CN116987495A - 一种用于生物检测的蛋白质膜大分子探针的构建和应用 - Google Patents
一种用于生物检测的蛋白质膜大分子探针的构建和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于生物检测的蛋白质膜大分子探针的构建和应用,属于生物检测及信息加密领域。本发明将荧光团与具有生物正交性能的配体单元相连接,合成了一系列能够与生物大分子特异结合的新型荧光分子。并进一步通过优化生物正交反应将小分子与HaloTAG蛋白共价结合,制备出具有良好响应性能的蛋白质膜大分子探针。该蛋白质膜探针采用融合蛋白代替ELISA中的抗体单元,可实现在固相界面上对待测物进行快速、便捷的检测,同时能够回收利用实际样品,解决了液相检测体系中难以分离探针和待测物的难题。与小分子探针相比,该类蛋白质膜探针表现出对待测物更高的灵敏度和信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生物检测的蛋白质膜大分子探针的构建和应用,属于生物检测及信息加密领域。
背景技术
目前已报道的生物标志物的检测手段多种多样,如传统的比色法、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)法,但比色法灵敏度差,HPLC和MS受限于其昂贵的仪器设备和复杂的操作技术。荧光探针具有选择性好、灵敏度高等优点,可同时提供方便、快捷和廉价的分析检测手段,因此在环境化学、分析化学和生物医学等领域备受关注。但是大多数荧光探针均由小分子组成,难以实现样品与小分子探针在检测后的快速分离与回收再利用。
酶联免疫吸附法(ELISA)是一类在固相表面检测的技术,可作为商品化的试剂盒实现快速的样品检测和分离,已被环境、生物、医药等多部门采用。但是ELISA通常需要使用抗体来进行特异性识别检测物及固相吸附,抗体制备复杂,价格昂贵,其成本限制了ELISA的普遍应用。
融合蛋白的工业化生产为解决上述抗体成本问题带来了曙光,同时近年来生物正交反应的快速发展(获2022年诺贝尔化学奖)可用来修饰融合蛋白结构使其具有靶向性,因此,将具有生物正交功能的融合蛋白与有机小分子相结合可很好地解决上述小分子探针难以分离和ELISA成本高的不足。
鉴于此,设计合成新的低成本蛋白质膜大分子探针实现生物过程在线监测以及信号存储与加密,成为本发明需要解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明设计并合成一类功能化的香豆素类分子,并通过生物正交反应与蛋白实现共价结合,能够实现对生物硫醇、ROS的快速便捷检测以及光学信息储存及加密。
本发明提供一种具有硫醇、ROS、或者光控/pH双信号荧光响应的小分子探针,其结构为式Ⅰ所示:
式Ⅰ中,
R1和R2分别独立选自:氢(H)、取代或未取代的C1~C3的烷基,或R1与R2的共同形成取代或未取代的的5~6元杂环;烷基上的取代基为取代或未取代的苯基,苯基上的取代基选自:羟基(-OH)、R5、R6分别独立选自H、C1~C3烷基、C1~C3酰基中一种;所述5~6元杂环中的杂原子选自O和/或N;5~6元杂环上的取代基选自:-OH、C1~C3烷基、C1~C3酰基中一种;
R3选自:羟基(-OH)、
n为1-4;m为1-6;
R4为可与蛋白进行正交反应的配基单元,包括:卤素(F、Cl、Br)、叠氮基、炔基、苯甲基鸟嘌呤基、烷基胞嘧啶基、甲氧苄啶基。
上述结构式中涉及的曲线标记处为连接位点。
本发明另一个目的在于,提供一种基于上述小分子探针构建生物大分子探针的方法,包括:
将上述小分子探针和HaloTag蛋白分散在磷酸盐缓冲体系中,0-40℃下反应1-5h。
在本发明的一种实施方式中,小分子探针与HaloTag蛋白的用量比为(10-100)μmol/(0.25-5)g。
进一步地,当R3为时,小分子探针与HaloTag蛋白的用量比优选为100μmol/(1-50)g。次优选100μmol/(5-50)g。;最优选100μmol/10g。
当R3为或者/>时,小分子探针与HaloTag蛋白的用量比优选为100μmol/(0.25-5)g。最优选100μmol/(1-3)g。
当R3为或者/>时,小分子探针与HaloTag蛋白的用量比优选为100μmol/(1-5)g。最优选100μmol/5g。
本发明基于上述方法制备提供一种生物大分子探针,其结构如式Ⅳ所示:
其中,R1、R2、R3、R4基团的定义如上所述,为HaloTag蛋白。
本发明还提供一种蛋白质膜探针,是将上述生物大分子探针稀释成一定浓度的探针溶液,然后加入到酶标孔中,静置,然后除上清液,在酶标孔的底部获得蛋白质膜探针。
在本发明的一种实施方式中,所述探针溶液的浓度为0.1-4.2μg/μL;进一步可选0.7-4.2μg/μL。
此外,本发明还有一个目的在于,提供一种快速便捷、样品可回收的检测手段,利用蛋白质膜大分子探针检测生物硫醇、ROS等生物标记物;同样利用蛋白质膜大分子探针提供一种通过光控/pH双信号调控的信息储存和加密的方法。
具体地:
本发明提供一种快速检测硫醇的方法,包括:配置一系列浓度的硫醇的磷酸盐缓冲溶液作为标准溶液,然后加入上述生物大分子探针,测定其在发射波长为440nm处的荧光强度值,将标准溶液的硫醇浓度与相应的荧光强度值进行关联,得到定量检测模型。
在本发明的一种实施方式中,快速检测硫醇的定量检测模型为y=20543.5x-12943.7,R2=0.9944;其中y为荧光强度值,x为相应硫醇浓度,线性范围为0-1000μM。
本发明提供一种快速检测过氧化氢的方法,包括:配置一系列浓度的过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液作为标准溶液,然后加入上述生物大分子探针,测定其在发射波长为440nm处的荧光强度值,将标准溶液的过氧化氢浓度与相应的荧光强度值进行关联,得到定量检测模型。
在本发明的一种实施方式中,快速检测硫醇的定量检测模型为y=72698.9x-102690.3,R2=0.9987;其中y为荧光强度值,x为相应过氧化氢浓度,线性范围为0-1000μM。
本发明提供一种上述小分子探针、生物大分子探针或者蛋白质膜探针在信息储存和加密方面的应用。
有益效果:
本发明首先将荧光探针与具有生物正交性能的配体单元相连接,合成了一系列能够与生物大分子进行特异性共价结合的新型荧光分子。进一步通过优化生物正交反应中荧光分子和蛋白质的浓度、反应时间、温度等,纯化得到对检测物表现出最佳荧光性能的蛋白质大分子探针。最后将大分子探针通过物理吸附的方式制备出具有良好响应性能的蛋白质膜探针。
该发明最终制得的蛋白质膜探针采用便宜易得的融合蛋白代替传统酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)中昂贵的抗体单元,实现了快速、便捷地在固相界面上对待测物进行检测,同时能够快速回收实际样品(如贵重的生物样品)进行循环利用,解决了液相检测体系中难以分离探针和待测物的难题。与小分子探针相比,该类蛋白质膜探针在相同条件下均表现出更高的灵敏度和更短的响应时间。因此本发明提供了一种制备快速便捷、响应性能优越的蛋白质膜大分子探针的方法。
附图说明
图1为式I-1所示化合物(详见实施例5)在DMSO/PBS(v/v=1:99)溶液中随GSH含量的荧光发射光谱图(2.5μM);
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图2为式I-2所示化合物(详见实施例6)在DMSO/PBS(v/v=1:99)溶液中随H2O2含量的荧光发射光谱图(2.5μM);
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图3为式I-3所示化合物(详见实施例7)在DMSO/PBS(v/v=1:99)溶液中随光照时间的荧光发射光谱图(2.5μM);
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图4为由式I-1和HaloTag蛋白发生反应制得的式IV-1探针(详见实施例8)在蛋白胶中通过考马斯蓝染色和荧光照射的结果图。
图5为式IV-1所示探针(详见实施例8)在磷酸盐缓冲液中随GSH含量的荧光发射光谱图;
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图6为由式I-2和HaloTag蛋白发生反应制得的式IV-2探针(详见实施例9)在蛋白胶中通过考马斯蓝染色和荧光照射的结果图。
图7为式IV-2所示探针(详见实施例9)在磷酸盐缓冲液中随H2O2含量的荧光发射光谱图;
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图8为由式I-3和HaloTag蛋白发生反应制得的式IV-3探针(详见实施例10)在蛋白胶中通过考马斯蓝染色和荧光照射的结果图。
图9为式IV-3所示探针(详见实施例10)在磷酸盐缓冲液中随光照时间的荧光发射光谱图;
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图10为式IV-1形成的蛋白质膜探针V-1(详见实施例11)在同一条件下与I-1相比对GSH随时间的荧光响应图;
其中,横坐标为不同时间点,纵坐标为不同时间荧光强度与初始荧光的比值。
图11为式IV-2形成的蛋白质膜探针V-2(详见实施例12)在同一条件下与I-2相比对H2O2随时间的荧光响应图;
其中,横坐标为不同时间点,纵坐标为不同时间荧光强度与初始荧光的比值。
图12为式IV-3形成的蛋白质膜探针V-3(详见实施例13)随光照和pH变化下的荧光变化图;
其中,横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度(a.u.)。
图13为本发明的整体设计思路图。
图14为实施例11-13的制备流程示意图。
图15为检测硫醇的线性模型。
图16为检测过氧化氢的线性模型。
具体实施方式
在本发明一个优选的技术方案中:
R1为H,甲基,氨基取代的乙基;R2为H,甲基,氨基取代的甲基;或者R1与R2的组合(R1+R2)为取代或未取代的6元杂环;其中,所述取代或未取代的6元杂环的杂原子为O和/或N;取代基选自:-OH,C1~C3烷基中一种,或C1~C3酰基中一种;进一步的,C1~C3烷基具体可选甲基,C1~C3酰基具体可选乙酰基;
R3为羟基或
R4为氯原子。
本发明所提供的,一种制备式Ⅰ所示化合物的方法,所述方法的主要具体步骤是:在碱性(如4-二甲氨基吡啶等)条件下,由式Ⅵ所示化合物与相应的蛋白配体于四氢呋喃或乙腈等有机溶剂(反应介质)中,在加入脱水剂二环己基碳二亚胺的条件下,冰浴反应20分钟至2小时,制得目标物(式Ⅰ所示化合物)。
本发明所提供的,一种制备式Ⅳ所示生物大分子探针的方法,所述方法的主要具体步骤是:在4℃或常温(温度条件)下,由式Ⅰ所示化合物与相应的蛋白于水溶剂(反应介质)中反应2小时至过夜,纯化制得生物大分子探针(式Ⅳ所示化合物)。
本发明涉及的化合物Ⅵ-1,Ⅵ-3,Ⅵ-4的制备过程:在碱性(如碳酸铯或三乙胺)条件下,将市售原料(安耐吉化学,CAS:1656-44-6;69642-00-8;138500-85-3)与香豆素母体(参考文献:J.Med.Chem.,2014,57,4289)于二氯甲烷或乙腈溶剂(反应介质)中,常温搅拌12h,柱层析得到目标物(式Ⅵ-1,Ⅵ-3,Ⅵ-4所示化合物)。
本发明涉及的化合物Ⅵ-2的制备过程:在甲苯回流条件下,将米氏酸(安耐吉化学,CAS:2033-24-1)与18-氯-3,6,9,12-四氧十八烷-1-醇(参考文献:JACS,2018,140,11926)反应12h,柱层析得到目标物(式Ⅵ-2所示化合物)。
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述,其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此,所举之例并不限制本发明的保护范围:
实施例1
式Ⅵ-1所示化合物(简记为化合物Ⅵ-1,以下化合物用相同的简记法)的合成:
在50mL圆底烧瓶中,分别加入香豆素母体(Coumarin:200mg,0.65mmol)、2,4-二硝基磺酰氯(344mg,1.30mmol)、三乙胺(202mg,2.0mmol)、二氯甲烷(20mL),氩气保护下,常温反应12h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=50:1(v/v)),得到浅红色固体136mg(化合物Ⅵ-1),产率为39%。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=8.78(s,1H),8.23(d,J=8.0Hz,1H),7.83(d,J=8.0Hz,1H),6.93(d,J=8.0Hz,1H),6.85(d,J=4.0Hz,1H),6.28(s,1H),6.09(s,1H),3.83(d,J=8.0Hz,2H),3.88(s,2H),3.52(d,J=8.0Hz,2H),2.39(s,3H),0.68(s,3H).HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd for C22H21N2O12S:537.0815[M+H]+;found:537.0821。
实施例2
化合物Ⅵ-2的合成:
在100mL圆底烧瓶中,加入18-氯-3,6,9,12-四氧十八烷-1-醇(500mg,1.6mmol),甲苯(20mL),米氏酸(276mg,1.9mmol),置换氩气,回流12h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=10:1(v/v)),得到深红色油状物249mg(化合物Ⅵ-2),产率为39%。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=4.26(d,J=8.0Hz,2H),3.31-3.75(m,21H),1.76(d,J=8.0Hz,2H),1.56(d,J=8.0Hz,2H),1.39(m,4H).HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd for C17H32ClO8:399.1785[M+H]+;found:399.1796。
实施例3
化合物Ⅵ-3的合成:
在50mL圆底烧瓶中,分别加入香豆素母体(Coumarin:200mg,0.65mmol)、苯硼酸频哪醇酯(384mg,1.30mmol)、碳酸铯(650mg,2.0mmol)、乙腈(20mL),氩气保护下,常温反应12h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=100:1(v/v)),得到白色固体164mg(化合物Ⅵ-3),产率为48%。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=7.86(d,J=8.0Hz,2H),7.50-7.43(m,2H),6.89(d,J=8.0Hz,1H),6.29(s,1H),6.16(d,J=4.0Hz,1H),5.26(s,2H),4.14-4.05(m,2H),3.98(s,2H),3.69(d,J=8.0Hz,2H),2.37(d,J=4.0Hz,3H),1.36(s,12H),0.79(s,3H).HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd for C29H36BO8:523.2503[M+H]+;found:523.2510。
实施例4
化合物Ⅵ-4的合成:
在50mL圆底烧瓶中,分别加入香豆素母体(Coumarin:200mg,0.65mmol)、1-(1-溴甲基)-2-硝基苯(299mg,1.30mmol)、碳酸铯(650mg,2.0mmol)、二氯甲烷(20mL),氩气保护下,常温反应12h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=50:1(v/v)),得到白色固体124mg(化合物Ⅵ-4),产率为49%。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.75(d,J=8.0Hz,1H),7.51(t,J=8.0Hz,1H),7.35(t,J=8.0Hz,1H),7.30(d,J=8.0Hz,1H),6.53(d,J=4.0Hz,1H),6.27(s,1H),6.17(q,J=8.0Hz,1H),6.06(s,1H),4.06-4.11(m,4H),3.70(s,2H),2.23(s,3H),1.76(d,J=8.0Hz,2H),0.78(s,3H).HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd forC24H26NO8:456.1658[M+H]+;found:456.1669。
实施例5式I-1所示化合物(简记为化合物I-1,以下化合物用相同的简记法)的合成:
在25mL圆底烧瓶中,分别加入化合物Ⅵ-1(100mg,0.19mmol)、4-二甲氨基吡啶(23mg,0.19mmol)、化合物Ⅵ-2(90mg,0.21mmol)、四氢呋喃(10mL),氩气保护下,冰浴反应30min,加入二环己基碳二亚胺(59mg,0.29mmol),继续室温反应2h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=50:1(v/v)),得到白色固体65mg(化合物I-1),产率为36%。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=8.91(d,J=4.0Hz,1H),8.31(dd,J=8.0Hz,1H),7.70(d,J=8.0Hz,1H),6.96(dd,J=8.0Hz,2H),6.36(d,J=4.0Hz,1H),6.26(s,1H),4.29-4.22(m,2H),4.17(s,2H),3.96-3.86(m,2H),3.74-3.45(m,27H),3.33(s,2H),2.47(d,J=4.0Hz,3H),1.78(dd,J=8.0Hz,5H),1.67-1.51(m,4H),0.76(s,3H).HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd for C39H50ClN2O19S:917.2417[M+H]+;found:917.2410。
实施例6
化合物I-2的合成:
在25mL圆底烧瓶中,分别加入化合物Ⅵ-3(100mg,0.19mmol)、4-二甲氨基吡啶(23mg,0.19mmol)、化合物Ⅵ-2(90mg,0.21mmol)、四氢呋喃(10mL),氩气保护下,冰浴反应30min,加入二环己基碳二亚胺(59mg,0.29mmol),继续室温反应2h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=100:1(v/v)),得到白色固体70mg(化合物I-2),产率为40%。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=7.80(d,J=8.0Hz,2H),7.45(t,J=8.0Hz,3H),6.86(d,J=8.0Hz,1H),6.30(s,1H),6.13(d,J=4.0Hz,1H),5.29(s,2H),4.58(s,2H),4.35-4.24(m,3H),4.02(d,J=8.0Hz,2H),3.70(dd,J=4.0Hz,3H),3.68-3.61(m,16H),3.58(dd,J=4.0Hz,3H),3.53(t,J=8.0Hz,4H),3.48-3.43(m,6H),2.35(d,J=4.0Hz,3H),1.77(dd,J=8.0Hz,4H),1.64-1.55(m,4H),1.35(d,J=4.0Hz,14H),0.79(s,3H).
HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd for C46H65BClO15:903.4108[M+H]+;found:903.4100。
实施例7
化合物I-3的合成:
在25mL圆底烧瓶中,分别加入化合物Ⅵ-4(60mg,0.13mmol)、4-二甲氨基吡啶(16mg,0.13mmol)、化合物Ⅵ-2(62mg,0.15mmol)、四氢呋喃(10mL),氩气保护下,冰浴反应30min,加入二环己基碳二亚胺(40mg,0.20mmol),继续室温反应2h。旋蒸溶剂,柱层析(DCM:MeOH=50:1(v/v)),得到白色固体42mg(化合物I-3),产率为30%。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ=8.00(dd,J=8.0Hz,1H),7.88(dd,J=8.0Hz,1H),7.58(t,J=8.0Hz,1H),7.38(dd,J=8.0Hz,2H),6.60(d,J=8.0Hz,1H),6.36(s,1H),6.25(d,J=8.0Hz,1H),6.11(d,J=4.0Hz,1H),4.84(d,J=8.0Hz,1H),4.72(d,J=8.0Hz,1H),4.34-4.26(m,4H),4.16-4.07(m,2H),3.80(d,J=8.0Hz,2H),3.75(s,2H),3.71(dt,J=9.3,4.0Hz,4H),3.65(dd,J=8.0Hz,18H),3.58(dd,J=8.0Hz,4H),3.52(dd,J=8.0Hz,3H),3.49-3.42(m,7H),2.30(s,3H),1.83(d,J=8.0Hz,3H),1.81-1.73(m,4H),1.64-1.55(m,4H),0.87(s,3H).
HRMS(TOF-ESI+,m/z):calcd for C41H55ClNO15:836.3260[M+H]+;found:836.3264。
对比例1
小分子探针构建方法对比:
方法1:
实验过程:在25ml反应管中,加入化合物1(5mg,0.016mmol),化合物2(3.94mg,0.033mmol),对二甲氨基吡啶(0.4mg,0.003mmol),四氢呋喃4mL,以及EDC(3mg,0.02mmol)。置换氩气,室温条件下反应40h。反应结束后,将反应液浓缩旋干,用饱和食盐水洗涤,二氯甲烷萃取,有机相TLC点板,没有新的产物点出现。
结果说明:该酯化反应理论上可行,但实际反应后二氯甲烷有机相中并没有新点出现,分析原因有可能是生成的产物水溶性较强,因此难以提纯得到产物,进而无法有效构建获得小分子探针。
方法2:
实验过程:取25ml反应管,加入化合物1(61.28mg,0.1mmol),化合物2(67.5mg,0.3mmol),对甲苯磺酸(1.6mg,0.005mmol),甲苯4mL,置换氩气,回流4h。反应结束后,将反应液浓缩旋干,TLC点板,没有新的产物点出现。
结果说明:分析可能该方法中酰胺键的吸电子特性影响其羟基与化合物1中的醛进行羟醛缩合反应,进而影响醛基的缩醛保护,无法有效构建获得小分子探针。
测试例1:
测定实施例5-7所得小分子探针的荧光相应情况:
1.1、化合物I-1对生物硫醇的荧光响应情况
测试过程:首先配制化合物I-1浓度为50mM的DMSO母液,在200μL DMSO/PBS(v/v=1:99)的溶液体系中配制化合物I-1的工作浓度为2.5μM,然后加入不同浓度的GSH(0,125,250,500,1000μM),静置10min,在荧光分光光度计上分别测试各个样品的荧光强度,其中激发波长为315nm,发射波长为325-800nm。
结果分析说明:如图1所示,化合物I-1对GSH呈现出GSH浓度依赖型荧光响应,在10min的孵育时间内其荧光增强了约9倍。
1.2、化合物I-2对ROS的荧光响应情况
测试过程:首先配制化合物I-2浓度为50mM的DMSO母液,在200μL DMSO/PBS(v/v=1:99)的溶液体系中配制化合物I-2的工作浓度为2.5μM,然后加入不同浓度的H2O2(0,31.25,62.5,125,250μM),静置60min,在荧光分光光度计上分别测试各个样品的荧光强度,其中激发波长为315nm,发射波长为325-800nm。
结果分析说明:如图2所示,化合物I-2对H2O2呈现出比率型荧光响应,其在440nm的荧光强度随H2O2含量的增加增强了约6倍。
1.3、化合物I-3对光激活调控下的荧光响应情况
测试过程:首先配制化合物I-3浓度为50mM的DMSO母液,在200μL DMSO/PBS(v/v=1:99)的溶液体系中配制化合物I-3的工作浓度为2.5μM,然后在荧光分光光度计上分别测试不同光照时间下(0,0.5,1,2,3min)其荧光强度,其中激发波长为315nm,发射波长为325-800nm。
结果分析说明:如图3所示,化合物I-3随着光照时间的增长,其在440nm的荧光强度梯度增强了约5倍。
实施例8
式IV-1所示大分子生物探针(简记为探针IV-1,以下化合物用相同的简记法)的构建:
在100μL磷酸盐缓冲体系中,分别加入纯化的HaloTag蛋白(终浓度为3μg/μL),式I-1化合物(终浓度为100μM),常温下反应3h。反应结束后,将反应液加入到超滤管离心除去未与蛋白结合的式I-1化合物,同时用等体积的磷酸盐缓冲液洗涤3遍,最终离心得到纯化的大分子探针IV-1。进一步通过SDS-PAGE验证探针IV-1的纯度和对生物硫醇的荧光响应情况。
实施例9
探针IV-2的构建:
在100μL磷酸盐缓冲体系中,分别加入纯化的HaloTag蛋白(3μg/μL),式I-2化合物(100μM),4℃下反应2h。反应结束后,将反应液加入到超滤管离心除去未与蛋白结合的式I-2化合物,同时用等体积的磷酸盐缓冲液洗涤3遍,最终离心得到纯化的大分子探针IV-2。进一步通过SDS-PAGE验证探针IV-2的纯度和对ROS的荧光响应情况。
实施例10
探针IV-3的构建:
在100μL磷酸盐缓冲体系中,分别加入纯化的HaloTag蛋白(1μg/μL),式I-3化合物(100μM),4℃下反应2h。反应结束后,将反应液加入到超滤管离心除去未与蛋白结合的式I-3化合物,同时用等体积的磷酸盐缓冲液洗涤3遍,最终离心得到纯化的大分子探针IV-3。进一步通过SDS-PAGE验证探针IV-3的纯度和对光激活/pH调控下的荧光响应情况。
测试例2:
测定大分子探针的荧光响应情况:
2.1、通过SDS-PAGE验证探针IV-1的纯度和对生物硫醇的荧光响应情况
测试过程:在1mL磷酸盐缓冲溶液中,分别加入纯化的HaloTag蛋白(5μg/μL),式I-1化合物(100μM),常温下反应3h。反应结束后,取40μL的反应液,加入10μL 5x SDS上样缓冲液,煮沸10min,冷却后进行SDS-PAGE验证IV-1的纯度。进一步将剩余的反应液加入到超滤管离心除去未与蛋白结合的式I-1化合物,收集离心后得到的100μL蛋白溶液进一步用1mL磷酸盐缓冲液洗涤3遍,最终离心得到100μL纯化的大分子探针IV-1。将上述100μL纯化的IV-1用磷酸盐缓冲溶液稀释至1mL,得到3.9μg/μL的探针IV-1溶液。取200μL探针IV-1溶液,然后加入不同浓度的GSH(0,125,250,500,1000μM),静置10min,在荧光分光光度计上分别测试各个样品的荧光强度,其中激发波长为315nm,发射波长为325-800nm。
结果分析说明:如图4所示,反应3h后,蛋白胶显示小分子化合物I-1与HaloTag蛋白能够良好地结合,其中考马斯蓝染色的部分代表IV-1的纯度和大小,荧光胶部分代表IV-1在蛋白胶上的荧光显色。图5为纯化的IV-1在440nm处的荧光随着GSH的浓度增加而增强,呈现出良好的响应性能。利用硫醇浓度与相应的荧光强度值进行关联构建,其线性模型如图15所示。硫醇定量检测模型为y=20543.5x-12943.7,R2=0.9944;其中y为荧光强度值,x为相应硫醇浓度,线性范围为0-1000μM。
2.2、通过SDS-PAGE验证探针IV-2的纯度和对ROS的荧光响应情况
测试过程:在1mL磷酸盐缓冲溶液中,分别加入纯化的HaloTag蛋白(0.5μg/μL),式I-2化合物(100μM),常温下反应3h。反应结束后,取40μL的反应液,加入10μL 5x SDS上样缓冲液,煮沸10min,冷却后进行SDS-PAGE验证IV-2的纯度。进一步将剩余的反应液加入到超滤管离心除去未与蛋白结合的式I-2化合物,收集离心后得到的100μL蛋白溶液进一步用1mL磷酸盐缓冲液洗涤3遍,最终离心得到100μL纯化的大分子探针IV-2。将上述100μL纯化的IV-2用磷酸盐缓冲溶液稀释至1mL,得到0.4μg/μL的探针IV-2溶液。取200μL探针IV-2溶液,然后加入不同浓度的H2O2(0,125,250,500,1000μM),静置60min,在荧光分光光度计上分别测试各个样品的荧光强度,其中激发波长为315nm,发射波长为325-800nm。
结果分析说明:如图6所示,反应3h后,蛋白胶显示小分子化合物I-2与HaloTag蛋白能够良好地结合,其中考马斯蓝染色的部分代表IV-2的纯度和大小,荧光胶部分代表IV-2在蛋白胶上的荧光显色。图7为纯化的IV-2在373nm处的荧光随着H2O2的浓度增加而减弱,440nm处的荧光随着H2O2的浓度增加而增强,呈现出良好的比率型响应性能。利用H2O2浓度与相应的荧光强度值进行关联构建,其线性模型如图16所示。H2O2定量检测模型为y=72698.9x-102690.3,R2=0.9987;其中y为荧光强度值,x为相应过氧化氢浓度,线性范围为0-1000μM。
2.3、通过SDS-PAGE验证探针IV-3的纯度和对光激活调控下的荧光响应情况
测试过程:在1mL磷酸盐缓冲溶液中,分别加入纯化的HaloTag蛋白(5μg/μL),式I-3化合物(100μM),常温下反应3h。反应结束后,取40μL的反应液,加入10μL 5x SDS上样缓冲液,煮沸10min,冷却后进行SDS-PAGE验证IV-3的纯度。进一步将剩余的反应液加入到超滤管离心除去未与蛋白结合的式I-3化合物,收集离心后得到的100μL蛋白溶液进一步用1mL磷酸盐缓冲液洗涤3遍,最终离心得到100μL纯化的大分子探针IV-3。将上述100μL纯化的IV-3用磷酸盐缓冲溶液稀释至1mL,得到4.1μg/μL的探针IV-3溶液。取200μL探针IV-3,然后在荧光分光光度计上分别测试不同光照时间下(0-10min)各个样品的荧光强度,其中激发波长为315nm,发射波长为325-800nm。
结果分析说明:如图8所示,反应3h后,蛋白胶显示小分子化合物I-3与HaloTag蛋白能够良好地结合,其中考马斯蓝染色的部分代表IV-3的纯度和大小,荧光胶部分代表IV-3在蛋白胶上的荧光显色。图9为纯化的IV-4在440nm处的荧光随着光照时间的增加而增强,呈现出良好的光激活响应性能。
对比例2
大分子的合成对比:
参照实施例8,调整小分子与HaloTag蛋白的用量比例,其他不变。并将测试所得探针对不同浓度的GSH(0,125,250,500,1000μM)的荧光响应性能。结果如下所示。
小分子与HaloTag蛋白的用量比 | 对GSH检测性能对比 |
I-1(100μM):HaloTag(5μg/μL) | 440nm处荧光最大增强2.7倍 |
I-1(100μM):HaloTag(3μg/μL) | 440nm荧光最大增强2.4倍 |
I-1(100μM):HaloTag(1μg/μL) | 440nm荧光最大增强1.6倍 |
I-1(50μM):HaloTag(5μg/μL) | 440nm荧光最大增强3.1倍 |
I-1(10μM):HaloTag(5μg/μL) | 440nm荧光最大增强2.7倍 |
参照实施例9,调整小分子与HaloTag蛋白的用量比例,其他不变。并将测试所得探针对不同浓度的H2O2(0,125,250,500,1000μM)的荧光响应性能。结果如下所示。
小分子与HaloTag蛋白的用量比 | 对H2O2检测性能对比 |
I-2(100μM):HaloTag(0.25μg/μL) | 440nm处荧光最大增强3.2倍 |
I-2(100μM):HaloTag(0.5μg/μL) | 440nm荧光最大增强5.2倍 |
I-2(100μM):HaloTag(1μg/μL) | 440nm荧光最大增强5.8倍 |
I-2(100μM):HaloTag(3μg/μL) | 440nm荧光最大增强5.1倍 |
I-2(100μM):HaloTag(5μg/μL) | 440nm荧光最大增强3.9倍 |
参照实施例10,调整小分子与HaloTag蛋白的用量比例,其他不变。并将测试所得探针在不同光照时间下(0-10min)的荧光响应性能。结果如下所示。
小分子与HaloTag蛋白的用量比 | 对光控检测性能对比 |
I-3(100μM):HaloTag(1μg/μL) | 440nm处荧光最大增强3.8倍 |
I-3(100μM):HaloTag(3μg/μL) | 440nm荧光最大增强1.6倍 |
I-3(100μM):HaloTag(5μg/μL) | 440nm荧光最大增强11.3倍 |
实施例11
蛋白质膜探针V-1的构建:
将100μL最优反应条件(I-1为50μM+HaloTag为5μg/μL)下制备纯化得到的式IV-1探针溶液(3.2μg/μL)加入到酶标孔中,静置过夜。第二天去除上清液,即可在酶标孔的底部获得蛋白质膜探针V-1用于对GSH的检测。
实施例12
蛋白质膜探针V-2的构建:
将100μL最优反应条件(I-2为100μM+HaloTag为1μg/μL)下制备纯化得到的式IV-2探针溶液(0.7μg/μL)加入到酶标孔中,静置过夜。第二天去除上清液,即可在酶标孔的底部获得蛋白质膜探针V-2用于对H2O2的检测。
实施例13
蛋白质膜探针V-3的构建:
将100μL最优反应条件(I-3为100μM+HaloTag为5μg/μL)下制备纯化得到的式IV-3探针溶液(4.2μg/μL)加入到酶标孔中,静置过夜。第二天去除上清液,即可在酶标孔的底部获得蛋白质膜探针V-3用于光控荧光/pH响应。
测试例3:
测定实施例11-13所得蛋白质膜大分子探针的荧光响应情况:
3.1、测试蛋白质膜探针V-1对生物硫醇的荧光响应情况
测试过程:在新鲜制得蛋白质膜探针V-1的酶标孔中,加入200μL含浓度为31.25μMGSH的磷酸盐缓冲溶液,在酶标仪上分别测试随时间增长V-1对GSH的荧光响应情况,其中激发波长为315nm,发射波长为440nm。
结果分析说明:如图10所示,随着反应时间的增加探针V-1对低浓度的GSH(31.25μM)表现出良好的荧光响应,其在30min处荧光增强了2.8倍。
3.2、测试蛋白质膜探针V-2对ROS的荧光响应情况
测试过程:在新鲜制得蛋白质膜探针V-2的酶标孔中,加入200μL含浓度为250μMH2O2的磷酸盐缓冲溶液,在酶标仪上分别测试随时间增长V-2对H2O2的荧光响应情况,其中激发波长为315nm,发射波长为440nm。
结果分析说明:如图11所示,随着反应时间的增加探针V-2对H2O2表现出良好的荧光响应,其在30min处荧光增强了3.3倍。
3.3、测试蛋白质膜探针V-3对光控/pH的荧光响应情况
测试过程:在新鲜制得蛋白质膜探针V-3的酶标孔中,加入200μL磷酸盐缓冲溶液,在酶标仪上分别测试光照3min前后,及光照3min后调节体系pH为4左右时的荧光变化情况,其中激发波长为315nm,发射波长为440nm。
结果分析说明:如图12所示,254nm波长下光照3min后探针V-3荧光增加,当进一步调节pH至4左右时其荧光下降至其初始值附近,从而通过光控/pH调节V-3的荧光信号可实现潜在的信息储存与加密的性能。
对比例3
对比测试例1.1和测试例3.1(或者1.2Vs 3.2),小分子荧光探针与蛋白质膜探针相比,其荧光性能对比。
如图10所示,在同一条件下,通过对比测试例1.1中小分子探针I-1和测试例3.1中蛋白质膜探针V-1对GSH的响应,结果表明V-1对同一浓度的GSH的荧光响应是I-1的2倍,表现出高的信噪比。
同理,如图11所示,在同一条件下,通过对比测试例1.2中小分子探针I-2和测试例3.2中蛋白质膜探针V-2对H2O2的响应,结果表明V-2对同一浓度的H2O2的荧光响应是I-2的2.5倍,表现出高的信噪比。
以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围,所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进,亦落入本发明权力要求书所界定的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有硫醇、ROS、或者光控/pH双信号荧光响应的小分子探针,其特征在于,其结构为式Ⅰ所示:
式Ⅰ中,
R1和R2分别独立选自:H、取代或未取代的C1~C3的烷基,或R1与R2共同形成取代或未取代的的5~6元杂环;烷基上的取代基为取代或未取代的苯基,苯基上的取代基选自:羟基、R5、R6分别独立选自H、C1~C3烷基、C1~C3酰基中一种;所述5~6元杂环中的杂原子选自O和/或N;5~6元杂环上的取代基选自:羟基、C1~C3烷基、C1~C3酰基中一种;
R3选自:羟基、
n为1-4;m为1-6;
R4为卤素、叠氮基、炔基、苯甲基鸟嘌呤基、烷基胞嘧啶基、甲氧苄啶基。
2.一种基于权利要求1所述小分子探针构建生物大分子探针的方法,其特征在于,包括:
将权利要求1所述的小分子探针和HaloTag蛋白分散在磷酸盐缓冲体系中,0-40℃下反应1-5h。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,小分子探针与HaloTag蛋白的用量比为(10-100)μmol/(0.25-5)g。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,R3为小分子探针与HaloTag蛋白的用量比为100μmol/(1-50)g;
或者,R3为时,小分子探针与HaloTag蛋白的用量比为100μmol/(0.25-5)g;
或者,R3为小分子探针与HaloTag蛋白的用量比为100μmol/(1-5)g。
5.基于权利要求2-4任一项所述方法制备得到的一种生物大分子探针。
6.根据权利要求5所述的生物大分子探针,其特征在于,其结构如式Ⅳ所示:
其中,R1、R2、R3、R4的定义同权利要求1,为HaloTag蛋白。
7.一种蛋白质膜探针,其特征在于,是将权利要求5或6所述的生物大分子探针稀释得到探针溶液,然后加入到酶标孔中,静置,然后除上清液,在酶标孔的底部获得蛋白质膜探针。
8.一种快速检测硫醇的方法,其特征在于,包括:配置一系列浓度的硫醇的磷酸盐缓冲溶液作为标准溶液,然后加入权利要求5所述的生物大分子探针,测定其在发射波长为440nm处的荧光强度值,将标准溶液的硫醇浓度与相应的荧光强度值进行关联,得到定量检测模型。
9.一种快速检测过氧化氢的方法,其特征在于,包括:配置一系列浓度的过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液作为标准溶液,然后加入权利要求5所述的生物大分子探针,测定其在发射波长为440nm处的荧光强度值,将标准溶液的过氧化氢浓度与相应的荧光强度值进行关联,得到定量检测模型。
10.权利要求1所述的小分子探针、权利要求5所述的生物大分子探针或者权利要求7所述的蛋白质膜探针在信息储存和加密方面的应用。
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