CN117003849A - 多肽及其作为抗纤维化药物的用途 - Google Patents

多肽及其作为抗纤维化药物的用途 Download PDF

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CN117003849A CN202311010313.0A CN202311010313A CN117003849A CN 117003849 A CN117003849 A CN 117003849A CN 202311010313 A CN202311010313 A CN 202311010313A CN 117003849 A CN117003849 A CN 117003849A
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陈纯
谢灵枫
洪金省
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Abstract

本申请公开了一类多肽及其作为抗纤维化药物的用途。本申请中，多肽序列通过解除SDC4和integrin受体间的协同作用，抑制纤维化基质诱导的成纤维细胞增殖、活化及基质蛋白分泌，并在小鼠博莱霉素肺纤维化模型中表现出良好的抗肺纤维化效果；此外，本申请中提供的多肽序列不含RGD序列，不阻断integrin与细胞外基质蛋白的结合，安全性好。

Description

多肽及其作为抗纤维化药物的用途
相关申请交叉引用
本申请要求于2022年11月02日提交的、申请号为2022113671846、发明名称为“多肽及其作为抗纤维化药物的用途”的中国专利申请的优先权，上述申请的全文以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及多肽及其作为抗纤维化药物的用途。
背景技术
肺纤维化是多种刺激因素引起的肺组织慢性炎症损伤、基质堆积、结构重构，可导致患者的通气功能下降甚至引起死亡。有研究显示，SARS患者和同属于冠状病毒的MERS-CoV感染患者出现肺纤维化的比例远高于正常人。在新型冠状病毒感染全球流行背景下，可推测未来肺纤维化的疾病负担将加重。整合素(integrin)在细胞外基质(ECM)与细胞间传递信息，在纤维化病变中高表达，是推动肺纤维化进展的核心因素。以整合素为靶点的多个抗肺纤维化化合物正处于临床研究中。跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Syndecans(SDCs)通过协同integrin受体，在细胞黏附、迁移、分化中发挥作用。目前，临床使用的用于治疗肺纤维化的药物主要为吡非尼酮和尼达尼布，但两药在阻止疾病进展、改善生命质量方面仍存在不足。因此，本领域尚需开发阻止肺纤维化进展并实现有效治疗肺纤维化的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽。
本发明的另一目的在于一种多核苷酸。
本发明的另一目的在于一种表达载体。
本发明的另一目的在于一种转化的蛋白。
本发明的另一目的在于一种药物组合物。
本发明的另一目的在于一种预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的方法。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了分离的多肽或包含所述多肽的融合蛋白的用途，所述分离的多肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-5所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；和
(iii)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
(iv)与(iii)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；
并且，所述用途选自以下任一种：
(1)用于抑制成纤维细胞的增殖；
(2)用于抑制纤维化相关蛋白表达；
(3)用于预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病；和
(4)用于制备预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的药物。
表1
编号 名称 氨基酸序列
SEQ ID NO：1 SC-1 Ac-NHIPERAGSGSQVPTEPKKLSPVEESEDVSNKVSMTTNVT-NH2
SEQ ID NO：2 SC-2 Ac-NHIPERAGSGSQVPTEPKKLSPVEESEDRSNKVSM-NH2
SEQ ID NO：3 SC-3 Ac-NHIPERAGSGSQVPTEPKKLSPVEESEDWSNKVSM-NH2
SEQ ID NO：4 SC-4 Ac-NHIPERAVPTEPKKLSPVEESEDITNSTLVTTNVT-NH2
SEQ ID NO：5 SC-5 Ac-NHIPERAVPTEPKKLSPVEESEDITNSTLV-NH2
表2
在一些优选的方案中，所述纤维化相关蛋白选自Ki67、ɑ-SMA、Fibronectin、Collagen I、CollagenⅢ、TGF-β1、IL-6、IL-1β和TNF-α中至少一种。
本发明第二方面，还提供了一种分离的多肽，所述多肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-5所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的多肽。
在一些优选的方案中，所述多核苷酸包含选自如下的(a)或(b)中任一项所述的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：9-13所示的多核苷酸序列；
(b)与所述多核苷酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的多核苷酸序列。
表3
上述多核苷酸序列SEQ ID NO：9编码氨基酸序列SEQ ID NO：1；
上述多核苷酸序列SEQ ID NO：10编码氨基酸序列SEQ ID NO：2.
上述多核苷酸序列SEQ ID NO：11编码氨基酸序列SEQ ID NO：3.
上述多核苷酸序列SEQ ID NO：12编码氨基酸序列SEQ ID NO：4.
上述多核苷酸序列SEQ ID NO：13编码氨基酸序列SEQ ID NO：5.
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第三方面所述的多核苷酸。
本发明的第五方面，提供了一种转化的细胞，所述转化的细胞包括本发明第四方面所述的表达载体。
本发明的第六方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明第五方面所述的多肽。
在一些优选的方案中，所述融合蛋白还包含IgG、Fc片段、FLAG、His、GST、SUMO、TrxA、DsbA或eGFP中至少一种。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第二方面所述的多肽或本发明的第六方面所述的融合蛋白，以及药学上可接受的配制剂。
本发明的第八方面，提供了一种预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的方法，所述方法包步骤：
向受试者施用本发明第二方面所述的多肽、本发明的第六方面所述的融合蛋白或者本发明的第七方面所述的药物组合物。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明中提供的多肽序列可有效解除integrin和RTK受体间的协同关系，对integrin信号通路和RTK信号通路均产生下调作用，从而获得更强的抗肺纤维化效果；
(2)本发明中提供的多肽序列不含RGD序列，不阻断integrin与ECM蛋白的结合，即不影响细胞的粘附从而避免整合素介导的细胞死亡(IMD)，毒副作用低。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1A是根据本发明实施例中SSTN87-131氨基酸序列示意图；
图1B是根据本发明实施例中SSTN87-131对NIH3T3成纤维细胞增殖影响图；
图2A是根据本发明实施例中SSTN87-131对肌成纤维细胞(MFB)细胞增殖影响图；Note:SSTN87-131:100nM，Nintedanib:100nM；
图2B是根据本发明实施例中SSTN87-131对去细胞肺组织基质三维培养的NIH3T3细胞增殖的影响图，Note:三维培养：将细胞培养在去细胞的肺组织基质上，dECM-Nor:去细胞化的正常小鼠肺组织基质，dECM-RIPF:去细胞化的放射性肺纤维化(RIPF)小鼠肺组织基质，SSTN87-131:100nM、Nintedanib:100nM；*P<0.05,**P<0.01vs.dECM-Nor or dECM-RIPFgroup；
图3A是根据本发明实施例中SSTN87-131对去细胞肺组织基质三维培养中Ki67、α-SMA、CollagenⅢ的mRNA水平的影响图，Note:dECM-Nor:去细胞化的正常小鼠肺组织基质，dECM-RIPF:去细胞化的放射性肺纤维化(RIPF)小鼠肺组织基质，*P<0.05,**P<0.01vs.dECM-Nor group,#P<0.05,##P<0.01vs.dECM-RIPF group；
图3B是根据本发明实施例中SSTN87-131对去细胞肺组织基质三维培养中TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I的mRNA水平的影响图；Note:dECM-Nor:去细胞化的正常小鼠肺组织基质，dECM-RIPF:去细胞化的RIPF小鼠肺组织基质，*P<0.05,**P<0.01vs.dECM-Nor group,#P<0.05,##P<0.01vs.dECM-RIPF group；
图4A是根据本发明实施例中博莱霉素(BLM)建立小鼠肺纤维化模型及给药方案示意图；
图4B是根据本发明实施例中小鼠肺组织HE染色和Masson染色示意图(20×)，Note:Normal:正常对照组，PF：BLM肺纤维化模型组，其它各组为相应给药组；
图5是根据本发明实施例中小鼠肺组织中肺纤维化指标的mRNA水平图，Note:NC:正常对照组，PF:BLM肺纤维化模型组，*P<0.05,**P<0.01vs.NC group,#P<0.05,##P<0.01vs.PF group；
图6是根据本发明实施例中小鼠肺指数与血象检测结果图，Note:NC:正常对照组，PF:BLM肺纤维化模型组，*P<0.05,**P<0.01vs.NC group,#P<0.05,##P<0.01vs.PF group；
图7是根据本发明实施例中Fibronectin包被细胞粘附实验结果图，Note:C8：整合素抑制剂，*P<0.05,**P<0.01vs.NS group；
图8A是根据本发明实施例中integrinαV+SSTN87-131的结合模式图，绿色是integrinαV的全长结构，橙色是多肽SSTN87-131；
图8B是根据本发明实施例中SSTN87-131的C端和calf-2区域能够形成稳定的β片层的稳定相互作用示意图；
图8C是根据本发明实施例中SSTN87-131和integrinαV结合模式分析统计图；
图9A是根据本发明实施例中改造肽对NIH3T3细胞增殖的影响图，Note:SC-1～SC-5：改造肽；
图9B是根据本发明实施例中改造肽对肌成纤维细胞(MFB)增殖的影响图，Note:SC-1～SC-5：改造肽；
图9C是根据本发明实施例中改造肽对去细胞肺组织基质三维培养的NIH3T3细胞增殖影响图，Note:dECM-Nor:去细胞化的正常小鼠肺组织基质，dECM-RIPF:去细胞化的放射性肺纤维化(RIPF)小鼠肺组织基质，*P<0.05,**P<0.01vs.dECM-Nor or dECM-RIPFgroup,#P<0.05,##P<0.01vs.SSTN87-131 group；
图9D是根据本发明实施例中改造肽对去细胞肺组织基质三维培养中Fibronectin、Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1的mRNA水平的影响图，Note:dECM-Nor:去细胞化的正常小鼠肺组织基质，dECM-RIPF:去细胞化的放射性肺纤维化(RIPF)小鼠肺组织基质，Ninte:Nintedanib，*P<0.05,**P<0.01vs.dECM-Nor group,#P<0.05,##P<0.01vs.dECM-RIPF group；
图10A是根据本发明实施例中SSTN87-131和SC-1,SC-4,SC-5给药后肺组织样本Masson染色图(放大倍数2倍,20倍)，Note:Normal:正常对照组，BLM：BLM肺纤维化组，其它各组为相应给药组；
图10B是根据本发明实施例中SSTN87-131和SC-1,SC-4,SC-5给药后对肺组织样本IOD值影响图，Note:Normal:正常对照组，NS：BLM肺纤维化组，其它各组为相应给药组，*P<0.05,**P<0.01vs.Normal group；#P<0.05,##P<0.01vs.NS group；
图10C是根据本发明实施例中SSTN87-131和SC-1,SC-4,SC-5给药后对肺组织样本羟脯氨酸值影响图，Note:Normal:正常对照组，NS：BLM肺纤维化组，其它各组为相应给药组，*P<0.05,**P<0.01vs.Normal group；#P<0.05,##P<0.01vs.NS group；&P<0.05,&&P<0.01vs.SSTN87-131 group；
图11是根据本发明实施例中SC-1、SC-4和SC-5对Fibronectin包被细胞黏附实验中细胞黏附数量影响图，**P<0.01vs.NS group；
图12A是根据本发明实施例中SSTN87-131的表征结果图；
图12B是根据本发明实施例中SC-1～SC-5的表征结果图。
具体实施方式
整合素(intergrin)是目前抗肺纤维化药物开发的重要靶点，SDC4作为integrin的主要辅助者，协同integrin参与细胞黏附、细胞-ECM间的相互作用。研究显示SDC4片段肽(Asn87-Met131，简称为SSTN87-131)可抑制integrin介导的细胞黏附。为证实SSTN87-131可能也同时是治疗肺纤维化的药物，本发明人建立了拟似体内纤维化环境的三维培养来检测SSTN87-131的体外抗纤维化作用，并进一步通过体内实验观察到SSTN87-131在肺纤维化中效用，以及与integrin相关的调节肺纤维化的机制，然后对其进行改造获得具有抗肺纤维化潜力的新型多肽SC-1～SC-5。基于此，本发明的一方面涉及分离的多肽或包含所述多肽的融合蛋白的用途，所述分离的多肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(iii)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
(iv)与(iii)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；
并且，所述用途选自以下任一种：
(1)用于抑制成纤维细胞的增殖；
(2)用于抑制纤维化相关蛋白表达；
(3)用于预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病；和
(4)用于制备预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的药物。
此外，本发明人在现有的三种SSTN肽的基础上进行结构改造，设计合成了氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的第一多肽(SC-1)、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的第二多肽(SC-2)、氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的第三多肽(SC-3)、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的第四多肽(SC-4)、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的第五多肽(SC-5)。因此，在本发明还涉及分离的多肽，所述多肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-5所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；
本发明中的改造肽如第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽亦可用于如SSTN87-131相同的用途。本发明中的改造肽，可以通过重组蛋白的方式制备，也可以通过蛋白质合成法制备，应理解，改造肽的制备方式是本领域技术人员熟知的技术。
本发明还涉及编码本发明中改造的多肽的多核苷酸序列、含有其的表达载体、转化的细胞以及包含本发明多肽的融合蛋白。本发明也涉及制备本发明中改造的多肽的方法。
序列同一性
本发明中，术语“序列同源性”、“序列同一性”和“同一性的百分比”是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。举例来说，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。
肽
本发明中，术语“肽”指的是包含以肽键结合的氨基酸序列的分子，与长度，翻译后修饰或功能无关。术语“多肽”指的是天然存在或通过重组以化学方式或其它方式生产或改变的蛋白质，其本质上可设想为与原生蛋白质相同方式在翻译后处理的蛋白质的三维结构。本文中，术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”在本文中是同义的。
多肽的合成
本发明中，上述多肽可通过本领域常规的方法进行制备，例如本领域技术人员已知的通过基于基因工程的蛋白质制备方法制备本发明中的多肽。
上述目的蛋白(多肽)的核酸全场序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
在本发明的一个实施方式中，通过对本发明中改造后的多肽序列进行(SEQ IDNO:1-5)进行分析，可获得编码其的目的基因序列信息。本发明的一些实施方式中，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明改造后的多肽(SEQ ID NO:1-5)。
多核苷酸
本发明中，术语“多核苷酸”表示从5'端到3'端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源分离，在体外合成，或者从天然和合成分子的组合制备。
载体
本发明还涉及一种表达载体，包含本发明第三方面所述的多核苷酸。
本发明中，术语“载体”是指多核苷酸的递送载体。在一些实施例中，在基因工程重组技术中，载体包括编码可操作插入的特定蛋白质的多核苷酸序列，以实现该蛋白质的表达。载体用于转化，转导或转染宿主细胞，并且可以在宿主细胞中表达由载体传递的遗传物质元件。本公开中的“载体”可以是任何合适的载体，包括染色体，非染色体和合成核酸载体(包括一系列适当的表达控制元件的核酸序列)。例如，载体可以是重组质粒载体，重组真核生物病毒载体，重组细菌噬菌体载体，重组酵母迷你染色体载体，重组细菌人工染色体载体或重组酵母质粒载体。
转化的细胞
本发明还涉及转化的细胞，所述转化的细胞包括本发明第四方面所述的表达载体。本发明中，术语“转化的细胞”与“宿主细胞”同义，术语“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞是真核宿主细胞或原核宿主细胞。其中，真核宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞，昆虫宿主细胞，植物宿主细胞，真菌宿主细胞，真核藻类宿主细胞，线虫宿主细胞，原生动物宿主细胞和鱼类宿主细胞。示例性地，本公开中的宿主细胞是真核宿主细胞，并且真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。其中，哺乳动物宿主细胞是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，COS细胞，Vero细胞，SP2/0细胞，NS/O髓细胞，人胎儿性肾细胞，未成熟仓鼠肾细胞，HeLa细胞，人B细胞，cv-1/EBNA细胞，L细胞，3T3细胞，HEPG2细胞，PerC6细胞。
融合蛋白
本发明还涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明第五方面所述的多肽。
本发明中，术语“融合蛋白”是指通过共价键连接两个或更多个蛋白质或其片段，并通过每个肽的主链含有的分子。融合蛋白优选通过编码这些蛋白质的多核苷酸分子的遗传表达产生。
药物组合物
优选将本发明的肽，模拟物和载体作为药物配制剂(例如组合物，制备物，药物)，其包含一种活性化合物，如上所述，以及本领域技术人员已知的一或多种其它可药用的成分，包括但不限于，可药用的载体，佐剂，赋形剂，缓冲液，防腐剂和稳定剂。所述配制剂还可包括其它活性药剂。本发明还涉及药物组合物，其包括多肽或本发明的第六方面所述的融合蛋白，以及药学上可接受的配制剂。
本发明中，术语“药学上可接受的”指化合物，成分，物质，组合物，剂型等，其在合理医学判断范围内，适合用于接触目的受试者(例如人)的组织而没有过多的毒性，剌激，过敏反应，或其它问题或并发症，并具有合理的益处/风险比。每种载体，佐剂，赋形剂等必须在与其它配制剂成分相容的意义上而言是“可接受的”。
适宜的载体，佐剂，赋形剂等可见于标准药物教科书，Remington'sPharmaceutical Sciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,2nd edition,1994。
配制剂可适宜地是可注射的配制剂，例如以液体、等张、无致热源、无菌溶液的形式，其中溶解有活性化合物。所述液体可还含有其它可药用的成分，诸如抗氧化剂，缓冲液，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，稠化剂，以及使得所述配制剂与血液或脑脊液等张的溶剂。用于所述配制剂的适宜的等张载体的实例包括氯化钠注射剂，林格氏(Ringer's)溶液，或乳酸盐化的林格氏注射液。通常，液体中活性化合物的浓度为约1ng/时，约10μg/ml，例如约10ng/ml-1μg/ml。所述配制剂可位于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓶和小药瓶，并可以储存于冷冻-干燥(冻干)条件中而仅需要在用前加入无菌液体载体例如水用于注射。即配即用注射溶液和悬液可从无菌粉末，颗粒和片剂制备。
治疗方法
本发明还涉及预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的方法，所述方法包步骤：
向受试者施用本发明第二方面所述的多肽、本发明的第六方面所述的融合蛋白或者本发明的第七方面所述的药物组合物。
受试者
本发明合物和/或治疗所给药的受试者是哺乳动物，优选试验动物诸如喝齿类动物(口兔，大鼠或小鼠)，狗，猫，猴或猿，或饲养动物诸如母牛，马，绵羊，猪或山羊。更优选，所述受试者是人。
改造的肽的用途
本发明还提供了上述SSTN肽的改造肽，或包含改造肽的融合蛋白的用途，改造肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-5所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；和
(iii)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
(iv)与(iii)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；
并且，所述用途选自以下任一种：
(1)用于抑制成纤维细胞的增殖；
(2)用于抑制纤维化相关蛋白表达；
(3)用于预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病；和
(4)用于制备预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的药物。
发明人发现，改造后的SSTN肽序列，在肽链缩短(≤40个aa)的同时还具有更强的抗纤维化作用，具体体现在包括相比SSTN87-131更为有效的抑制NIH3T3细胞增殖、活化的能力，以及缓解BLM小鼠肺纤维化的能力。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、SSTN87-131对成纤维细胞增殖的影响
本实施例采用CCK-8法测定SSTN87-131(氨基酸序列见图1A)对成纤维细胞NIH3T3增殖情况的影响。具体实验步骤如下：
收集状态良好的、处于对数生长期的NIH3T3细胞，以5000cells/mL接种于96孔培养板中，以无血清DOMA培养液进行培养，以避免血清中生长因子的干扰作用。每组同时设3个复孔。按检测试剂说明进行操作、OD值检测。分析结果。CCK-8法测定SSTN87-131对成纤维细胞增殖的影响见图1B。
结果表明，低浓度(1nM～10nM)SSTN87-131作用48h对NIH3T3成纤维细胞增殖无明显抑制作用，如图1B，随着药物浓度的增加，在10nM～1000nM浓度范围内细胞的存活率有所降低，但仍高于80％，显示SSTNs对未受刺激的NIH3T3细胞无明显毒性。确定SSTNs的给药浓度为100nM。
实施例2、SSTN87-131抑制MFB细胞的增殖
在纤维化病灶中，纤维细胞在多种诱发因子如TGF-β1、纤维化肺基质的作用下活化为肌成纤维细胞(MFB)，MFB表现为增殖能力、迁移能力及分泌基质蛋白的能力增加，是促进纤维化病灶形成的核心细胞。本实施例首先采用TGF-β1刺激NIH3T3获得MFB，MFB细胞的增殖加快，而100nM的SSTN87-131可抑制MFB细胞的增殖(图2A)，其作用略弱于100nMNintedanib。
随后采用去细胞的肺基质刺激NIH3T3，即将NIH3T3成纤维细胞接种于贴满去细胞的正常肺组织切片(dECM-Nor)和去细胞的RIPF肺组织切片(dECM-RIPF)的培养孔中，观察细胞增殖情况，如图2B所示，结果表明，阳性对照药物Nintedanib对RIPF纤维化基质及正常基质诱导的细胞增生均有显著的抑制作用，而SSTN87-131抑制效果与Nintedanib接近。
实施例3、SSTN87-131对纤维化相关蛋白表达的影响
(1)体外纤维化模型构建
本实施例采用实施例2的去细胞肺纤维化基质+纤维细胞的三维培养模拟肺纤维化的体内环境，RT-PCR测定增殖指标Ki67、纤维细胞活化指标ɑ-SMA、纤维化指标CollagenⅢ的mRNA水平，结果如图3A所示。
根据图3A，与去细胞的正常肺基质(dECM-Nor)相比较，肺纤维化基质(dECM-RIPF)可诱导纤维细胞表达更高的Ki67、ɑ-SMA及CollagenⅢ水平，而Nintedanib则可显著下调这三个因子的水平。该结果合并图3的结果证实了去细胞肺纤维化基质+纤维细胞三维培养为合适的体外纤维化模型，可用于初步评价、筛选药物的抗纤维化作用。
(2)SSTN87-131处理对纤维化相关蛋白表达的影响
在三维培养中加入100nM SSTN87-131处理，RT-PCR测定相关蛋白的mRNA水平，如图3A和图3B所示，可得SSTN87-131对dECM-RIPF刺激上调的Ki67、ɑ-SMA、Fibronectin、CollagenI、CollagenⅢ及TGF-β1的水平具有下调作用，并且与Nintedanib的下调作用相趋近。这表明SSTN87-131具有一定的抗纤维化潜能。
实施例4、SSTN87-131对肺纤维化病理改变的影响
采用博莱霉素(BLM)支气管滴注建立小鼠肺纤维化模型，给药21天后终止实验，过程如图4A所示，各组给药浓度为：尼达尼布:30mg/kg，腹腔注射，SSTN87-131:300μg/kg，皮下注射。
给药21天实验终止时收集小鼠肺组织，HE染色观察肺组织结构病理变化，Masson染色观察肺组织中胶原蛋白沉积现象，显微图像见图4B。结果显示正常组(Normal)组织形态正常，结构清晰，未见明显的病理现象和胶原蛋白沉积；模型组(PF)肺泡壁出现破裂，结缔组织显著增多，出现严重的细胞浸润，胶原蛋白沉积明显，表现明显的肺纤维化作用；
SSTN87-131组与PF组比较，其肺泡壁虽有增厚，但无明显破裂，结缔组织、浸润细胞和胶原蛋白沉积也有所减少，肺纤维化较PF组有所缓解，与抗肺纤维化药物Nintedanib的作用相近。
实施例5、SSTN87-131对肺纤维化相关指标的影响
BLM肺纤维化实验终止时取各组小鼠肺组织，RNA提取试剂盒提取各组mRNA后逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR以β-actin为内参对比各组肺组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA、IL-1β的mRNA表达水平，结果显示见图5。
模型组(PF)与正常组(Normal)相比，CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA、IL-1β的mRNA表达均有上调，证明本次实验的肺纤维化模型较为成功。SSTN87-131组与PF组相比，CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA、IL-1β的mRNA表达水平明显下调，证明了SSTN87-131在小鼠体内对于肺纤维化进程具有一定的抑制作用，并在CollagenⅠ、IL-1β中优于Nintedanib，提示SSTN87-131具有良好的抗肺纤维化作用。
实施例6、SSTN87-131对肺纤维化小鼠肺指数及血液学指标的影响
对小鼠进行血象与肺指数检测，结果显示(图6)，小鼠的肺指数(Lung index)、大血小板数目(P-LCC)、白细胞总数(WBC)以及白细胞中的中性粒细胞百分比(GRAN％)PF组相较于Normal组均有明显上调，SSTN87-131组与PF组相比，指数均有下调，其中，在白细胞总数中，SSTN87-131组数量明显低于Nintedanib组，进一步证明SSTNs可抑制肺纤维化的发展。
实施例7、SSTN87-131可抑制integrin活化
本实施例采用Fibronectin包被细胞粘附实验显示，SSTN87-131处理可显著减少粘附细胞数(图7)，作用与integrin抑制剂C8的作用相近。以上结果表明，SSTN87-131的抗肺纤维化作用与抑制integrin活化有关，显示SSTN87-131干扰了SDC4对integrin的协同作用。
实施例8、构建integrinαV+SSTN87-131的结合模式，根据结合模式进行肽链的改造设计
本实施例以integrinαV胞外区蛋白作为结合对象，通过AlphaFold2-Multimer模拟SSTN87-131与integrinαV的结合，获得两个主要的结合模式(图8A)，使用MMPB/GBSA的结合自由能算法显示SSTN87-131对αV的lower leg(Calf-1,Calf-2)区域有较高结合力(model 2,MMPBSA为-3.86kcal/mol)，高于与αV的头部(β-propeller)区域的结合力(model 1,MMPBSA为51.71kcal/mol)(表6)，表明SSTN87-131的结合部位可能是αV的lower leg区域。从结合模式看，SSTN87-131和integrinαV的calf-1/2的接触区域更多，且多肽的C端和calf-2区域能够形成稳定的β片层的稳定相互作用(图8B)。通过分析SSTN87-131和integrinαV的三种模拟结合模式，发现置信度在0.8以上的结合部位主要位于多肽链的中段和C端(图8C)。据此，发明人设计了多种短肽，其核心假设是增强短肽C端和integrinαV calf-2的β片层的氢键相互作用，同时部分减少短肽在N端和calf-1的结合。基于SSTN87-131，使用Protein MPNN算法和基于结构的模板搜索，发明人设计了肽链长度均≤40aa的多肽(SC-1～SC-5)，分别建模了这些多肽和integrinαV calf-1/2的结合模式，以及它们的结合能量。从integrinαV和多肽的结合能量出发，设计的多肽大多数有接近或者比SSTN87-131更低的结合自由能(表7)，表明设计的短肽可能会有更好的结合。
表6 SSTN87-131和integrinαV胞外区的两种主要的结合模式的结合能
Name MMGBSA(kcal/mol) MMGPSA(kcal/mol)
Mode 1 -33.19 51.71
Mode 2 -88.99 -3.86
表7改造多肽SC-1～SC-5的结合能量
实施例9、SSTN87-131改造肽SC-1、SC-2、SC-3、SC-4、SC-5在体外肺纤维化模型中呈现更强的抗肺纤维化作用
采用CCK-8法在成纤维细胞、MFB、去细胞基质三维培养中分别测定SC-1～SC-5对细胞增殖的影响(图9A-C)。图9A显示五条改造肽均呈现较SSTN87-131更为有效的抑制作用，故后续通过100nM相同浓度进行比较。于MFB(图9B)中，SC-1～SC-5与SSTN87-131抑制作用相差无几，在去细胞的正常及照射肺基质三维培养中(图9C)，SC-1、SC-3的作用与Nintedanib相近，提示SC-1、SC-3改造肽的抗肺纤维化作用较SSTN87-131有所加强。
随后在去细胞的正常及照射肺基质三维培养中(图9D)，测定纤维细胞活化指标ɑ-SMA、纤维化指标Fibronectin、Collagen I、CollagenⅢ及TGF-β1的mRNA水平，结果显示(图9D)，SC-1～SC-5可显著下调正常基质(dECM-Nor)、肺纤维化基质(dECM-RIPF)诱导的CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、Fibronectin、α-SMA的mRNA水平，证明SC-1～SC-5对肺纤维化具有一定的抑制作用。其中SC-1、SC-3作用明显强于其他改造肽，对各指标的下调作用与Nintedanib持平。
实施例10、SC-1、SC-4、SC-5的抗肺纤维化作用强于SSTN87-131
本实施例在BLM建立小鼠肺纤维化模型后第2天开始给药，选择SC-1、SC-4、SC-5、SSTN87-131 300μg/kg±(根据肽链分子量不同，略有差异)皮下注射，一天一次，观察它们对肺纤维化的作用。给药持续20天，于BLM造模后21天收集肺组织样本，Masson染色和IOD值分析显示，SC-1,SC-4,SC-5与SSTN87-131均具有显著抗肺纤维化作用，肺组织中胶原沉积减少(图10A,10B)，羟脯氨酸测定结果与此一致(图10C)，其中SC-5降低羟脯氨酸含量的作用显著强于SSTN87-131。
综上，改造肽SC-1、SC-4、SC-5相较于SSTN87-131，在肽链缩短的基础上具有部分增强的抑制肺纤维化的能力，提示改造肽具有潜在的抗肺纤维化开发前景。
实施例11、SC-1、SC-4、SC-5抑制integrin活化
本实施例观察SC-1、SC-4和SC-5对integrin活化的影响，Fibronectin包被细胞黏附实验显示(图11)，与SSTN87-131相似，SC-1、SC-4和SC-5可减少细胞黏附数量，表明改造多肽具有与SSTN87-131相似的抑制integrin活化的作用。
实施例12、SSTN87-131以及改造肽SC-1至SC-5的制备与表征
本实施例中，改造肽SC-1至SC-5的氨基酸序列信息见表1。
(1)多肽制备
1制备步骤
1.1树脂溶涨：将树脂放入反应管中，加DMF(15ml/g)，30min。
1.2脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
1.3检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KC N，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min。
1.4洗：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
1.5缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。
1.6洗：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
1.7重复二至六操作。
1.8洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次。
1.9裂解：配制裂解液(10/g)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS1％120min。
1.10吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
2切割及后处理
2.1切割液的配制：TFA/TIS/EDT/H2O(95/2/1/2)，有时候要加入苯酚、苯甲醚等。
2.2切割时间一般为2小时，根据具体情况可以延长或缩短。
2.3切割时的副反应，如氧化反应等。
2.4切割后用乙醚沉淀，除去切割下来的侧链保护基，切割液辅助试剂、盐等杂质，具体是加入10-15倍与切割液体积的冰乙醚，离心、倒掉上清乙醚，反复6次，最后挥干乙醚。
3纯化和鉴定
3.1溶解：先用水溶解，如果水溶性不好加入乙腈，不能太多，必要时可以加乙二胺，醋酸，等。
3.2纯化：一般用反相C8柱，流动相为含0.1％TFA水和乙腈，梯度为20％～80％。
3.3鉴定：分子量确证:ESI-MS,MALDI-TOF-MS。
(2)表征方法
按照下表4中的仪器参数进行液相色谱表征。
表4
按照下表5中仪器参数进行质谱表征。
表5
Probe: ESI Probe Bias: +4.5kv
Nebulizer Gas Flow: 1.5L/min Detector: 1.2kv
CDL: -20.0v T.Flow: 0.2ml/min
CDL Temp.: 250℃ B.Conc.: 50％H2O/50％ACN
Block Temp.: 400℃ Sample: SSTN87-131
SSTN87-131以及SC-1至SC-5的表征结果依次见图12A-12B。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.分离的多肽或包含所述多肽的融合蛋白的用途，其特征在于，所述分离的多肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-5所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；和
(iii)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
(iv)与(iii)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列；
并且，所述用途选自以下任一种：
(1)用于抑制成纤维细胞的增殖；
(2)用于抑制纤维化相关蛋白表达；
(3)用于预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病；和
(4)用于制备预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述纤维化相关蛋白选自Ki67、ɑ-SMA、Fibronectin、Collagen I、CollagenⅢ和TGF-β1中至少一种。
3.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自下述任一种所述的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1-5所示的氨基酸序列；
(ii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少97％同源性的氨基酸序列。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求2所述的多肽。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种转化的细胞，其特征在于，所述转化的细胞包括如权利要求5所述的表达载体。
7.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如权利要求3所述的多肽。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含IgG、Fc片段、FLAG、His、GST、SUMO、TrxA、DsbA或eGFP中至少一种。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求3所述的多肽或如权利要求7或8所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
10.一种预防和/或治疗与肺纤维化相关的疾病的方法，其特征在于，所述方法包步骤：
向受试者施用如权利要求3所述的多肽、如权利要求7或8所述的融合蛋白或者如权利要求9所述的药物组合物。
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