CN117003641A - 一种大麻二酚衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大麻二酚衍生物及其制备方法和应用，特别是神经系统疾病(例如癫痫、帕金森病)的预防和治疗中的应用。上述大麻二酚衍生物是从一系列合成衍生物中筛选得到的，动物试验结果显示，这些化合物可有效缩短实验动物癫痫发作持续时间，改善实验动物癫痫发作症状，还可以降低帕金森模型动物的平衡木评分，提高多巴胺水平和脑黑质中酪氨酸羟化酶细胞阳性率，可用于癫痫、帕金森病等多种疾病的药物开发和研究，具有较佳的应用价值。

Description

一种大麻二酚衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化学医药技术领域，具体涉及一种大麻二酚衍生物及其制备方法和应用，特别是神经系统疾病(例如癫痫、帕金森病)的预防和治疗中的应用。
背景技术
大麻素(cannabinoids)是大麻植物中特有的含有烷基和单萜基团结构的一类次生代谢产物。目前已从大麻植物中分离出百余种大麻素，主要包括δ-9-四氢大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)、大麻环萜酚(CBC)、大麻萜酚(CBG)、大麻酚(CBN)等，其中CBD的含量最高。研究显示，大麻素具有广泛的药理作用。
大麻二酚(CBD)，化学名称为2-[(1R,6R)-3-甲基-6-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-基]-5-戊基-1,3-苯二酚，CAS登记号：13956-29-1，化学结构如下所示：
研究发现CBD具有抗痉挛、抗焦虑、抗炎、抗氧化等药理作用，可用于药物开发。但是，高纯度的CBD是一种白色或淡黄色结晶，熔点为66-67℃，几乎不溶于水或者10％的氢氧化钠溶液，易溶于乙醇、甲醇、乙醚、苯、氯仿及石油醚等有机溶剂。CBD水溶性不佳，生物利用度低，大大限制了CBD在医药等领域的应用。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种大麻二酚衍生物及其制备方法和应用，特别是神经系统疾病(例如癫痫、帕金森病)的预防和治疗中的应用。
在本发明第一方面，提供一种化合物，其具有如下结构：
其中，
X1和X2独立地选自：单键、取代或未取代的亚烷基、被一个或多个-C(＝O)O-间隔的亚烷基、被一个或多个-OC(＝O)-间隔的亚烷基、被一个或多个-C(＝O)NH-间隔的亚烷基；
X3和X4独立地选自：
R1和R2独立地选自：OH、烷氧基、氨基酸残基；
R3选自：OH、烷氧基、氨基酸残基；
或者，通式(I)任选地被1个或者多个D原子取代。
具体地，X1和X2独立地选自：单键、C1-6直链或支链亚烷基，特别是C1-3直链烷基；在本发明的一个实施例中，X1为亚甲基；在本发明的一个实施例中，X2为亚甲基。
在本发明的一些实施例中，X3为
在本发明的一些实施例中，X4为
具体地，R1选自：OH、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)、氨基酸残基(即氨基酸的氨基上缺少一个氢原子所剩余的部分，例如 在本发明的一些实施例中，R1为OH、甲氧基或乙氧基。
具体地，R2选自：OH、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)、氨基酸残基(即氨基酸的氨基上缺少一个氢原子所剩余的部分，例如 在本发明的一些实施例中，R2为OH、甲氧基或乙氧基。
在本发明的一些实施例中，与/>相同，例如二者均为/>
在本发明的一些实施例中，R3为OH。
在本发明另一些实施例中，R3为烷氧基，例如C1-6烷氧基，如甲氧基或乙氧基。
在本发明另一些实施例中，R3为氨基酸残基，即氨基酸的氨基上缺少一个氢原子所剩余的部分，例如
在本发明的一些实施例中，上述化合物具有如下结构：
在本发明第二方面，提供第一方面所述化合物的立体异构体，其具有如下结构：
其中，X1、X2、X3、X4、R1、R2、R3具有本发明第一方面所述相应定义。
在本发明的一些实施例中，上述立体异构体具有如下结构：
在本发明第三方面，提供第一方面所述化合物或第二方面所述立体异构体的盐或共晶，特别是药学上可接受的盐或共晶。
具体地，该盐为碱加成盐，其可以由金属或胺与化合物形成，特别是碱金属盐、碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐，特别是钠盐。
在本发明第四方面，提供第一方面所述化合物的前药、溶剂化物、代谢产物。
在本发明第五方面，提供第一方面所述化合物的制备方法。
具体地，该制备方法可以包括如下反应步骤：
其中，R3′为烷氧基，例如C1-6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基。
具体地，该制备方法还可以包括分别或同时(此时与/>代表相同的物质)与/>反应得到/>的步骤；
其中，R1′、R2′为烷氧基，例如C1-6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基；
R4、R5为离去基团，例如-F、-Cl、-Br、-I、(-OTs)、/>(-OMs)、(-OBs)、/>(-OTf)。
在本发明的一个实施例中，与/>代表相同的物质，例如
具体地，该制备方法还可以包括如下反应步骤：
具体地，上述反应步骤中的碱为碱金属的氢氧化物，例如氢氧化钠。
具体地，上述反应步骤中的酸为无机酸，例如盐酸。
具体地，上述反应的温度为20-30℃，例如室温。
具体地，该制备方法还可以包括如下反应步骤：
具体地，上述反应步骤中的碱为碱金属的氢氧化物，例如氢氧化钠。
具体地，上述反应步骤中的酸为无机酸，例如盐酸。
具体地，上述反应的温度为80-95℃，例如90℃。
在本发明第六方面，提供一种药物组合物，其包含本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
具体地，药学上可接受的辅料可以选自：填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂等中的一种或多种。
具体地，该药物组合物可通过胃肠给药或非胃肠给药，如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径给药。
具体地，该药物组合物可以制备成以下剂型：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、凝胶剂、乳剂、混悬剂、控制释放制剂、气雾剂、粉雾剂、膜剂、注射剂、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂、鼻制剂、肺制剂等。
具体地，上述药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
具体地，该药物组合物还可以包含一种或多种其他针对相同或不同适应症的活性成分。
在本发明第七方面，提供本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物、第六方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
具体地，上述疾病选自：神经系统疾病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、疼痛、炎症、肝损伤中的一种或多种，特别是神经系统疾病，更特别是癫痫。
具体地，神经系统疾病包括，但不限于，癫痫、多发性硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默症、路易体痴呆、亨廷顿病、焦虑症、抑郁症等。
具体地，癫痫可以为急性癫痫、慢性癫痫，特别是慢性癫痫。
具体地，癌症包括，但不限于，乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、胃食管腺癌、食管癌、小肠癌、贲门癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、外阴癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病、神经胶质瘤等。
具体地，自身免疫性疾病包括，但不限于，系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、自身免疫性肝炎等。
在本发明第八方面，提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需求的受试者施用本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物，或第六方面所述的药物组合物的步骤。
具体地，上述疾病选自：神经系统疾病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、疼痛、炎症、肝损伤中的一种或多种，特别是神经系统疾病，更特别是癫痫。
具体地，神经系统疾病包括，但不限于，癫痫、多发性硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默症、路易体痴呆、亨廷顿病、焦虑症、抑郁症等。
具体地，癫痫可以为急性癫痫、慢性癫痫，特别是慢性癫痫。
具体地，癌症包括，但不限于，乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、胃食管腺癌、食管癌、小肠癌、贲门癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、外阴癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病、神经胶质瘤等。
具体地，自身免疫性疾病包括，但不限于，系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、自身免疫性肝炎等。
具体地，受试者可以为哺乳动物，例如，人类、猩猩、猴、犬、兔、鼠等，特别是人类。
本发明的发明人在大麻二酚的基础上进行结构修饰改造，在一系列合成衍生物中筛选得到本发明的化合物，动物试验结果显示，这些化合物可有效缩短实验动物癫痫发作持续时间，改善实验动物癫痫发作症状，还可以降低帕金森模型动物的平衡木评分，提高多巴胺水平和脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率，可用于癫痫、帕金森病等多种疾病的药物开发和研究，具有较佳的应用价值。
附图说明
图1所示为治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的癫痫发作持续时间检测结果。
图2所示为治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的行为发作指标Ono’s分级。
图3所示为治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的癫痫发作潜伏期检测结果。
图4所示为大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的PAGE胶图。
图5所示为大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2变化。
图6所示为大鼠脑组织匀浆液中γ-氨基丁酸含量检测结果。
图7所示为大鼠脑组织匀浆液中甘氨酸含量检测结果。
图8所示为大鼠脑组织匀浆液中谷氨酸含量检测结果。
图9所示为大鼠脑组织匀浆液中天冬氨酸含量检测结果。
图10所示为脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞的显微镜图像。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义，例如：
术语“烷基”指的是烷烃分子失去一个氢原子而成的烃基，其可以为直链或支链且其以单键与分子其它部分连接。在本文中所使用的烷基通常含有1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)个碳原子，优选含有1至6个碳原子(即，C1-C6烷基)。所述烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基等。
术语“亚烷基”指的是烷烃分子失去两个氢原子而成的烃基(二价烷基)，其可以是直链或支链且其以单键与分子其它部分连接。在本文中典型的亚烷基1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)个碳原子，优选含有1至6个碳原子，亚烷基的实例如亚甲基(-CH2-)、亚乙基、亚丙基、亚丁基等。
术语“烷氧基”指的是羟基中的氢被烷基取代后形成的取代基。本文中所使用的烷氧基通常含有1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)个碳原子，优选含有1至6个碳原子(即，C1-C6烷氧基)。所述烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。
术语“共晶”是指本发明的化合物与其他生理上可接受的酸、碱、非离子化合物，通过氢键、范德华力、π-π堆积作用、卤键等非共价键作用下结合而成的晶体。
术语“立体异构体”包括对映体、非对映体和几何异构体的形式存在。
术语“溶剂化物”是指本发明的化合物与一种或多种溶剂分子的物理结合。该物理结合包括各种程度的离子和共价键合，包括氢键合。在某些情况下，溶剂化物可被分离出来，例如当一个或多个溶剂分子掺入到结晶固体的晶格中。溶剂化物包括溶液相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括乙醇化物、甲醇化物等。
术语“代谢产物”是指本发明的化合物在体内生理条件下使其发生化学降解所得产物。
术语“前药”指适于对患者给药的无过分毒性、刺激性和变态反应等的并且对其应用目的有效的式Ⅰ化合物形式，包括缩醛、酯和两性离子形式。前药在体内转化，如通过在血液中水解，得到母体化合物。
在本发明中，“D”指氘；“被氘取代”指的是用相应数量的氘原子取代一个或多个氢原子。
术语“受试者”是指接受本文所述的方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。具体地，前述动物包括哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴、猩猩或人类，特别是人类。
术语“治疗”是指在疾病发作之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病的一种或多种临床症状。
术语“预防”指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病难于发作或发展。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：化合物E1的制备
1、合成路线
2、合成方法
(1)化合物3的制备
在一500ml单口瓶中依次加入原料2,4-二羟基-6-戊烷基苯甲酸乙酯(10g，39.6mmol)、(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇(6.62g，43.56mmol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中，再加入14.4g无水MgSO4，氮气保护，降温控制外温-20℃，缓慢的滴加三氟化硼乙醚溶液(1.06ml，3.96mmol)至此反应液中，滴加完毕，保持控温-20℃反应1.5～2小时。反应液LC-MS监测，反应完毕，过滤掉无水MgSO4，二氯甲烷淋洗，母液二氯甲烷相用饱和NaCl水溶液洗(400ml*2)，分出有机相干燥，过滤，浓缩旋干得16g黄色油状产品。MS(ESI):387[M+H]+
(2)化合物4的制备
在一100ml单口瓶中依次加入原料3(1.6g，4mmol)、溴乙酸乙酯(1.73g，10mmol)、碳酸铯(3.26g，10mmol)和溶剂40ml丙酮，混合均匀，氮气保护，室温搅拌过夜反应。反应液LC-MS监测，反应完毕，加入乙酸乙酯和水各200ml，分液，分出有机相，用饱和NaCl水溶液洗(200ml)，分出有机相干燥，过滤，浓缩旋干得2.3g淡黄色油状产品。MS(ESI):559[M+H]+。
(3)化合物E1的制备
在一100ml单口瓶中原料4(2.3g，4.1mmol)溶于20ml四氢呋喃中，室温下，加入氢氧化钠水溶液(2g/20ml)，室温搅拌反应2小时。反应液LC-MS监测，反应完毕，加水稀释至70ml，用乙醚洗水相(50ml*2)，水相加稀盐酸调pH～3，乙酸乙酯萃取(50ml*2)，合并乙酸乙酯相，干燥、浓缩旋干得2g淡黄色油状产品5。
成盐：将上述产品5加30ml乙醇溶解，加入0.8g NaHCO3的饱和水溶液，加热搅拌半小时，充分反应成钠盐，浓缩蒸干，乙醇带除残留的水两次，蒸干，油泵抽干；得到的固体加入无水乙醇30ml，超声，通过硅藻土过滤掉不溶物(过量的碳酸氢钠)，母液浓缩旋干得1.8g淡黄色泡沫状固体产品(纯度>93％)；取1.2g用乙醇和乙酸乙酯重结晶得到550mg纯度>95％白色固体产品。MS(ESI):503[M+H]+；1H-NMR(MeOD，400MHz):δH 6.56(1H，s)，5.28(1H，d)，4.60(1H，d)，4.49(1H，d)，,4.17-4.37(6H，m)，3.22(1H，m)，2.45-2.60(2H，m)，2.26-2.30(1H，m)，1.50-2.00(12H，m)，1.20-1.40(7H，m)，0.90(3H，t)。
经检测，化合物E1在水中溶解度达到1g/100ml水。
实施例2：化合物E2的制备
1、合成路线
2、合成方法
在一100ml单口瓶中原料化合物5(0.6g，1.2mmol)溶于10ml四氢呋喃中，室温下，加入氢氧化钠水溶液(20％，10ml)，油浴加热至90℃回流搅拌反应过夜。反应液LC-MS监测，反应完毕，加水50ml，用二氯甲烷洗水相(50ml*2)，水相在冰水浴下加稀盐酸调pH～2，乙酸乙酯萃取(50ml*2)，合并乙酸乙酯相，干燥、浓缩旋干得350mg黄色油状产品6。
成盐：将上述产品6加20ml乙醇溶解，加入0.4g NaHCO3的饱和水溶液，加热搅拌半小时，充分反应成钠盐，浓缩蒸干，乙醇带除残留的水两次，蒸干，油泵抽干；得到的固体加入无水乙醇20ml，超声充分溶解，通过硅藻土过滤掉不溶物(过量的碳酸氢钠)，母液浓缩旋干得320mg棕黄色固体产品(纯度>95％)。MS(ESI):475[M+H]+；1H-NMR(MeOD，400MHz):δH6.61(1H，s)，5.24(1H，d)，4.63(1H，d)，4.53(1H，d)，,4.26(2H，s)，4.38(2H，s)，3.33(1H，m)，2.57-2.70(2H，m)，2.25-2.31(1H，m)，1.50-2.00(12H，m)，1.20-1.40(4H，m)，0.90(3H，t)。
经检测，化合物E2在水中溶解度达到3g/100ml水。
实施例3：抗癫痫活性研究
1、实验动物和部分试剂
Wistar大鼠，SPF级别，体重240-260g，周龄6-8，雌性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养环境温度保持在22±1℃，湿度保持在65-70％，12小时明/暗光照周期，可自由饮水。
PTZ，购自Sigma公司；丙戊酸钠，购自Sigma公司；无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。
2、实验分组
将实验动物随机分为4组：模型组、阳性药物组、化合物1组、化合物2组，每组8只。
3、实验方法
(1)腹腔给药造模
所有大鼠适应性饲养1周后，开始造模。用生理盐水新鲜配置1.75％的PTZ溶液，腹腔注射配制好的PTZ溶液，注射剂量为35mg/kg。隔日注射1次PTZ，注射PTZ后30min内观察大鼠行为学变化，记录发作分级。
实验过程中连续注射11次PTZ后，记录发作分级，所有大鼠已经连续5次出现2级或2级以上的记录的大鼠，大鼠连续注射11次PZT后所有大鼠模型成功。
(2)灌胃给药治疗
模型成功后，随机分组。开始治疗，所有Wistar大鼠称重，计算灌胃剂量。模型组灌胃等体积生理盐水；阳性药物组(丙戊酸钠灌胃100mg/kg)；化合物1组(实施例1制备的化合物E1灌胃，100mg/kg)；化合物2组(实施例2制备的化合物E2灌胃，100mg/kg)。
(3)Ono’s分级
在给药前、给药后第7天、14天，灌胃给药1h后腹腔注射配制好的PTZ溶液，注射剂量为35mg/kg。注射PTZ后30min内观察大鼠行为学变化。
记录给药前后的行为发作指标按照Ono’s分级，记录发作潜伏期，发作分级和发作持续时间。
表1 Ono’s分级
Ono’s分级 发作表现
0 无惊厥
1 点头或头部抽搐
2 全身肌肉阵挛
3 头部抽搐加前肢阵挛
4 阵挛惊厥加后肢站立
5 跌倒
6 全身强直-阵挛性惊厥
实验结束后，采集实验动物的脑、海马，-80℃冻存。
4、WB检测大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达：
4.1试剂、抗体和仪器
实验所用部分试剂、抗体和仪器分别如表2-4所示。
表2试剂
表3抗体
表4仪器
4.2样品准备
将海马组织剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃12000g离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
4.3蛋白定量
(1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂；
表5试剂
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8
蛋白标准液(μl) 0 2 4 6 8 12 16 20
去离子水(μl) 20 18 16 14 12 8 4 0
蛋白浓度(μg/μl) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5
(2)根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；
(3)各孔加入160μl BCA工作液；
(4)把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度；以吸光值为横坐标，蛋白浓度(μg/μl)为纵坐标，绘出标准曲线；
(5)在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS(稀释10倍)，加入160μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度；
(6)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(μg/μl)，乘以样品稀释倍数(10)即为样品实际浓度(单位：μg/μl)。
4.4上样及电泳
(1)上样
每孔上样量约为25μg蛋白，可以根据实验要求加大上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。
(2)电泳
一般浓缩胶80V 20分钟，分离胶120V 60分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。
转膜
转膜分为湿转和半干转，本实验选用半干转。
半干式转膜中，三明治的排列为：/滤纸/胶/膜/滤纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48mM Tris,39mM glycine,0.04％SDS,20％甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分钟(NC膜在电转液中浸泡10-20分钟)，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形。
膜上蛋白的检测
为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，丽春红染色工作液：2％的丽春红贮备液1：10稀释，即加9倍的ddH2O。
染色方法：将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，(膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色)PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。
4.5膜的封闭及抗体孵育
(1)封闭：5％脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭1小时或4℃过夜。
(2)一抗：根据说明书Bcl-2 1:500 Bax 1:5000 GAPDH 1:30000稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2小时或4℃孵育过夜。
(3)二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。
4.6显色
ECL化学发光检测：配制ECL发光液，根据用量，取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液，用纸小心吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸。将其放入成像系统中进行扫描。
5、试剂盒法检测大鼠大脑组织中γ-氨基丁酸和谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的含量
5.1实验材料
实验所用试剂盒、仪器如下表所示。
表6试剂盒信息
表7主要仪器及耗材
5.2实验方法
实验操作及方法参考试剂盒说明书。
6、实验结果
(1)治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的癫痫发作持续时间如下表及图1所示。
表8治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的癫痫发作持续时间
结果显示：治疗前后PTZ点燃癫痫发作持续时间，通过对比数据发现治疗前的各组的持续时间没有变化，持续发作时间在350s左右；随着进入治疗阶段，各组出现明显差异，阳性药物组在治疗7天和14天出现了发作持续时间出现下降，且具有统计学意义。其他化合物组也在治疗7天出现和治疗前明显发作持续时间下降，具有统计学意义；其中化合物E1在持续时间上出现明显下降趋势；化合物E2在后续治疗第14天的发作持续时间和治疗第7天对比均出现发作持续时间下降具有统计学意义；化合物E1在治疗第14天的发作持续时间和治疗第7天对比出现发作持续时间没有出现变化。
(2)治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的行为发作指标Ono’s分级如下表及图2所示。
表9治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的行为发作指标Ono’s分级
结果显示：治疗前后的行为发作指标按照Ono’s分级记录显示，在造模完成后和治疗期间，注射PTZ进行癫痫点燃模型，发作Ono’s分级都是在等级3-4之间，各组之间没有明显差异。在治疗14天后，也未出现明显的组间差异。
实验过程中Ono’s分级记录的是大鼠癫痫发作的最高分级，在实验过程中癫痫发作是进程性过程，最高发作等级在癫痫发作期间都会有持续期。建议后续记录每个发作分级的持续时间。
实验过程中发现出现Ono’s分级在5-6的分级状态下，不采取措施，大多都会出现死亡，且如果没有出现死亡的大鼠接下来也会出现PTZ点燃情况下死亡现象。
(3)治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的癫痫发作潜伏期如下表及图3所示。
表10治疗前后PTZ点燃癫痫大鼠的癫痫发作潜伏期
结果显示：治疗前后PTZ点燃癫痫发作潜伏期，在治疗前和治疗期间统计PTZ点燃癫痫发作潜伏期的均值80s-100s，发作潜伏期时间数据表明PTZ点燃癫痫的时间在60s-120s之间。且各组之间没有明显相关性，而且随着时间变化同组之间也没有看到发作潜伏期时间明显变化趋势。
(4)WB检测大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2变化的结果如图4和5所示。
实验结果表明模型组大鼠海马组织中促进凋亡相关Bax蛋白出现高表达，而阳性药物组和模型组对比促进凋亡相关Bax蛋白出现了低表达，且具有统计学意义。而且化合物组对比模型组也出现了Bax蛋白表达的下调。
相反检测各组大鼠海马组织中抗凋亡的Bcl-2蛋白，实验结果表明模型组的Bcl-2蛋白和其他各组相比出现明显低表达，阳性药物组中Bcl-2蛋白和其他各组相比均出现高表达，而化合物组中化合物E1、化合物E2和模型组对比都出现明显的Bcl-2蛋白的高表达，且具有统计学意义。
(5)大鼠脑组织匀浆液中γ-氨基丁酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸含量测定结果如下表及图6-9所示。
表11大鼠脑组织匀浆液中γ-氨基丁酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸含量测定结果
通过ELISA检测试剂盒检测脑组织匀浆中，兴奋性氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸，抑制性神经递质：γ-氨基丁酸和甘氨酸含量。
ELISA实验结果表现，模型组脑组织匀浆中γ-氨基丁酸和甘氨酸含量低，谷氨酸和天冬氨酸含量高。
阳性药物和化合物组对比模型组，兴奋性氨基酸均出现表达量降低，各组均具有统计学意义；抑制性神经递质的γ-氨基丁酸和甘氨酸表达量对比模型组出现含量升高，且具有统计学意义。
7、实验总结
PTZ点燃大鼠癫痫模型大鼠治疗过程中，阳性药物和各化合物对大鼠治疗效果在PTZ点燃大鼠癫痫的持续时间上具有显著性差异；在潜伏期和癫痫模型程度上具有作用趋势，但没有显著性差异。
与模型组相比，化合物组治疗第7、14天的癫痫发作持续时间均明显减少，均具有显著性差异。其中治疗第7天，癫痫发作持续时间依次为化合物E1>化合物E2；治疗第14天，癫痫发作持续时间依次为化合物E2>化合物E1。
通过对比治疗第14天的大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2，和脑组织匀浆中，兴奋性氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸，抑制性神经递质：γ-氨基丁酸和甘氨酸含量，化合物E2具有较佳的效果。
实施例4：对帕金森的治疗研究
1、实验动物和部分试剂
C57/BL6小鼠，SPF级别，体重18-20g，周龄6-8，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养环境温度保持在22±1℃，湿度保持在65-70％，12小时明/暗光照周期，可自由饮水。
MPTP，购自Sigma公司；金刚烷胺，购自Sigma公司；无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。
2、实验分组
将实验动物随机分为4组：空白组、模型组、阳性药物组、化合物组，每组8只。
3、实验方法
(1)购买6-8周龄SPF级的C57小鼠，适应性饲养一周，开始造模。
(2)每天腹腔注射MPTP(25mg/kg)每天1次，连续7天。空白组不做处理。
(3)造模完成后，开始给药。阳性药物组灌胃金刚烷胺(40mg/kg)，化合物组(100mg/kg)灌胃化合物E2(实施例2制备)确定好的药物剂量，每天灌胃1次，连续14天。
(4)先进行行为学检测：平衡木检测评分
一根长为80cm、宽为2.5cm的木条，水平固定在离台面10cm高度的地方，然后让动物在木条上行走。
能跳上平衡木条，可以自由行走但不跌倒：0分；能跳上平衡木条，动物在上面行走会跌下，但跌下的机会小于50％：1分；能跳上平衡木条，动物在上面行走会跌下，但跌下的机会大于50％：2分；动物在正常侧身体的帮助下可以跳上平衡木条；但是瘫痪侧的后肢不能够帮助身体向前移动：3分；动物无法在平衡木条上行走，但是可以坐在木条上：4分；将动物放在木条上，动物很快会掉落下来：5分。
(5)评分结束后，开始取材
迅速处死小鼠后，取小鼠大脑，分离小鼠大脑皮质(CP)。暴露小鼠大脑纹状体后，取纹状体进行称量后，按照比例添加PBS后，进行研磨匀浆。然后分离上清检测脑纹状体中多巴胺含量。
4、试剂盒法检测检测脑纹状体中多巴胺含量
4.1试剂盒和部分仪器如下表所示。
表12试剂盒信息
表13主要仪器及耗材
4.2蛋白定量
(1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂；
表14试剂
(2)根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；
(3)各孔加入160μl BCA工作液；
(4)把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度(μg/μl)为纵坐标，绘出标准曲线；
(5)在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS(稀释10倍)，加入160μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度；
(6)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(μg/μl)，乘以样品稀释倍数(10)即为样品实际浓度(单位：μg/μl)；
(7)小鼠多巴胺检测实验操作及方法参考试剂盒说明书。
5、免疫组化测定脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞
5.1实验材料
表15主要试剂
表16主要仪器及耗材
溶液配制
(1)PBS溶液
600ml的ddH2O中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液pH至7.4，定容至1L，滤器过滤后，高压灭菌，室温保存。
(2)0.1mol/L枸橼酸酸钠缓冲溶液
0.1mol/L柠檬酸3.8ml、0.1mol/L柠檬酸钠16.2ml。
柠檬酸C6H8O7·H2O：分子量210.14；0.1mol/L溶液为21.01克/升。
柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O：分子量294.12；0.1mol/L溶液为29.41克/毫升。
5.2实验方法
5.2.1样本包埋与固定
(1)取材和固定
切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2～0.3cm，大小为1.5cm×1.5cm×0.3cm为宜。取好的组织块置于10％福尔马林中固定48小时。
(2)洗涤和脱水
将固定后的组织用流水冲洗，去除残留的固定液和杂质。不同浓度的乙醇逐级脱水，50％、70％、85％、95％直至纯酒精(无水乙醇)，每级2小时。脱水必须在有盖的瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70％乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
(3)透明
将组织块置入纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中2小时，再进入纯二甲苯两小时，再一次纯二甲苯两小时；材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。
(4)浸蜡
浸蜡须在恒温箱中进行。先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍各3小时左右。
(5)包埋
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是：先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
(6)切片
切片前将蜡块在-20℃冰箱中至少放置30min，以增加硬度。将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。调整切片机上的切片厚度为4-7μm，然后切片。
5.2.2免疫组化染色
(1)烤片和脱蜡
将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片30min；置于二甲苯I中浸泡15min，再置于二甲苯II中浸泡15min。
(2)水化
将脱蜡后的切片经100％酒精、95％酒精、85％酒精、75％酒精分别浸泡5min，自来水冲洗10min。
(3)抗原修复
采用0.01M柠檬酸钠缓冲溶液中高压修复15min，自然冷却后，0.02M PBS洗3min×3次。
(4)阻断
将玻片置于3％H2O2中，湿盒孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。0.02MPBS冲洗3min×3次。
(5)一抗孵育
滴加一抗(1:2000稀释)，湿盒孵育，室温下放置1h(或者4℃孵育过夜)。0.02M PBS冲洗3min×3次。
(6)二抗孵育
滴加HRP标记广谱二抗，湿盒孵育，室温下放置20min-30min。0.02M PBS冲洗3min×3次。
(7)显色
DAB染色，观察到切片有颜色改变时，立即用自来水洗去染色液。
(8)苏木素染色
苏木素复染3min，1％盐酸酒精分化，显微镜下观察，控制染色程度。自来水冲洗10min，放入65℃烘箱中烘干水分。
(9)透明和封片
将玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱中15min。
5.2.3图像采集和分析
通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位，计算阳性面积。
6、实验结果
(1)帕金森模型行为学平衡木评分结果如下表所示。
表17帕金森模型行为学平衡木评分结果
分组 造模后 治疗后
空白组 0 0
模型组 4.63±0.52*** 4.50±0.53
阳性药物组(给药金刚烷胺) 4.75±0.46*** 2.13±0.83###
化合物组(给药化合物E2) 4.75±0.46*** 3.25±0.71###
小鼠通过腹腔注射MPTP进行帕金森模型制备，通过平衡木评分进行行为学评价，MPTP腹腔注射7天后，进行平衡木评分，除空白组不进行造模，平衡木评分为0，其他各组小鼠的评分均在5-6分，各组对比空白组P≤0.05，具有统计学意义，证明模型成功。
后续通过阳性药物和化合物组进行治疗后，模型组的平衡木评分4-5分，阳性药物平衡木评分在2-3分之间。其他化合物治疗组平衡木评分是3-4分。阳性药物组和化合物组对比模型组出现明显下降趋势，P≤0.05，具有统计学意义。
治疗后各组评分为空白组＜阳性药物组＜化合物组＜模型组。
(2)帕金森模型治疗后纹状体多巴胺含量如下表所示。
表18帕金森模型治疗后纹状体多巴胺含量
多巴胺作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能，通过检测治疗小鼠帕金森模型纹状体中多巴胺含量。判断药物治疗帕金森模型效果。
通过各组和空白组多巴胺含量进行对比判断模型中多巴胺下降程度，其中除阳性药物组外，其他各组的多巴胺含量均出现明显下降，P≤0.05，具有统计学意义。
再通过化合物组对比模型组多巴胺含量，多巴胺含量对比模型组都出现增高，P≤0.01，具有统计学意义，表明各药物组具有升高脑内多巴胺含量的作用。
纹状体多巴胺含量是空白组＞阳性药物组＞化合物组＞模型组。
(3)免疫组化测定脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞的实验结果如下表及图10所示。
表19免疫组化测定脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞的实验结果
分组 TH细胞阳性率(％)
空白组 34.27±5.08
模型组 12.74±1.71***
阳性药物组(给药金刚烷胺) 20.82±5.77##
化合物组(给药化合物E2) 15.09±1.50#
酪氨酸羟化酶(TH)是一种单加氧酶，它是催化生物体自身合成左旋多巴胺(L-Dopamine，DA)系列反应的第一步反应的限速酶，仅在胞浆表达。神经元中TH含量丰富，因中脑缺乏多巴胺-β-羟化酶，故中脑TH免疫反应阳性神经元为DA神经元，可作为脑内多巴胺神经元的标志。机体利用左旋酪氨酸，在酪氨酸羟化酶的催化下生存左旋多巴，左旋多巴在芳香族脱羧酶的催化下脱去羧基最后生成左旋多巴胺。由于酪氨酸羟化酶在多巴胺合成中的重要地位，其功能的缺失或表达不足直接影响多巴胺的合成与分泌。多巴胺是一种重要的神经递质，多巴胺能神经元对多巴胺不能合成或分泌不足会导致帕金森氏病。
本实验结果显示，通过腹腔注射MPTP造成的小鼠帕金森模型中，小鼠的脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率出现降低，P≤0.05，具有统计学意义。阳性药物组对比模型组的脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率，出现明显升高现象，表明造模成功。
对比化合物对小鼠帕金森模型治疗后，通过化合物组对比模型组的脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率，都出现升高现象。其中化合物组的脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率对比模型组，P≤0.01，且具有统计学意义。
通过对比各组的治疗后的脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率，空白组＞阳性药物组＞化合物组＞模型组。
7、实验总结
本次实验通过腹腔注射MPTP(25mg/kg)每天1次，连续7天，造模成小鼠帕金森模型，通过平衡木评分对小鼠帕金森模型进行筛选。
后续通过阳性药物和化合物组对模型小鼠进行灌胃治疗，连续灌胃治疗14天后，通过分析治疗后各组的平衡木评分，ELISA检测纹状体中多巴胺含量，免疫组化检测脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率等检测方法，鉴定化合物和空白组，模型组差别，再进行统计学分析，对化合物组有效性进行分析。
通过治疗后平衡木评分鉴定，阳性药物组和化合物组对比模型组出现明显下降趋势，P≤0.05，具有统计学意义。
再通过其他化合物组对比模型组多巴胺含量，各组的多巴胺含量对比模型组都出现增高，P≤0.01，具有统计学意义。
对比化合物组和阳性药物组对小鼠帕金森模型治疗后，阳性药物组和化合物组对比模型组的阳性率，其中化合物组的脑黑质(SubN)中酪氨酸羟化酶(TH)细胞阳性率对比模型组，P≤0.01，且具有统计学意义。
通过整体分析化合物组对比模型组，均具有一定的治疗效果，对比各检测指标，化合物E2具有较佳的治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (10)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐、共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物，所述化合物具有如下结构：
其中，
X1和X2独立地选自：单键、取代或未取代的亚烷基、被一个或多个-C(＝O)O-间隔的亚烷基、被一个或多个-OC(＝O)-间隔的亚烷基、被一个或多个-C(＝O)NH-间隔的亚烷基；
X3和X4独立地选自：
R1和R2独立地选自：OH、烷氧基、氨基酸残基；
R3选自：OH、烷氧基、氨基酸残基；
或者，通式(I)任选地被1个或者多个D原子取代。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，X1和X2独立地选自：单键、C1-6直链或支链亚烷基；
优选地，X1为亚甲基；
优选地，X2为亚甲基。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1和R2独立地选自：OH、C1-6烷氧基；
优选地，R1为OH、甲氧基或乙氧基；
优选地，R2为OH、甲氧基或乙氧基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，与/>相同，优选为
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R3为OH或C1-6烷氧基。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有如下结构：
7.如权利要求1-6任一项所述的化合物，其特征在于，所述立体异构体具有如下结构：
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
9.权利要求1-7任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、共晶、立体异构体、前药、溶剂化物、代谢产物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中，所述疾病选自：神经系统疾病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、疼痛、炎症、肝损伤中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病选自：癫痫、多发性硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默症、路易体痴呆、亨廷顿病、焦虑症、抑郁症；
所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、胃食管腺癌、食管癌、小肠癌、贲门癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、外阴癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病、神经胶质瘤；
所述自身免疫性疾病选自：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、自身免疫性肝炎。
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