CN1169834C - 从人血浆中分离纯化巨核细胞刺激因子的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化分离纯化技术领域。本发明从人血浆经生产白蛋白和球蛋白后的沉淀物中，通过溶解、离心、超滤、离子交换纤维素层析，凝胶过滤，DEAE凝胶层析等方法，分离纯化了巨核细胞刺激因子(Megakarylcyte Stimulator，简称MES)，MES具有分子量40-42Kda和18-20Kda两种形式，等电点4.6±0.1，均具有促进巨核细胞的祖细胞分化成熟，表现出巨核细胞的功能，从而可以在体内促进血小板生成，对血小板低下症具有专一的治疗效果。此外MES还具有促进脐带血干细胞增殖的功能。在干细胞移植中有着重大的潜在价值。
Description
一、技术领域：
本发明属于生化分离纯化技术领域。
二、背景技术
引起血小板低下的因素很多，如接触有害的化学物质、病毒感染、放、化疗，还有某些血液病(如血小板减少性紫癜，骨髓增生异常综合症-难治性贫血，再生障碍性贫血)。血小板低下的后果很严重，可造成危险的出血，在皮肤上表现为大片紫癜，内脏或脑内出血将危及生命。目前尚无特效的升血小板药物面市，1994年美国三家公司通过DNA重组技术合成了血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)的N-端大片段，体外和动物试验效果甚好，给人们带来很大希望，但I、II期临床效果不理想，故至今未上市，其它如IL-3、6、11等因子据报道亦有增加血小板数的功能，这些因子一般作用位点比较广泛，并非专一，多数是间接的，因此其用量比较大。一般用量比MES大15-20倍。
本发明发现人肾细胞条件化培养液，人尿中都含有一种可促进动物血小板生成的蛋白质，但分子量、等电点和免疫学性质和血小板生成素(TPO)完全不同，经深入研究发现，这是一种新的生长因子，故命名为巨核细胞刺激因子简称MES，以与TPO区别。鉴于胎肾来源有限，人尿虽无限制，但体积大，必须从大量尿液中富集，给生产带来不便，而且人尿MES主要是低分子量形式，活性比高分子量形式低得多。本发明从人血浆沉淀物中分离MES，得到比较理想的结果。
三、发明内容：
本发明的目的是从分离白蛋白、球蛋白后的废弃的人血浆沉淀物中，获得重要的造血细胞生长因子，即巨核细胞刺激因子MES(Megakarylcyte Stimulater)，它有两种分子形式，分子量分别为40-42Kda和18-20Kda，pI为4.6±0.1。但大分子形式MES的生物活性明显高于低分子量形式，经测定二种分子形式的N-末端序列完全相同，(Val-thr-glu-asp-ser-asp-gln-leu-gly-tyr-)。通过与国际上PDB，SWISSPORT蛋白质数据库进行比较，未发现与MES有明显同源性的蛋白质，提示MES是一种未知结构的全新的蛋白质。为治疗血小板低下这一类棘手疾病提供一种有效的新药。
本发明技术将人血浆分离白蛋白和(或)球蛋白后的沉淀物，溶于磷酸缓冲液(PBS)中，上阴离子纤维素层析柱，用含有不同浓度NaCl的PBS洗脱，收集活性峰，加(NH4)2SO4沉淀，放置过夜，离心，沉淀溶解后对水透析，离心，上清上Sephacryl柱分离，收集洗脱活性峰，冻干、溶解、透析，上DEAE-Sephadex柱，进行NaCl直线梯度洗脱，收集活性峰，透析平衡，透析液离心，上清除热原，除菌，测蛋白浓度，加蛋白保护剂60℃10h灭活病毒，测活性，除菌，去热原，得原料液，稀释至所需浓度后加入冻干辅料，除菌，分装，冻干，包装，药品常规检查，得最终的合格药品。该药品可用于治疗肿瘤放、化疗引起的血小板低下，以及血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症等血液病或环境、药物、化学物质、放射性物质、电磁波等引起的血小板减少症。
活性测定：(体内法)
小鼠肌肉注射样品含MES 5ug/ml，0.1ml/10g体重每日一次(在肌注样品之前，先每只小鼠眼眶或尾部采血，计数血小板)连续8天，于第三次注射样品后再腹腔注射环磷酰胺(CTX)100mg/kg/d，连续三天，盐水对照组注射生理盐水代替样品，代替样品，在最后一次注射后次日小鼠眼眶或尾部取血20ul，加入0.38ml血小板稀释液中混合，室温放置10-30分钟以溶解红细胞和白细胞，取此稀释好的血小板悬液一滴加入计数池内静置10-15分钟，用高倍镜计数血小板数，凡试验组的血小板数与对照组比较，经统计学处理，有明显差异视为合格产品。
本发明所述MES无论在体内还是体外促进血小板生成的效果都十分明显：
1、巨核细胞刺激因子对环磷酰胺所致的小鼠血小板减少的影响：
取健康小鼠40只，♀♂各半，体重18-22g，随机分四组，生理盐水(NS)组，巨核细胞刺激因子低、中、高剂量组(剂量分别为0.5ug/Kg、5ug/Kg、2Sug/Kg)小鼠肌肉注射样品0.1ml/10g体重，每日一次(在肌注样品之前，先每只小鼠眼眶或尾部采血，计数血小板)连续8天，于第三次注射样品后再腹腔注射环磷酰胺100mg/kg/d，连续三天，盐水对照组注射生理盐水代替样品，在最后一次注射后次日小鼠眼眶或尾部取血20ul，加入0.38ml血小板稀释液中混合，室温放置10-30分钟以溶解红细胞和白细胞，取此稀释好的血小板悬液一滴加入计数池内静置10-15分钟，用高倍镜计数血小板数，经统计学处理试验组的血小板数比对照组有显著性差异，结果见表1。
表1.肌肉注射不同剂量的MES对CTX所致小鼠的血小板减少的影响
剂量 动物数 血小板(×109)
组别 ug/Kg 只 CTX处理前 CTX处理和治疗后
NS 10 888.00±337.30 477.00±289.00+++
MES 0.5 10 1014.00±123.10* 1015.00±154.00+***
MES 5.0 10 1074.00±139.75* 1025.00±107.50+***
MES 25.0 10 944.15±89.60* 1220.00±200.75++***
注：*与相应NS相比，*p＞0.05，***p＜0.01。+与处理前相比，+p＞0.05，+++p＜0.01。
由表1可见，CTX可使小鼠血小板明显减少，与CTX处理前相比有明显差异。肌肉注射不同剂量的巨核细胞刺激因子可不同程度地提高血小板值，并有剂量依赖关系。
2、巨核细胞刺激因子对60Co照射所致的大鼠血小板减少的影响：
取28只SD大鼠，♀♂各半，体重250±30g，随机分四组，生理盐水(NS)组，巨核细胞刺激因子低、中、高剂量组(剂量分别为2.5ug/Kg、5ug/Kg、10ug/Kg)，尾部取血，测正常血小板数，送江苏省农科院辐射中心经60Co照射(总量为4.0Gy，剂量率为800伦/min)后，肌肉注射NS或巨核细胞刺激因子，每天一次(注射容积为0.1ml/100g体重)，分别于7，11，14日测血小板值，观察它们的变化。
表2.不同剂量的MES对60Co照射所致的大鼠血小板减少的影响
剂量 动物数 血小板(×109/L)
组别
(ug/Kg) (只) 0d 7d 11d 14d
NS 7 919.14±78.55 143.57±14.84+++ 30.71±14.38+++ 276.36±158.35+++
MES 2.5 7 950.00±195.0* 121.00±30.00*+++ 57.90±37.11*+++ 382.12±190.25*+++
MES 5.0 7 959.43±85.32* 132.71±39.99*+++ 101.29±38.07***+++ 513.57±194.83**+++
MES 10 7 934.86±76.47* 127.57±28.72*+++ 130.00±31.27***+++ 615.50±121.87***+++
注：*与相应NS相比，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01.+与0d相比，+P＞0.05，++P＜0.05，+++P＜0.01.
由表2结果可见，60Co照射后7d，11d，14d，大鼠血小板明显减少，但不同剂量的巨核细胞刺激因子可不同程度地阻止血小板值的进一步减少，照射后第14d，巨核细胞刺激因子组血小板值恢复较NS组明显增快，且呈剂量相关性。
3、巨核细胞刺激因子对60Co照射所致的犬血小板减少的影响：
犬12只，随机分为3组，每组4只，生理盐水(NS)组，巨核细胞刺激因子低、高剂量组(剂量分别为15、30ug/Kg)，测正常血小板值后送江苏省农科院辐射中心经60Co双侧骨盆屏蔽照射，共6.0Gy，剂量率为100伦/min，照射后第二天开始每天肌肉注射NS或巨核细胞刺激因子(注射容积为0.1ml/Kg体重)，于照射后隔日测血小板值，观察它们的变化。结果见表3。
表3不同剂量的MES对60Co照射所致的犬血小板值减少的影响
剂量 动物数 血小板值(×109/L)
组别
(ug/Kg) (只) 0d 2d 4d 6d
NS 4 249.50±72.57 246.00±85.45 229.50±100.87 154.00±65.49*
MES 15 4 236 50±48.52 234.75±18.21 254.67±29.37 201.25±35.68
MES 30 4 247.00±31.43 277.25±25.41 283.25±66.60 222.25±82.96
PLT续表1.
8d 10d 12d 14d 16d
105.67±24.11** 80.50±17.77** 86.66±19.42** 77.25±21.14** 74.75±12.48**
97.75±16.38** 84.50±12.01** 75.00±23.40** 87.50±15.28** 84.50±10.85**
106.00±16.02** 85.50±11.09* 77.25±22.87** 92.75±19.88** 90.25±23.82**
PLT续表2.
18d 20d 22d 24d 26d
97.00±14.10** 109.50±34.23** 99.25±18.20** 104.00±6.21** 90.00±10.23**
97.50±24.72** 105.25±22.87** 129.00±45.88** 125.25±29.83** 98.00±28.32**
114.50±35.15** 135.00±32.30* 141.50±30.13*# 168.50±36.19# 158.75±37.56#
PLT续表3.
28d 30d 32d 34d
108.00±40.65** 113.25±22.54* 111.34±28.34** 110.25±31.94**
148.75±52.36** 139.00±23.90** 177.10±32.12 215.00±48.91##
201.00±42.23# 212.50±84.63# 232.57±52.11# 251.67±30.86##
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与0d相比；#P＜0.05，##p＜0.01，与相应NS相比。
由表3结果可见，MES对60Co照射后的血小板减少具有明显的刺激作用，高剂量组在34天治疗后，血小板完全恢复到照射前的水平，而对照组仅恢复到照射前的44％。
本发明与已有技术相比，有以下特点：
1.国内外均无同类产品，为治疗血小板低下症的专一药物。
2.纯天然制品，在制造过程中未使用过任何有害化学物质，十分安全。
3.本品为与人同源的细胞生长因子，使用量为微克水平，不存在异源蛋白的问题。
4.原料来源丰富，甚至是废物利用，成本低，制造过程无污染。
5.MES除了可刺激巨核细胞的增殖分化外，对造血干细胞也有很好的促增殖分化作用。分离脐血中的单个核细胞(MNC)与MES或MES+rSCF(重组干细胞生长因子)培养7天后，MNC扩增25倍和29倍，对照组为10.8倍。CD34+细胞扩增32倍和60倍，对照组仅9倍，CD34+CD38-细胞扩增23倍和60倍，而对照组只扩增6倍，说明MES对脐血干细胞或骨髓干细胞(CD34+、CD38-)体外有扩增作用，MES可单独使用，也可与干细胞生长因子(rSCF)合并使用。可制备成制剂或试剂盒，而用于干细胞体外扩增和干细胞移植。
实施例：收集制备过白蛋白后的血浆沉淀物300g湿重(相当于100L血浆)，溶于6L 10mmol/L pH6.5的PBS中，4℃ 9000r/m，离心10分钟，取上清(蛋白浓度2.46mg/ml)，共得蛋白质14.76g，将离心上清上DEAE纤维素柱层析，以10mmol/L PBS和含0.1mol/L NaCl的10mmol/L PBS洗去杂蛋白，再以0.5mol/LNaCl/10mmol/L PBS洗下目的蛋白共10.5g，回收率71.1％。加入(NH4)2SO4至80％饱和度，收集沉淀，对水透析；透析液经过Sephacryl凝胶柱分离，共得4个蛋白峰，收集峰I和峰II，得蛋白质4.29g，回收率40％，冷冻浓缩后，透析平衡，再经DEAE-Sephadex柱分离，上样后先以含0.1mol/LNaCl的10mmol/L PBS洗去杂质，再以0.1mol/L-0.5mol/LNaCl的直线梯度洗脱，其中峰III为活性峰，得到800mg蛋白质，通过SDS-PAGE检查呈现二条带，分子量分别为40-42kd与18-20kd二者比例为2∶1。MES经巯基乙醇加热变性后40-42kd的成分减少，18-20kd成分大量增加，没有新的条带产生，二条带洗脱后测活均有促进小鼠骨髓细胞中巨核细胞增殖的生物学功能，40-42kd的活性比18-20kd的活性高约10％-20％，将SDS-PAGE的条带转移到PVDF膜上，以考马斯亮蓝染色，切下蓝色条带，经序列测定，二种分子形式蛋白的N-端10个氨基酸的序列相同，经国外蛋白质序列库检索至2002年2月，未能与目前已知的人源蛋白序列获得明显的相容性结果。MES的等电点测定为4.6±0.1，故称本品为一种全新结构的蛋白质。
活性峰800mg，经过冻干、透析、离心去热原，除菌等步骤后，得到合格产品330mg，相当于1吨血浆可得3300mgMES，可制成针剂10000-15000瓶。
Claims (4)
1.一种巨核细胞刺激因子(MES)，其特征在于该巨核细胞刺激因子，分离自人血浆，它有两种分子形式，分子量分别为40-42Kda和18-20Kda，pI为4.2±0.1，MES的N-端1-10氨基酸序列为Val-thr-glu-asp-ser-asp-gln-leu-gly-tyr-。
2.根据权利要求1所述巨核细胞刺激因子的生产方法，其特征是将人血浆分离白蛋白和(或)球蛋白后的沉淀物，溶于磷酸缓冲液(PBS)中，上阴离子纤维素层析柱，用含有不同浓度NaCl的PBS洗脱，收集活性峰，加(NH4)2SO4沉淀，放置过夜，离心，沉淀溶解后对水透析，离心，上清上Sephacryl柱分离，收集洗脱活性峰，冻干、溶解、透析，上DEAE-Sephadex柱，进行NaCl直线梯度洗脱，收集活性峰，透析平衡，透析液离心，上清除热原，除菌，加蛋白保护剂60℃10h灭活病毒，测蛋白浓度，测活性，除菌，去热原，得原料液，稀释至所需浓度后加入冻干制剂用辅料，除菌，分装，冻干，包装，药品常规检查，得最终产品。
3.权利要求1的巨核细胞刺激因子，在制备治疗肿瘤放、化疗引起的血小板低下、血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症以及环境、药物、化学物质、放射性物质、电磁波等引起的血小板减少症药物中的应用。
4.权利要求1的巨核细胞刺激因子，在制备用于干细胞体外扩增和干细胞移植制剂或试剂盒中的应用。
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