CN116987143A - 一种鲍hmgr抑制肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲍HMGR抑制肽及其制备方法、应用，属于HMGR抑制肽技术领域，鲍HMGR抑制肽，其氨基酸序列为SPADIGFH。该HMGR抑制肽具有抑制HMGR活性作用，并且可以降低细胞内总胆固醇与总甘油三酯积累、保护H2O2引起的细胞损伤等功效，有助于开发成天然降血脂、抗氧化损伤产品。此外，利用鲍鱼内脏为原料开发出鲍HMGR抑制肽，对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂产品拓展了资源。
Description
技术领域
本发明涉及鲍HMGR抑制肽技术领域，具体涉及一种鲍HMGR抑制肽、制备及应用。
背景技术
近年来高血脂症患病人群越来越趋于年轻化，高血脂症也是心脑血管疾病、糖尿病和多种癌症等慢性疾病的重要危险因素。目前在临床中使用较多的降血脂药物多为他汀类药物，据可靠研究，他汀类药物的使用会有主要两方面的副作用，一个是转氨酶升高，一个是肌肉痛的不良反应风险。因此，加大天然、无毒害降血脂食品的研究力度时非常迫切的。
目前人们对鲍鱼的加工利用主要集中在罐头、冷冻、鲜销等，鲍鱼的精深加工利用较低、下脚料浪费严重。现已有的对鲍鱼活性的研究主要集中在性腺、内脏、壳以及鳃等下脚料的抗氧化活性上，鲜有关于降血脂活性的研究。而开发安全、无毒害的天然降血脂产物的需求又比较迫切。因此，本文以真空冷冻干燥的鲍鱼内脏为原料，开发具有降血脂功效的鲍鱼肽，能够对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂产品拓展了资源。
传统生物HMGR抑制肽的筛选制备方法是先酶解，酶解液经超滤后再进一步纯化制备得到肽，常规方法中纯化步骤耗时耗力，并且花大成本制备得到的肽不一定具有靶向活性。
因此，本文以真空冷冻干燥的鲍鱼内脏为原料开发具有降血脂功效的鲍鱼肽，能够对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂产品拓展了资源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种鲍HMGR抑制肽、其筛选制备方法及应用，通过计算机辅助软件辅助筛选出的鲍HMGR抑制肽，具有抑制细胞内总胆固醇与总甘油三酯积累等功效，有助于开发成天然降血脂产品。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种鲍HMGR抑制肽，其特征在于，该种鲍HMGR抑制肽来源于内脏、性腺等鲍鱼下脚料；氨基酸序列为：丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-组氨酸，缩写为：SPADIGFH。
进一步地，所述的一种鲍HMGR抑制肽，在制备、辅助降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤的产品中的应用。
一种鲍HMGR抑制肽的筛选和制备方法：
S1：酶解制备<1kDa的鲍混合肽：利用碱性蛋白酶酶解鲍鱼内脏，酶解结束灭酶后经平板离心机离心，再使用陶瓷膜粗滤，得到的滤出液经<1kDa的膜超滤，最终得到<1kDa分子量的混合肽，冷冻干燥成粉末；
S2：鉴定鲍混合肽氨基酸序列：取适量<1kDa的混合肽经C18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析；获得多种鲍混合肽的序列；
S3：虚拟筛选：以蛋白质HMGR的3D结构作为受体，运用对接软件Discovery Studio2019对HMGR分子加氢、去水，进行能量最小化处理，用单肽分子以Discovery Studio2019Client绘制小分子作为配体，确定HMGR的活性口袋，进行虚拟筛选；
S4：HMGR抑制肽固相合成：将虚拟筛选的结果通过Grid Score得分进行排名，根据排名和相互作用的情况，挑选出与口袋结合相互作用力的较强的单肽进行固相合成，获得所述鲍HMGR抑制肽，经RP-HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量。
进一步地，S2的具体步骤为：整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的Q-ExactivePlus质谱仪，共上样1μL样品(分析柱：Acclaim PepMap C18，75μm x 25cm)，以60min的梯度分离样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35％，后1分钟内升高到100％，维持12分钟；质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换，质谱参数设置如下：
(1)MS：扫描范围(m/z)：200-2000；分辨率:70000；AGC target：3e6；最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率：17500；AGC target：1e5；最大注入时间：45ms；碰撞能量：28；动态排除时间：30s。
进一步地，S3步骤中：所述的蛋白质HMGR的3D结构从RCSB蛋白质数据库下载人3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶(天然)的晶体结构；所述的HMGR的活性口袋为口袋范围8，盒子边缘4。
本发明的有益效果：
1、本发明所筛选制备出的鲍HMGR抑制肽SPADIGFH在体外细胞实验中，不同浓度均抑制了Hep-G2细胞中总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)的积累，且细胞内总胆固醇、总甘油三酯的积累水平随处理浓度的提高而下降，400μM时差异最显著(P<0.01)。说明多种浓度的鲍HMGR抑制肽SPADIGFH均能够抑制细胞中总胆固醇、总甘油三酯的积累，具有降血脂、降胆固醇的功效，有利于开发天然降血脂产品，或拓展其在制备、辅助降血脂、降胆固醇的产品中的应用。
2、本发明所筛选制备出的鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对胆固醇胶束溶解度抑制率随着单肽处理浓度升高而提升，处理浓度为400μM时效果最明显。
3、本发明所筛选制备出的鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对多种细胞在高浓度的情况下对细胞活力、细胞生长均无显著性影响，说明鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对细胞无毒性，符合降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤产品的安全性，具有制备、辅助降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤的产品中的应用的价值和可能性。
4.本发明所筛选制备出的鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对氧化损伤的体外细胞也有保护效果，处理浓度在50μM时单肽对L02细胞呈现出显著的氧化损伤保护效果(P＜0.05)，且随着浓度升高效果越明显。具有抗氧化损伤的功效，有利于开发天然抗氧化产品，或拓展其在制备、辅助抗氧化损伤的产品中的应用。
5、此外，本发明中所使用的筛选和制备方法相较于传统方法具有花费时间少、所得HMGR抑制肽产物靶向性、功效性好的优势。本方法的思路是对酶解后的混合肽通过S3步骤虚拟筛选，根据计算机软件的评分，选出综合排名较高的肽段，再用体内体外的试验验证肽的活性功能，打破传统一一制备、实验验证的思路。
一方面，常规酶解制备肽的方法是先酶解，酶解液经超滤后再进一步纯化制备得到肽，常规方法中纯化步骤耗时耗力，而直接用计算机辅助软件进行虚拟筛选的方案大大减少了得到HMGR抑制肽所需的时间；另一方面，常规酶解制备的HMGR抑制肽大多不具备的靶向性、功能性较弱，本发明中所使用的筛选和制备方法使用计算机辅助软件虚拟筛选，得到的HMGR抑制肽具有显著的靶向活性功能。
6、本发明利用鲍鱼内脏等下脚料为原料开发出一种鲍HMGR抑制肽，对鲍下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然降血脂、抗氧化损伤产品拓展了资源。
7、本发明首次使用Discovery Studio等计算机软件筛选技术应用于鲍鱼提取肽的分析，通过大量实验和虚拟比对确定了鲍鱼HMGR抑制肽筛选的活性口袋为口袋范围8和盒子边缘4的筛选范围，列出了高得分的肽段清单。该方法在短时间内排除鲍鱼下脚料中存在的大量靶向不明确、效果不准确的无关肽段，为后续鲍鱼提取物的活性成分研究提供思路和可行范围，有助于缩短研发时间，提供了高效、低成本的研究思路。
8、相较于传统的成分混杂的鲍鱼提取物，本发明利用虚拟筛选技术开发出一种鲍HMGR抑制肽，肽序列结构明确，且具有明显靶向性，为以后开发辅助性产品以及在未来活性物质的协同使用方面提供了可能。
附图说明
图1是本发明鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的HPLC色谱图；
图2是本发明鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的质谱图；
图3是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对HMGR酶活力的影响(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图4是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对Hep-G2细胞活力的影响；
图5是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对Hep-G2细胞总胆固醇(TC)的影响(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图6是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对Hep-G2细胞总甘油三酯(TG)的影响(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图7是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的胆固醇胶束溶解度抑制率(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图8是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对L02细胞活力的影响；
图9是本发明不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对H2O2损伤L02细胞的保护效果(注：*表示P<0.05，**表示P<0.01)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，凡未注明厂商的试剂、仪器或设备，均可通过市售获得。
实施例1
S1：酶解制备<1kDa的鲍混合肽
利用碱性蛋白酶酶解鲍鱼内脏，酶解结束灭酶后经平板离心机离心，再使用陶瓷膜粗滤，得到的滤出液经<1kDa的膜超滤，最终得到<1kDa分子量的混合肽，冷冻干燥成粉末。
S2：鲍混合肽氨基酸序列鉴定
取适量<1kDa的混合肽经C18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的Q-Exactive Plus质谱仪(ThermoFisher Scientific,MA,USA)。共上样1μL样品(分析柱：Acclaim PepMap C18，75μm x25cm)，以60min的梯度分离样品,柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35％，后1分钟内升高到100％，维持12分钟。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：
(1)MS：扫描范围(m/z)：200-2000；分辨率：70000；AGC target：3e6；最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率：17500；AGCtarget：1e5；最大注入时间：45ms；碰撞能量：28；动态排除时间：30s。
S3：虚拟筛选
HMGR作为受体，蛋白质HMGR的3D结构可从RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org)下载人3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶(天然)的晶体结构(PDB ID：1HWK)。运用对接软件Discovery Studio 2019对HMGR分子加氢、去水，进行能量最小化处理，以单肽分子以Discovery Studio 2019Client绘制小分子作为配体，最后确定HMGR的活性口袋，在口袋范围8，盒子边缘4的条件下虚拟筛选。
S4：HMGR抑制肽固相合成
将虚拟筛选的结果通过Grid Score得分进行排名，根据排名和相互作用的情况，挑选出与口袋结合相互作用力的较强的单肽进行固相合成，获得鲍HMGR抑制肽SPADIGFH，经RP-HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量。
如图1所示，HPLC鉴定鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的纯度达99.56％。如图2所示，经LC/MS确定相对分子质量为842.89。采用ProtParam对鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的理化参数进行分析如表1所示。
表1鲍HMGR抑制肽的理化参数
实验例1：体外HMGR酶活的影响与结果
按照表2体系配制反应孔(以阿托伐他汀为对照)，使得每个孔中最终含rhHMGR0.05μg，NADPH 0.5mM，HMG-CoA 0.2mM。以此测定HMGR的酶活力。
表2鲍HMGR抑制肽体外HMGR酶活配置体系
加好体系后37℃避光孵育15min，测定340nm处的OD值，并按照以下公式计算HMGR的酶活力。
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对HMGR酶活的影响如图3所示。由图可见，不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH能抑制HMGR酶活，且浓度为200μM时效果最为显著(p<0.01)。
实验例2：Hep-G2细胞活力与脂质积累的测定与结果
2.1细胞毒性测定与结果
10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素双抗的DMEM高糖培养基培养Hep-G2细胞。当细胞生长、融合汇至80-90％(对数生长期)时消化细胞，轻微吹打混匀，离心收集细胞，将细胞数稀释到1×105个/mL。吸取100μL细胞悬液加入96孔板中，在CO2培养箱中，37℃培养14-16h，待细胞融汇至80-90％，将不同浓度(0、50、100、200、400μM)肽孵育细胞培养24h，参照cck8试剂盒方法测定细胞活力。
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对Hep-G2细胞活力的影响如图4所示。结果表明：经鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的低浓度50μM到高浓度400μM处理对Hep-G2的细胞活力没有显著性影响，说明400μM的单肽处理对Hep-G2细胞无毒性。
2.2TC、TG含量测定与结果
当细胞生长至对数生长期消化细胞，轻微吹打混匀，离心收集细胞，加入培养基，吹打混匀，采用血球计数器对细胞计数，用完全培养基将细胞数稀释到4×105个/mL。吸取250μL细胞悬液加入48孔板中，在CO2培养箱中，37℃培养14-16h，待细胞融汇至80-90％，加入不同浓度(0、50、100、200、400μM)肽与游离脂肪酸(10％的油酸与棕榈酸)孵育细胞24h，设置未加游离脂肪酸和肽的空白对照组。用DPBS清洗细胞，再使用1.5％Triton-X100在冰上裂解45min，用南京建成甘油三酯(TG)测定试剂盒和总胆固醇(TC/TCH)测定试剂盒测定细胞TC、TG含量。
配置不同浓度蛋白标准品，试剂盒A液：B液按照50：1混合(现配现用)，每孔含样品25μL，反应液200μL，避光孵育30min后在测定反应孔OD 562nm。
TC总胆固醇含量(mmol/g prot)＝(A样本-A空白)/(A标准-A空白)×C标准(5.17)÷Cpr
TG总甘油三酯含量(mmol/g prot)＝(A样本-A空白)/(A标准-A空白)×C标准(2.26)÷Cpr
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对Hep-G2细胞中总胆固醇(TC)积累的影响如图5所示。由图可知，经100、200μM鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理均显著(P<0.05)抑制了Hep-G2细胞中总胆固醇的积累，处理浓度为400μM时效果最明显，且与模型组(0μM)(有极显著差异(P<0.01)。
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对Hep-G2细胞中总甘油三酯(TG)积累的影响如图6所示。由图可知，不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理均抑制了Hep-G2细胞中总甘油三酯的积累，处理浓度为400μM时效果最明显，与模型组(0μM)有极显著差异(P<0.01)。
实验例3：体外胆固醇胶束溶解度抑制率的测定与结果
单肽对胆固醇胶束溶解度抑制率参考Nagaoka等的方法。胶束溶液(1mL)中含10mM牛黄胆酸钠、0.4mM胆固醇、1mM油酸、132mM NaCl、15mM磷酸钠(pH 7.4)。将单肽粉溶于PBS使得终浓度为10mM，后与胆固醇胶束溶液混合，使得单肽的最终浓度分别为50、100、200、400μM。混匀的样品在37℃下超声乳化30min，在37℃恒温培养箱中摇晃孵育24h。常温下10000r离心20min，取上清液用南京建成总胆固醇测试试剂盒测定上清中的胆固醇含量。同时做空白实验，用等体积的PBS代替单肽溶液。最后计算单肽溶液对胆固醇胶束溶解度的抑制率。计算公式如下：
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对胆固醇胶束溶解度抑制率的影响如图7所示。由图可见，随处理浓度的升高，鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对胆固醇胶束溶解度的抑制率也加强，且处理浓度为400μM时效果最明显。
实验例4：L02细胞活力与H2O2氧化损伤的测定与结果
4.1细胞毒性测定与结果
10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素双抗的RPMI1640高糖培养基培养L02细胞。当细胞生长、融合汇至80-90％(对数生长期)时消化细胞，轻微吹打混匀，离心收集细胞，将细胞数稀释到1×105个/mL。吸取100μL细胞悬液加入96孔板中，在CO2培养箱中，37℃培养14-16h，待细胞融汇至80-90％，将不同浓度(0、50、100、200、400μM)肽孵育细胞培养3h，参照cck8试剂盒方法测定细胞活力。
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH对L02细胞活力的影响如图8所示。结果表明：经鲍HMGR抑制肽SPADIGFH的低浓度50μM到高浓度400μM处理对L02的细胞活力没有显著性影响，说明400μM的鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对L02细胞无毒性。
4.2对H2O2氧化损伤的保护效果测定与结果
当细胞生长至对数生长期消化细胞，轻微吹打混匀，离心收集细胞，加入培养基，吹打混匀，采用血球计数器对细胞计数，用完全培养基将细胞数稀释到1×105个/mL。吸取100μL细胞悬液加入96孔板中，在CO2培养箱中，37℃培养14-16h，待细胞融汇至80-90％，加入不同浓度(0、50、100、200、400μM)肽与150μM H2O2孵育细胞3h，设置未加H2O2和肽的空白对照组。
不同浓度鲍HMGR抑制肽SPADIGFH处理对H2O2损伤L02细胞的保护效果如图9所示。由图可知，处理浓度在50μM时单肽对L02细胞呈现出显著的氧化损伤保护效果(P＜0.05)，且随着浓度升高效果越明显。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种鲍HMGR抑制肽，其特征在于，该种鲍HMGR抑制肽来源于内脏、性腺等鲍鱼下脚料；氨基酸序列为：丝氨酸-脯氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-组氨酸，缩写为：SPADIGFH。
2.根据权利要求1所述的一种鲍抑制肽，在制备、辅助降血脂、降胆固醇、抗氧化损伤的产品中的应用。
3.一种筛选和制备权利要求1所述的一种鲍HMGR抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：酶解制备<1kDa的鲍混合肽：利用碱性蛋白酶酶解鲍鱼内脏，酶解结束灭酶后经平板离心机离心，再使用陶瓷膜粗滤，得到的滤出液经<1kDa的膜超滤，最终得到<1kDa分子量的混合肽，冷冻干燥成粉末；
S2：鉴定鲍混合肽氨基酸序列：取适量<1kDa的混合肽经C18除盐柱进行除盐，将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析；获得多条鲍混合肽的序列；
S3：虚拟筛选：以蛋白质HMGR的3D结构作为受体，运用对接软件Discovery Studio2019对HMGR分子加氢、去水，进行能量最小化处理，用单肽分子以Discovery Studio2019Client绘制小分子作为配体，确定HMGR的活性口袋，进行虚拟筛选；
S4：HMGR抑制肽固相合成：将虚拟筛选的结果通过Grid Score得分进行排名，根据排名和相互作用的情况，挑选出与口袋结合相互作用力的较强的单肽进行固相合成，获得所述鲍HMGR抑制肽，经RP-HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量。
4.根据权利要求3所述的一种鲍HMGR抑制肽的筛选和制备方法，其特征在于，所述的S2的具体步骤为：整套系统为串联EASY-nanoLC 1200的Q-Exactive Plus质谱仪，共上样1μL样品(分析柱：Acclaim PepMap C18，75μm x 25cm)，以60min的梯度分离样品，柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35％，后1分钟内升高到100％，维持12分钟；质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换，质谱参数设置如下：
(1)MS：扫描范围(m/z)：200-2000；分辨率:70000；AGC target：3e6；最大注入时间：50ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率：17500；AGC target：1e5；最大注入时间：45ms；碰撞能量：28；动态排除时间：30s。
5.根据权利要求3所述的一种鲍HMGR抑制肽的筛选和制备方法，其特征在于，S3步骤中：所述的蛋白质HMGR的3D结构从RCSB蛋白质数据库下载人3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶(天然)的晶体结构；所述的HMGR的活性口袋为口袋范围8，盒子边缘4。
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