了抗CTLA-4×抗TIGIT融合蛋白(RAb03)的结构示意图；图1E显示了抗PD-L1×抗HER2×抗EpCAM×抗CD137融合蛋白 (RAb04)的结构示意图。
图2A至图2D显示了实施例中的Rainbody经纯化后的SDS-PAGE 电泳结果，其中图2A显示了RAb01的SDS-PAGE电泳结果，图2B显示了RAb02的SDS-PAGE电泳结果，图2C显示了RAb03的SDS-PAGE 电泳结果，图2D显示了RAb04的SDS-PAGE电泳结果。泳道M为DNA Marker、泳道1为非还原条件下的SDS-PAGE电泳结果、泳道3为还原条件下的SDS-PAGE电泳结果。
图3A至图3C显示了通过HPLC检测实施例中纯化的Rainbody纯度的结果，其中图3A为RAb02的纯度，图3B为RAb03的纯度，图3C为 RAb04的纯度。所示实施例的一步纯化纯度均不低于90％。
图4A至图4C显示了RAb01与细胞表面抗原结合的流式细胞术结果，其中图4A显示了RAb01与MC38-PDL-1细胞结合的流式细胞术结果，图4B显示了RAb01与MC38-HER2细胞结合的流式细胞术结果，图4C显示了RAb01与MC38-HER2&PD-L1细胞结合的流式细胞术结果。
图5显示了本申请所构建的各融合蛋白与其相应的抗原之间的亲和力常数测定结果。
发明的详细描述
提供以下定义和方法以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
定义
本文使用的术语“约”指所记载的数字的±10％，例如约1％指的 0.9％至1.1％的范围。
本文使用的术语“融合蛋白(fusion protein)”是指有目的地把两段或更多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所述蛋白。这种通过人工条件下将两个或更多个基因的编码区首尾连接，由调控序列控制的基因表达后所得的蛋白质产物即为融合蛋白。
本文所用的术语“肽接头”在本申请的背景下是指用于连接两个功能蛋白之间的短肽，长度可以从3个氨基酸(aa)高至76个氨基酸。肽接头可为融合蛋白中的各功能蛋白提供一定的柔性，使其能够发挥各自的功能。本申请中所用的肽接头优选只含有一个半胱氨酸，从而能够在两个肽接头之间形成一个稳定的二硫键。
本文所用的术语“抗体”是指能显示期望的生物活性的任何形式的抗体或其片段。因此，它以最广义的含义使用，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、融合蛋白(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们能显示期望的生物活性。因此，本领域技术人员也可以理解，本文所用的术语“抗体”还可以指能显示期望的生物活性的任何形式的相同或不同抗体或其片段的融合蛋白，从而实现多特异性抗体的功能。
本文所用的术语“抗原”是指能被选择性结合剂如抗体结合的分子或分子部分，还能用于动物中以制备能结合该抗原的表位的抗体。抗原可以具有一个或多个抗原表位。本文所述的抗原可以包括但不限于大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素，多糖(如肺炎球菌的荚膜多糖)和类脂等。
本文所用的术语“特异性结合”是本领域熟知的术语，并且测定抗体与抗原此类特异性结合的方法也为本领域所熟知。例如，在一些实施方案中，“特异性结合”是指抗体与预期的靶标结合，但不与其他靶标显著结合。相比与其他表位的结合，抗体以明显增加的亲和力和/或以更长的持续时间结合预期的靶表位。
本文所述的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群抗体的单个抗体之间是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异外。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原表位。本文公开的单克隆抗体不限于抗体来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体挑选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括在“抗体”定义下的完整免疫球蛋白以及其片段等。
本文使用的术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文使用的术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体 Y的亲和力通常可由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。
本文使用的术语“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的个体已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。
本文使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。
本文使用的术语“治疗有效量”可以根据具体情况而定，本领域普通技术人员根据实际所需药量可以很容易地掌握，如可根据患者体重、年龄和病症情况来确定。
具体实施方式
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中
所述第一多肽链从N端至C端依次包含：第一结合模块的第一部分，第一连接区域，第二结合模块的第二部分；
所述第二多肽链从N端至C端依次包含：第二结合模块的第一部分，第二连接区域，第一结合模块的第二部分；并且其中
所述第一结合模块的第一部分与所述第一结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；
所述第二结合模块的第一部分与第二结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；并且其中
所述第一连接区域与所述第二连接区域能够二聚化。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分与所述第一连接区域直接融合或通过第一接头融合。
在一些实施方案中，所述第一连接区域与所述第二结合模块的第二部分直接融合或通过第二接头融合。
在一些实施方案中，所述第二结合模块的第一部分与所述第二连接区域直接融合或通过第三接头融合。
在一些实施方案中，所述第二连接区域与所述第一结合模块的第二部分直接融合或通过第四接头融合。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第一抗体的轻链可变区，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第二结合模块的第一部分为第二抗体的重链可变区，并且所述第二结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的轻链可变区-第五接头-第二抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区-第六接头-第一抗体的重链可变区，并且其中所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的轻链可变区-第七接头- 第四抗体的重链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的轻链可变区-第八接头-第三抗体的重链可变区。在优选的实施方案中，所述第一抗体与第三抗体相同，所述第五接头与第七接头相同，所述第二抗体与第四抗体相同，所述第六接头与第八接头相同，由此形成完全对称的结构，例如图1D所示的融合蛋白结构。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的轻链可变区-第五接头-第二抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区-第六接头-第一抗体的重链可变区，并且所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然，并且所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的轻链可变区-第七接头-第四抗体的重链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的轻链可变区-第八接头-第三抗体的重链可变区。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的重链可变区-第五接头-第二抗体的轻链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的重链可变区-第六接头-第一抗体的轻链可变区，并且其中所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的重链可变区-第七接头- 第四抗体的轻链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的重链可变区-第八接头-第三抗体的轻链可变区。在优选的实施方案中，所述第一抗体与第三抗体相同，所述第五接头与第七接头相同，所述第二抗体与第四抗体相同，所述第六接头与第八接头相同，由此形成完全对称的结构，例如图1D所示的融合蛋白结构。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的重链可变区-第五接头-第二抗体的轻链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的重链可变区-第六接头-第一抗体的轻链可变区，并且所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然，并且所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的重链可变区-第七接头-第四抗体的轻链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的重链可变区-第八接头-第三抗体的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一连接区域和所述第二连接区域各自独立地选自抗体的Fc结构域，优选 IgG1的Fc结构域、配体和受体。
在具体的实施方案中，本申请中构建的融合蛋白Rainbody的示意性结构可以如图1A所示。
具体地，如果所述第一连接区域为配体，那么第二连接区域可以为所述配体的受体，从而使得第一连接区域和第二连接区域可以二聚化。
在所述第一连接区域和所述第二连接区域为抗体的Fc结构域的情况下，其可以为与铰链区连接的Fc结构域。
术语“铰链区”表示抗体重链多肽的一部分，其在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如，从根据Kabat的EU编号系统的约216位到约230位，或者从根据Kabat的EU编号系统的约226位到约230位。其他IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。
铰链区通常是由具有相同氨基酸序列的两个多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许结合的靶标结合位点独立地移动。铰链区可以细分为三个结构域：上部、中部和下部铰链结构域(参见例如Roux等人，J.Immunol.161(1998)4083)。
对抗体的氨基酸序列进行编号以鉴定等同位置，目前针对抗体存在多种不同的编号方案。Kabat方案(Kabat等，1991)是基于相同结构域类型的序列之间的高序列变异区域的位置而开发的。其对抗体重链(VH) 和轻链(Vλ和Vκ)可变结构域的编号不同。Chothia方案(Al-Lazikani， 1997)与Kabat方案相同，但校正了在第一个VH互补决定区(CDR) 周围插入注释的位置，使其对应于结构环。本申请中的抗体是按照Kabat 方案来编号的。
本文的第一抗体、第二抗体、第三抗体和第四抗体可以各自独立地来源于单克隆抗体。
在一些实施方案中，本申请中所用的单克隆抗体可以选自以下的一种或多种：Atezolizumab、博纳吐单抗(blincyto)、阿达木单抗 (adalimumab)、苏金单抗(secukinumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、吉妥珠单抗-奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、贝伦妥单抗-维多汀(Brentuximab vedotin)、地诺单抗(Denosumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、Obinutuzumab、雷莫芦单抗 (Ramucirumab)、3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗 (adecatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、培化阿珠单抗(alacizumab (pegol))、阿麦妥昔(amatuximab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗(bivatuzumab)、莫-坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、拉 -坎妥珠单抗(cantuzumab(ravtansine))、卡罗单抗-喷地肽(capromab (pendetide))、卡妥索单抗(catumaxomab)、泊-西他珠单抗(citatuzumab (bogatox))、西妥木单抗(cixutumumab)、clivatuzumab(tetraxetan)、可那木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、地莫单抗(Detumomab)、drozitumab、依美昔单抗 (ecromeximab)、依决洛单抗(edrecolomab)、埃罗妥珠单抗 (elotuzumab)、enavatuzumab、恩司昔单抗(ensituximab)、依帕珠单抗 (epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、FBTA05、flanvotumab、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、ganitumab、吉瑞昔单抗 (girentuximab)、格莱木单抗-维多汀(glembatumumab(vedotin))、替-伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、icrucumab、伊戈伏单抗(igovomab)、拉 -英达西单抗(indatuximab ravtansine)、英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗-奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab) (MDX-101)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、莫-洛伏珠单抗 (lorvotuzumab(mertansine))、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗 (lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫加珠单抗 (mogamulizumab)、moxetumomab(pasudotox)、他那可单抗(nacolomab (tafenatox))、他那莫单抗(naptumomab(estafenatox))、narnatumab、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nivolumab、 NR-LU-10、olaratumab、莫奥珠单抗(oportuzumab(monatox))、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、普立木单抗(pritumumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、radretumab、、罗妥木单抗(robatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、帕他普莫单抗(taplitumomab (paptox))、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替西木单抗(ticilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、替加珠单抗 (tigatuzumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab(celmoleukin))、 ublituximab、乌瑞鲁单抗(urelumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥昔单抗(votumumab)和扎鲁木单抗 (zalutumumab)。
在一些实施方案中，其中所述第一接头、第二接头、第三接头、第四接头、第五接头、第六接头、第七接头和/或第八接头为肽接头。
优选地，肽接头是“合成肽接头”，其富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基例如以多达5个氨基酸的小重复单元排列，如GGGS、 GGGGS、QQQG、QQQQG、SSG或SSSSG。这个小的重复单元可以重复两到五次以形成多聚体单元，如例如，(GGGS)2、(GGGS)3、(GGGS)4、 (GGGS)5、(GGGGS)2、(GGGGS)3或(GGGGS)4。在多聚体单元的氨基和/或羧基端末端，可以加入多达六个的额外任意、天然存在的氨基酸。其它合成的肽接头由单个氨基酸组成，其重复10至20次，并且可以在氨基和/或羧基端末端包含多达六个的额外任意、天然存在的氨基酸，如，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG中的丝氨酸。所有肽接头可以由核酸分子编码，因此可以重组表达。
在一些实施方案中，所述第一接头至第八接头相同或不相同。
在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
在优选的实施方案中，所述核酸可以是适合在宿主细胞中表达的密码子优化的核酸。例如根据密码子的简并性，其仍然编码同样的蛋白质。根据所用宿主细胞进行密码子优化的方法是本领域技术人员公知的。
在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的衍生物。可用于酵母的载体的实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括以下众所周知的衍生物：SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列以及衍生自功能性哺乳动物载体(如上述那些) 和功能性质粒和噬菌体DNA的组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体为本领域已知的(例如，P J.Southern&P. Berg,J.Mol.Appl.Genet,1:327-341(1982)；Subramani等人,Mol.Cell. Biol,1:854-864(1981)；Kaufinann&Sharp,"Amplification And Expression of SequencesCotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,"J.Mol.Biol,159:601-621 (1982)；Kaufhiann&Sharp,Mol.Cell.Biol,159:601-664(1982)；Scahill 等人,"Expression And Characterization Of The Product Of AHuman Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,"Proc. Nat'lAcad.Sci USA,80:4654-4659(1983)；Urlaub&Chasin,Proc.Nat'l Acad.Sci USA,77:4216-4220,(1980)，将其全部通过引用并入本文)。
可用于本申请的表达载体含有至少一个表达控制序列，其与待表达的DNA序列或片段可操作连接。将控制序列插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统， trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd 外壳蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母α-交配因子的启动子，以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子，例如SV40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的其它序列。
在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。
在第五方面，本申请提供了制备第一方面所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)培养第四方面所述的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。
在第六方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体为不减弱免疫细胞活力以及功能、不影响抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合的载体，包括但不限于细胞培养基、缓冲液、生理盐水和平衡盐溶液等。缓冲液的实例包括等渗磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐等。在具体的实施方案中，所述药学上可接受的载体为含1％血清的磷酸盐缓冲液。
在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的药物中的用途。
在第八方面，本申请提供了治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞。
在第九方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的用途。
肿瘤可以指良性肿瘤或恶性肿瘤，即癌症。本文使用的术语“癌症”是指由个体中的细胞的不受控制或异常生长引起的疾病状态。癌症的代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。其它实例包括但不限于胆管癌、脑癌(例如成胶质细胞瘤)、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、 CNS(例如听神经瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、成血管细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜细胞瘤、成神经细胞瘤、少突神经胶质瘤、松果体瘤和视网膜母细胞瘤)、子宫内膜癌、造血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)、肾癌、喉癌、肺癌、肝癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(例如黑色素瘤和鳞状细胞癌)和甲状腺癌。癌症可以包括实体瘤(例如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)、弥漫性肿瘤(例如，白血病)或这些肿瘤的一些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。癌症也可以耐受常规治疗(例如常规化疗和/或放疗)。
在第七方面至第九方面的一些实施方案中，所述肿瘤可以选自上文列出的各种癌症，优选地，所述肿瘤可以选自肺癌、结直肠癌、膀胱癌、白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌、恶性胶质瘤，肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌。“自身免疫性疾病”为由个体自身组织引起且针对个体自身组织的疾病或病症。自身免疫疾病或病症的实例包括但不限于炎性反应，如炎症性皮肤疾病，包括银屑病和皮炎(例如，异位性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病相关的反应 (如克罗恩病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性病况，如湿疹和哮喘以及涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的其他病况；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如，I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化；雷诺综合征(Reynaud’s syndrome)；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；斯耶格伦综合征(Sjorgen’s syndrome)；青少年型糖尿病；以及通常在结核病、结节病、多肌炎、炎性肌病、间质性肺病、肉芽肿病和血管炎中发现的由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应；恶性贫血(艾迪生病(Addison’s disease))；涉及白血球渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症(cryoglobinemia)或库姆斯阳性贫血 (Coombs positive anemia))；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；强直性脊柱炎；变应性神经炎；格雷夫斯病(Graves’disease)；朗-爱二氏肌无力综合征(Lambert-Eatonmyasthenic syndrome)；大疱性类天疱疹；天疱疹；自身免疫性多内分泌腺疾病；Reiter病；僵人综合征；贝切特病(Behcet disease)；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
在第七方面至第九方面的一些实施方案中，所述自身免疫性疾病可以选自上文列出的各种自身免疫性疾病，优选地，所述自身免疫性疾病可以选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、银屑病、多发性肌炎、天疱疹、炎性肠病、强直性脊柱炎和自身免疫性溶血性贫血。
“感染性疾病”包括在个体身体内部或身体外部存在病原体，其中当病原体的生长被抑制时个体受益。除了指病原体的存在之外，术语“感染”还指不利的正常细菌组。如本文所用，术语“病原体”是指能够引起疾病的感染性材料。感染性材料的非限制性实例包括在受试者中诱导疾病的病毒、细菌、朊病毒、真菌、类病毒或寄生虫。在一个特定的具体实例中，感染是由病原体引起的，例如细菌或病毒。在某些具体实例中，感染是细胞内感染。在一个具体实例中，感染是病毒感染。
在第七方面至第九方面的一些实施方案中，所述感染性疾病可以选自由病毒、细菌、朊病毒、真菌、类病毒或寄生虫引发的疾病，包括但不限于各型的病毒性肝炎(例如乙型肝炎、甲型肝炎、丙型肝炎等)、流行性感冒、麻疹、水痘、带状疱疹、流行性腮腺炎、肾综合征出血热、登革热、艾滋病、狂犬病、新型冠状病毒(例如，COVID-19)感染、伤寒、副伤寒、布鲁氏菌病、炭疽、白喉、百日咳、鲜红热、结核病、流行性脑脊髓膜炎、流行性和地方性斑疹、伤寒、恙虫病等。优选地，所述感染性疾病可以选自流行性感冒、乙型肝炎、狂犬病、梅毒、艾滋病、新型冠状病毒(例如，COVID-19)感染、丙型肝炎、结核病。
本领域技术人员可以根据预期想要治疗的疾病(例如上文列出的肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病)，将针对不同疾病的抗体(例如单克隆抗体)构建成本申请中的Rainbody结构，从而靶向这些不同的疾病。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本申请，通过下面的实施例进一步示例本申请。描述这些实施例仅为说明本申请，而不是限制本申请的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域常规的方法和技术。对于其它没有特别注明厂家的材料和设备等，其通常是可通过商业途径常规获得的。
实施例
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
在本申请的实施例中，如没有特别指明，所用原料和试剂皆为常规的，可通过市购获得。
如无特别说明，本申请的实施例的表达载体均由两条链组成，分别命名为α链和β链。α链包含三个部分，分别为位于N端的结合模块P1A，连接区域以及位于C端的结合模块P2B；β链包含三个部分，分别为位于N端的结合模块P1B，连接区域以及位于C端的结合模块P2A。α链的P1A与β链的P2A结合形成靶点结合区域，β链的P1B与α链的P2B 结合形成靶点结合区，最终α链与β链形成互相环化的球型结构。α链和β链的连接区域均为IgG1 Hinge-Fc。
实施例1：抗PD-L1×抗HER2融合蛋白RAb01的制备、表达与鉴定
1.1抗PD-L1×抗HER2融合蛋白RAb01表达载体的制备
1.1.1 α链表达载体pQK RAb01α和β链表达载体pQK RAb01β的构建
载体质粒pQK RAb01α与载体质粒pQK RAb01β为前期全合成的载体(九天基因科技(天津)有限公司)。α链包含的结合模块P1A为抗PD-L1 VL-G4S-抗HER2 VH-G4S，结合模块P2B为2×G4S-IL-15R，连接区域则为IgG1 Hinge-Fc。β链包含的结合模块P1B为IL-15-G4S，结合模块 P2A为2×G4S-抗HER2 VL-G4S-抗PD-L1 VH，连接区域为IgG1 Hinge-Fc。实施例中所用的抗PD-L1单抗来自于Atezolizumab(Roche)，抗HER2单抗来自于Trastuzumab(Roche)，配体IL-15与受体IL-15R均为人源的蛋白序列。
1.1.2重组质粒的扩增和制备
将全合成获得的α链表达载体pQK RAb01α和β链表达载体pQK RAb01β分别转化至大肠杆菌(E.coli)TOP10中。挑取单克隆并鉴定后，在含有氨苄青霉素(终浓度为100mg/L)的LB培养基中培养16小时，培养条件为37℃，200rpm振荡培养。以8000×g离心20分钟收集细菌。使用NucleoBond Xtra Midi试剂盒(Macherey-nagel)，按照试剂盒的说明书，对质粒进行分离提取，以1mL的无菌超纯水进行洗脱，最后使用 Nanodrop微量分光光度计测定质粒浓度。
1.2抗体的表达
将α链表达载体pQK RAb01α和β链表达载体pQK RAb01β共同转染HEK293细胞进行表达。转染前24小时，将1.5×106的HEK293(ATCC，编号：CRL-1573)细胞接种于含有100mLOPM-293CD05无血清培养基 (奥浦迈，Cat：81075-001)的500mL摇瓶中，培养条件为36.5℃，7.5％CO2，120rpm悬浮培养。转染时，将重组质粒pQK RAb01α和pQK RAb01β按照1:1的重量比(DNA总量为100μg)于10mL OPM-293 CD05 培养基中混合，随后加入100μL PEI(浓度为3mg/mL)，迅速涡旋混匀，室温静止孵育15分钟。然后将该混合物加入至上述细胞培养物中。细胞在36.5℃，7.5％CO2，120rpm/min条件下继续培养7天以收获表达的抗体。该抗体指由质粒pQK RAb01α和pQK RAb01β表达的抗PD-L1×抗 HER2融合蛋白，抗体命名为RAb01，结构如图1B所示。
1.3抗体的纯化
将收获的细胞培养物于3000×rpm离心20min，收集上清并用0.22μm 过滤器过滤。用20mM PB和150mM NaCl的混合缓冲液(pH 7.4)平衡5 mL Protein A亲和层析柱(GE)，流速5mL/min，体积大于5CV。将过滤后的样品液以5mL/min流速上样。上样完成后，用20mM PB和150mM NaCl的混合缓冲液(pH 7.4)洗涤Protein A亲和层析柱，流速5mL/min。用50mM柠檬酸(pH 3.0)缓冲液进行洗脱，流速5mL/min，收集完整洗脱峰，同时用1M Tris HCl(pH9.0)缓冲液调节收集到的洗脱液的pH至7.0 左右。纯化产物经超滤管超滤，将Tris-柠檬酸缓冲液置换成商品化的PBS 缓冲液。将所获蛋白用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测(图2A)，使用Nanodrop微量分光光度计测定蛋白浓度，计算蛋白产量为32mg/L。
1.4流式细胞术检测抗体与细胞结合活性
1.4.1抗体与MC38-PD L1细胞结合活性
将复苏并培养了超过3代的MC38-PD L1细胞(购于康源博创生物科技(北京)有限公司，货号：KC-0984)以10mL PBS洗1次，1mL 0.05％胰酶消化1min，加入4mL含有10％FBS的RPMI1640培养基，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min，重悬计数，调整细胞密度为1×106个细胞/mL。组别设为空白组，封闭组以及非封闭组。封闭组指细胞先与Atezolizumab共同孵育60min(终浓度为40μg/ml)，再与经生物素标记的药物RAb01-Biotin(生物素购自Thermo Fisher Scientific，REF：21335) 共同孵育。非封闭组即直接与药物RAb01-Biotin共同孵育。封闭组与非封闭组均设置5个梯度浓度(终浓度)，分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5 μg/ml，1μg/ml和0.1μg/ml。先向各组的管中加入10μl的上述细胞悬液，其中封闭组中先加入Atezolizumab(终浓度为40μg/ml)，与剩余各组一起以2％FBS的PBS缓冲液补足至100μl。4℃孵育60min后，用3mL含有2％FBS的PBS缓冲液清洗，1000rpm/min离心5min，以50μl的含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，此时封闭组与非封闭组均加入各浓度梯度的药物RAb01-Biotin(终浓度分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1 μg/ml和0.1μg/ml)，并以2％FBS的PBS缓冲液补足至100μl。4℃孵育 60min，完成后再次以用3mL含有2％FBS的PBS缓冲液清洗，1000 rpm/min离心5min，以50μl的含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，各组均加入0.5μl的PE Streptavidin(BioLegend，CAT：405203)，室温孵育30 min后，最后以含有2％FBS的PBS缓冲液清洗各组的管，1000rpm/min 离心5min，以100μl含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，上流式细胞仪(艾森，仪器型号：NovoCyte)检测。结果如图4A所示。
1.4.2抗体与MC38-HER2细胞结合活性
将复苏并培养了超过3代的MC38-HER2细胞(购于康源博创生物科技(北京)有限公司，货号：KC-1363)以10mL PBS洗1次，1mL 0.05％胰酶消化1min，加入4mL含有10％FBS的RPMI1640培养基，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min，重悬计数，调整细胞密度为1×106个细胞/mL。组别设为空白组，封闭组以及非封闭组。封闭组指细胞先与Trastuzumab共同孵育60min(终浓度为40μg/ml)，再与药物RAb01-Biotin 共同孵育。非封闭组即直接与药物RAb01-Biotin共同孵育。封闭组与非封闭组均设置5个梯度浓度(终浓度)，分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5 μg/ml，1μg/ml和0.1μg/ml。先向各组的管中加入10μl的上述细胞悬液，其中封闭组中先加入Trastuzumab(终浓度为40μg/ml)，与剩余各组一起以2％FBS的PBS缓冲液补足至100μl。4℃孵育60min后，用3mL含有2％FBS的PBS缓冲液清洗，1000rpm/min离心5min，以50μl的含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，此时封闭组与非封闭组均加入各浓度梯度的药物RAb01-Biotin(终浓度分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1 μg/ml和0.1μg/ml)，并以2％FBS的PBS缓冲液补足至100μl。4℃孵育 60min，完成后再次以用3mL含有2％FBS的PBS缓冲液清洗，1000 rpm/min离心5min，以50μl的含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，各组均加入0.5μl的PE Streptavidin(BioLegend，CAT：405203)，室温孵育30min后，最后以含有2％FBS的PBS缓冲液清洗各组的管，1000rpm/min 离心5min，以100μl含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，上流式细胞仪(艾森，仪器型号：NovoCyte)检测。结果如图4B所示。
1.4.3抗体与MC38-HER2&PD-L1细胞结合活性
将复苏并培养了超过3代的HER2&PD-L1细胞(购于康源博创生物科技(北京)有限公司，货号：KC-2095)以10mL PBS洗1次，1mL 0.05％胰酶消化1min，加入4mL含有10％FBS的RPMI1640培养基，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min，重悬计数，调整细胞密度为1×106个细胞/mL。组别设为空白组，双封闭组以及非封闭组。双封闭组指细胞先与Atezolizumab和Trastuzumab共同孵育60min(终浓度均为40 μg/ml)，再与药物RAb01-Biotin共同孵育。非封闭组即直接与药物 RAb01-Biotin共同孵育。双封闭组与非封闭组均设置5个梯度浓度(终浓度)，分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1μg/ml和0.1μg/ml。先向各组的管中加入10μl的上述细胞悬液，其中双封闭组中先加入 Atezolizumab和Trastuzumab(终浓度为40μg/ml)，与剩余各组一起以 2％FBS的PBS缓冲液补足至100μl。4℃孵育60min后，用3mL含有 2％FBS的PBS缓冲液清洗，1000rpm/min离心5min，以50μl的含有 2％FBS的PBS缓冲液重悬，此时双封闭组与非封闭组均加入各浓度梯度的药物RAb01-Biotin(终浓度分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1 μg/ml和0.1μg/ml)，并以2％FBS的PBS缓冲液补足至100μl。4℃孵育 60min，完成后再次以用3mL含有2％FBS的PBS缓冲液清洗，1000 rpm/min离心5min，以50μl的含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，各组均加入0.5μl的PE Streptavidin(BioLegend，CAT：405203)，室温孵育 30min后，最后以含有2％FBS的PBS缓冲液清洗各组的管，1000rpm/min 离心5min，以100μl含有2％FBS的PBS缓冲液重悬，上流式细胞仪(艾森，仪器型号：NovoCyte)检测。结果如图4C所示。
实施例2：抗B7H3×抗CD3×抗CD137融合蛋白RAb02的制备、表达与鉴定
2.1抗B7H3×抗CD3×抗CD137融合蛋白RAb02表达载体的制备
2.1.1 α链表达载体pQK RAb02α和β链表达载体pQK RAb02β的构建
载体质粒pQK RAb02α与载体质粒pQK RAb02β为前期全合成的载体(九天基因科技(天津)有限公司)。α链包含的结合模块P1A为抗 B7H3 VL-G4S-抗CD137 VH-G4S，结合模块P2B为2×G4S-抗CD3 VL-G4S-抗B7H3 VH，连接区域则为IgG1 Hinge-Fc。β链包含的结合模块P1B为抗B7H3 VL-G4S-抗CD3 VH，结合模块P2A为2×G4S-抗CD137 VL-G4S-抗B7H3 VH，连接区域为IgG1 Hinge-Fc。实施例中所用的抗 B7H3单抗序列由北京免疫方舟医药科技有限公司通过杂交瘤筛选得到，其VH和VL序列如SEQ ID Nos：1和2所示，CD137单抗来自于北京免疫方舟医药科技有限公司(序列参见专利，专利号： US-2019-0284292-A1)，抗CD3单抗来自于Blincyto(Amgen)。
2.1.2质粒的扩增和制备
参照实施例1所描述的流程，最后使用Nanodrop微量分光光度计测定质粒浓度。
2.2抗体的表达
参照实施例1所描述的流程进行转染，其中转染细胞为HEK293 (ATCC，编号：CRL-1573)，转染体积为100mL。转染后的细胞于500 mL摇瓶中悬浮培养7天后收获抗体，培养条件为36.5℃，7.5％CO2，120 rpm/min。所得抗体指由质粒pQKRAb02α和质粒pQKRAb02β表达的抗 B7H3×抗CD137×抗CD3融合蛋白，抗体命名为RAb02，结构如图1C 所示。
2.3抗体的纯化
参照实施例1所描述的流程进行纯化，经缓冲液置换后用SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色检测(图2B)，使用Nanodrop微量分光光度计测定蛋白浓度，计算蛋白产量为34mg/L。
2.4抗体的鉴定
2.4.1 HPLC测定抗体的纯度
经Protein A纯化的抗体，通过HPLC(安捷伦1260II)SEC检测其纯度。色谱柱为Sepax水溶性体积排阻色谱柱，流动相为50mm PB+300 mm NaCl pH 7.0，上样量为10μg，流速1mL/min，等度洗脱20min。结果如图3A所示，一步纯化后其单体纯度约为91.06％。
2.4.2 Fortebio测定抗体亲和力
纯化的抗体使用分子互作仪Fortebio Octet QK(Molecular Devices公司)测定其亲和力常数KD。通过Ni-NTA的传感器(sensor)固定抗原，抗原分别为人B7H3(义翘神州，Cat：11188-H08H)、人CD137(义翘神州，Cat：10041-H08H)和人CD3(义翘神州，Cat：10981-H08H)，固定浓度均为0.25μM。抗体RAb02分别按照浓度200nM，100nM，50nM 和25nM浓度上样，体积均为200μl。亲和力常数测定结果如图5所示。
实施例3：抗CTLA-4×抗TIGIT融合蛋白RAb03的制备、表达与鉴定
3.1抗CTLA-4×抗TIGIT融合蛋白RAb03表达载体的制备
3.1.1表达载体pQK RAb03的构建
表达抗体RAb03的载体由单一质粒pQK RAb03构成(九天基因科技(天津)有限公司)，其模块P1A与模块P1B在核苷酸序列上完全相同，结构为抗CTLA-4VL-G4S-抗TIGIT VH-G4S；模块P2B与模块P2A 在核苷酸序列上完全相同，结构为2×G4S-抗TIGIT VL-G4S-抗CTLA-4 VH-G4S。连接区域均为IgG1 Hinge-Fc。实施例中所用的抗CTLA-4单抗和抗TIGIT单抗序列均由北京免疫方舟医药科技有限公司通过杂交瘤筛选得到，抗CTLA-4单抗的VH和VL序列如SEQ ID Nos：3和4所示，并且抗TIGIT单抗的VH和VL序列如SEQ ID Nos：5和6所示。
3.1.2重组质粒的扩增和制备
参照实施例1所描述的流程，最后使用Nanodrop微量分光光度计测定质粒浓度。
3.2抗体的表达
参照实施例1所描述的流程进行转染，其中转染细胞为HEK293 (ATCC，编号：CRL-1573)，转染体积为100mL。转染后的细胞于500 mL摇瓶中悬浮培养7天后收获抗体，培养条件为36.5℃，7.5％CO2，120 rpm/min。所得抗体指由质粒pQKRAb03表达的抗CTLA-4×抗TIGIT融合蛋白，抗体命名为RAb03，结构如图1D所示。
3.3抗体的纯化
参照实施例1所描述的流程进行纯化，经缓冲液置换后用SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色检测(图3B)，使用Nanodrop微量分光光度计测定蛋白浓度，计算蛋白产量为68mg/L。
3.4抗体的鉴定
3.4.1 HPLC测定抗体纯度
经Protein A纯化的抗体，通过HPLC(安捷伦1260II)SEC检测其纯度。色谱柱为Sepax水溶性体积排阻色谱柱，流动相为50mm PB+300 mm NaCl pH 7.0，上样量为10μg，流速1mL/min，等度洗脱20min。结果如图3B所示，一步纯化后其单体纯度约为93.04％。
3.4.2 Fortebio测定抗体亲和力
具体流程参照实施例2。通过Ni-NTA的传感器(sensor)固定抗原，抗原分别为人CTLA-4(义翘神州，Cat：11159-H08H)和人TIGIT(义翘神州，Cat：10917-H08H)，固定浓度均为0.25μM。抗体RAb03分别按照浓度200nM，100nM，50nM和25nM、12.5nM和6.25nM浓度上样，体积均为200μl。亲和力常数测定结果如图5所示。
实施例4：抗PD-L1×抗HER2×抗EpCAM×抗CD137融合蛋白RAb04的制备、表达与鉴定
4.1抗PD-L1×抗HER2×抗EpCAM×抗CD137融合蛋白RAb04表达载体的制备
4.1.1表达载体pQK RAb04的构建
载体质粒pQK RAb04α与载体质粒pQK RAb04β为前期全合成的载体(九天基因科技(天津)有限公司)。α链包含的结合模块P1A为抗PD-L1 VL-G4S-抗HER2 VH-G4S，结合模块P2B为2×G4S-抗EpCAM VL-G4S- 抗CD137 VH，连接区域则为IgG1 Hinge-Fc。β链包含的结合模块P1B 为抗CD137 VL-G4S-抗EpCAM VH，结合模块P2A为2×G4S-抗HER2 VL-G4S-抗PD-L1 VH，连接区域为IgG1 Hinge-Fc。实施例中所用的抗 PD-L1单抗来自于Atezolizumab(Roche)，抗HER2单抗来自于 Trastuzumab(Roche)，CD137单抗来自于北京免疫方舟医药科技有限公司(序列参见专利，专利号：US-2019-0284292-A1)，抗CD3单抗来自于Blincyto(Amgen)。
4.1.2重组质粒的扩增与制备
参照实施例1所描述的流程，最后使用Nanodrop微量分光光度计测定质粒浓度。
4.2抗体的表达
参照实施例1所描述的流程进行转染，其中转染细胞为HEK293 (ATCC，编号：CRL-1573)，转染体积为100mL。转染后的细胞于500 mL摇瓶中悬浮培养7天后收获抗体，培养条件为36.5℃，7.5％CO2，120 rpm/min。所得抗体指由质粒pQKRAb04α和质粒pQKRAb04β表达的抗 PD-L1×抗HER2×抗CD137×抗CD3融合蛋白，抗体命名为RAb04，结构如图1E所示。
4.3抗体的纯化
参照实施例1所描述的流程进行纯化，经缓冲液置换后用SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色检测(图2D)，使用Nanodrop微量分光光度计测定蛋白浓度，计算蛋白产量为26mg/L。
4.4抗体的鉴定
4.4.1 HPLC测定抗体纯度
经Protein A纯化的抗体，通过HPLC(安捷伦1260II)SEC检测其纯度。色谱柱为Sepax水溶性体积排阻色谱柱，流动相为50mm PB+300 mm NaCl pH 7.0，上样量为10μg，流速1mL/min，等度洗脱20min。结果如图3C所示，一步纯化后其单体纯度约为91.92％。
4.4.2 Fortebio测定抗体亲和力
具体流程参照实施例2。通过Ni-NTA的传感器(sensor)固定抗原，抗原分别为人PD-L1(义翘神州，Cat：10084-H08H)、人HER2(义翘神州，Cat：10004-H08H)、人CD137(义翘神州，Cat：10041-H08H) 和人CD3(义翘神州，Cat：10981-H08H)，固定浓度均为0.25μM。抗体RAb04分别按照浓度200nM，100nM，50nM和25nM、12.5nM和 6.25nM浓度上样，体积均为200μl。亲和力常数测定结果如图5所示。
序列表
<110> 北京免疫方舟医药科技有限公司
<120> 一种多靶向融合蛋白Rainbody及其制备方法和用途
<130> 22C10776CN
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asn
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Glu Gly Arg Tyr Gly Phe Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Gly
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Leu Leu Arg Leu Arg Asp Trp Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gln Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu
20 25 30
Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser
85 90 95
Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr
100 105 110
Ile Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Thr Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Phe Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (14)

1.一种融合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中
所述第一多肽链从N端至C端依次包含：第一结合模块的第一部分，第一连接区域，第二结合模块的第二部分；
所述第二多肽链从N端至C端依次包含：第二结合模块的第一部分，第二连接区域，第一结合模块的第二部分；并且其中
所述第一结合模块的第一部分与所述第一结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；
所述第二结合模块的第一部分与第二结合模块的第二部分能够形成特异性结合靶标的功能性结合位点；并且其中
所述第一连接区域与所述第二连接区域能够二聚化。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一结合模块的第一部分与所述第一连接区域直接融合或通过第一接头融合，任选地，所述第一连接区域与所述第二结合模块的第二部分直接融合或通过第二接头融合，任选地，所述第二结合模块的第一部分与所述第二连接区域直接融合或通过第三接头融合，任选地，所述第二连接区域与所述第一结合模块的第二部分直接融合或通过第四接头融合。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第一抗体的轻链可变区，或反之亦然，任选地，所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然，任选地，所述第二结合模块的第一部分为第二抗体的重链可变区，并且所述第二结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区，或反之亦然，任选地，所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然。
4.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的轻链可变区-第五接头-第二抗体的重链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的轻链可变区-第六接头-第一抗体的重链可变区，或者所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然；并且其中
所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的轻链可变区-第七接头-第四抗体的重链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的轻链可变区-第八接头-第三抗体的重链可变区，或者所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然，
优选地，所述第一抗体与第三抗体相同，所述第五接头与第七接头相同，所述第二抗体与第四抗体相同，并且所述第六接头与第八接头相同。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一结合模块的第一部分为第一抗体的重链可变区-第五接头-第二抗体的轻链可变区，并且所述第一结合模块的第二部分为第二抗体的重链可变区-第六接头-第一抗体的轻链可变区，或者所述第一结合模块的第一部分为配体，并且所述第一结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然；并且其中
所述第二结合模块的第一部分为第三抗体的重链可变区-第七接头-第四抗体的轻链可变区，并且，所述第二结合模块的第二部分为第四抗体的重链可变区-第八接头-第三抗体的轻链可变区，或者所述第二结合模块的第一部分为配体，并且所述第二结合模块的第二部分为所述配体的受体，或反之亦然，
优选地，所述第一抗体与第三抗体相同，所述第五接头与第七接头相同，所述第二抗体与第四抗体相同，并且所述第六接头与第八接头相同。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一连接区域和所述第二连接区域各自独立地选自抗体的Fc结构域，优选IgG1的Fc结构域、配体和受体。
7.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述第一接头、第二接头、第三接头、第四接头、第五接头、第六接头、第七接头和/或第八接头为肽接头，任选地，所述第一接头至第八接头相同或不相同。
8.一种核酸，其编码权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白。
9.一种表达载体，其包含权利要求8所述的核酸。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的核酸或权利要求8所述的表达载体，任选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。
11.制备权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)培养权利要求9所述的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。
12.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，权利要求8所述的核酸，权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
13.权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，权利要求8所述的核酸，权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或感染性疾病的药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述肿瘤选自肺癌、结直肠癌、膀胱癌、白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌、恶性胶质瘤，肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌，任选地，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、银屑病、多发性肌炎、天疱疹、炎性肠病、强直性脊柱炎和自身免疫性溶血性贫血，任选地，所述感染性疾病选自乙型肝炎、甲型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、麻疹、水痘、带状疱疹、流行性腮腺炎、肾综合征出血热、登革热、艾滋病、狂犬病、新型冠状病毒(例如，COVID-19)感染、伤寒、副伤寒、布鲁氏菌病、炭疽、白喉、百日咳、鲜红热、结核病、流行性脑脊髓膜炎、流行性和地方性斑疹、伤寒和恙虫病。
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